CN111378583A

CN111378583A - 一种里氏木霉及其应用

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Publication number: CN111378583A
Application number: CN201811606120.0A
Authority: CN
Inventors: 张青; 田延军; 许韡; 刘艳萍; 李�瑞; 宋清清; 陈艳超; 徐晓东; 张金祥
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Weilan Biological Group Co Ltd; Weifang Kdn Biotech Co ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN111378583B

Abstract

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉突变菌株及其应用。所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO:M2018880。所述突变菌株能高效表达脂肪酶，摇瓶发酵酶活高达2140 U/mL，比出发菌提高的54%，20L罐发酵酶活高达40000 U/mL，比出发菌株提高了48%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于脂肪酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其推广与应用。

Description

一种里氏木霉及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其应用。

背景技术

脂肪酶又称甘油酯水解酶，能够催化天然底物油脂的分解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一，作用于异相系统，即在油水界面上水解脂肪酸甘油酯，而只有当底物以微粒、小聚合分散状态或成乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶被广泛应用于食品、生物、饲料等领域，在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。

脂肪参与动物机体的组成，是动物必需的营养物质，是畜禽体内主要能量物质，是机体最大的能量储备库，当机体需要能量时，体内脂肪在脂肪酶的作用下被分解，参与能量代谢，保证其健康生长，并可满足畜禽特殊生长阶段对高能量的需求。另外，在动物饲料中添加脂肪可以改善饲料外观油性，减少饲料加工过程中的粉尘污染，同时可增加动物的食欲及其对脂溶性物质的吸收。动物饲料中的脂类必须经脂肪酶分解成脂肪酸、甘油二脂、甘油单酯后，才能被畜禽机体消化、吸收和利用，在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程。大量研究表明，微生物脂肪酶对动物体内源消化酶的分泌有一定的促进作用，并有利于营养物质的消化与吸收。此外，在饲料中添加外源脂肪酶能够补充动物特殊生理阶段内源脂肪酶的不足，提高脂肪的消化，提高断奶仔猪等幼龄动物的生产性能、缓解应激、促进动物生长。

脂肪酶的生产方法有三种，即化学合成法（通过分析酶的氨基酸组成顺序，然后用化学方法合成）、提取法（从动植物器官或组织中提取）、生物发酵法（利用微生物发酵获得）。化学合成法和提取法因试验技术等客观条件而受到限制，微生物脂肪酶种类多，微生物发酵法成为脂肪酶主要生产方法，由于微生物资源丰富，并且种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH 和作用温度范围，且微生物来源的脂肪酶一般均是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，生产不受自然环境的影响，可通过人工控制来大量生产目的酶，此外，其生产周期短，生产成本低，是一种经济而实用的方法，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源。脂肪酶在微生物中具有广泛的分布，已知大约有2%的微生物产脂肪酶，其产生菌包括细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属，至少65个属的微生物产脂肪酶。近年来，微生物脂肪酶的研究主要集中在高产菌株的选育、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺优化、酶的分离纯化及工业化生产；提高脂肪酶酶活性的方法有诱变育种、构建基因工程菌及优化发酵工艺等。但目前现有的脂肪酶生产菌株的产量仍偏低，脂肪酶的生产成本需要进一步降低，才能有效促进该酶的广泛应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉突变菌株。申请人首先将来源于疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶基因转化入里氏木霉（Trichoderma reesei）宿主细胞中，构建得到重组表达该脂肪酶的工程菌。然后以该工程菌为出发菌，通过紫外诱变方法筛选获得脂肪酶产量得到显著提高的里氏木霉突变菌株，能有效降低脂肪酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达脂肪酶基因的重组载体。

所述的脂肪酶，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株里氏木霉C2TL1（Trichoderma reesei C2TL1），已于2018年12月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2018880。

本发明还提供了所述里氏木霉突变株在生产脂肪酶中的应用。

本发明所述突变菌株里氏木霉C2TL1摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活达2140U/ml，比出发菌提高了54%；20L罐发酵上清液中脂肪酶酶活高达40000 U/ml，比出发菌株提高了48％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌里氏木霉C2TL1发酵上清液的最适作用pH为8.0，最适作用温度为55℃，与出发菌一致。本发明提供的里氏木霉突变菌株可广泛应用于脂肪酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进脂肪酶的推广与应用。

附图说明

图1为本发明重组表达的脂肪酶的pH-相对酶活曲线；

图2为本发明重组表达的脂肪酶的温度-相对酶活曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶基因表达载体的构建

1.1 提取疏绵状嗜热丝孢菌总基因组DNA

将疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）接种摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mMTrisHCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2 min左右；水浴锅65℃水浴20 min后加入200μl 10M NH4AC冰浴10 min；13000rpm离心10 min取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；13000 rpm离心10 min弃上清，用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于-20℃保存。

基因克隆

设计引物：

TG-F：AAAGGTACC A TGAGGAGCTC CCTTGTGC；

T1-F：CTCTAC TCGTTTGAAG GGTAAGTGTC GACATAAG；

T1-R：CTTATGTCGA CACTTACCCT TCAAACGAGT AGAG；

T2-F：GG ATCGGGAATCTTAAGTTCCT CATGAAAGAA ATAAATG；

T2-R：CATTTATTTC TTTCATGAGG AACTTAAGAT TCCCGATCC；

T3-F：C ACCGGCGGCA ATAACCGGCC TAACATTCCG GAT；

T3-R：ATCCGGAATG TTAGGCCGGT TATTGCCGCC GGTG；

TG-R:AAAACGCGTC TAAAGACATG TCCCAATTAA C。

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用引物TG-F和T1-R，T1-F和T2-R，T2-F和T3-R，T3-F和TG-R进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S，59℃ 40S，72℃ 50s30个循环；72℃ 7min。获得三条序列分别命名为：T1、T2和T3。再以TG-F和TG-R为引物，T1、T2、T3为模板进行PCR，PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S，59℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。测序结果显示，所述PCR扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。经NCBI blast比对发现，SEQ ID NO:1编码的蛋白为脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

构建载体

将上述扩增获得的TG基因用KpnI和MluI进行双酶切，回收TG片段；取2μl回收产物双酶切TG，连接pKDN载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-TG。测序结果证实插入的片段为TG基因。

实施例2 转化与筛选

（1）原生质体制备

取宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei）孢子悬液，接种于PDA平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；

用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；

将预冷的20 mL 1.2 M山梨醇（1.2 M山梨醇，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl₂）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 mL 1.2 M山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 M山梨醇悬浮分装（200 μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL）。

（2）表达载体转化与菌株验证

以下操作均在冰上进行，取10 μg重组质粒pKDN-TG加入到含有200 μL原生质体溶液的7 mL无菌离心管中，然后加入50 μL 25% PEG（25% PEG，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl₂），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 mL 25% PEG，混匀后室温放置5 min；加入4 mL 1.2 M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO₄, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上（2%葡萄糖，0.5%(NH₄)₂SO₄，1.5%KH₂PO₄，0.06%MgSO₄，0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），30℃培养5~7 d至有转化子长出。

挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2 d；取适量菌丝体置于2 mL离心管中，加入100 mg无菌石英砂和400 μL抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl，100 mM EDTA，250 mMNaCl，1%SDS)；用珠打仪剧烈振荡2 min；65℃水浴20 min后，加入200 μL 10 M NH₄AC，冰浴10 min；13000 rpm离心10 min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；13000rpm离心10 min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。

以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用进行PCR扩增目的基因进行验证。PCR扩增条件为94℃ 4 min；94℃ 40 s；58℃ 40 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 7 min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了重组表达脂肪酶的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉C2TL（Trichoderma reesei C2TL）。

实施例3 发酵验证与酶活检测

将里氏木霉C2TL接种到新鲜的PDA平板（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；琼脂粉1.5%），30℃培养7d。

吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种1L液体发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素），30℃，200rpm，培养120小时，离心获得发酵上清液。将发酵上清液进行脂肪酶酶活力测定。结果显示，所述发酵上清液中脂肪酶酶活为1390U/mL。

（1）脂肪酶活性单位定义

在30℃、pH值为8.0的条件下，每分钟从浓度为6%对硝基苯酚-棕榈酸酯的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。

（2）酶活测定方法

取四支15*150试管 (一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入底物2.7mL；将四支试管同时置于30±0.1℃水浴中，预热5min；取稀释好的酶液，30±0.1℃水浴中℃预热5min；准确向空白试管中加入0.3mL缓冲液，迅速涡旋混合，将混合液倒入1cm比色皿中，作为空白在400nm下调零；准确向样品试管中加入0.3mL酶液，此时开始计时并迅速涡旋混合、倒入比色皿，400nm下记录吸光值变化，每0.5 min读取一次数值，即读取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min，共10次数据。取1 ～5 min内的测定值，用来绘制曲线。

酶活的计算：

酶活力A=[( K-b) ×δ×V1×n]/ (k×V2)

式中：A—脂肪酶酶活力，u/g(或u/mL)；

K—吸光值每分钟增长量；

b、k—标准曲线中的截距和斜率；

n—酶样品的稀释倍数；

V1—所加入基准物的体积，0.3 mL；

V2—反应体系中所加入酶液的体积，0.3 mL；

δ—对硝基酚浓度由mg/mL换算成μmol/mL，值为106/103/139.11。

实施例4 发酵验证和酶学性质测定

1、最适作用pH

用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的缓冲液分别稀释里氏木霉C2TL发酵上清液，在25℃条件下分别测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，里氏木霉C2TL重组表达的脂肪酶最适作用pH值为8.0，且在pH6.5-8.0范围内能保持90%以上的酶活。

2、最适作用温度

分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，pH7.5条件下测定里氏木霉C2TL发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，里氏木霉C2TL重组表达的脂肪酶最适作用温度为55℃，且在50-60℃范围内能保持80%以上的酶活力。

实施例5 紫外诱变及筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉C2TL为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其脂肪酶的产量。

1、确定致死率：

将里氏木霉C2TL接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布152块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出35-50个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共95个，分别到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉C2TL作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的95株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中脂肪酶的酶活高于出发菌；其中，76株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余21株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了3-5%。

申请人按照上述方法继续进行了14轮诱变筛选，最终获得1株脂肪酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉C2TL1（Trichoderma reesei C2TL1）。里氏木霉C2TL1摇瓶发酵上清液中脂肪酶的酶活最高，达2140U/ml，比出发菌提高了54%。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉C2TL和上述突变菌株里氏木霉C2TL1分别在20L罐中进行发酵。发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测。

结果显示，出发菌株里氏木霉C2TL发酵上清液中脂肪酶酶活为27027 U/ml，而突变菌株里氏木霉C2TL1的发酵上清液中脂肪酶酶活高达40000 U/ml，比出发菌株提高了48％，取得了意料不到的技术效果。

申请人参照实施例4所述方法，对上述突变菌里氏木霉C2TL1的发酵上清液进行酶学性质分析。结果显示，突变菌里氏木霉C2TL1发酵上清液的最适作用pH为8.0，最适作用温度为55℃，与出发菌一致。

申请人已于2018年12月10日将里氏木霉C2TL1（Trichoderma reesei C2TL1）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2018880。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种里氏木霉及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1224

<212> DNA

<213> 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)

<400> 1

atgtaccact gatccatttt gattcaactc atcaatgctt ggagagtgtc atcttgattt 60

gaccgtcaaa tgaccccaag tgacgaacat catgatcctg cctaacctca aactttatac 120

aaactgtcat tgcggaccca gccgcgccgc gcactaaaga catgtcccaa ttaacccgaa 180

gtaccatagg tgcgcaggga tatccggaat gttaggccgg ttattgccgc cggtggcatc 240

gatgccttct atcttcacga tatcgtttcg ggtgacgggg acaagggttc cagatttgat 300

ccagtactct gggctagaat ggctgtaacc gaattcgcgc ggcgggagtc tagggacaat 360

atcattggtg tgggtaatgc ggtagagtgt tccgccggtc tgtacggtca ggaattctgc 420

aaaagccctg tttccgactc ggggggcgcc atatgaaaac taatatgcgt gtatcagact 480

tcctgcactt tcccgcatga tctcgtttac tacataccac gtcgatatca tacccatttc 540

cacgcaggtc tgctccggca acagttgcca atgcaccacc caagctatgt ccggtaaaca 600

ccacgcgata gtcgggatgc tccctcacag catcctccac cttctgcctt aacgtatcgg 660

ctacagacct ccaggacgaa gtgaagccgt catgtcccct gcagccggag caaatgtcat 720

ttatttcttt catgaggaac ttaagattcc cgatccagtt ctctatggaa cgagagccac 780

ggaaagagag gacgatcaat ttgttcgtgt tgtcgagagc aaggaagccg gtgacatcgc 840

ccactccaga gctgcacttc ccggtcagtc tgctatttcc acggcgagtg cctgcactta 900

tgtcgacact tacccttcaa acgagtagag aaacgttgca tccgccttct ctacctcggg 960

gcaggcattt cccgtgcacg taatgtttgt accagctggg gcatcattgt tttttccgca 1020

gtatgcggct gcagaatact gtgcaaagag attgaactgg ttaaacagat cctgcgagac 1080

ctctgtatgt gcagtcttag tacagcaggt cgaaaggcaa tgcatgagag tattgcgtgg 1140

ccacatacct cgacgaatag gactggccaa ggccgtccac gcagagacaa agaacagcac 1200

aagggagctc ctcatatcgt cgct 1224

<210> 2

<211> 291

<212> PRT

<213> 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)

<400> 2

Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu

1 5 10 15

Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

20 25 30

Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn

35 40 45

Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro

50 55 60

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Gly Ser

65 70 75 80

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys

85 90 95

Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile

100 105 110

Gly Asn Leu Lys Phe Leu Met Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly

115 120 125

Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp

130 135 140

Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

145 150 155 160

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

165 170 175

Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser

180 185 190

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

195 200 205

Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

210 215 220

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp

245 250 255

Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Arg Pro

260 265 270

Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

275 280 285

Thr Cys Leu

290

Claims

1.一种里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的里氏木霉工程菌株携带有用于重组表达脂肪酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述的脂肪酶的编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种里氏木霉突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株的保藏编号为CCTCCNO: M2018880。

4.权利要求1所述的里氏木霉工程菌株在生产脂肪酶中的应用。

5.权利要求3所述的里氏木霉突变菌株在生产脂肪酶中的应用。

6.一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或3所述的菌株发酵生产脂肪酶。