CN1641020A

CN1641020A - 一种碱性α－淀粉酶及其编码基因与生产方法

Info

Publication number: CN1641020A
Application number: CN 200410001061
Authority: CN
Inventors: 马延和; 吴襟; 薛燕芬
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2004-01-18
Filing date: 2004-01-18
Publication date: 2005-07-20
Anticipated expiration: 2024-01-18
Also published as: CN1313608C

Abstract

本发明公开了一种碱性α－淀粉酶及其编码基因与生产方法。本发明所提供的碱性α－淀粉酶，是与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％的同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质。该碱性α－淀粉酶的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明可广泛用于制备洗碗和厨房用具的洗涤剂组合物以及洗衣的洗涤剂组合物中的添加剂，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种碱性α-淀粉酶及其编码基因与生产方法

技术领域

本发明涉及酶基因工程和酶工程领域中一种α-淀粉酶及其编码基因与生产方法，特别涉及一种碱性α-淀粉酶及其编码基因与生产方法。

背景技术

α-淀粉酶，也称液化型淀粉酶，能使淀粉不规则地水解。它存在于动物的唾液、胰脏及植物的麦芽中。此外，霉菌和细菌也产生此酶。

长期以来α-淀粉酶一直被用于多个领域。例如，在发酵业中它一直被用于谷物和马铃薯的糖化，在纺织业中用作淀粉糊去除剂，在制药业中用作助消化药，而在食品业中用于制造粘稠的麦芽糖浆。α-淀粉酶是一种作用于淀粉相关多糖如直链淀粉和支链淀粉，单一地水解多糖分子中α-1，4-糖苷键的内切酶。自从1833年Payen和Persoz首次发现这种酶开始，已经从包括细菌、真菌、植物种子和动物消化腺等多种不同来源中获得了α-淀粉酶的晶体样品或电泳纯的样品。

研究发现当将α-淀粉酶和支链淀粉酶都渗入洗碗剂和衣物洗涤剂中时，洗碗剂和衣物洗涤剂的效能可被改善，特别是对淀粉污渍的去除能力会得到大大提高(日本专利申请公开(kokai)2-132192号)。然而目前在自然界中发现的大部分α-淀粉酶在中性到酸性pH范围内表现出最大且稳定的酶切活性，但在pH 9-10的碱性溶液中却很少发挥作用。已知只有少数的碱性α淀粉酶在碱性的pH范围内表现最大的活性。碱性α-淀粉酶是指酶最适工作pH高于8的α-淀粉酶，这些碱性α-淀粉酶包括由芽孢杆菌A-40-2产生的一种酶[Horikoshi，K.等，(Agric.Biol.Chem.)，35，1783(1971)]，由芽孢杆菌NRRL B-3881产生的一种酶[Boyer，E.等，(J.Bacteriol.)，110，992(1972)]，由链霉菌KSM-9产生的一种酶(日本专利申请公开(kokai)61-209528号)，由芽孢杆菌H-167产生的一种酶(日本专利申请公开(kokai)62-208278号)，由嗜热碱性芽孢杆菌A3-8产生的一种酶(日本专利申请公开(kokai)2-49584号)以及由嗜盐碱球菌AH-36产生的一种酶(日本专利申请公开(kokai)4-211369)。

上述碱性α-淀粉酶大部分是将淀粉或淀粉相关糖分解为葡萄糖、麦芽糖或麦芽三糖的所谓的糖化α-淀粉酶。虽它们能被有效地用于制糖业中，但如果将它们用作洗涤剂的酶却会产生问题。因此，仍然需要寻找对用于洗涤剂中的表面活化剂具有抗性并以一种高度随机的方式分解淀粉或淀粉相关多糖的所谓的液化型碱性α-淀粉酶。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种碱性α-淀粉酶及其编码基因。

一种碱性α-淀粉酶，来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10，它是与SEQID №：2的氨基酸序列具有至少80％的同源性，优选为具有至少90％的同源性，且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质；较优选为序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID№：2衍生的蛋白质；最优选为序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10，已于2003年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1081。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081自盐湖土壤中分离得到。其菌落粗糙，不透明、不闪光，为污白色；细胞为椭圆至杆状，有芽孢，革兰氏阳性菌；生长pH值范围是8.0-11.0，最适10.0；温度范围20-40℃，最适30℃；好氧，水解淀粉。

序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列是由520个氨基酸残基组成的蛋白质。

一种碱性α-淀粉酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列，其中，优选为与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID №：1的DNA序列由1563个碱基组成，该基因的开放阅读框架(ORF)为自5’端第1到第1563位碱基。

含有碱性α-淀粉酶的编码基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。

所述细胞系可为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有上述碱性α-淀粉酶的编码基因的工程菌。

所述工程菌的出发菌株可为大肠杆菌或芽孢杆菌，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌K-12的EK系统成员，如DH5α、HB101、BL21和JM109，最优选为大肠杆菌DH5α；所述芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌的BS系统成员，如BD170、MI112和ISW1214。

可将上述碱性α-淀粉酶的编码基因导入包括适用于EK系统的pET3a、pBR322、pBv220、pUC18和pUC19，以及适用于BS系统的pUB110和pHY300PLK等载体内，得到碱性α-淀粉酶的编码基因的表达载体，如将上述碱性α-淀粉酶的编码基因导入pET3a得到的表达载体pAML10(物理图谱如图3所示)。

扩增本发明的碱性α-淀粉酶编码基因的任一片段的引物属于本发明的保护范围。

本发明的碱性α-淀粉酶基因可用作从其它微生物中分离与其同源的核苷酸序列的探针。

本发明的另一个目的是提供一种制备碱性α-淀粉酶的方法。

本发明所提供的制备碱性α-淀粉酶的方法，是通过培养芽孢杆菌(Bacillussp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有上述的碱性α-淀粉酶的编码基因的工程菌获得碱性α-淀粉酶。

所述工程菌可为含有本发明的碱性α-淀粉酶的编码基因的大肠杆菌或芽孢杆菌，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌K-12的EK系统成员，如DH5α、HB101、BL21和JM109，最优选为大肠杆菌BL21；所述芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌的BS系统成员，如BD170、MI112和ISW1214。将碱性α-淀粉酶的编码基因导入上述大肠杆菌和芽孢杆菌的载体可为包括适用于EK系统pET3a、pBR322、pBV220、pUC18和pUC19，以及适用于BS系统的pUB110和pHY300PLK等载体。

可利用常规方法将含有本发明的碱性α-淀粉酶编码基因的重组DNA分子转化宿主，例如可用氯化钙法(Mandel，M.和Higa，A.，《分子生物学杂志》，53，159(1970))转化EK系统宿主，可用原生质体法(Chang，C.和Cohen，S.N.，Mol.Gen.Genet.)，168，111(1978))转化BS系统宿主。可通过载体本身的筛选标记进行重组子微生物(工程菌)的初步筛选，再利用水解淀粉的性质最终确定工程菌，例如，在利用EK系统的pBR322作载体并利用HindIII酶切本发明的碱性α-淀粉酶编码基因将其插入pBR322的HindIII酶切位点时，四环素抗性基因失活，可以通过Amp^rTet^s来初步筛选转化子。然后将所筛选的转化子利用影印等方法转移至含有淀粉的琼脂平板上，然后进行培养形成菌落，靶重组子微生物在集落周围分解淀粉，所以可利用含碘溶液对含有淀粉的琼脂平板进行淀粉染色以确定工程菌。

生产本发明的碱性α-淀粉酶的培养基，可采用包括碳源、氮源和无机盐在内的通常用于培养细菌的培养基；培养条件也应该是培养工程菌的出发菌的条件，即只要是适合于产生本发明的碱性α-淀粉酶即可，通常情况下，培养温度为20-40℃，pH为5-8，培养时间为3-24小时，其中优选的条件是培养温度为30-37℃，pH为6-7.5，培养时间5-10小时。

可通过改善芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或工程菌的培养方法或通过基因工程方法改造本发明的碱性α-淀粉酶基因来提高碱性α-淀粉酶的产量，以适应工业化规模生产的需要。

本发明的碱性α-淀粉酶在碱性条件下具有良好的活性和稳定性，最适作用pH为9.0-10.5，可广泛用于制备洗碗和厨房用具的洗涤剂组合物以及洗衣的洗涤剂组合物中的添加剂，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081产生的碱性α-淀粉酶的最适反应pH曲线

图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081产生的碱性α-淀粉酶的pH稳定性曲线

图3为pAML10的物理构建图谱

具体实施方式

实施例中的浓度都是以(W/V)的％为基础。

实施例1、碱性α-淀粉酶编码基因的获得

1)将产生碱性液化α-淀粉酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081接种在5ml培养基A(表1)中并在30℃进行振荡培养24小时。将1ml培养物接种于100ml同样的培养基中，然后在30℃再次振荡培养48小时。随后通过离心收集细胞并按照Saito和Miura推荐的方法(Saito，H.和Miura，K.，Biochem.Biophys.Acta，1963，72，619)获得大约1mg的染色体DNA。用Sau3AI部分酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收10kb以下DNA片段，和BamHI酶切的并脱磷的pUC18质粒连接，转化E.coli DH5α，在含Amp的LB琼脂平板上进行克隆质粒的初步挑选和分离，获得阳性克隆250株。

表1培养基A的组成

可溶性淀粉 1.0％

胰蛋白胨 1.5％

大豆蛋白胨 0.5％

酵母提取物 0.5％

NaCl 0.5％

Na₂CO₃ 1.0％(单独灭菌)

2)已知淀粉酶家族的许多成员具有氨基酸序列高度保守的I-IV区(Nakajima，R.等，(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，23，355(1986))。因而，根据在已知的碱性液化α-淀粉酶的I到IV区中非常保守的II区和IV区的氨基酸序列合成与II区和IV区相应的引物1(5-GACCT CGTTGTGAAT-3)和引物2(5-CCTTCAG GTGTTTGA-3)。利用所合成的引物和芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081的染色体DNA(用作模板)按照如下条件进行PCR扩增：1个循环＝94℃×1min+50℃×1min

+72℃×1min，然后按同样条件再进行30个循环。获得了一个大约0.3kb的基因片段A，并测定了该片段的核苷酸序列。结果，发现该片段编码一种与已知淀粉酶的从II区延伸到IV区的氨基酸序列同源性为91％的氨基酸序列。

3)利用片段A作为一个探针，对步骤1)中用含Amp的LB琼脂平板分离获得的阳性克隆菌株进行原位杂交的粗步筛选，获得1个淀粉酶弱阳性菌株，划平板进一步确定后，进行单独培养，提取质粒，用BamHI进行酶切鉴定，确定含有一个4.0kb插入基因片断。对该4.0kb插入基因片断进行核苷酸序列测定，结果表明有一个表达含有26个氨基酸组成的信号肽序列(序列表中序列2的第1到第26位)的520个氨基酸的1563bp(ORF)的淀粉酶结构基因(序列表中序列1)的存在。4)利用定位于信号肽序列上游的引物A(5-GCGCCATATGAAAGGGAAAAAATGGAC-3)，定位于终止密码下游处的引物B(5-GCGCGCGGATCCTTATTTTATCAAAACCGATG-3)并以芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081的染色体DNA作为模板，按照常规方法进行PCR扩增得到引物间的大约1.6kb的片段。将所获的扩增片段插入pET3a的NdeI和BamHI位点，然后导入大肠杆菌BL21。转化子可以在含有0.4％淀粉天青，50ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长。分离在周围形成透明晕环菌落作为生产碱性α-淀粉酶的大肠杆菌菌株。利用制备质粒DNA的标准程序(Maniatis T.等，(Molecular Cloning)，冷泉港实验室，纽约(1982))，从该转化子中提取重组质粒，并制备质粒的限制性酶切图谱。在图谱中，证实含有一个大约1.6kb的DNA片段，该重组质粒被定名为质粒pAML10(物理图谱如图3所示)，其大小为6.2kb。

实施例2、碱性α-淀粉酶的生产

1、培养工程菌生产碱性α-淀粉酶

将在实施例1的步骤(4)中获得的重组大肠杆菌菌株BL21(pAML10)于2ml含有50ug/ml氨苄青霉素LB液体培养基中振荡培养12小时后，将该2ml培养物接种于50ml LB培养基(含有50ug/ml氨苄青霉素)中，然后在37℃振荡培养24小时。离心分离收集细胞，悬于Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，并通过超声处理破碎细胞。细胞被超声处理后，通过离心分离清除细胞碎片，收集上清液得到无细胞提取物。以相同方法制备的BL21(含有pET3a空载体)菌株的无细胞提取物作为对照。首先通过在一含有50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10)和可溶性淀粉的反应混合物中于30℃反应15分钟，然后通过利用3，5-二硝基水杨酸方法定量测定所产生的还原糖来检测这些提取物中的α-淀粉酶活性。将1个单位的酶活性定义为每分钟产生等价于1μmol葡萄糖的还原糖的蛋白质的量。

①最适酶活温度

标准反应条件下，在给定的温度条件下测定酶活性，表明该酶最适温度为50℃。

②最适pH

在标准反应条件下(25℃)，在表2中的50mmoL/L不同缓冲液的条件下测定酶活性，结果表明菌株DH5α(pAML10)的无细胞提取物中α-淀粉酶的的最适工作pH在10.5左右，与芽孢杆菌CS-10产生的α-淀粉酶的最适pH非常一致。

③pH稳定性

将酶液与pH4.0-12.0的缓冲液混合，25℃放置30min，测定酶活力，结果表明酶活在pH5-11.5的范围内比较稳定。

用SDS-PAGE测得的该碱性α-淀粉酶的分子量为60000道尔顿，与理论上推算的分子量59000道尔顿相似。

表2.碱性α-淀粉酶的酶活性测定中所用的缓冲液

pH3.5-5.5：醋酸盐缓冲液

pH5.5-8.5：Tris-HCl缓液

pH8.5-10.5：Gly-NaOH缓冲液

pH10.5-12.0：Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液

2、培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081生产碱性α-淀粉酶

将产生碱性液化α-淀粉酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081接种在5ml培养基A(表1)中并在30℃进行振荡培养24小时。将1ml培养物接种于100ml同样的培养基中，然后在30℃再次振荡培养48小时，收集发酵液，发酵液6000r/m离心10min去菌体，所得上清液为含有α-淀粉酶的酶液。采用步骤1中(2)相同的方法测定芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081产生的碱性α-淀粉酶的特性，结果表明所产生的碱性α-淀粉酶最适酶活温度为50℃；最适工作pH为10.5(图1)，其酶活在pH5-11.5范围内稳定。用SDS-PAGE测得的该碱性α-淀粉酶的分子量为60000道尔顿。对从芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081培养物中纯化的碱性α-淀粉酶进行氨基酸测序表明，其氨基末端侧的10个氨基酸残基序列与由碱性α-淀粉酶编码基因的核苷酸序列所推导的第27个氨基酸延伸的序列(序列2中的自氨基端的27-36氨基酸)一致。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1563

<212>DNA

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>1

atgaaaggga aaaaatggac agctttagct ctaacactgc cgctggctgc tagcttatca 60

acaggcgttc acgcggaaac cgtacataaa ggtaaatctc cagctgcaga taaaaacggt 120

gtattttatg aggtgtatgt aaactctttt tacgatgcaa ataaagatgg acatggtgat 180

ttaaaaggtc ttacacaaaa gctggactat ttaaatgatg gcaattctca tacaaagaat 240

gatcttcaag taaacgggat ttggatgatg ccggtcaacc cttctcctag ctatcataaa 300

tatgatgtaa cggactatta taacattgat cctcagtatg gaaatctgca agattttcgc 360

aaactaatga aagaagcaga taaacgagat gtaaaagtta ttatggacct cgttgtgaat 420

catacgagca gtgaacaccc ttggtttcaa gctgcgttaa aagataaaaa cagcaagtac 480

agagattact atatttgggc tgataaagat accgacttga atgaaaaagg atcttggggg 540

cagcaagtat ggcataaagc tccaaacgga gagtattttt atggaacgtt ctgggaagga 600

atgcctgact taaattacga taaccctgaa gtaagaaaag aaatgattaa cgtcggaaag 660

ttttggctaa agcaaggcgt tgacggcttc cgcttagatg ctgccctcca tatctttaaa 720

ggtcaaacac ctgaaggcgc taagaaaaat ctcctgtggt ggaatgagtt tagagatgca 780

atgaaaaaag aaaaccctaa cgtatatcta acgggtgaag tatgggatca gccggaagta 840

gtagctcctt attatcagtc gcttgattcc ctatttaact ttgatttagc aggaaaaatt 900

gtcagctctg taaaagcagg aaatgatcaa ggaatcgcta ctgcagctgc ggcaacagat 960

gaactgttca aatcatacaa tccaaataaa attgacggca ttttcttaac caatcatgac 1020

caaaatcgcg tcatgagtga gttaagcgga gatgtcaata aagcaaagtc agctgcctct 1080

atcttactta cgcttcctgg aaatccgtat atttattacg gtgaagaaat cggcatgacc 1140

ggtgaaaagc ctgatgaatt aatccgtgaa ccgttccgct ggtacgaagg aaacggactt 1200

ggacaaacta gttgggaaac acctgtatac aataaaggcg gcaacggcgt gtctgtagaa 1260

gcacaaacca aacaaaagga ctctttgtta aatcattatc gtgaaatgat tcgcgtgcgt 1320

cagcagcacg aagagttagt aaaaggaacg cttcaatcta tttcagtaga cagtaaagaa 1380

gttgttgctt atagccgtac gtataaaggc aactccatta gtgtgtatca taatatttca 1440

aatcaacctg taaaagtatc tgtagcagcg aaaggtaaat tgatttttgc tagtgaaaaa 1500

ggtgctaaga aagtcaagaa tcagcttgta attccggcga atacatcggt tttgataaaa 1560

taa 1563

<210>2

<211>520

<212>PRT

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>2

Met Lys Gly Lys Lys Trp Thr Ala Leu Ala Leu Thr Leu Pro Leu Ala

1 5 10 15

Ala Ser Leu Ser Thr Gly Val His Ala Glu Thr Val His Lys Gly Lys

20 25 30

Ser Pro Ala Ala Asp Lys Asn Gly Val Phe Tyr Glu Val Tyr Val Asn

35 40 45

Ser Phe Tyr Asp Ala Asn Lys Asp Gly His Gly Asp Leu Lys Gly Leu

50 55 60

Thr Gln Lys Leu Asp Tyr Leu Asn Asp Gly Asn Ser His Thr Lys Asn

65 70 75 80

Asp Leu Gln Val Asn Gly Ile Trp Met Met Pro Val Asn Pro Ser Pro

85 90 95

Ser Tyr His Lys Tyr Asp Val Thr Asp Tyr Tyr Asn Ile Asp Pro Gln

100 105 110

Tyr Gly Asn Leu Gln Asp Phe Arg Lys Leu Met Lys Glu Ala Asp Lys

115 120 125

Arg Asp Val Lys Val Ile Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Ser

130 135 140

Glu His Pro Trp Phe Gln Ala Ala Leu Lys Asp Lys Asn Ser Lys Tyr

145 150 155 160

Arg Asp Tyr Tyr Ile Trp Ala Asp Lys Asp Thr Asp Leu Asn Glu Lys

165 170 175

Gly Ser Trp Gly Gln Gln Val Trp His Lys Ala Pro Asn Gly Glu Tyr

180 185 190

Phe Tyr Gly Thr Phe Trp Glu Gly Met Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn

195 200 205

Pro Glu Val Arg Lys Glu Met Ile Asn Val Gly Lys Phe Trp Leu Lys

210 215 220

Gln Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ala Leu His Ile Phe Lys

225 230 235 240

Gly Gln Thr Pro Glu Gly Ala Lys Lys Asn Leu Leu Trp Trp Asn Glu

245 250 255

Phe Arg Asp Ala Met Lys Lys Glu Asn Pro Asn Val Tyr Leu Thr Gly

260 265 270

Glu Val Trp Asp Gln Pro Glu Val Val Ala Pro Tyr Tyr Gln Ser Leu

275 280 285

Asp Ser Leu Phe Asn Phe Asp Leu Ala Gly Lys Ile Val Ser Ser Val

290 295 300

Lys Ala Gly Asn Asp Gln Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Asp

305 310 315 320

Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Asn Pro Asn Lys Ile Asp Gly Ile Phe Leu

325 330 335

Thr Asn His Asp Gln Asn Arg Val Met Ser Glu Leu Ser Gly Asp Val

340 345 350

Asn Lys Ala Lys Ser Ala Ala Ser Ile Leu Leu Thr Leu Pro Gly Asn

355 360 365

Pro Tyr Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr Gly Glu Lys Pro

370 375 380

Asp Glu Leu Ile Arg Glu Pro Phe Arg Trp Tyr Glu Gly Asn Gly Leu

385 390 395 400

Gly Gln Thr Ser Trp Glu Thr Pro Val Tyr Asn Lys Gly Gly Asn Gly

405 410 415

Val Ser Val Glu Ala Gln Thr Lys Gln Lys Asp Ser Leu Leu Asn His

420 425 430

Tyr Arg Glu Met Ile Arg Val Arg Gln Gln His Glu Glu Leu Val Lys

435 440 445

Gly Thr Leu Gln Ser Ile Ser Val Asp Ser Lys Glu Val Val Ala Tyr

450 455 460

Ser Arg Thr Tyr Lys Gly Asn Ser Ile Ser Val Tyr His Asn Ile Ser

465 470 475 480

Asn Gln Pro Val Lys Val Ser Val Ala Ala Lys Gly Lys Leu Ile Phe

485 490 495

Ala Ser Glu Lys Gly Ala Lys Lys Val Lys Asn Gln Leu Val Ile Pro

500 505 510

Ala Asn Thr Ser Val Leu Ile Lys

515 520

Claims

1、一种碱性α-淀粉酶，是与序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列具有至少80％的同源性且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质，或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

2、一种碱性α-淀粉酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3、含有权利要求2所述的基因的表达载体和细胞系。

4、根据权利要求3所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述表达载体为重组质粒pAML10。

5、根据权利要求3或4所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述细胞系为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有碱性α-淀粉酶的编码基因的工程菌。

6、根据权利要求5所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述工程菌的出发菌为大肠杆菌或芽孢杆菌。

7、根据权利要求6所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌K-12的EK系统成员，其中优选的为大肠杆菌DH5α、HB101、BL21和JM109。

8、根据权利要求6所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌的BS系统成员，其中优选的为枯草芽孢杆菌BD170、MI112和ISW1214。

9、一种制备碱性α-淀粉酶的编码基因的方法，是通过培养(Bacillus sp.)BG-CS10 CGMCC №1081或含有碱性α-淀粉酶的编码基因的编码基因的工程菌获得碱性α-淀粉酶。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述工程菌为含有碱性α-淀粉酶的编码基因的的大肠杆菌或芽孢杆菌。