CN1128799A - 高热稳定性β-半乳糖苷酶基因 - Google Patents

高热稳定性β-半乳糖苷酶基因 Download PDF

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Abstract

一种源自Pyrococcus furiosus的分离的耐SDS高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。其实例包括分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的基因和可与示于SEQ ID NO：1中的上述基因杂交的基因。一种克隆高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的方法，其中用上述一种基因或其部分作为探针或引物。一种通过培养已转入了含上述一种基因的质粒的转化子来生产高热稳定性β-半乳糖苷酶的方法。

Description

高热稳定性β—半乳糖苷酶基因
本发明涉及一种耐SDS的高热稳定性β—半乳糖苷酶的编码基因，用此基因或其部分克隆半乳糖苷酶基因的方法，及生产用于例如食品工业和制糖业的这种酶的基因工程方法。
已在动物、植物和微生物中发现了β—半乳糖苷酶，它是一种能够分解β—半乳糖苷的酶。已知该酶特别存在于细菌如大肠杆菌、乳链球菌枯草杆菌、嗜热链球菌和Solfataricus硫化叶菌中。利用其水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖的能力。这种β—半乳糖苷酶用于生产低乳糖奶。它还用于从在奶酪的生产工艺中形成的大量奶清中所含乳糖生产半乳糖或葡萄糖。
因此，为了将β—半乳糖苷酶应用于食品加工，要求开发一种能经受高温使用的酶，高温一方面是为了防止在加工过程的微生物污染，另一方面是为了提高作为底物的乳糖的溶解度。
另外，近年来利用β—半乳糖苷酶糖基转移反应进行各种糖化合物的生产(日本专利公开NO.25275/1994和14774/1994)。因此，需要开发高热稳定性的酶。
例如源自Sulfolobus Solfataricus的β—半乳糖苷酶[EuropeanJournal of Biochemistry，187，321—328(1990)]是一种耐热酶，其在90℃时有活性。但在85℃处理180分钟后，其活性减至约50％。
在例如European Journal of Biochemistry，213，305—312(1993)中描述了产自高嗜热细菌Pyrococcus furiosus的β—半乳糖苷酶在高温下有活性，从而保证了高热稳定性。本发明者发现了一种高热稳定性β—半乳糖苷酶，在90℃处理120分钟后，其残余活性比为约80％，并成功地分离了三类β—半乳糖苷酶(欧洲专利会开NO.0592158 A2)。
这三类β—半乳糖苷酶都是高热稳定性的，其中一类β—半乳糖苷酶极其稳定，甚至在1％十二烷基硫酸钠(SDS)存在下显示活性。
如上所述，在高温下进行的食品加工和糖化合物生产中要求耐热和热稳定性酶。另外，如果甚至在强表面活性剂SDS存在下酶具有活性，其应用范围就更广。
本发明的目的是分离具有改进的耐热性，良好的热稳定性和耐受表面活性剂的β—半乳糖苷酶的编码基因，及用上述基因生产高热稳定性β—半乳糖苷酶的工业方法。
概括起来讲，本发明的第一方面涉及源自Pyrococcus furiosus的分离的耐SDS高热稳定性β—半乳糖苷酶基因。本发明的第二方面涉及根据本发明第一方面的基因，它编码具有如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或其部分并具有高热稳定性β—半乳糖苷酶活性的片段。本发明的第三方面涉及根据本发明第一方面的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本发明的第四方面涉及一种耐SDS的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，它能与根据本发明第二方面的基因杂交。本发明的第五方面涉及一种克隆高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的方法，它包括根据本发明第1—4方面之一的基因或其部分用作探针或引物。本发明的第六方面涉及高热稳定性β—半乳糖苷酶的生产方法，它包括培养转化子，该转化子中已导入了含有根据本发明第一方面的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的重组质粒，然后从培养物中收获高热稳定性β—半乳糖苷酶。
含本发明中的编码高耐热β—半乳糖苷酶的分离DNA的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，可通过使用粘性质粒载体的表达克隆方法筛选得到。表达克隆是一种可被用于在无靶酶一级结构的任何信息的情况下克隆某些酶的编码基因的方法。例如，用表达克隆方法克隆了Pyrococcus Woesei的支链淀粉酶基因(WO 92/02614)。但该方法不能应用于所有类型的酶，因为在质粒载体用于该方法时，需要非常适当的限制酶；它必须将靶基因切得足够小以插入质粒载体中，而又不在靶基因的内部切割。另外，因为需要几次克隆，这种方法很复杂。
因此，本发明者试图通过用Pyrococcus furiosus基因组DNA构建的粘性质粒文库中筛选β—半乳糖苷酶活性，来分离β—半乳糖苷酶基因，该粘性质粒载体中插入的DNA片断(35—50kbp)要比质粒载体中的大。通过使用粘性质粒载体，用限制酶切在编码酶的靶基因内部的危险性降低，并且需测试的克隆数减少。相反，产生了检测不到酶活性的危险，这是因为粘性质粒载体在宿主生物中的考贝数比质粒载体的少，因而酶的表达水平低。
本发明者的目标是热稳定性极高的靶酶，并使制备仅含热稳定蛋白的溶胞产物的方法和个别培养粘性质粒文库中的转化子的方法结合起来。将这组溶胞产物称为“粘性质粒蛋白文库”。使用该文库检测酶活性，比使用转化子的菌落检测敏感性提高，可消除如宿主蛋白或酶活性抑制的本底不良影响。
本发明者研究了源自Pyrococcus furiosus的粘性质粒蛋白文库，并得到一个在1％SDS存在下具有β—半乳糖苷酶活性(尽管弱)的粘性质粒克隆。
更进一步，本发明者充分利用各种基因工程技术从插入上述分离的克隆中的DNA片断中分离了编码高热稳定性β—半乳糖苷酶的基因，并测定了该基因的DNA序列。另外，本发明者还用该基因成功地表达了高热稳定性β—半乳糖苷酶，这样完成了本发明。
顺便讲，这里描述的使用粘性质粒载体的表达克隆方法不能应用于所有热稳定性酶，结果由靶酶的性质决定。例如，本发明者试图分离Pyrococcus furiosus的编码α—葡糖苷酶的基因[Journal ofBacteriology，172，3654—3660(1990)]，但没有分离到该基因。
现在对本发明进行更详细的描述。
对用于本发明的微生物没有特别限制，只要它能产生高热稳定性β—半乳糖苷酶基因。例如，属于Pyrococcus属的菌株，即高热稳定性细菌，如Pyrococcus furiocus DSM3638和Pyrococcus woesei DSM3773适用于此，这两种菌株都可从Deutsche Sammalung vor Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH得到。
例如，可按下述方式制备Pyrococcus furiosus基因的粘性质粒文库。首先，Pyrococcus furiosus DSM 3638的基因组基因用适当的限制酶如Sau 3AI(由Takara Shuzo公司生产)部分消化。按35—50Kbp的大小分离后，所得每个DNA片断与适当的粘性质粒载体如TripleHelix粘性质粒载体(由Stratagene生产)连结。通过体外包装方法先将Pyrococcus furiosus基因组DNA片段包装在λ-噬菌体颗粒中，然后用所得噬菌体溶液转化适当的大肠杆菌株如大肠杆菌DH5αMCR(由BRL生产)，从而得到目标粘性质粒文库。然后从转化子的几个菌落制备了粘性质粒DNA，这样证实了35—50Kbp的基因组DNA片段在转化子中的插入。一般地讲，可培养300—700个菌落。
每个菌落培养后，收集培养后的细胞。通过在100℃处理10分钟、超声、及在100℃再处理10分钟，将这些细胞加工成粘性质粒蛋白文库。然后在1％SDS存在下测定所得溶胞产物中的β—半乳糖苷酶活性，从而筛选到了在上述处理后还保持稳定的高热稳定性β—半乳糖苷酶的表达菌落。例如用邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷或乳糖(均由Nacalai Tesque制造)作为底物在如95℃的反应温度下测定β—半乳糖苷酶活性。然后，分析显示活性的转化子的插入粘性质粒DNA中的片段。
由本发明者制备的500个转化子中一个转化子显示活性，插入其粘性质粒DNA中的片断用各种限制性酶裂解，将形成的片断插入适当的载体中。例如，从上述粘性质粒克隆制得的粘性质粒DNA用Hind III(由Takara Shuzo公司生产)消化，将所得DNA片断插入质粒载体pUC18(由Takara Shuzo公司生产)的Hind III位点。这样可得到重组质粒。
然后，将此重组质粒导入大肠杆菌JM 109(由Takara Shuzo公司生产)中，从而得到转化子，培养并收获转化子。检测β—半乳糖苷酶(细胞内表达蛋白)的活性。对细胞及在100℃进行热处理10分钟两次所得溶胞产物进行检测，用邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷作为底物在1％SDS存在下进行。在95℃下反应进行30分钟，来测定活性。
发现上述转化子的溶胞产物无活性。然后，用限制酶AccI、BglII、Eco RV、PstI和Hinc II(均由Takara Shuzo公司生产)中的每一种以相同方法进行活性研究，但没发现活性。
使用能够产生比使用上述限制酶更长的DNA片段的限制酶进行相同的研究，例如Cla I(由Takara shuzo公司生产)。但发现在向质粒插入阶段插入片段中有缺失，并发现无活性。后来用SmaI(由Takara Shzo公司生产)以相同方法进行研究。结果，在其中插入了约4Kbp的DNA片段的质粒中发现了活性。本发明者称此质粒为质粒pTG2S—112。用该质粒转化大肠杆菌JM 109，可得到本发明者称为大肠杆菌JM 109/pTG2S—112的转化子。培养该转化子，培养后收集细胞。在这些细胞中表达的β—半乳糖苷酶在1％SDS存在下100℃下10分钟处理两次，仍保持稳定。因此，其中已表达了靶酶高热稳定性β—半乳糖苷酶。
质粒pTG2S—112进一步用各种限制酶消化，将形成的片断插入适当载体中。将形成的重组质粒导入大肠杆菌JM109中，培养并收获所得转化子。检测β—半乳糖苷酶(细胞内表达蛋白)的活性。这样可找出表达高热稳定性β—半乳糖苷酶的质粒。
例如，质粒pTG2S—112用限制酶Eco 81I(由Takara Shuzo公司生产)和SmaI消化。纯化所形成的约2.0Kbp的Eco 81I—SmaI DNA断片，并插入pUC18中，从而得到重组质粒。
另外，利用pTG2S—112的载体(pUC18)区的多克隆位点，用限制酶Eco81I和KpnI(由Takara Shuzo公司生产)消化。纯化形成的约4.7Kbp的Eco 81I—KpnI DNA片断，将末端钝化并自身连结。这样可得到含上述Eco 81I—SmaI DNA片断的重组质粒。
将此质粒导入大肠杆菌JM109中，检测所形成菌落的高热稳定β—半乳糖苷酶活性。从显示活性的菌落制备了一质粒，该质粒称为质粒pTG2ES—105。因此质粒转化的大肠杆菌JM109称为大肠杆菌JM109/pTG2ES—105。该菌株已于1994年4月20日保藏在Nation-al Institute of Bioscience和Human—Technology Agency of IndustrialScience and Technology L(1—3，Higashi 1 Chome Tsukuba—shi Ibaraki—ken 305，JAPAN)，保藏号为FERM BP—5023，质粒pTG2ES—105的限制性酶切图谱示于图1中，其中粗实线代表插入质粒pUC18中的片断。
本申请的基因(DNA)可由第三者从已知的公开的商业上可得到的微生物菌株Pyrococcus furiosus和Pyrococcus woesei(请见1993年的DSM目录，特别是DSM3638和DSM3773)开始，并按照本申请说明书中所解释的步骤得到。因此，本发明的基因没有必要保藏。但为保全起见，申请人已于1995年6月7日将大肠杆菌JM109/pTG2ES—105保藏在中国典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC—M95030。
图2表示源自Pyrococcus furiosus并插入质粒pTG2ES—105中的DNA片断的限制性酶切图。即图2表示按照本发明所得高热稳定性β—半乳糖苷酶基因形式之一的限制性酶切图。通过培养称为大肠杆菌JM109/pTG2ES—105的转化子然后收集所得细胞，其中表达的β—半乳糖苷酶在1％SDS存在下100℃10分钟进行两次热处理后仍稳定。因此，其中已表达了靶酶高热稳定性β—半乳糖苷酶。
通过培养已导入了含高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的重组质粒的转化子，如大肠杆菌JM109/pTG2S—112或大肠杆菌JM109/pTG2ES—105，积累高热稳定性β—半乳糖苷酶。高热稳定性β—半乳糖苷酶从培养物中的纯化可这样进行，如超声破碎所收集细胞，离心溶胞产物，并将形成的上清液进行凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析等。
当在本发明中欲纯化高热稳定性β—半乳糖苷酶时，在超声处理之前或之后对细胞进行热处理有利，因为这样可使污染蛋白变性，从而可容易地进行纯化。
通过表达本发明的基因如整合在质粒pTG2ES—105中的基因，所得到的高热稳定性β—半乳糖苷酶具有如下理化性质。(1)作用：
它具有水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖的作用。另外，它具有水解邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷为邻硝基苯酚和半乳糖的作用。
更进一步，它在含1％SDS的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中具有水解邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷为邻硝基苯酚和半乳糖的作用。(2)测定酶活性的方法：[(2)—a]
在酶活性测定中，可通过分光光度法检测水解所形成的邻硝基苯酚来测定酶的邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷水解活性。即，将5μl本发明的酶溶液加到含112mM 2—巯基乙醇、1mM氯化镁和1％SDS的199μl100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。然后向其中加入含0.4M邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的1μl二甲基亚砜溶液。在95℃反应进行30分钟后，加入100μl0.1M碳酸钠终止反应，测定反应混合物在410nm处的吸光度，从而确定所形成的邻硝基苯酚的量。按照本发明所得高热稳定性β—半乳糖苷酶的一个单位表示在95℃1分钟内可使410nm处的吸光度增加1.0的酶量。本发明中所得酶在pH 7.0、95℃下，1％SDS存在下具有分解邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的活性。[(2)-b]
β—半乳糖苷酶的邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷水解活性还可按下述方法测定。将含1M邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的15μl二甲亚砜溶液加到分光光度计的石英小池中的含酶的1485μlMcIlvaine缓冲液(pH 5.0)中开始反应，使邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的终浓度达10mM。在分光光度计上监视410nm处的吸光度对时间的变化来检测反应。基于每分钟410nm处吸光度的变化，用前述测定的吸光系数计算每分钟所释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的量。
用蛋白检测试剂盒(由Bio—Rad Laboratories制造)进行酶蛋白检测。(3)热稳定性：
用与[(2)—b]中所述方法相符的下列步骤测定了热稳定性。将含酶的1.5ml McIlvaine缓冲液(pH5.0)在90℃加热一段给定时间，从中取出1485μl所形成的溶液的样品。将此样品在分光光度计小池中于90℃加热5分钟，向其中加入15μl含1M邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的二甲亚砜溶液，以开始反应。通过计算每分钟410nm处吸光度的变化并用上述所测邻硝基苯酚的消光系数确定每分钟所释放的邻硝基苯酚的量，以跟踪该反应。甚至在90℃热处理180分钟后，本发明酶的残余活性比为约100％，如图3所示。即图3显示酶的稳定性，纵轴表示残余活性比(％)，横轴表示酶在90℃下处理的时间。(4)最佳pH：
按照[(2)-b]中所述方法测定最佳pH。将测定了给定范围内pH值(pH4—8)的、含10mM邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的2990μl McIlvaine缓冲液，在小池中90℃下培养，向小池中加入10μl含酶(150单位/ml)的McIlvaine缓冲液(pH 5.0)开始反应。在分光光度计上监视410nm处吸光度对时间的变化来检测反应。测定每分钟410mm吸光度的变化，基于此变化用每一pH条件下测定的吸光系数计算出每分钟释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为一分钟内催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酚量。如图4所示，在pH4.5—5.5范围内，本发明的酶显示其最大活性。图4是显示酶的最佳pH的曲线，其中纵坐标为比活性(单位/mg蛋白)，横坐标表示pH值。(5)最佳温度：
按照[(2)-b]中所述方法测定最佳温度。将2990μl含10mM邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的McIlvaine缓冲液，在指定温度下(45℃—90℃)在小池中培养，加入10μl酶(150单位/ml)开始反应。在分光光度计上监视410nm处吸光度对时间的变化来检测反应。测定每分钟410mm吸光度的变化，基于此值，用在每一温度下测得的吸光系数计算出每分钟所释放的邻硝基苯酚。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酶量。如图5所示，本发明的酶在95℃以上显示其最大活性。图5为显示酶的最佳温度的图，其中纵座标为比活性(单位/mg蛋白)，横坐标为处理温度(℃)。(6)pH稳定性
按[(2)-b]中所述方法测定pH稳定性。将含150单位/ml酶的McIlvaine缓冲液(pH 3.0—8.0)和含150单位/ml酶的甘氨酸缓冲液(pH 8.0—11.0)在90℃孵育10分钟。为起动反应，向含10mM邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷并在90℃预培养的2990μl McIl-vaine缓冲液(pH5.0)中，加入10μl酶溶液。
在分光光度计上监视410nm处吸光度的变化来检测反应。测定410nm处吸光度每分钟内的变化，基于此值，用前述测定的吸光系数计算出每分钟所释放的邻硝基酚。一单位酶活性定义为每分钟内释放1μmol邻硝基苯酚所要求的酶量。如图6所示，本发明的酶甚至在pH范围5.0—10.0范围内90℃下处理10分钟后仍保持其活性。图6为显示酶的pH稳定性的图，其中纵座标为残余活性比(％)，横座标为处理pH。(7)各种表面活性剂的影响：
与[(2)-b]中所述方法相符，按下述步骤测定了各种表面活性剂存在下酶的热稳定性，十二烷基硫酸钠[由Nacalai Tesue生产]用作阴离子表面活性剂，溴化十六烷基三甲基铵(Nacalai Tesque生产)用作阳离子表面活性剂，聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯(由Wako Pure Chemical Industries Ltd生产)作为非离子表面活性剂，胆酸钠(由Nacalai Tesque生产)用作两性表面活性剂。
将反应溶液中上述表面活性剂的浓度调至1％。将1.5ml含酶的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)在90℃加热一定时间，从中取出1485ml形成的溶液作为样品。样品在分光光度计小池中90℃下加热5分钟，向其中加入15μl含1M邻硝基苯基—β—D—吡喃半孔糖苷的二甲亚砜溶液，开始反应。通过计算每分钟410nm吸光度的变化并从前述测得的邻硝基苯酚的消光系数确定每分钟所释放的邻硝基苯酚的量，以跟踪该反应。如图7所示，除溴化十六烷基三甲基铵外，在表面活性剂存在下于90℃热处理120分钟后，本发明的酶的残余活性比为约80％。特别是，在十二烷基硫酸钠(常用于使蛋白质变性)存在下，于90℃热处理120分钟后，本发明的酶的残余活性比为约90％。图7是显示在每一表面活性剂存在下酶的热稳定性的图，其中纵轴表示残余活性比(％)，横轴表示在90℃处理酶的时间。
图7中，空方块表示溴化十六烷基三甲基铵，实方块表示十二烷基硫酸钠，空圈表示聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯，实圈表示胆酸钠。(8)底物特异性：
底物特异性可以用表1中所示的对硝基苯酚衍生物测定。方法如下所示：
将1485μl含酶的150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)加入分光光度计的石英小池中。将15μl表1所示0.1M底物溶液加入酶溶液中并混合。在分光光度计上马上监视410nm处吸光度对时间的变化，检测反应。用不含酶的1485μl150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)作为空白对照，如上所述进行测定。检测时，反应在90℃下进行。一单位酶活性定义为每分钟催化释放1μl对硝基苯酚所需酶量。
按照上述方法，测定了对于对硝基苯基—β—D—吡喃葡糖苷(Glcp—βNp)、对硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷(GalpβNp)、对硝基苯基—β—D—吡喃甘露糖苷(ManpβNp)、对硝基苯基—β—D—吡喃木糖苷(XylpβNp)、对硝基苯基—β—D—吡喃果糖苷(FucpβNp)、对硝基苯基—α—D—吡喃半乳糖苷(GalpαNp)(均由Nacalai Tesque生产)的水解活性。
结果示于表1中。表1表示对上述底物的比活性(单位/mg蛋白)和相对活性性(％)。
              表1：酶的比活性
  底物             比活性           相对活性
                 (单位/mg)            (％)
GalpβNp            192               100
GlcpβNp            512               267
ManpβNp            12.8              6.7
XylpβNp            51.2              26.7
FucpβNp             0                 0
GalpαNp             0                 0
另外，用下列天然底物测试了酶的酶解活性。具体地讲，乳糖、纤维二糖和麦芽糖(均由Nacalai Tesque生产)的每一种作为底物溶解在1ml150mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)中，终浓度为50mM。将羧甲基纤维素(Wako Paro Chemical Industries，Ltd.)、微晶纤维素Avicel(由Funakoshi Pharmaceutical co；Ltd制造)和昆布多糖(由Nacalai Tesque生产)的每一种溶解在此缓冲液中，终浓度为17g/l。将上述每种底物溶液加热至90℃，向其中加入15μl(约45mu)的含酶磷酸盐缓冲液，在90℃进行反应30分钟。用冰冷却终止反应。用Glucose B Test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd生产)测定反应液中所释放的葡萄糖的量。表2显示当以乳糖水解活性作为100％时所测的其它底物的相对活性(％)。
                   表2：酶的府物特异性
   底物                              相对活性(％)
   乳糖                                  100
   纤维二糖                              136
   甲基—β—D—葡糖苷                   10.2
   水杨苷                                69.6
   熊果苷                                6.1
   蔗糖                                  1.9
   麦芽糖                                1.9
   羧甲基纤维素                          0
   微晶纤维素Avicel                      0
   昆布多糖                              1.3(9)氨基酸序列特征：对于质粒pTG2ES—105的β—半乳糖苷酶基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，用DNASIS的NBRF)PIR(由Hitachi Software Engi-neering制造)对氨基酸序列同源性进行研究。
将本发明酶和Pyrococcus furiosus产生的其它高热稳定性β—半乳糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与Sulfolobus Solfataricus中存在的两类热稳定性β—半乳糖苷酶的序列(SEQ ID NO：4和SEQID NO：5)进行了对比，令人惊异地是第一次清楚显示此两类热稳定性酶之间的某些同源序列保留在此高热稳定性酶中。图8和图9是示于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列与ESQ ID NO：3到SEQ IDNO：5的序列的对比图。如图8和图9中所示的十个不同的序列，本发明者均称之为“盒序列”(盒NO.1到盒NO.10)，为上述的保留序列。基于上述这些序列可以克隆其它高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，例如，使用从盒NO.7，8和10的氨基酸序列制备的引物或探针，其中氨基酸序列分别由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所定义。
图8和图9中的四排氨基酸序列，从上到下分别相当于SEQ IDNO：3(第一排)、SEQ ID NO：1(第二排)、SEQ ID NO：4(第三排)和SEQ ID NO：5(第四排)。
如上的详细说明，本发明提供编码高热稳定性β—半乳糖苷酶的基因，和用所述基因生产高热稳定性β—半乳糖苷酶的基因工程方法。该酶具有高热稳定性，并耐SDS，特别在高温下食品加工和制糖中有用。
另外，按照本发明分离的基因或其部分可用作筛选探针或引物。与本发明酶类似的所有酶的基因，将通过用所得基因作为探针在严格条件下进行杂交而得到，这些酶的序列与本发明的酶稍有不同，但预期具有相似的酶活性。此外所用术语“在严格条件下”指探针和其上固定了DNA的尼龙膜的杂交在含6×SSC(1×SSC为8.76g氯化钠和4.41g柠檬酸钠溶解在1升水中的溶液)、1％SDS、100μg/ml鲑鱼精子DNA和5×Denhardt′s(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和ficoll，均为0.1％)的溶液中，于65℃进行20小时。
其序列与本发明酶的序列稍有不同但预期具有相似酶活性的、与本发明酶相似的所有酶的基因，还可用以上所得基因作为引物进行扩增而得到。
另外，可用具有编码上述氨基酸序列—由热稳定性β—半乳糖苷酶和高热稳定性β—半乳糖苷酶共同保留的氨基酸序列—的核苷酸序列的寡聚物作为探针进行筛选。即，通过在具有如上所述的相同组成的杂交溶液中在低于Tm值5℃的温度下进行杂交，每个寡聚物在温度下与靶DNA形成互补链，可分别从嗜热和高嗜热细菌得到任何预期具有本发明酶相同的酶活性的与本发明酶类似的酶的热稳定性和高热稳定性基因。另一方面，可通过用上述寡聚物作为引物进行基因扩增来进行筛选。
可用下述方法确定上述筛选所得基团是否预期具有与本发明酶相同的酶活性的类似于本发明酶的酶。按常规步骤将所得基因连结在确保在适当宿主中表达的表达载体上，并导入宿主中，从而得到转化子。培养该转化子，用本文所述方法测定培养物或其无细胞提取物的β—半乳糖苷酶活性。这样，可确定该基因是否预期具有与本发明酶相同的酶活性的类似于本发明酶的酶的基因，本发明酶的酶活性指在SDS存在下90℃处理120分钟后，残余活性比为约90％。
经本发明的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的表达所得高热稳定性β—半乳糖苷酶，可通过在适当的生长培养基中培养Pyrococcus属的菌株如Pyrococcus furiosus DSM3638或Pyrococcus woesei DSM3773，并从细胞或培养液中纯化靶酶而得到。为了培养Pyrococcus属的细菌，可用通常用于培养高热稳定性细菌的方法。可向培养基中加入所用菌株可利用的任何营养物。例如，淀粉可用碳源，胰胨和蛋白胨可用作氮源。其它营养物，可使用醇母膏等。此培养基可含有金属盐如镁盐、钠盐或作为微量元素的铁盐。使用人工海水制备此培养基是有利的。此培养基优选为不含固体硫元素的透明培养基，因为这样的培养基易于通过测定培养物的光密度来监视细胞的生长。可进行静止培养或搅拌下培养。例如，可进行通气培养[WO 90/11352]或透析培养[Applied and Environmental Microbiology，55，2086—2088(1992)]。一般培养温度优选为95℃左右。通常在约16小时内培养物中集累相当大量的高热稳定性β—半乳糖苷酶。当然应根据所选菌株和培养基组成确定培养条件，以取得最大产率的高热稳定性β—半乳糖苷酶。
可通过例如离心或过滤从培养液中收集细胞、然后破碎细胞来收获本发明的高热稳定性β—半乳糖苷酶。可通过例如超声破碎、珠破碎或溶菌酶处理进行细胞破碎。使用这些技术，可从细胞中提取高热稳定性β—半乳糖苷酶。根据所选用的细菌，使用能够产生最好的提取效果的方法提取此酶，这样得到了粗酶溶液。结合纯化酶的通用技术，例如用硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析，可从所得粗酶溶液中分离高热稳定性β—半乳糖苷酶。
例如，从Pyrococcus furiosus DSM 3638的培养细胞制备的粗酶溶液用DEAE Toyopearl M650离子交换剂层析，从中流脱出活性流份。将所得活性流份倾入HIC—Cartridge柱(由Bio—Rad Laboratories生产)从中流脱出活性流份。将所得活性流分倾入羟磷灰石柱(由Bio—Rad Laboratories生产)，从中洗出活性流份。这样就得到了高热稳定性β—半乳糖苷酶。
[图1]显示质粒pTG2ES—105的限制性酶切图谱。
[图2]显示本发明的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因一种形式的限制性酶切图谱。
[图3]为显示酶的热稳定性的图。
[图4]为显示酶的最佳pH的图。
[图5]为显示酶的最佳温度的图。
[图6]为显示酶的pH稳定性的图。
[图7]为显示酶在表面活性剂存在下的热稳定性的图。
[图8]为对比β—半乳糖苷酶的氨基酸序列的部分视图(前半部分)。
[图9]为对比β—半乳糖苷酶的氨基酸序列的部分视图(后半部分)。
下列实施例将进一步说明本发明，但不构成任何限制。实施例1：[1]Pyrococcus furiosus基因组DNA的制备
按下列方式培养Pyrococcus furiosus DSM3638。
将包括1％胰胨、0.5％酵母膏、1％可溶性淀粉、3.5％JamarinSSolid(由Jamarin Laboratory生产)、0.5％Jamarin S Liquid(由Ja-marin Laboratory生产)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeS-4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppmH3BO3、0.1ppmNa2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2升培养基装入2升培养基瓶中，120℃消毒20分钟。吹入氮气消除溶解氧以后，将上述菌株接种在此培养基中，在95℃静止温育16小时。温育后，离心收集细胞。
然后将所收集细胞悬浮在4ml含25％蔗糖的0.05M Tris—HCl(pH，8.0)中。向所得悬液中加入0.8ml溶菌酶[5mg/ml，0.25MTris—HCl(pH8.0)]和2ml0.2M EDTA。在20℃保持1小时后，加入24ml SET溶液[150mM NaCl，1mM EDTA、20mM Tris—HCl(pH8.0)]。再向其中加入4ml5％SDS和400μl蛋白激酶K(10mg/ml)，在37℃反应1小时。反应完成后，用氯仿/苯酚萃取反应混合物，用乙醇沉淀。这样制得了约3.2mg基因组DNA。(2)粘性质粒蛋白文库的制备
将400μg Pyrococcus furiosus DSM 3638基因组DNA在Sau 3AI的缓冲液[5mM Tris—HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(dithiothreitol DTT)，100mM NaCl]中，用Sau 3AI部分消化，通过梯度离心按大小分级分离。将1μg Triple Helix粘性质粒载体用Bam HI裂解，与140μg上述分级分离所得35—50kbp的基因组DNA片段混合。用连结试剂合Ligation kit(由Takara Shuzo公司生产)连结后，用Gigapack II Gold(Stratagene生产)按体外包装方法将Pyro-coccus基因组DNA片段包装在λ-噬菌体颗粒中。用部分所得噬体溶液转化大肠杆菌DH5αMCR，从而形成粘性质粒文库。
从几个所得菌落制备了粘性质粒DNA，并证实它们都具有适当大小的插入片段。然后，将500个菌落悬浮在2ml含0.01％氨苄基霉素的L-液体培养基中，于37℃摇动培养16小时。离心培养物，收集沉淀的细胞。将这些细胞悬浮在20mM Tris—HCl(pH 8.0)中，于100℃热处理10分钟。然后，将其超声处理，再于100℃热处理10分钟。离心后，收集上清液，称为粗酶溶液。这样制备了500个粘性质粒蛋白文库。(3)含β—半乳糖苷酶基因的粘性质粒的选择
测定实施例1—(2)中所得到的500个粘性质粒蛋白文库的粗酶溶液的β—半乳糖苷酶活性。具体讲，将10μl粗酶溶液加到含112mM 2-巯基乙醇、1mM氯化镁和1％SDS的99.5μl 100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。然后加入含0.4M邻硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的0.5μl二甲亚砜溶液于95℃反应30分钟、加入0.1M碳酸钠终止反应。测定410nm处的吸光度，从而确定邻硝基苯酚的形成量。
从500个粘性质粒蛋白文库中选出了一个具有β—半乳糖苷酶活性的粘性质粒蛋白，相应地鉴别了一个粘性质粒DNA。(4)质粒pTG2S—112的制备和热稳定性β—半乳糖苷酶的生产
将实施例1—(3)中所得一个粘性质粒DNA用限制酶Sma I完全消化。另外，将载体pUC18在其Sma I位点裂解，然后未端脱磷酸化。用连结试剂盒将上述Sma I消化的DNA片段与载体质粒连结。用所形成的反应溶液转化大肠杆菌JM109。将转化子悬浮在含0.01％氨苄青霉素的L-液体培养基中，于37℃摇动培养16小时。离心所形成的培养物，回收的细胞悬浮在含1mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液中。将此悬液于100℃加热10分钟，超声处理，于100℃再加热10分钟，离心得到上清液作为粗酶溶液。用实施例1—(3)中相同的活性检测方法检测β—半乳糖苷酶活性，只是使用5.1该粗酶溶液。发现此粗酶溶液显示耐100℃20分钟的热处理的高热稳定性β—半乳糖苷酶活性。
将相应于该粗酶溶液的质粒称为质粒pTG2S—112。将质粒pTG2S—112转入大肠杆菌JM 109中，得到一转化子，该转化子称为大肠杆菌JM109/pTG2S—112。(5)质粒pTG2ES—105的制备
实施例1—(4)中所得到的含约4kbp的Sma I DNA片断的质粒pTG2S—112，用限制酶Eco81I和KpnI完全消化。纯化形成的约4.7kbp的Eco81I—Kpn I DNA片断，钝化未端并自连结。
所得质粒称为pTG2ES—105，将该质粒转入大肠杆菌JM 109中，得到一转化子。该转化子称为大肠杆菌JM109/pTG2ES—105。该菌株已于1994年4月20日保藏在National Institute of Bioscienceand Human—Technology Agency of Industrial Science and Technology(1—3，Higashi 1 Chome Tsukuba—Shi Ibaraki—ken 305，JAPAN)，保藏号为FERM BP-5023。
图1显示质粒pTG2ES-105的限制性酶切图谱，图2显示按本发明从Pyrococcus furiosus得到的插入质粒pTG2ES—105中的约2.0kbp的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的限制性酶切图谱。实施例2：(高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的核苷酸序列的测定)
用Deletion Kit for Kilo Sequence试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)，从上述含高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的插入质粒pTG2ES—105中的约2.0kbp片段，制备了缺失突变体，测定了所形成片段的核苷酸序列。
用双脱氧方法进行核苷酸序列的测定，其中使用了Bca BastDidexy Sequencing Kit试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)。
SEQ ID NO：2显示含高热稳定性β—半乳糖苷酶基因并插入质粒pTG2ES—105的DNA片段的核苷酸序列。SEQ ID NO：1显示由上述核苷酸序列编码的高热稳定性β—半乳糖苷酶的氨基酸序列。实施例3：(1)高热稳定性β—半乳糖苷酶的生产
实施例1中所得大肠杆菌JM109/pTG2ES—105(FERM MP-—5023)，其中已导入了含本发明的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的质粒pTG2ES—105，将其悬浮在含0.01％氨苄青霉素的5ml L—液体培养基中，于37℃摇动培养16小时。将培养物悬浮在1.21相同组成的培养基中，于37℃摇动培养16小时。离心所形成的培养物，将回收的细胞悬浮在含1mM EDTA的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将悬浮液于100℃加热10分钟，超声处理，再于100℃加热10分钟，离心得到上清液作为粗酶溶液。
pH5.0和90℃下，此粗酶溶液中的β—半乳糖苷酶的比活性为约740单位/mg。
利用本发明的高热稳定β—半乳糖苷酶基因可在商用规模有利地生产耐SDS的高热稳定性β—半乳糖苷酶。
另外，利用本发明的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因或其部分作为探针或引物，可得到各种生物衍生物的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因。序列表SEQ I N NO：    1长度：491类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：1Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly1               5                  l0                  15Phe Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp
             20                  25                  30Trp Trp Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu
             35                  40                  45Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu
             50                  55                  60Tyr Lys Gin Asp His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys
             65                  70                  75Ile Arg Gly Gly Ile Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr
             80                  85                  90Phe Asp Val Lys Val Asp Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile
             95                 100                 105Ile Ser Val Asp Val Pro Glu Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys
            110                 115                 120Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser
            125                 130                 135Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe Ile Leu Asn Leu Tyr His
            140                 145                 150Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro Ile Ala Val Arg Lys
            155                 160                 165Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp Glu Lys Thr
            170                 175                 180Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala Tyr His Leu
            185                 190                 195Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val
            200                 205                 210Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro Pro
            215                 220                 225Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu
            230                 235                 240Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser
            245                 250                 255Glu Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro
            260                 265                 270Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys
            275                 280                 285Asp Tyr Glu Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp
            290                 295                 300Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys
            305                 310                 315Asp Gly His Leu Val Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu
            320                 325                 330Arg Gly Gly Phe Ala Lys Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly
            335                 340                 345Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu
            350                 355                 360Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met Ile lle Thr Glu Asn Gly Met
            365                 370                 375Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro His Tyr Leu Val Ser His
            380                 385                 390Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu Gly Ala Asp Val Arg
            395                 400                 405Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln
            410                 415                 420Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp Phe Glu Thr
            425                 430                 435
Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg Glu Ile
            440                 445                 450Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala Asp
            455                 460                 465Leu Lys Phe Val Thr Lys Lys Val Ala Ile Ser Phe Phe Leu Cys
            470                 475                 480Phe Leu Thr His Ile Phe Gly Lys Ile Arg Ser
            485                 490SEQ ID NO：2长度：1476类型：核酸链型：双链形态：线性分子类型：基因组DNA序列描述：    SEQ I D NO：2ATGAAGTTCC CAAAAAACTT CATGTTTGGA TATTCTTGGT CTGGTTTCCA GTTTGAGATG   60GGACTGCCAG GAAGTGAAGT GGAAAGCGAC TGGTGGGTGT GGGTTCACGA CAAGGAGAAC  120ATAGCATCAG GTCTAGTAAG TGGAGATCTA CCAGAGAACG GCCCAGCATA TTGGCACCTC  180TATAAGCAAG ATCATGACAT TGCAGAAAAG CTAGGAATGG ATTGTATTAG AGGTGGCATT  240GAGTGGGCAA GAATTTTTCC AAAGCCAACA TTTGACGTTA AAGTTGATGT GGAAAAGGAT     300GAAGAAGGCA ACATAATTTC CGTAGACGTT CCAGAGAGTA CAATAAAAGA GCTAGAGAAA     360ATTGCCAACA TGGAGGCCCT TGAACATTAT CGCAAGATTT ACTCAGACTG GAAGGAGAGG     420GGCAAAACCT TCATATTAAA CCTCTACCAC TGGCCTCTTC CATTATGGAT TCATGACCCA     480ATTGCAGTAA GGAAACTTGG CCCGGATAGG GCTCCTGCAG GATGGTTAGA TGAGAAGACA     540GTGGTAGAGT TTGTGAAGTT TGCCGCCTTC GTTGCTTATC ACCTTGATGA CCTCGTTGAC     600ATGTGGAGCA CAATGAACGA ACCAAACGTA GTCTACAATC AAGGTTACAT TAATCTACGT     860TCAGGATTTC CACCAGGATA TCTAAGCTTT GAAGCAGCAG AAAAGGCAAA ATTCAACTTA     720ATTCAGGCTC ACATCGGAGC ATATGATGCC ATAAAAGAGT ATTCAGAAAA ATCCGTGGGA     780GTGATATACG CCTTTGCTTG GCACGATCCT CTAGCGGAGG AGTATAAGGA TGAAGTAGAG     840GAAATCAGAA AGAAAGACTA TGAGTTTGTA ACAATTCTAC ACTCAAAAGG AAAGCTAGAC     900TGGATCGGCG TAAACTACTA CTCCAGGCTG GTATATGGAG CCAAAGATGG ACACCTAGTT     980CCTTTACCTG GATATGGATT TATGAGTGAG AGAGGAGGAT TTGCAAAGTC AGGAAGACCT    1020GCTAGTGACT TTGGATGGGA AATGTACCCA GAGGGCCTTG AGAACCTTCT TAAGTATTTA    1080AACAATGCCT ACGAGCTACC AATGATAATT ACAGAGAACG GTATGGCCGA TGCAGCAGAT    1140AGATACAGGC CACACTATCT CGTAAGCCAT CTAAAGGCAG TTTACAATGC TATGAAAGAA    1200GGTGCTGATG TTAGAGGGTA TCTCCACTGG TCTCTAACAG ACAACTACGA ATGGGCCCAA    1260GGGTTCAGGA TGAGATTTGG ATTGGTTTAC GTGGATTTCG AGACAAAGAA GAGATATTTA    1320AGGCCAAGCG CCCTGGTATT CAGAGAAATA GCCACTCAAA AAGAAATTCC AGAAGAATTA    1380GCTCACCTCG CAGACCTCAA ATTTGTTACC AAGAAAGTAG CCATTTCATT TTTTCTTTGT    1440TTTTTAACTC ATATTTTTGG GAAAATAAGA TCATAA                              1476SEQ ID NO：3长度：：510类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：    SEQ ID N0：3Met Phe Pro Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Gln Ser Gly Phe1               5                  10                  15Gln Phe Glu Met Gly Asp Lys Leu Arg Arg Asn Ile Asp Thr Asn
             20                  25                  30Thr Asp Trp Trp His Trp Val Arg Asp Lys Thr Asn Ile Glu Lys
             35                  40                  45Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Glu Gly Ile Asn Asn Tyr
             50                  55                  60Glu Leu Tyr Glu Lys Asp His Glu Ile Ala Arg Lys Leu Gly Leu
             65                  70                  75Asn Ala Tyr Arg Ile Gly Ile Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Trp
             80                  85                  90Pro Thr Thr Phe Ile Asp Val Asp Tyr Ser Tyr Asn Glu Ser Tyr
             95                 100                 105Asn Leu Ile Glu Asp Val Lys Ile Thr Lys Asp Thr Leu Glu Glu
            110                 115                 120Leu Asp Glu Ile Ala Asn Lys Arg Glu Val Ala Tyr Tyr Arg Ser
            125                 130                 135Val Ile Asn Ser Leu Arg Ser Lys Gly Phe Lys Val Ile Val Asn
            140                 145                 150Leu Asn His Phe Thr Leu Pro Tyr Trp Leu His Asp Pro Ile Glu
            155                 160                 165Ala Arg Glu Arg Ala Leu Thr Asn Lys Arg Asn Gly Trp Val Asn
            170                 175                 180Pro Arg Thr Val Ile Glu Phe Ala Lys Tyr Ala Ala Tyr Ile Ala
            185                 190                 195Tyr Lys Phe Gly Asp Ile Val Asp Met Trp Ser Thr Phe Asn Glu
            200                 205                 210Pro Met Val Val Val Glu Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Tyr Ser Gly
            215                 220                 225Phe Pro Pro Gly Val Leu Asn Pro Glu Ala Ala Lys Leu Ala Ile
            230                 235                 240Leu His Met Ile Asn Ala His Ala Leu Ala Tyr Arg Gln Ile Lys
            245                 250                 255Lys Phe Asp Thr Glu Lys Ala Asp Lys Asp Ser Lys Glu Pro Ala
            260                 265                 270Glu Val Gly Ile Ile Tyr Asn Asn Ile Gly Val Ala Tyr Pro Lys
            275                 280                 285Asp Pro Asn Asp Ser Lys Asp Val Lys Ala Ala Glu Asn Asp Asn
            290                 295                 300Phe Phe His Ser Gly Leu Phe Phe Glu Ala Ile His Lys Gly Lys
            305                 310                 315Leu Asn Ile Glu Phe Asp Gly Glu Thr Phe Ile Asp Ala Pro Tyr
            320                 325                 330Leu Lys Gly Asn Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Glu
            335                 340                 345Val Val Thr Tyr Gln Glu Pro Met Phe Pro Ser Ile Pro Leu Ile
            350                 355                 360Thr Phe Lys Gly Val Gln Gly Tyr Gly Tyr Ala Cys Arg Pro Gly
            365                 370                 375Thr Leu Ser Lys Asp Asp Arg Pro Val Ser Asp Ile Gly Trp Glu
            380                 385                 390Leu Tyr Pro Glu Gly Met Tyr Asp Ser Ile Val Glu Ala His Lys
            395                 400                 405Tyr Gly Val Pro Val Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile Ala Asp Ser
            410                 415                 420Lys Asp Ile Leu Arg Pro Tyr Tyr Ile Ala Ser His Ile Lys Met
            425                 430                 435Ile Glu Lys Ala Phe Glu Asp Gly Tyr Glu Val Lys Gly Tyr Phe
            440                 445                 450His Trp Ala Leu Thr Asp Asn Phe Glu Trp Ala Leu Gly Phe Arg
            455                 460                 465Met Arg Phe Gly Leu Tyr G1u Val Asn Leu Ile Thr Lys Glu Arg
            470                 475                 480Ile Pro Arg Glu Lys Ser Val Ser Ile Phe Arg Glu Ile Val Ala
            485                 490                 495Asn Asn Gly Val Thr Lys Lys Ile Glu Glu Glu Leu Leu Arg Gly
            500                 505                 510SEQ ID NO：4长度：491类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：    SEQ ID N0：4Met Leu Ser Phe Pro Lys Gly Phe Lys Phe Gly Trp Ser Gln Ser1               5                  10                  15Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn
             20                  25                  30Ser Asp Trp His Val Trp Val His Asp Arg Glu Asn Ile Val Ser
             35                  40                  45Gln Val Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp
             50                  55                  60Gly Asn Tyr Lys Arg Phe His Asp Glu Ala Glu Lys Ile Gly Leu
             65                  70                  75Asn Ala Val Arg Ile Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Arg
             80                  85                  90Pro Leu Pro Lys Pro Glu Met Gln Thr Gly Thr Asp Lys Glu Asn
             95                 100                 105Ser Pro Val Ile Ser Val Asp Leu Asn Glu Ser Lys Leu Arg Glu
            110                 115                 120Met Asp Asn Tyr Ala Asn His Glu Ala Leu Ser His Tyr Arg His
            125                 130                 135Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Arg Gly Phe His Ile Val Leu Asn
            140                 145                 150Met Tyr His Trp Thr Leu Pro Ile Trp Leu His Asp Pro Ile Arg
            155                 160                 165Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Gly Pro Thr Gly Trp Leu Asn Ser
            170                 175                 180Arg Thr Val Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Val Ala Trp
            185                 190                 195Lys Leu Asp Asp Leu Ala Ser Glu Tyr Ala Thr Met Asn Glu Pro
            200                 205                 210Asn Val Val Trp Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Pro Arg Ala Gly Phe
            215                 220                 225Pro Pro Asn Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Ser Glu Ile Ala Lys Trp
            230                 235                 240Asn Ile Ile Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Ser
            245                 250                 255Val Ser Lys Lys Ser Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Thr Ser Tyr
            260                 265                 270Tyr Pro Leu Arg Pro Gln Asp Asn Glu Ala Val Glu Ile Ala Glu
            275                 280                 285Arg Leu Asn Arg Trp Ser Phe Phe Asp Ser Ile Ile Lys Gly Glu
            290                 295                 300Ile Thr Ser Glu Gly Gln Asn Val Arg Glu Asp Leu Arg Asn Arg
            305                 310                 315Leu Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Thr
            320                 325                 330Lys Ala Glu Ser Gly Tyr Leu Thr Leu Pro Gly Tyr Gly Asp Arg
            335                 340                 345Cys Glu Arg Asn Ser Leu Ser Leu Ala Asn Leu Pro Thr Ser Asp
            350                 355                 360Phe Gly Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Leu
            365                 370                 375Lys Tyr Trp Asn Arg Tyr Gly Leu Pro Leu Tyr Val Met Glu Asn
            380                 385                 390Gly Ile Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val
            395                 400                 405Ser His Ile Tyr Gln Val His Arg Ala Leu Asn Glu Gly Val Asp
            410                 415                 420Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp
            425                 430                 435Ser Ser Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr
            440                 445                 450Leu Thr Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg
            455                 460                 465Glu Ile Thr Arg Ser Asn Gly Ile Pro Glu Glu Leu Glu His Leu
            470                 475                 480Asn Arg Val Pro Pro Ile Lys Pro Leu Arg His
            485                 490SEQ ID NO：5长度：489类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：        SEQ ID N0：5Met Tyr Ser Phe Pro Asn Ser Phe Arg Phe Gly Trp Ser Gln Ala1               5                  10                  15Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn
             20                  25                  30Thr Asp Trp Tyr Lys Trp Val His Asp Pro Glu Asn Met Ala Ala
             35                  40                  45Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp
             50                  55                  60Gly Asn Tyr Lys Thr Phe His Asp Asn Ala Gln Lys Met Gly Leu
             65                  70                  75Lys Ile Ala Arg Leu Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Asn
             80                  85                  90Pro Leu Pro Arg Pro Gln Asn Phe Asp Glu Ser Lys Gln Asp Val
             95                 100                 105Thr Glu Val Glu Ile Asn Glu Asn Glu Leu Lys Arg Leu Asp Glu
            110                 115                 120Tyr Ala Asn Lys Asp Ala Leu Asn His Tyr Arg Glu Ile Phe Lys
            125                 130                 135Asp Leu Lys Ser Arg Gly Leu Tyr Phe Ile Leu Asn Met Tyr His
            140                 145                 150Trp Pro Leu Pro Leu Trp Leu His Asp Pro Ile Arg Val Arg Arg
            155                 160                 165Gly Asp Phe Thr Gly Pro Ser Gly Trp Leu Ser Thr Arg Thr Val
            170                 175                 180Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Ile Ala Trp Lys Phe Asp
            185                 190                 195Asp Leu Val Asp Glu Tyr Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val Val
            200                 205                 210Gly Gly Leu Gly Tyr Val Gly Val Lys Ser Gly Phe Pro Pro Gly
            215                 220                 225Tyr Leu Ser Phe Glu Leu Ser Arg Arg His Met Tyr Asn Ile Ile
            230                 235                 240Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Val Ser Lys
            245                 250                 255Lys Pro Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Ser Ser Phe Gln Pro Leu
            260                 265                 270Thr Asp Lys Asp Met Glu Ala Val Glu Met Ala Glu Asn Asp Asn
            275                 280                 285Arg Trp Trp Phe Phe Asp Ala Ile Ile Arg Gly Glu Ile Thr Arg
            290                 295                 300Gly Asn Glu Lys Ile Val Arg Asp Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp
            305                 310                 315Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Lys Arg Thr
            320                 325                 330Glu Lys Gly Tyr Val Ser Leu Gly Gly Tyr Gly His Gly Cys Glu
            335                 340                 345Arg Asn Ser Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro Thr Ser Asp Phe Gly
            350                 355                 360Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Thr Lys Tyr
            365                 370                 375Trp Asn Arg Tyr His Leu Tyr Met Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile
            380                 385                 390Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val Ser His
            395                 400                 405Val Tyr Gln Val His Arg Ala Ile Asn Ser Gly Ala Asp Val Arg
            410                 415                 420Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Ser
            425                 430                 435Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr Asn Thr
            440                 445                 450Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg Glu Ile
            455                 460                 465Ala Thr Asn Gly Ala Ile Thr Asp Glu Ile Glu His Leu Asn Ser
            470                 475                 480Val Pro Pro Val Lys Pro Leu Arg His
            485SEQ ID NO：6长度：12类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：    SEQ ID NO：6
Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val
  1               5                  10SEQ ID NO：7长度：13类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述    ：SEQ ID NO：7
Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly
  1               5                  10SEQ ID NO：8长度：23类型：氨基酸链型：单链形态：线性分子类型：肽序列描述：    SEQ ID NO：8
Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln
  1               5                  10                  15
Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu
                 20

Claims (6)

1.源自Pyrococcus furiosus的分离的耐SDS高热稳定性β—半乳糖苷酶基因。
2.权利要求1的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，其编码具有高热稳定性β—半乳糖苷酶活性的具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或其部分的片段。
3.权利要求1的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，其具有如SEQ ID NO：2所示的核基酸序列。
4.一种耐SDS高热稳定性β—半乳糖苷酶基因，其可与权利要求2的基因杂交。
5.一种高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的克隆方法，其包括用权利要求2—4中任一项的基因或其部分作为探针或引物。
6.一种高热稳定性β—半乳糖苷酶的生产方法，其包括培养一种转化子，该转化子中已导入了含权利要求1的高热稳定性β—半乳糖苷酶基因的重组质粒，并从培养物中收获高热稳定性β—半乳糖苷酶。
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