JP3497817B2 - 硫酸化フコガラクタン分解酵素 - Google Patents
硫酸化フコガラクタン分解酵素Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖工学用試薬と
して有用な硫酸化フコガラクタン、該硫酸化多糖由来低
分子化物、及びその製造方法、さらに糖鎖工学分野にお
いて有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、該酵素の製
造方法に関する。
して有用な硫酸化フコガラクタン、該硫酸化多糖由来低
分子化物、及びその製造方法、さらに糖鎖工学分野にお
いて有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、該酵素の製
造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】褐藻類には何種類もの硫酸化フコース含
有多糖が含まれている。例えば、フコースと硫酸基の
みからなる硫酸化フカン、グルクロン酸、マンノー
ス、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロ
ノマンナン、例えばＷＯ９７／２６８９６公報に記載の
フコース硫酸含有多糖−Ｕ（構成糖及びそのモル比がフ
コース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基
＝約１０：７：４：５：２０、以下、Ｕ−フコイダンと
称す）、フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコ
ガラクタン、例えば、ＷＯ９７／２６８９６公報に記載
のフコース硫酸含有多糖−Ｆ（構成糖及びそのモル比が
フコース：ガラクトース＝約１０：１、以下、Ｆ−フコ
イダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られて
いる。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総
て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程におい
て理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そ
のため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離
されることなく、そのまま生物活性が調べられることが
多く、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコー
ス含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
有多糖が含まれている。例えば、フコースと硫酸基の
みからなる硫酸化フカン、グルクロン酸、マンノー
ス、フコース及び硫酸基を含有する硫酸化フコグルクロ
ノマンナン、例えばＷＯ９７／２６８９６公報に記載の
フコース硫酸含有多糖−Ｕ（構成糖及びそのモル比がフ
コース：マンノース：ガラクトース：ウロン酸：硫酸基
＝約１０：７：４：５：２０、以下、Ｕ−フコイダンと
称す）、フコース、ガラクトースよりなる硫酸化フコ
ガラクタン、例えば、ＷＯ９７／２６８９６公報に記載
のフコース硫酸含有多糖−Ｆ（構成糖及びそのモル比が
フコース：ガラクトース＝約１０：１、以下、Ｆ−フコ
イダンと称す）等の硫酸化フコース含有多糖が知られて
いる。これらの硫酸化フコース含有多糖は、おおよそ総
て高分子の陰イオンであるため、様々な精製工程におい
て理化学的に同じ挙動を取り、分離が困難であった。そ
のため褐藻類の硫酸化フコース含有多糖はそれぞれ分離
されることなく、そのまま生物活性が調べられることが
多く、見出された生物活性を担うのがどの硫酸化フコー
ス含有多糖であるのかを決定することは困難であった。
【０００３】現在までに活性と分子の相関関連が知られ
ているのは、アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー (Agricultural and Biological Che
mistry )、第４４巻、第８号、第１９６５頁〜第１９６
６頁（１９８０）記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン
画分、ＷＯ９７／２６８９６公報記載の癌細胞に対する
アポトーシス誘発作用を担うＵ−フコイダンである。
ているのは、アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー (Agricultural and Biological Che
mistry )、第４４巻、第８号、第１９６５頁〜第１９６
６頁（１９８０）記載の抗凝血作用を担う硫酸化フカン
画分、ＷＯ９７／２６８９６公報記載の癌細胞に対する
アポトーシス誘発作用を担うＵ−フコイダンである。
【０００４】硫酸化フカン画分の抗凝血作用に関して
は、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてき
た。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性す
なわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを
得る必要があり、その方法が求められていた。
は、ヘパリンの代わりに使用することが検討されてき
た。しかし、薬品として使用する場合、予期せぬ活性す
なわち副作用を防ぐためにも、高純度の硫酸化フカンを
得る必要があり、その方法が求められていた。
【０００５】同様に、Ｕ−フコイダンに関しても癌細胞
に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製
するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Ｕを簡便に
得る必要があり、その方法が求められていた。
に対するアポトーシス誘発作用を利用した薬品類を調製
するために高純度のフコース硫酸含有多糖−Ｕを簡便に
得る必要があり、その方法が求められていた。
【０００６】一般的に、多糖の構造解析やオリゴ糖の製
造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法であ
る。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖
だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解
する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した
後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にそ
の他の多糖と分離することができる。
造に酵素分解を利用する方法は、最も効率良い方法であ
る。また、分離が困難な多糖の混合物から一種類の多糖
だけを除去する際にも、除去したい多糖を特異的に分解
する酵素があれば、その多糖をその酵素で低分子化した
後、限外ろ過等の分子量分画を行うことにより容易にそ
の他の多糖と分離することができる。
【０００７】硫酸化フコガラクタンに関して、硫酸化フ
コガラクタンを特異的に分解する酵素があれば、硫酸化
フコガラクタンの構造解析、硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖の製造が容易である。
コガラクタンを特異的に分解する酵素があれば、硫酸化
フコガラクタンの構造解析、硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖の製造が容易である。
【０００８】以上のことから硫酸化フコガラクタン分解
酵素、及び酵素的に製造した硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖を得る方法が求められていた。
酵素、及び酵素的に製造した硫酸化フコガラクタンオリ
ゴ糖を得る方法が求められていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明の目的
は、（１）糖鎖工学用試薬あるいは肝細胞増殖因子（he
patocyte growth factor；ＨＧＦ）産生誘導物質として
有用な硫酸化フコガラクタン又はその塩、（２）該硫酸
化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物又はその塩、（３）糖鎖工
学的に有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、（４）硫
酸化フコガラクタン又はその塩に該酵素を作用させて得
られる低分子化物の製造方法、及び（５）硫酸化フコガ
ラクタン分解酵素の製造方法を提供することにある。
は、（１）糖鎖工学用試薬あるいは肝細胞増殖因子（he
patocyte growth factor；ＨＧＦ）産生誘導物質として
有用な硫酸化フコガラクタン又はその塩、（２）該硫酸
化フコガラクタンに硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物又はその塩、（３）糖鎖工
学的に有用な硫酸化フコガラクタン分解酵素、（４）硫
酸化フコガラクタン又はその塩に該酵素を作用させて得
られる低分子化物の製造方法、及び（５）硫酸化フコガ
ラクタン分解酵素の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本願の発明者らは鋭意研
究の結果、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン、該
硫酸化多糖を分解する硫酸化フコガラクタン分解酵素及
びその製造方法を見出した。さらに、糖鎖工学用試薬と
して利用できる硫酸化フコガラクタンの低分子化物及び
その製造方法を見出し、本発明を完成させた。
究の結果、褐藻類に含まれる硫酸化フコガラクタン、該
硫酸化多糖を分解する硫酸化フコガラクタン分解酵素及
びその製造方法を見出した。さらに、糖鎖工学用試薬と
して利用できる硫酸化フコガラクタンの低分子化物及び
その製造方法を見出し、本発明を完成させた。
【００１１】本発明の第１の発明は、下記の理化学的性
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン又は
その塩に関する。該硫酸化フコガラクタンは、構成糖と
してガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が
１：１〜６：１であり、下記一般式（ＸＩ）で表される
硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン又は
その塩に関する。該硫酸化フコガラクタンは、構成糖と
してガラクトースとフコースを含有し、そのモル比が
１：１〜６：１であり、下記一般式（ＸＩ）で表される
硫酸化糖を構成糖の必須成分とする。
【化５】
（式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）
【００１２】さらに、本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素により低分子化され、下記一般式（Ｉ）〜（Ｉ
Ｖ）で表される化合物より選択される１種以上の化合物
が生成する。
解酵素により低分子化され、下記一般式（Ｉ）〜（Ｉ
Ｖ）で表される化合物より選択される１種以上の化合物
が生成する。
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
（式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）
【００１３】本発明の第２の発明は、下記一般式（Ｉ
Ｉ）、（ＩＩＩ’）又は（ＩＶ）から選択される化学構
造を有する糖化合物またはその塩に関する。
Ｉ）、（ＩＩＩ’）又は（ＩＶ）から選択される化学構
造を有する糖化合物またはその塩に関する。
【化１０】
【化１１】
【化１２】
（式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）
【００１４】本発明の第３の発明は、下記の理化学的性
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解
酵素に関する。該酵素は、構成糖としてガラクトースと
フコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１である
硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フ
コガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラ
クトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成さ
せることができ、至適ｐＨは、約７〜９の範囲であり、
至適温度は、約２５〜４５℃である。
質を有することを特徴とする硫酸化フコガラクタン分解
酵素に関する。該酵素は、構成糖としてガラクトースと
フコースを含有し、そのモル比が１：１〜６：１である
硫酸化フコガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フ
コガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラ
クトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成さ
せることができ、至適ｐＨは、約７〜９の範囲であり、
至適温度は、約２５〜４５℃である。
【００１５】本発明の第４の発明は、上記第３の発明に
記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫
酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得するこ
とを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物又は
その塩の製造方法に関する。該酵素によって得られる低
分子化物は、例えば、上記第２の発明に記載のオリゴ糖
又はその塩が挙げられる。
記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を褐藻類由来の硫
酸化フコガラクタン又はその塩に作用させて取得するこ
とを特徴とする硫酸化フコガラクタンの低分子化物又は
その塩の製造方法に関する。該酵素によって得られる低
分子化物は、例えば、上記第２の発明に記載のオリゴ糖
又はその塩が挙げられる。
【００１６】本発明の第５の発明は、硫酸化フコガラク
タン分解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌
を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴
とする上記第３の発明に記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素の製造方法に関する。
タン分解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌
を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴
とする上記第３の発明に記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素の製造方法に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下本発明に関して具体的に説明
する。褐藻類に属する海藻には複数種の硫酸化フコース
含有多糖が含まれている。その分子種としては、硫酸化
フカン及び硫酸化フコグルクロノマンナン等や他にも何
種類もの分子種が報告されている。
する。褐藻類に属する海藻には複数種の硫酸化フコース
含有多糖が含まれている。その分子種としては、硫酸化
フカン及び硫酸化フコグルクロノマンナン等や他にも何
種類もの分子種が報告されている。
【００１８】本発明の硫酸化フコガラクタンとは、構成
糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモ
ル比が１：１〜６：１であり、以下、本発明の硫酸化フ
コガラクタンあるいはＧ−フコイダンと称し、例えば、
２：１の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平
均分子量は、例えば、ＨＰＬＣゲルろ過法で約１３万
（分子量分布は、約１０万〜約２０万）の硫酸化多糖で
ある。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組
成、及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料
の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により
異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条
件、ｐＨ条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸
化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従っ
て、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子
量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその１
例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件に
より、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸
基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載
のフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−Ｆ分解酵素を用いて本発明の硫酸化フコガラ
クタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を
示す本発明の硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわ
ち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分
布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタ
ンを調製することができる。例えば、本発明の硫酸化フ
コガラクタンの主要な構成糖は、６糖あたりおよそ５残
基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合
している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカ
リあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性や
アルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減
少するものである。すなわち、本発明の硫酸化フコガラ
クタンから意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。従って、本発明の硫酸化フコガラクタンは、
前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される
硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のも
のを包含する。
糖として主にガラクトースとフコースを含有し、そのモ
ル比が１：１〜６：１であり、以下、本発明の硫酸化フ
コガラクタンあるいはＧ−フコイダンと称し、例えば、
２：１の硫酸化フコガラクタンが例示される。また、平
均分子量は、例えば、ＨＰＬＣゲルろ過法で約１３万
（分子量分布は、約１０万〜約２０万）の硫酸化多糖で
ある。なお、上記硫酸化フコガラクタンの分子量、糖組
成、及び硫酸基含量は、該硫酸化フコガラクタンの原料
の収穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により
異なり、また硫酸化フコガラクタンの抽出時の加熱条
件、ｐＨ条件等により異なる。例えば、酸により該硫酸
化フコガラクタンは加水分解される場合がある。従っ
て、本明細書に記載した硫酸化フコガラクタンの分子
量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸基含量はその１
例にすぎず、該硫酸化フコガラクタンの抽出処理条件に
より、その分子量、分子量分布、糖組成、あるいは硫酸
基含量は容易に変化させ得る。例えば、本明細書に記載
のフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−Ｆ分解酵素を用いて本発明の硫酸化フコガラ
クタンを調製する場合、例えば上記の糖組成と分子量を
示す本発明の硫酸化フコガラクタンが得られる。すなわ
ち、調製方法の条件によって任意の分子量、分子量分
布、糖組成、あるいは硫酸基含量の硫酸化フコガラクタ
ンを調製することができる。例えば、本発明の硫酸化フ
コガラクタンの主要な構成糖は、６糖あたりおよそ５残
基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖にエステル結合
している硫酸基は、化学的に不安定であり、酸やアルカ
リあるいは熱により容易に切断される。例えば、酸性や
アルカリ性条件下で加熱処理を行えばその硫酸含量は減
少するものである。すなわち、本発明の硫酸化フコガラ
クタンから意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。従って、本発明の硫酸化フコガラクタンは、
前述の特徴を備えた硫酸化フコガラクタンもしくは、本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化される
硫酸化フコガラクタンであればすべての褐藻類由来のも
のを包含する。
【００１９】本発明の硫酸化フコガラクタンの主骨格
は、下記一般式（ＸＩＩ）に表される。下記一般式にお
いて、ｎは、１以上の整数であり、例えば、１〜１００
０の範囲、さらに好ましくは１〜５００の範囲のものが
本発明の硫酸化フコガラクタンに含まれる。また、本発
明の硫酸化フコガラクタンには、上記範囲であれば、下
記一般式（ＸＩＩ）が連続的に繰り返した構造をもつも
の及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式（Ｘ
ＩＩ）が含有される構造をもつもののいずれもが含まれ
る。
は、下記一般式（ＸＩＩ）に表される。下記一般式にお
いて、ｎは、１以上の整数であり、例えば、１〜１００
０の範囲、さらに好ましくは１〜５００の範囲のものが
本発明の硫酸化フコガラクタンに含まれる。また、本発
明の硫酸化フコガラクタンには、上記範囲であれば、下
記一般式（ＸＩＩ）が連続的に繰り返した構造をもつも
の及び他の構造が介在して、非連続的に下記一般式（Ｘ
ＩＩ）が含有される構造をもつもののいずれもが含まれ
る。
【化１３】
（式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）
【００２０】本発明の硫酸化フコガラクタンが由来する
褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴ
メ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レ
ッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリ
ア（durvillaea）由来のものを調製することができる。
特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダン
には、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン及び本発明のＧ
−フコイダンが含まれている。
褐藻類は、特に限定されるものではないが例えば、ガゴ
メ昆布、ワカメ、マ昆布、アラメ、カジメ、クロメ、レ
ッソニアニグレセンス、ジャイアントケルプ、ダービリ
ア（durvillaea）由来のものを調製することができる。
特に限定はないが、例えば、ガゴメ昆布由来フコイダン
には、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン及び本発明のＧ
−フコイダンが含まれている。
【００２１】本発明の硫酸化フコガラクタンの塩として
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の
遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
は、薬学的に許容される塩を用いることができ、例えば
ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩、カルシウ
ム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、亜鉛等の
遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が挙げられる。
【００２２】本明細書において硫酸化フコガラクタン低
分子化物とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られる
オリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースである。
分子化物とは、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発明
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られる
オリゴ糖であり、還元性末端糖が硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースである。
【００２３】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素と
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化
フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガ
ラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成
させる。また、ＷＯ９７／２６８９６公報には、フコー
ス硫酸含有多糖−Ｆを分解するエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明
の硫酸化フコガラクタンを分解しない。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコ
ガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクト
ースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの
間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエンド的に分解す
る酵素である。
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用して該硫酸化
フコガラクタンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガ
ラクトースあるいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成
させる。また、ＷＯ９７／２６８９６公報には、フコー
ス硫酸含有多糖−Ｆを分解するエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素が記載されているが、該酵素は、本発明
の硫酸化フコガラクタンを分解しない。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素は、本発明の硫酸化フコ
ガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクト
ースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースの
間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエンド的に分解す
る酵素である。
【００２４】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
基質となる本発明の硫酸化フコガラクタンを製造する際
にはまず、褐藻類から硫酸化フコース含有多糖画分を得
てから本発明の硫酸化フコガラクタンを精製する方法が
簡便である。例えば、硫酸化フコース含有多糖画分の製
造にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
の硫酸化フコース含有多糖の低分子化を防ぐためには、
ｐＨは４〜９、温度は１００℃以下の抽出が好ましい。
基質となる本発明の硫酸化フコガラクタンを製造する際
にはまず、褐藻類から硫酸化フコース含有多糖画分を得
てから本発明の硫酸化フコガラクタンを精製する方法が
簡便である。例えば、硫酸化フコース含有多糖画分の製
造にはまず、褐藻類の水溶性画分抽出液を得る。その際
の硫酸化フコース含有多糖の低分子化を防ぐためには、
ｐＨは４〜９、温度は１００℃以下の抽出が好ましい。
【００２５】当該抽出液からアルギン酸を除くには、酸
性処理によるアルギン酸の等電点沈殿を利用する方法、
カルシウム塩等、アルギン酸と沈殿を形成する塩を添加
する方法、アルギン酸分解酵素により分解する方法等が
ある。また、アミノ酸やマンニトール等の低分子を除く
には限外ろ過を用いれば効率良く除去できる。疎水性物
質の除去には活性炭処理なども有効である。
性処理によるアルギン酸の等電点沈殿を利用する方法、
カルシウム塩等、アルギン酸と沈殿を形成する塩を添加
する方法、アルギン酸分解酵素により分解する方法等が
ある。また、アミノ酸やマンニトール等の低分子を除く
には限外ろ過を用いれば効率良く除去できる。疎水性物
質の除去には活性炭処理なども有効である。
【００２６】このようにして硫酸化フコース含有多糖の
混合物を得ることができる。この混合物から本発明の硫
酸化フコガラクタンを製造する際には、硫酸化フコース
含有多糖の混合物に、ＷＯ９７／２６８９６公報にエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びＷＯ９７／２６８９６
公報にエンド型フコイダン分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を作用させた後に、低分子
画分を限外ろ過法で除去し、本発明の硫酸化フコガラク
タンを調製すれば良い。
混合物を得ることができる。この混合物から本発明の硫
酸化フコガラクタンを製造する際には、硫酸化フコース
含有多糖の混合物に、ＷＯ９７／２６８９６公報にエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びＷＯ９７／２６８９６
公報にエンド型フコイダン分解酵素として記載のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を作用させた後に、低分子
画分を限外ろ過法で除去し、本発明の硫酸化フコガラク
タンを調製すれば良い。
【００２７】こうして得られた硫酸化フコガラクタンに
は硫酸化フコガラクタン以外の何種類かの硫酸化フコー
ス含有多糖が含まれる場合があるが、例えば、陰イオン
交換樹脂を用いて分離精製することにより、本発明の硫
酸化フコガラクタンを単離することができる。この方法
によれば、硫酸化フコース含有多糖の混合物を直接陰イ
オン交換樹脂により分離する方法と比べて樹脂量も少な
くて済み、上記２種の硫酸化フコース含有多糖の混入が
ないため、分離が格段に向上する。
は硫酸化フコガラクタン以外の何種類かの硫酸化フコー
ス含有多糖が含まれる場合があるが、例えば、陰イオン
交換樹脂を用いて分離精製することにより、本発明の硫
酸化フコガラクタンを単離することができる。この方法
によれば、硫酸化フコース含有多糖の混合物を直接陰イ
オン交換樹脂により分離する方法と比べて樹脂量も少な
くて済み、上記２種の硫酸化フコース含有多糖の混入が
ないため、分離が格段に向上する。
【００２８】前述の方法で得られた本発明の硫酸化フコ
ガラクタンは本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
精製する際の活性測定用基質、あるいは本発明の硫酸化
フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料としても使用でき
る。また、硫酸化フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料
としては、上記の硫酸化フコース含有多糖の混合物を使
用してもよい。
ガラクタンは本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
精製する際の活性測定用基質、あるいは本発明の硫酸化
フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料としても使用でき
る。また、硫酸化フコガラクタンオリゴ糖製造時の原料
としては、上記の硫酸化フコース含有多糖の混合物を使
用してもよい。
【００２９】本発明の酵素の製造に使用される菌株とし
ては、本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する酵
素を産生する菌であれば特に限定はないが例えば、ＷＯ
９７／２６８９６公報記載のフラボバクテリウム (Flav
obacterium ) ｓｐ． ＳＡ−００８２株 （通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）］
に平成７年（１９９５年）３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ
−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２
［国際寄託への移管請求日：平成８年（１９９６年）２
月１５日］として寄託)が好適に使用できる。上記菌株
はグラム染色性、ＤＮＡのＧＣ含量、主要キノン系等の
菌学的性質から、フラボバクテリウム属であると考えら
れた。一方、最近の分類基準に１６ＳｒＤＮＡの塩基配
列が考慮されていることが多いため、本発明者らも本細
菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列についてインターネット
National Center for Biotechnology Information (NCB
I)のAdvanced BLAST searchでホモロジー検索を行っ
た。
ては、本発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する酵
素を産生する菌であれば特に限定はないが例えば、ＷＯ
９７／２６８９６公報記載のフラボバクテリウム (Flav
obacterium ) ｓｐ． ＳＡ−００８２株 （通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）］
に平成７年（１９９５年）３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ
−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２
［国際寄託への移管請求日：平成８年（１９９６年）２
月１５日］として寄託)が好適に使用できる。上記菌株
はグラム染色性、ＤＮＡのＧＣ含量、主要キノン系等の
菌学的性質から、フラボバクテリウム属であると考えら
れた。一方、最近の分類基準に１６ＳｒＤＮＡの塩基配
列が考慮されていることが多いため、本発明者らも本細
菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列についてインターネット
National Center for Biotechnology Information (NCB
I)のAdvanced BLAST searchでホモロジー検索を行っ
た。
【００３０】上記塩基配列と相同性の高い遺伝子を持つ
細菌を検索したところ、全域に渡って相同性が最も高い
ものは、ポーラリバクター フィラメンタス（Polariba
cterfilamentus）で、その相同性は１４２４塩基にわた
って８９％であった。その他の細菌では全域にわたって
相同性が高いものはなかった。なお、比較的相同性の高
いものとしては、ポーラリバクター イルジェンシー
（Polaribacter irgensii、１３６０塩基にわたって８
９％の相同性）、サイトファーガ スピーシーズ（Cyto
phaga sp.、１２４９塩基にわたって９２％の相同
性）、フレキシバクター マリティムス（Flexibacter
maritimus、１２４７塩基にわたって９１％の相同性）
等があった。一般的に１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同
性が９０％以下の場合、同属の細菌と判断できないた
め、本細菌は、遺伝子学的分類には既知の細菌と同じ属
に帰属しないことが考えられた。即ち、本細菌の菌学的
性質がサイトファーガ（Cytophaga）目に属するフラボ
バクテリウム（Flavobacterium）属細菌とほぼ一致する
こと及び本細菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列について相
同性が高い上記４菌株が総て、サイトファーガ目細菌で
あることなどから、本細菌は、サイトファーガ目に属す
る新規細菌であると考えられる。なお、本明細書に記載
のフラボバクテリウム属細菌には、菌学的性質から分類
されるフラボバクテリウム属細菌及び遺伝子学的分類に
おいて相同性のあるサイトファーガ目細菌も含まれる。
従って、サイトファーガ目に属する細菌を培養して本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する場合は、
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に含
まれる。
細菌を検索したところ、全域に渡って相同性が最も高い
ものは、ポーラリバクター フィラメンタス（Polariba
cterfilamentus）で、その相同性は１４２４塩基にわた
って８９％であった。その他の細菌では全域にわたって
相同性が高いものはなかった。なお、比較的相同性の高
いものとしては、ポーラリバクター イルジェンシー
（Polaribacter irgensii、１３６０塩基にわたって８
９％の相同性）、サイトファーガ スピーシーズ（Cyto
phaga sp.、１２４９塩基にわたって９２％の相同
性）、フレキシバクター マリティムス（Flexibacter
maritimus、１２４７塩基にわたって９１％の相同性）
等があった。一般的に１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の相同
性が９０％以下の場合、同属の細菌と判断できないた
め、本細菌は、遺伝子学的分類には既知の細菌と同じ属
に帰属しないことが考えられた。即ち、本細菌の菌学的
性質がサイトファーガ（Cytophaga）目に属するフラボ
バクテリウム（Flavobacterium）属細菌とほぼ一致する
こと及び本細菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列について相
同性が高い上記４菌株が総て、サイトファーガ目細菌で
あることなどから、本細菌は、サイトファーガ目に属す
る新規細菌であると考えられる。なお、本明細書に記載
のフラボバクテリウム属細菌には、菌学的性質から分類
されるフラボバクテリウム属細菌及び遺伝子学的分類に
おいて相同性のあるサイトファーガ目細菌も含まれる。
従って、サイトファーガ目に属する細菌を培養して本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する場合は、
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方法に含
まれる。
【００３１】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
製造方法に使用する菌株の培地は、使用する菌株が代謝
し、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する
ものであればよく、炭素源としては例えば硫酸化フコガ
ラクタン、硫酸化フコース含有多糖の混合物、海藻粉
末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコー
ス、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マル
トース等が利用でき、窒素源としては、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス等が好適に使用できる。また、本菌株
は、上記栄養素を含んだ海水あるいは人工海水中で非常
に良く生育する。
製造方法に使用する菌株の培地は、使用する菌株が代謝
し、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を生産する
ものであればよく、炭素源としては例えば硫酸化フコガ
ラクタン、硫酸化フコース含有多糖の混合物、海藻粉
末、アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコー
ス、マンニトール、グリセロール、サッカロース、マル
トース等が利用でき、窒素源としては、ペプトン、酵母
エキス、肉エキス等が好適に使用できる。また、本菌株
は、上記栄養素を含んだ海水あるいは人工海水中で非常
に良く生育する。
【００３２】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
生産菌を培養するに当たり、生産量は培養条件により変
動するが、培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは６〜
９がよく、５〜７２時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素の生産量は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素の生産量が最大になる様に
設定するのは当然のことである。また、当該硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在
する。
生産菌を培養するに当たり、生産量は培養条件により変
動するが、培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは６〜
９がよく、５〜７２時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素の生産量は最高に達する。培
養条件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素の生産量が最大になる様に
設定するのは当然のことである。また、当該硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在
する。
【００３３】上記のフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−
００８２を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常
用いられる細胞破砕手段、例えば、超音波処理等で菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出
液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得
ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製
を行い、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素
を含まない純化された本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌
体を除去した培養上清中にも本酵素が大量に存在するの
で、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することが
できる。
００８２を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常
用いられる細胞破砕手段、例えば、超音波処理等で菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出
液から通常用いられる精製手段により精製酵素標品を得
ることができる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロ
マト、疎水結合カラムクロマト、ゲルろ過等により精製
を行い、実質的に他の硫酸化フコース含有多糖分解酵素
を含まない純化された本発明の硫酸化フコガラクタン分
解酵素を得ることができる。また、上述の培養液から菌
体を除去した培養上清中にも本酵素が大量に存在するの
で、菌体内酵素と同様の精製手段により精製することが
できる。
【００３４】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
理化学的性質は以下の通りである。 （Ｉ）作用：構成糖としてガラクトースとフコースを
含有し、そのモル比が１：１〜６：１である硫酸化フコ
ガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタ
ンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。 （ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約７〜９付近に
ある（図１）。すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと
相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
（％）、横軸はｐＨを示す。 （ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５
℃付近にある（図２）。すなわち図２は、本酵素の反応
時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は
相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
理化学的性質は以下の通りである。 （Ｉ）作用：構成糖としてガラクトースとフコースを
含有し、そのモル比が１：１〜６：１である硫酸化フコ
ガラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタ
ンを低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる。 （ＩＩ）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約７〜９付近に
ある（図１）。すなわち図１は本酵素の反応時のｐＨと
相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
（％）、横軸はｐＨを示す。 （ＩＩＩ）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５
℃付近にある（図２）。すなわち図２は、本酵素の反応
時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は
相対活性（％）、横軸は温度（℃）を示す。
【００３５】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
確認は、例えば、該酵素を硫酸化フコガラクタンに作用
させて得られる分解物をＨＰＬＣにより分析し、低分子
化の程度を測定することによって、あるいは生成する還
元末端を常法により測定することによって行なうことが
できる。活性測定は、産生菌の細胞抽出液もしくはクロ
マト精製後の酵素液のいずれにおいても可能である。
確認は、例えば、該酵素を硫酸化フコガラクタンに作用
させて得られる分解物をＨＰＬＣにより分析し、低分子
化の程度を測定することによって、あるいは生成する還
元末端を常法により測定することによって行なうことが
できる。活性測定は、産生菌の細胞抽出液もしくはクロ
マト精製後の酵素液のいずれにおいても可能である。
【００３６】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵
素を本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化
フコガラクタン含有物に作用させることによって調製す
ることができる。本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
としては、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンの部分
精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐
藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使
用できる。
物又はその塩は、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵
素を本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化
フコガラクタン含有物に作用させることによって調製す
ることができる。本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
としては、例えば本発明の硫酸化フコガラクタンの部分
精製品、褐藻類由来の硫酸化フコース含有多糖画分、褐
藻類の水性溶媒抽出物、もしくは褐藻類藻体が好適に使
用できる。
【００３７】本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは
該硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行
えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン、
若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高
溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考
慮して選定すればよい。本発明の硫酸化フコガラクタン
の溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択す
ればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は
通常３０℃付近で行う。酵素量や反応時間等を調整する
ことによって、低分子化物の分子量を調整することもで
きる。次に低分子化物を分子量分画することによって、
更に均一な分子量分布の本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処
理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。
該硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行
えばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン、
若しくは該硫酸化フコガラクタン含有物濃度はその最高
溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考
慮して選定すればよい。本発明の硫酸化フコガラクタン
の溶解液としては水、緩衝液等より目的に応じて選択す
ればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近で、酵素反応は
通常３０℃付近で行う。酵素量や反応時間等を調整する
ことによって、低分子化物の分子量を調整することもで
きる。次に低分子化物を分子量分画することによって、
更に均一な分子量分布の本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処
理、無菌処理、凍結乾燥処理をすることもできる。
【００３８】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物は、特に限定はないが、例えば本発明の硫酸化フコガ
ラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物として２糖類〜６糖類が挙
げられる。本発明の低分子化物中に存在する硫酸基の置
換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたもので
あれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物
の化学構造は、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に
示される。その中で、下記一般式（ＩＩＩ）は、前述の
硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
物は、特に限定はないが、例えば本発明の硫酸化フコガ
ラクタンに本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作
用させて得られる低分子化物として２糖類〜６糖類が挙
げられる。本発明の低分子化物中に存在する硫酸基の置
換位置は、調製方法によって変化するが、本発明の硫酸
化フコガラクタン分解酵素を作用させて得られたもので
あれば、本発明の低分子化物に含まれる。該低分子化物
の化学構造は、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に
示される。その中で、下記一般式（ＩＩＩ）は、前述の
硫酸化フコガラクタンの構成単位であると考えられる。
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
（式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）
【００３９】また、本発明の低分子化物は、硫酸基を分
子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形
成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分
子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウ
ム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形
態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０
Ｗ（ダウケミカル社製）等の陽イオン交換樹脂を利用す
ることによって遊離の本発明の硫酸化フコガラクタンの
低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、
更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。
子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形
成する。これらの本発明の硫酸化フコガラクタンの低分
子化物は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリウ
ム及び／又はカリウム及び／又はカルシウム等の塩の形
態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス５０
Ｗ（ダウケミカル社製）等の陽イオン交換樹脂を利用す
ることによって遊離の本発明の硫酸化フコガラクタンの
低分子化物に導くことが可能である。また、これらは、
更に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩
に交換することができる。
【００４０】本発明の硫酸化フコガラクタンの低分子化
物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることが
でき、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の
塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の
塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が
挙げられる。
物の塩としては、薬学的に許容される塩を用いることが
でき、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の
塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の
塩、亜鉛等の遷移金属の塩、またはアンモニウム塩等が
挙げられる。
【００４１】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を
用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれて
いる本発明の硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させ
ることができるので、分子量分画と組み合わせることに
よって本発明の硫酸化フコガラクタンを選択的に除去す
ることが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗
凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様
々な生物活性があることが報告されている。これまで、
褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン
及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、
当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り
除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得
ることができる。
用いれば任意の硫酸化フコース含有多糖画分に含まれて
いる本発明の硫酸化フコガラクタンのみを低分子化させ
ることができるので、分子量分画と組み合わせることに
よって本発明の硫酸化フコガラクタンを選択的に除去す
ることが可能である。例えば、硫酸化フカン画分には抗
凝血活性、癌転移抑制活性、ウイルス感染抑制活性等様
々な生物活性があることが報告されている。これまで、
褐藻類から得られた硫酸化フカン画分には硫酸化フカン
及びその他の多糖類が含まれている。従って、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素を利用することにより、
当該硫酸化フカン画分から硫酸化フコガラクタンを取り
除くことができ、その結果、高純度の硫酸化フカンを得
ることができる。
【００４２】さらに例えば、硫酸化フコグルクロノマン
ナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があるこ
とが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラ
クタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た
硫酸化フコグルクロノマンナンに共雑する本発明の硫酸
化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結
果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得
ることができる。
ナンには癌細胞に対するアポトーシス誘発作用があるこ
とが報告されている。従って、本発明の硫酸化フコガラ
クタン分解酵素を利用することにより、褐藻類から得た
硫酸化フコグルクロノマンナンに共雑する本発明の硫酸
化フコガラクタンを容易に取り除くことができ、その結
果、高純度の硫酸化フコグルクロノマンナンを簡便に得
ることができる。
【００４３】本発明の硫酸化フコガラクタンを除去する
方法としては、たとえば、本発明の硫酸化フコガラクタ
ン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。本発明の
硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行え
ばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含有
物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作
性、酵素力価を考慮して選定すればよい。本発明の硫酸
化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的
に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近
が好ましい。次に本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは
該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ本
発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応
は通常３０℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工
程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その
後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を容易に除去された目的物を調製すること
ができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法
を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画
膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
方法としては、たとえば、本発明の硫酸化フコガラクタ
ン含有物が水系溶媒に溶けた溶液を調製する。本発明の
硫酸化フコガラクタン含有物の溶解は通常の方法で行え
ばよく、溶解液中の本発明の硫酸化フコガラクタン含有
物濃度はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作
性、酵素力価を考慮して選定すればよい。本発明の硫酸
化フコガラクタン溶解液としては水、緩衝液等より目的
に応じて選択すればよい。溶解液のｐＨは通常中性付近
が好ましい。次に本発明の硫酸化フコガラクタン含有物
溶液に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素もしくは
該酵素の固定化物、あるいは両方を添加して反応させ本
発明の硫酸化フコガラクタンを低分子化する。酵素反応
は通常３０℃付近で行い、酵素量や反応時間等は、次工
程の分子量分画能に応じて適宜調整すればよい。その
後、分子量分画すれば、本発明の硫酸化フコガラクタン
の低分子化物を容易に除去された目的物を調製すること
ができる。分子量分画は、通常よく使用されている方法
を適用することができ、例えばゲルろ過法や分子量分画
膜を利用した限外ろ過法を使用すればよい。
【００４４】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用するため、本
発明の硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させると、前
記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に示される化学構造を有する
低分子化物が得られる。
は、本発明の硫酸化フコガラクタンに作用するため、本
発明の硫酸化フコガラクタンの構造解析に用いることが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンに本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させると、前
記一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）に示される化学構造を有する
低分子化物が得られる。
【００４５】さらに本発明の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタンを含有
する硫酸化フコース含有多糖から本発明の硫酸化フコガ
ラクタン成分を選択的に除去することができる。例え
ば、本発明の硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の
高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマ
ンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
酵素を用いれば、本発明の硫酸化フコガラクタンを含有
する硫酸化フコース含有多糖から本発明の硫酸化フコガ
ラクタン成分を選択的に除去することができる。例え
ば、本発明の硫酸化フコガラクタン成分を除去した後の
高純度の硫酸化フカンもしくは硫酸化フコグルクロノマ
ンナンは、医薬品の原材料としても好適に使用できる。
【００４６】本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、ＷＯ９７／２６８９６号公報に記載のフコース硫酸
含有多糖−Ｆ分解酵素及び／又はＷＯ９７／２６８９６
号公報記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素と組み
合わせて使用することができる。特に限定はないが例え
ば、ガゴメ昆布からｐＨ４〜９、１００℃以下の温度で
抽出する方法で得た硫酸化フコース含有多糖の混合物を
上記フコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素及び本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素で処理すると下記一般式
（ＸＩＶ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分と
し、その繰り返し構造を有する硫酸化多糖を得ることが
できる。下記一般式においてｎは、１以上の整数であ
り、例えば、１〜１０，０００の範囲、さらに好ましく
は１〜５，０００の範囲のものが得られる。
は、ＷＯ９７／２６８９６号公報に記載のフコース硫酸
含有多糖−Ｆ分解酵素及び／又はＷＯ９７／２６８９６
号公報記載のフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素と組み
合わせて使用することができる。特に限定はないが例え
ば、ガゴメ昆布からｐＨ４〜９、１００℃以下の温度で
抽出する方法で得た硫酸化フコース含有多糖の混合物を
上記フコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素及び本発明の硫
酸化フコガラクタン分解酵素で処理すると下記一般式
（ＸＩＶ）で表される硫酸化糖を構成糖の必須成分と
し、その繰り返し構造を有する硫酸化多糖を得ることが
できる。下記一般式においてｎは、１以上の整数であ
り、例えば、１〜１０，０００の範囲、さらに好ましく
は１〜５，０００の範囲のものが得られる。
【化１８】
（式中、Ｒは、Ｈ又はＯＳＯ3Ｈである）
【００４７】上記硫酸化多糖は、構成糖としてフコース
を含有する。例えば、抽出時の処理条件が、ｐＨ６〜
８、９５℃ ２時間程度の場合は、平均分子量は約２０
万（分子量分布は、約１万〜約１００万）である。さら
に例えば、抽出時の処理条件が、ｐＨ６〜８、２５℃
２４時間程度の場合は、平均分子量は約１，３００万
（分子量分布は、約１０万〜約２，０００万）である。
このように抽出条件によって平均分子量及び分子量分布
は異なってくる。しかしながら、いずれの抽出条件にお
いても得られる硫酸化多糖は、上記フコース硫酸含有多
糖−Ｆ分解酵素で低分子化される。なお、上記硫酸化多
糖の分子量及び硫酸基含量は、該硫酸化多糖の原料の収
穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異な
り、また抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。
例えば、酸により加水分解される場合がある。従って、
本明細書に記載した上記硫酸化多糖の分子量、分子量分
布あるいは硫酸基含量はその１例にすぎず、該硫酸化多
糖の抽出処理条件により、その分子量、分子量分布ある
いは硫酸基含量は容易に変化させ得る。すなわち、調製
方法の条件によって任意の分子量、分子量分布あるいは
硫酸基含量の上記硫酸化多糖を調製することができる。
例えば、上記硫酸化多糖の主要な構成糖は、７糖あたり
およそ１２残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖に
エステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であ
り、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。
例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばそ
の硫酸含量は減少するものである。すなわち、上記硫酸
化多糖から意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。
を含有する。例えば、抽出時の処理条件が、ｐＨ６〜
８、９５℃ ２時間程度の場合は、平均分子量は約２０
万（分子量分布は、約１万〜約１００万）である。さら
に例えば、抽出時の処理条件が、ｐＨ６〜８、２５℃
２４時間程度の場合は、平均分子量は約１，３００万
（分子量分布は、約１０万〜約２，０００万）である。
このように抽出条件によって平均分子量及び分子量分布
は異なってくる。しかしながら、いずれの抽出条件にお
いても得られる硫酸化多糖は、上記フコース硫酸含有多
糖−Ｆ分解酵素で低分子化される。なお、上記硫酸化多
糖の分子量及び硫酸基含量は、該硫酸化多糖の原料の収
穫期、該原料の乾燥方法、該原料の保存方法により異な
り、また抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異なる。
例えば、酸により加水分解される場合がある。従って、
本明細書に記載した上記硫酸化多糖の分子量、分子量分
布あるいは硫酸基含量はその１例にすぎず、該硫酸化多
糖の抽出処理条件により、その分子量、分子量分布ある
いは硫酸基含量は容易に変化させ得る。すなわち、調製
方法の条件によって任意の分子量、分子量分布あるいは
硫酸基含量の上記硫酸化多糖を調製することができる。
例えば、上記硫酸化多糖の主要な構成糖は、７糖あたり
およそ１２残基の硫酸基を含んでいるが、一般的に糖に
エステル結合している硫酸基は、化学的に不安定であ
り、酸やアルカリあるいは熱により容易に切断される。
例えば、酸性やアルカリ性条件下で加熱処理を行えばそ
の硫酸含量は減少するものである。すなわち、上記硫酸
化多糖から意図的に脱硫酸が可能である。また、脱硫酸
の際、酸やアルカリの種類や濃度、加熱処理時の温度や
時間を調整すれば、切断する硫酸基の量も調整すること
ができる。
【００４８】さらに、上記硫酸化フコガラクタン分解酵
素、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びフコース硫
酸含有多糖−Ｕ分解酵素を組み合わせて使用することに
より新規硫酸化糖を取得することができる。また、前述
の３種類の分解酵素の組み合わせにより従来とは異なる
硫酸化糖の分類をすることができる。特に限定はない
が、例えば、上記ガゴメ昆布のような褐藻類由来の硫酸
化フコース含有多糖の混合物に作用させて、 フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−Ｕ分解酵素で分解されず、硫酸化フコガラク
タン分解酵素で分解される硫酸化糖画分（本発明の硫酸
化フコガラクタン）； フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
Ｆ分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−Ｕ分
解酵素で分解される硫酸化糖画分； フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
Ｕ分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分
解酵素で分解される硫酸化糖画分； フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素で分解
されない硫酸化糖画分；をそれぞれ得ることができる。
これらの硫酸化糖画分は、本発明のフコガラクタン分解
酵素とフコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素あるいはフコ
ース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を組み合わせることによ
って初めて得られる。
素、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びフコース硫
酸含有多糖−Ｕ分解酵素を組み合わせて使用することに
より新規硫酸化糖を取得することができる。また、前述
の３種類の分解酵素の組み合わせにより従来とは異なる
硫酸化糖の分類をすることができる。特に限定はない
が、例えば、上記ガゴメ昆布のような褐藻類由来の硫酸
化フコース含有多糖の混合物に作用させて、 フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素及びフコース硫酸
含有多糖−Ｕ分解酵素で分解されず、硫酸化フコガラク
タン分解酵素で分解される硫酸化糖画分（本発明の硫酸
化フコガラクタン）； フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
Ｆ分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−Ｕ分
解酵素で分解される硫酸化糖画分； フコガラクタン分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−
Ｕ分解酵素で分解されず、フコース硫酸含有多糖−Ｆ分
解酵素で分解される硫酸化糖画分； フコガラクタン分解酵素、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
分解酵素及びフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素で分解
されない硫酸化糖画分；をそれぞれ得ることができる。
これらの硫酸化糖画分は、本発明のフコガラクタン分解
酵素とフコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素あるいはフコ
ース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を組み合わせることによ
って初めて得られる。
【００４９】本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩
は、成長因子産生誘導活性、特にＨＧＦ(hepatocyte gr
owth factor)産生誘導活性を有する。
は、成長因子産生誘導活性、特にＨＧＦ(hepatocyte gr
owth factor)産生誘導活性を有する。
【００５０】部分肝切除を受けた肝臓は、速やかに再生
し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長
年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中にＨＧＦが見
出され、その患者血漿から、単離、精製された（Ｊ．Cl
in．Invest．，88 414−419，1988）。さらに、ヒトＨ
ＧＦのｃＤＮＡもクローニングされ、ＨＧＦの１次構造
も明らかにされた（Biochem．Biophys．Res．Commu
n．，163 967-973，1989）。また、細胞の運動性を亢
進させるｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ（ＳＦ）およ
び、腫瘍細胞障害因子であるｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）とＨＧＦが同一物質で
あることも明らかになった（Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA 88 7001-7005，1991：Biochem．Biophys．Res．Co
mmun．，180 1151-1158，1991）。
し、もとのサイズになる。この肝再生因子の本体は、長
年不明であったが、劇症肝炎患者の血漿中にＨＧＦが見
出され、その患者血漿から、単離、精製された（Ｊ．Cl
in．Invest．，88 414−419，1988）。さらに、ヒトＨ
ＧＦのｃＤＮＡもクローニングされ、ＨＧＦの１次構造
も明らかにされた（Biochem．Biophys．Res．Commu
n．，163 967-973，1989）。また、細胞の運動性を亢
進させるｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ（ＳＦ）およ
び、腫瘍細胞障害因子であるｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏ
ｘｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＦ）とＨＧＦが同一物質で
あることも明らかになった（Proc．Natl．Acad．Sci．U
SA 88 7001-7005，1991：Biochem．Biophys．Res．Co
mmun．，180 1151-1158，1991）。
【００５１】ＨＧＦは、肝細胞だけでなく胆管上皮細
胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞
の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や
血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形
成を誘導するなど、ＨＧＦは極めて多彩な生理活性を示
す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器におい
て、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促
進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を
行う。また、ＨＧＦは、肝細胞増殖作用、タンパク合成
促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎
障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症
肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待
されている。
胞、腎尿細管上皮細胞、胃粘膜細胞など多くの上皮細胞
の増殖を促進させる。また、上皮細胞の運動性の亢進や
血管新生、上皮細胞の管腔形成で見られるような形態形
成を誘導するなど、ＨＧＦは極めて多彩な生理活性を示
す多機能活性物質である。つまり、様々な臓器におい
て、その臓器の障害を修復する際の上皮細胞の増殖を促
進、運動性の亢進や血管新生などの形態形成の誘導等を
行う。また、ＨＧＦは、肝細胞増殖作用、タンパク合成
促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎
障害の予防作用などを示す。これらのことからも、重症
肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞の治療薬として期待
されている。
【００５２】またＨＧＦのｍＲＮＡは、脳、腎臓、肺等
でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮
細胞等に対しても増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因
子である。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩は、肝細胞増殖因子の産生を誘導することによ
り、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢
性腎炎、肺炎、創傷の治療剤又は予防剤の成分として有
用である。
でも合成されており、肝実質細胞、腎細尿管細胞、表皮
細胞等に対しても増殖活性がある、中胚葉性細胞成長因
子である。従って、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩は、肝細胞増殖因子の産生を誘導することによ
り、肝炎、重症肝炎、肝硬変および肝内胆汁うっ滞、慢
性腎炎、肺炎、創傷の治療剤又は予防剤の成分として有
用である。
【００５３】本発明の硫酸化フコガラクタン又はその塩
は、そのＨＧＦ産生誘導作用により、化粧料の有効成分
として使用することができ、例えばＨＧＦ産生誘導用化
粧料として有用であり、ＨＧＦ産生誘導作用を有するバ
イオ化粧品が提供できる。
は、そのＨＧＦ産生誘導作用により、化粧料の有効成分
として使用することができ、例えばＨＧＦ産生誘導用化
粧料として有用であり、ＨＧＦ産生誘導作用を有するバ
イオ化粧品が提供できる。
【００５４】さらに、本発明の硫酸化フコガラクタン又
はその塩を含有する成長因子産生誘導用化粧品、例えば
ＨＧＦ産生誘導用化粧品は、常法に従って製造すること
ができ、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パ
ック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又
は洗髪剤が挙げられる。
はその塩を含有する成長因子産生誘導用化粧品、例えば
ＨＧＦ産生誘導用化粧品は、常法に従って製造すること
ができ、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パ
ック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又
は洗髪剤が挙げられる。
【００５５】本発明の硫酸化フコガラクタン、若しくは
該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩
は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、
常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガ
ラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動
物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製
することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原
を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞を
融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、この細胞を培養することによって調製することがで
きる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタン
若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれ
らの塩の精製に使用することができる。また、海藻中の
本発明の硫酸化フコガラクタンの同定に使用することが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンを認識
する抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化フコ
ガラクタン含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率
よく調製することが可能になる。さらに、本発明の硫酸
化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの
低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、本発明の
硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタ
ンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウ
イルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用
である。
該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれらの塩
は、抗原として使用することができる。抗体の作製は、
常法により行われるが、例えば、本発明の硫酸化フコガ
ラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化
物又はそれらの塩をアジュバンドとともにウサギ等の動
物に免疫することによって、ポリクローナル抗体を調製
することができる。また、モノクローナル抗体は、抗原
を免疫して得られた抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞を
融合し、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択
し、この細胞を培養することによって調製することがで
きる。これらの抗体は、本発明の硫酸化フコガラクタン
若しくは該硫酸化フコガラクタンの低分子化物又はそれ
らの塩の精製に使用することができる。また、海藻中の
本発明の硫酸化フコガラクタンの同定に使用することが
できる。例えば、本発明の硫酸化フコガラクタンを認識
する抗体を使用し、海藻抽出液中の本発明の硫酸化フコ
ガラクタン含量を容易に測定でき、高含有抽出液を効率
よく調製することが可能になる。さらに、本発明の硫酸
化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタンの
低分子化物又はそれらの塩を認識する抗体は、本発明の
硫酸化フコガラクタン、若しくは該硫酸化フコガラクタ
ンの低分子化物又はそれらの塩の受精阻害作用機作、ウ
イルス感染阻害機作、生体内での代謝等の解析等に有用
である。
【００５６】また、本発明の硫酸化フコガラクタン又は
その塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用
させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学
用試薬として用いることができる。例えば、特公平５−
６５１０８号公報記載の方法によりピリジル−（２）−
アミノ化（ＰＡ化）を行い、該低分子化物のＰＡ化物を
調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を
提供することができる。
その塩に本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用
させて得られた低分子化物即ちオリゴ糖類は、糖鎖工学
用試薬として用いることができる。例えば、特公平５−
６５１０８号公報記載の方法によりピリジル−（２）−
アミノ化（ＰＡ化）を行い、該低分子化物のＰＡ化物を
調製すれば、糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を
提供することができる。
【００５７】
【実施例】以下に本発明を実施例をもって具体的に示す
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。
が、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるもの
ではない。
【００５８】実施例１ 硫酸化フコガラクタンの調製
（１）硫酸化フコガラクタンを下記の工程により調製し
た。 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着
したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０
リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後
ろ過、洗浄した。得られた残さを５０ｍＭの塩化カルシ
ウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノー
ル、及びＷＯ９７／２６８９６公報記載のアルテロモナ
ス ｓｐ． ＳＮ−１００９株（通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）］に平成８年
（１９９６年）２月１３日よりＦＥＲＭ Ｐ−１５４３
６として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５７４７［国際寄託へ
の移管請求日：平成８年（１９９６年）１１月１５日］
として寄託)を培養し、該培養物から得られたフコース
硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３
０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２
５℃で２日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖
による強い粘弾性が完全に消失したので低分子化した硫
酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径３２μｍの
ステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを１
００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び
４ｇのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業製）を
含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を
得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化
物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを
装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％
のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウム
を添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しなが
ら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウム
によりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１
リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去し
た。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清
に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩
化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロ
ファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を
集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ
の塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾
燥物の重量は２９．３ｇであった。
た。 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着
したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０
リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後
ろ過、洗浄した。得られた残さを５０ｍＭの塩化カルシ
ウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノー
ル、及びＷＯ９７／２６８９６公報記載のアルテロモナ
ス ｓｐ． ＳＮ−１００９株（通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）］に平成８年
（１９９６年）２月１３日よりＦＥＲＭ Ｐ−１５４３
６として寄託され、前記通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−５７４７［国際寄託へ
の移管請求日：平成８年（１９９６年）１１月１５日］
として寄託)を培養し、該培養物から得られたフコース
硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３
０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２
５℃で２日攪拌すると高分子の硫酸化フコース含有多糖
による強い粘弾性が完全に消失したので低分子化した硫
酸化フコース含有多糖を除去するため、穴径３２μｍの
ステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残さを１
００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のエタノール、及び
４ｇのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業製）を
含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
６）に懸濁し、２５℃、４日攪拌後、遠心分離し上清を
得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化
物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを
装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％
のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウム
を添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しなが
ら、１Ｎの塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、得られた上清を１Ｎの水酸化ナトリウム
によりｐＨ８．０とした。この溶液を限外ろ過により１
リットルに濃縮後、１００ｍＭの塩化ナトリウムで溶液
交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去し
た。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清
に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍの塩
化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロ
ファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を
集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ
の塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾
燥物の重量は２９．３ｇであった。
【００５９】（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム及びＷＯ９７／２６８９６公報記載
のフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６
６）］に平成７年（１９９５年）３月２９日よりＦＥＲ
ＭＰ−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２［国際寄託への移管請求日：平成８年（１９９６
年）２月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を９Ｕ含む
１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、
２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍｌ
に濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チュー
ブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコ
グルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残っ
た液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リッ
トルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社
製）にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５
０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出
を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウム
で充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナ
トリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分と
して集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮
後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾
燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を０．８
５ｇ得た。この画分について、糖組成分析を行なった。
まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー( Journal of Biological Chemistry)、第１７５巻、
第５９５頁（１９４８）の記載に従い、フコース量を定
量した。
Ｍの塩化ナトリウム及びＷＯ９７／２６８９６公報記載
のフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所［日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６
６）］に平成７年（１９９５年）３月２９日よりＦＥＲ
ＭＰ−１４８７２として寄託され、前記通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２［国際寄託への移管請求日：平成８年（１９９６
年）２月１５日］として寄託）を培養し、該培養物から
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を９Ｕ含む
１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、
２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍｌ
に濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チュー
ブに入れて徹底的に透析し、低分子化された硫酸化フコ
グルクロノマンナンを除去した。透析チューブ内に残っ
た液を、５０ｍＭの塩化ナトリウムで平衡化した４リッ
トルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社
製）にかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５
０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出
を行った。更に同カラムを６５０ｍＭの塩化ナトリウム
で充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭの塩化ナ
トリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分と
して集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮
後、１０ｍＭの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾
燥して硫酸化フコガラクタン画分の凍結乾燥物を０．８
５ｇ得た。この画分について、糖組成分析を行なった。
まず、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー( Journal of Biological Chemistry)、第１７５巻、
第５９５頁（１９４８）の記載に従い、フコース量を定
量した。
【００６０】次に、得られた硫酸化フコガラクタンの乾
燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１
０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、
グライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグ リ
ージェント キット（宝酒造社製）を用いて加水分解し
て得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミ
ノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べ
た。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、１１
０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次に、
グライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコタッグ リ
ージェント キット（宝酒造社製）を用いて加水分解し
て得られた単糖の還元性末端をピリジル−（２）−アミ
ノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬＣにより構成糖の比率を調べ
た。なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
【００６１】装置；Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム；パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ；宝酒造社製） 溶離液；７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出；蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励
起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速；０．３ｍｌ／分 カラム温度；６５℃
ｍ；宝酒造社製） 溶離液；７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出；蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励
起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速；０．３ｍｌ／分 カラム温度；６５℃
【００６２】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。さら
に、バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journa
l)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫
酸含量を定量した。
ー(Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。さら
に、バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journa
l)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）の記載に従い硫
酸含量を定量した。
【００６３】以上の結果、得られた硫酸化フコガラクタ
ンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、
そのモル比は、約２：１であった。ウロン酸及びその他
の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコ
ースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
ンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、
そのモル比は、約２：１であった。ウロン酸及びその他
の中性糖は実質的に含有されていなかった。また、フコ
ースと硫酸基のモル比は約１：２であった。
【００６４】（３）硫酸化フコガラクタン分解酵素の活
性測定方法 （２）で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性を測定する
ときは下記の要領で行った。
性測定方法 （２）で得られた硫酸化フコガラクタン画分を用いて本
発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の活性を測定する
ときは下記の要領で行った。
【００６５】すなわち、６０μｌの５０ｍＭのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、４．８μｌの２．
５％の硫酸化フコガラクタン画分溶液と、６μｌの４Ｍ
塩化ナトリウムと、３７．２μｌの水と１２μｌの本発
明の第１の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混
合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃
で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣに
より分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、
本発明の第１の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様
の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン
画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、
それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
ール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）と、４．８μｌの２．
５％の硫酸化フコガラクタン画分溶液と、６μｌの４Ｍ
塩化ナトリウムと、３７．２μｌの水と１２μｌの本発
明の第１の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素とを混
合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃
で１０分間処理し、遠心分離後１００μｌをＨＰＬＣに
より分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、
本発明の第１の発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素の
代わりに、その酵素を溶解してある緩衝液を用いて同様
の条件により反応させたもの及び硫酸化フコガラクタン
画分の代わりに水を用いて反応を行ったものを用意し、
それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
【００６６】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌの硫酸化フコガラクタン画分のガラクト
シル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクト
シル結合の量は下記式により求めた。
間に１μｍｏｌの硫酸化フコガラクタン画分のガラクト
シル結合を切断する酵素量とする。切断されたガラクト
シル結合の量は下記式により求めた。
【００６７】{(4.8×1000×2.5/100)/MG}×{(MG/M)−1}
×{1/(180×0.012)}＝U/ml 4.8×1000×2.5/100：反応系中に添加した硫酸化フコガ
ラクタン（μｇ） MG：基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量 M：反応生成物の平均分子量 (MG/M)−1：１分子の硫酸化フコガラクタンが酵素によ
り切断された数 180：反応時間（分） 0.012：酵素液量（ｍｌ）
×{1/(180×0.012)}＝U/ml 4.8×1000×2.5/100：反応系中に添加した硫酸化フコガ
ラクタン（μｇ） MG：基質硫酸化フコガラクタン画分の平均分子量 M：反応生成物の平均分子量 (MG/M)−1：１分子の硫酸化フコガラクタンが酵素によ
り切断された数 180：反応時間（分） 0.012：酵素液量（ｍｌ）
【００６８】なお、ＨＰＬＣ条件は下記によった。
装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６ＨＱ（８×３００ｍ
ｍ、昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩
化ナトリウム 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃
ｍ、昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩
化ナトリウム 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃
【００６９】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲
線とした。
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で
分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に
表し、上記酵素反応生成物の分子量測定のための標準曲
線とした。
【００７０】蛋白質の定量は、酵素液の２８０ｎｍの吸
光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌ
の蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。
光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／ｍｌ
の蛋白質溶液の吸光度を１．０として計算した。
【００７１】実施例２ 硫酸化フコガラクタン分解酵素
の作用機作の決定 （１）硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製 硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産のため、フラボバ
クテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４０２）をグルコース０．１％、ペプトン１．０％、
酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボ
ラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを１２
０℃、２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時
間培養して種培養液とした。下記の実施例３（１）の方
法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖
画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１
％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１
％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１
２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６
００ｍｌを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リット
ルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
の作用機作の決定 （１）硫酸化フコガラクタン分解酵素の調製 硫酸化フコガラクタン分解酵素の生産のため、フラボバ
クテリウム ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４０２）をグルコース０．１％、ペプトン１．０％、
酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボ
ラトリー製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを１２
０℃、２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時
間培養して種培養液とした。下記の実施例３（１）の方
法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含有多糖
画分０．２％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．０１
％、及び消泡剤（ＫＭ７０、信越化学工業製）０．０１
％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培地２０リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターにいれ１
２０℃で２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６
００ｍｌを接種し、２４℃で２３時間、毎分１０リット
ルの通気量と毎分１２５回転の攪拌速度の条件で培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
【００７２】得られた菌体を、１，２００ｍｌの０．４
Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して
菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で
充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に
終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈
殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍｌの
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析
し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化
した５００ｍＬのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシ
ャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度
勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して
菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で
充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に
終濃度が９０％飽和となるように硫安を添加し生じた沈
殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を１５０ｍｌの
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析
し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化
した５００ｍＬのＤＥＡＥ−セファロースＦＦ（アマシ
ャムファルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で
洗浄後、５０ｍＭから６００ｍＭ塩化ナトリウムの濃度
勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
【００７３】得られた活性画分を０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍＬのＤＥ
ＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍから０．４Ｍ
の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分
を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナ
トリウムを添加し、４Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２
０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）
のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍから１Ｍの
塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍの
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得
られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添
加し、３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍＬのＰｈ
ｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにか
け、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍの塩化ナト
リウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍの塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。この様に
して得られた精製酵素を硫酸化フコガラクタン分解酵素
として用いた。
ムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した１００ｍＬのＤＥ
ＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラ
ムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍから０．４Ｍ
の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分
を集めた。得られた活性画分に４Ｍとなるように塩化ナ
トリウムを添加し、４Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した２
０ｍＬのＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）
のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、４Ｍから１Ｍの
塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに１Ｍの
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。得
られた活性画分に３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添
加し、３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した１０ｍＬのＰｈ
ｅｎｙｌ−セルロファイン（チッソ社製）のカラムにか
け、同じ緩衝液で洗浄後、３Ｍから０．５Ｍの塩化ナト
リウムの濃度勾配により溶出後、さらに０．５Ｍの塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）で充分溶出させ、活性画分を集めた。この様に
して得られた精製酵素を硫酸化フコガラクタン分解酵素
として用いた。
【００７４】（２）硫酸化フコガラクタンの低分子化物
の調製 実施例１（２）記載の硫酸化フコガラクタン画分に上記
の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させ低分子
化物を調製した。すなわち、１．９４ｇの硫酸化フコガ
ラクタン画分を０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１８６
ｍＵの実施例２（１）記載の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を加え、２５℃で、６日間反応させた。反応液をエ
バポレーターにより８０ｍｌに濃縮し、セルロファイン
ＧＣＬ−１０００（チッソ社製）のカラム（４×９０ｃ
ｍ）による分子量分画を行った。分子量１５，０００以
下の画分を集め、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画分
とした。
の調製 実施例１（２）記載の硫酸化フコガラクタン画分に上記
の精製硫酸化フコガラクタン分解酵素を作用させ低分子
化物を調製した。すなわち、１．９４ｇの硫酸化フコガ
ラクタン画分を０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、１８６
ｍＵの実施例２（１）記載の硫酸化フコガラクタン分解
酵素を加え、２５℃で、６日間反応させた。反応液をエ
バポレーターにより８０ｍｌに濃縮し、セルロファイン
ＧＣＬ−１０００（チッソ社製）のカラム（４×９０ｃ
ｍ）による分子量分画を行った。分子量１５，０００以
下の画分を集め、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画分
とした。
【００７５】次に、硫酸化フコガラクタン酵素消化物画
分の一部をグライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコ
タッグ リージェント キット（宝酒造社製）を用いて
還元性末端をＰＡ化し、得られたＰＡ化糖を２規定の塩
酸中で１００℃、３時間処理により加水分解し、ＨＰＬ
Ｃにより還元末端糖を調べた。ＨＰＬＣ条件は下記によ
った。
分の一部をグライコタッグ（宝酒造社製）及びグライコ
タッグ リージェント キット（宝酒造社製）を用いて
還元性末端をＰＡ化し、得られたＰＡ化糖を２規定の塩
酸中で１００℃、３時間処理により加水分解し、ＨＰＬ
Ｃにより還元末端糖を調べた。ＨＰＬＣ条件は下記によ
った。
【００７６】装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製）
カラム：パルパックタイプＡ（４．６×１５０ｍｍ、宝
酒造社製） 溶離液：０．７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセト
ニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器（Ｆ−１１５０、日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、 蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃
酒造社製） 溶離液：０．７Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセト
ニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器（Ｆ−１１５０、日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、 蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃
【００７７】この結果、ガラクトースのみが検出された
ので、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物画分の還元性
末端は総て硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースで
あることが判明した。
ので、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物画分の還元性
末端は総て硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースで
あることが判明した。
【００７８】また、硫酸化フコガラクタンの酵素消化物
画分の中性糖組成を分析するため、還元性末端糖を分析
した試料の一部を再度ＰＡ化し、上記と同じ条件でＨＰ
ＬＣにより分析した。その結果、硫酸化フコガラクタン
の酵素消化物画分はガラクトースとフコースからなり、
そのモル比は、約２：１であることが判明した。前述の
結果より、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、
硫酸化フコガラクタンのガラクトシル結合を切断して還
元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを
持つオリゴ糖を生成させるエンド型ガラクトシダーゼ類
であることが判明した。
画分の中性糖組成を分析するため、還元性末端糖を分析
した試料の一部を再度ＰＡ化し、上記と同じ条件でＨＰ
ＬＣにより分析した。その結果、硫酸化フコガラクタン
の酵素消化物画分はガラクトースとフコースからなり、
そのモル比は、約２：１であることが判明した。前述の
結果より、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素は、
硫酸化フコガラクタンのガラクトシル結合を切断して還
元性末端に硫酸化ガラクトースあるいはガラクトースを
持つオリゴ糖を生成させるエンド型ガラクトシダーゼ類
であることが判明した。
【００７９】実施例３
（１）ガゴメ昆布から硫酸化フコース含有多糖画分を調
製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを穴径
１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産
業社製）で破砕し、２０リットルの８０％エタノール中
に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得ら
れた残さを４０リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウム
を含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍ
のステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に２０
０ｇの活性炭、４．５リットルのエタノール、１２，０
００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社
製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、遠心分離し
た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバー
を装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、遠心分
離により不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外
ろ過機により溶液交換して１００ｍＭ塩化ナトリウム溶
液とした。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐ
Ｈを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．
０とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶
物を遠心分離により除去後、５０％のエタノールを８２
ｍｌ添加して凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分の乾燥物を７６ｇ得た。
製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを穴径
１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産
業社製）で破砕し、２０リットルの８０％エタノール中
に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得ら
れた残さを４０リットルの１００ｍＭの塩化ナトリウム
を含む３０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍ
のステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に２０
０ｇの活性炭、４．５リットルのエタノール、１２，０
００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社
製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、遠心分離し
た。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバー
を装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、遠心分
離により不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外
ろ過機により溶液交換して１００ｍＭ塩化ナトリウム溶
液とした。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸によりｐ
Ｈを２．０とし、生じた沈殿を遠心分離により除去し
た。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムにより８．
０とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶
物を遠心分離により除去後、５０％のエタノールを８２
ｍｌ添加して凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分の乾燥物を７６ｇ得た。
【００８０】（２）フラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ−
００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を実施例３
（１）の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコー
ス含有多糖画分０．２％、ペプトン１．０％、酵母エキ
ス０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培
地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコにいれ１２
０℃で２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時
間、振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体と培養液上清を得た。
００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を実施例３
（１）の方法で調製したガゴメ昆布由来の硫酸化フコー
ス含有多糖画分０．２％、ペプトン１．０％、酵母エキ
ス０．０１％を含む人工海水（ｐＨ７．５）からなる培
地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコにいれ１２
０℃で２０分間殺菌した培地に接種し、２４℃で２３時
間、振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体と培養液上清を得た。
【００８１】得られた菌体を、５ｍｌの０．４Ｍ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽
出液を得た。
トリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽
出液を得た。
【００８２】上記の培養液上清と菌体抽出液に含まれる
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を測定した
結果、培養液上清には培地１ｍｌあたり２ｍＵ、菌体抽
出液には培地１ｍｌあたり２ｍＵの活性が検出された。
上記の培養条件を用いれば、本発明の硫酸化フコガラク
タン分解酵素はフラボバクテリウム属細菌の菌体内にも
菌体外にもほぼ同量含まれることが判明した。
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素活性を測定した
結果、培養液上清には培地１ｍｌあたり２ｍＵ、菌体抽
出液には培地１ｍｌあたり２ｍＵの活性が検出された。
上記の培養条件を用いれば、本発明の硫酸化フコガラク
タン分解酵素はフラボバクテリウム属細菌の菌体内にも
菌体外にもほぼ同量含まれることが判明した。
【００８３】実施例４
実施例３（１）で得られた硫酸化フコース含有多糖画分
７ｇを７００ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０％の
エタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化
した、５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８０
０（チッソ社製）にかけ、同緩衝液で洗浄後、５０〜１
５５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出さ
せ、溶出塩濃度５５０〜１５５０ｍＭの硫酸化フコース
含有多糖画分を集めた。
７ｇを７００ｍｌの５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０％の
エタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化
した、５リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８０
０（チッソ社製）にかけ、同緩衝液で洗浄後、５０〜１
５５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出さ
せ、溶出塩濃度５５０〜１５５０ｍＭの硫酸化フコース
含有多糖画分を集めた。
【００８４】上記の画分には、硫酸化フコガラクタン分
解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸
化フコガラクタンも１０％程度含まれていた。そこで、
本画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機により脱塩し、さらに、２００ｍＭの塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で溶液置換した。そこに、６００ｍＵの
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を添加し２５℃
で３日間反応後、限外ろ過を行い、ろ液中に含まれる糖
の量をフェノール−硫酸法により測定し、糖が検出され
なくなるまで限外ろ過を続けた。この工程により、本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化され
る成分すなわち本発明の硫酸化フコガラクタンを前記の
硫酸化フコース含有多糖画分から除去することができ
た。
解酵素により低分子化される成分すなわち本発明の硫酸
化フコガラクタンも１０％程度含まれていた。そこで、
本画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機により脱塩し、さらに、２００ｍＭの塩化
ナトリウムを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で溶液置換した。そこに、６００ｍＵの
本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素を添加し２５℃
で３日間反応後、限外ろ過を行い、ろ液中に含まれる糖
の量をフェノール−硫酸法により測定し、糖が検出され
なくなるまで限外ろ過を続けた。この工程により、本発
明の硫酸化フコガラクタン分解酵素により低分子化され
る成分すなわち本発明の硫酸化フコガラクタンを前記の
硫酸化フコース含有多糖画分から除去することができ
た。
【００８５】実施例５
（１）硫酸化フコガラクタンの酵素消化物（ｉ）の調製
実施例３で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分７０ｇを３００ｍＭの塩化ナトリウム、２０
ｍＭの塩化カルシウム、及び１０％のエタノールを含む
２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解後、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に
除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に
用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。
有多糖画分７０ｇを３００ｍＭの塩化ナトリウム、２０
ｍＭの塩化カルシウム、及び１０％のエタノールを含む
２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
溶解後、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に
除去した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に
用いた緩衝液と同じ組成のものを用いた。
【００８６】次に、限外ろ過内液に、ＷＯ９７／２６８
９６公報記載の方法でアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１
００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を培養し、該培
養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を
５Ｕ添加し、２５℃で３日間反応させた。上記反応液を
排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ
過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解
酵素で低分子化された物質、すなわち、フコイダンの低
分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加
する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のも
のを用いた。
９６公報記載の方法でアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１
００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を培養し、該培
養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を
５Ｕ添加し、２５℃で３日間反応させた。上記反応液を
排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ
過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解
酵素で低分子化された物質、すなわち、フコイダンの低
分子化物を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加
する緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のも
のを用いた。
【００８７】次に、限外ろ過内液に、ＷＯ９７／２６８
９６公報記載の方法でフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ
−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を培養し、
該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵
素を２０Ｕ添加し、２５℃で５日間反応させた。上記反
応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−
Ｕ分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フ
コグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に２００ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８）に置換した。
９６公報記載の方法でフラボバクテリウム ｓｐ．ＳＡ
−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を培養し、
該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵
素を２０Ｕ添加し、２５℃で５日間反応させた。上記反
応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖−
Ｕ分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸化フ
コグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に２００ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８）に置換した。
【００８８】次に、限外ろ過内液に、実施例２（１）記
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を２Ｕ添加し、２５
℃で５日間反応させた。反応液を２等分し、一方は排除
分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機
で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低
分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの
低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時
には５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。こうして得られた
ろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化物（ｉ）とし
た。
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を２Ｕ添加し、２５
℃で５日間反応させた。反応液を２等分し、一方は排除
分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機
で限外ろ過し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低
分子化された物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの
低分子化物を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時
には５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。こうして得られた
ろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化物（ｉ）とし
た。
【００８９】（２）硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉｉ）の調製 実施例５（１）で２等分した反応液のもう一方に、実施
例２（１）記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を５５
０ｍＵ添加し、２５℃で７日間反応させ、低分子化の進
行を確認した。反応液を、排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、硫酸化フ
コガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。な
お、限外ろ過時には５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。こ
うして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化
物（ｉｉ）とした。
（ｉｉ）の調製 実施例５（１）で２等分した反応液のもう一方に、実施
例２（１）記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を５５
０ｍＵ添加し、２５℃で７日間反応させ、低分子化の進
行を確認した。反応液を、排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、硫酸化フ
コガラクタンの低分子化物を徹底的に限外ろ過した。な
お、限外ろ過時には５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１
０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。こ
うして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵素消化
物（ｉｉ）とした。
【００９０】（３）硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉ）の分離精製 実施例５（１）で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物（ｉ）をエバポレーターで５００ｍｌに濃縮後、電
気透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリ
ウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６２
ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。１３０ｍＭ付近及び２２０ｍＭ付近
の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを
形成していたので、それぞれを集め、１３０ｍＭ溶出画
分（ｉ）及び２２０ｍＭ溶出画分（ｉ）とした。
（ｉ）の分離精製 実施例５（１）で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物（ｉ）をエバポレーターで５００ｍｌに濃縮後、電
気透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリ
ウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６２
ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。１３０ｍＭ付近及び２２０ｍＭ付近
の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを
形成していたので、それぞれを集め、１３０ｍＭ溶出画
分（ｉ）及び２２０ｍＭ溶出画分（ｉ）とした。
【００９１】１３０ｍＭ溶出画分（ｉ）を電気透析装置
により脱塩後、５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを
溶解させ、あらかじめ５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡
化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８０
０（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、
５０ｍＭから２００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエン
トにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。５５ｍＭから７５ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分が糖含量のピークを形成していたので、６０
ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集めた。
この画分をスピードバック（サバントインストルメンツ
社製；SAVANT Instruments Inc.）で２ｍｌに濃縮後、
あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２００ｍｌ
のセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）のカラム
にかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は２ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、
（Ａ）とした。
により脱塩後、５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを
溶解させ、あらかじめ５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡
化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８０
０（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、
５０ｍＭから２００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエン
トにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。５５ｍＭから７５ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分が糖含量のピークを形成していたので、６０
ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集めた。
この画分をスピードバック（サバントインストルメンツ
社製；SAVANT Instruments Inc.）で２ｍｌに濃縮後、
あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２００ｍｌ
のセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）のカラム
にかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は２ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、
（Ａ）とした。
【００９２】一方、上記の２２０ｍＭ溶出画分（ｉ）に
関しては、電気透析装置により脱塩後、１００ｍＭとな
るように塩化ナトリウムを溶解させ、あらかじめ１００
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラム
にかけ、同緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから３５０ｍＭ
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。１６０ｍＭ付近の塩化
ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック
（サバントインストルメンツ社製；SAVANTInstruments
Inc.）で２ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノー
ルで平衡化した２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２
５（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させ
た。溶出画分は２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量を
フェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを
形成している画分を集め、（Ｂ）とした。
関しては、電気透析装置により脱塩後、１００ｍＭとな
るように塩化ナトリウムを溶解させ、あらかじめ１００
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）のカラム
にかけ、同緩衝液で洗浄後、１００ｍＭから３５０ｍＭ
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。１６０ｍＭ付近の塩化
ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック
（サバントインストルメンツ社製；SAVANTInstruments
Inc.）で２ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノー
ルで平衡化した２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２
５（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させ
た。溶出画分は２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量を
フェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを
形成している画分を集め、（Ｂ）とした。
【００９３】（４）硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉｉ）の分離精製 実施例５（２）記載の硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉｉ）をエバポレーターで５００ｍｌに濃縮後、電気
透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファ
インＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝
液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリウム
のグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６１ｍｌ
ずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法に
より測定した。１３０ｍＭ付近、２２０ｍＭ付近及び２
７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含
量のピークを形成していたので、それぞれを集め、１３
０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）、２２０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）
及び２７０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）とした。
（ｉｉ）の分離精製 実施例５（２）記載の硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉｉ）をエバポレーターで５００ｍｌに濃縮後、電気
透析装置により脱塩し、あらかじめ１０ｍＭの塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８）で平衡化した１リットルのＤＥＡＥ−セルロファ
インＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝
液で洗浄後、１０ｍＭから９００ｍＭの塩化ナトリウム
のグラジエントにより溶出させた。溶出画分は６１ｍｌ
ずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法に
より測定した。１３０ｍＭ付近、２２０ｍＭ付近及び２
７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含
量のピークを形成していたので、それぞれを集め、１３
０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）、２２０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）
及び２７０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）とした。
【００９４】１３０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）を電気透析装
置により脱塩後、２０ｍＭとなるように塩化ナトリウム
を溶解させ、あらかじめ２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平
衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、２０ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウムのグラジ
エントにより溶出させた。溶出画分は１３ｍｌずつ分取
し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定
した。５０ｍＭから７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め、エバポレーターで３０ｍｌに濃縮
後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した１２０
０ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の
カラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は１０
ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。糖含量がピークを形成している画分
を集め、１０ｍＭとなるように酢酸を添加後、塩酸でｐ
Ｈ３．５とし、２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）の導電率と同じになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ２０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．
５）で平衡化した３０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイン
Ａ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で
洗浄後、２０ｍＭから１２０ｍＭの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は３ｍｌずつ分
取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測
定した。６５ｍＭから８０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで
溶出される画分を集め、４０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）の導電率と同じ
になるように水で希釈し、あらかじめ４０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で
平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、４０ｍＭから８０ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエ
ントにより溶出させた。溶出画分は３ｍｌずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。５０ｍＭから６５ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分を集め、スピードバック（サバントインスト
ルメンツ社製；SAVANT Instruments Inc.）で２ｍｌに
濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２
００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）
のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は２ｍ
ｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法
により測定した。糖含量がピークを形成している画分に
ついて質量分析したところ、前半の画分には（Ａ）と同
じ物質が存在したが、後半の画分には実質的に（Ａ）と
同じ物質が含まれていなかったので、後半の画分を集
め、（Ｃ）とした。
置により脱塩後、２０ｍＭとなるように塩化ナトリウム
を溶解させ、あらかじめ２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平
衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、２０ｍＭから１５０ｍＭの塩化ナトリウムのグラジ
エントにより溶出させた。溶出画分は１３ｍｌずつ分取
し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定
した。５０ｍＭから７０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶
出される画分を集め、エバポレーターで３０ｍｌに濃縮
後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した１２０
０ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の
カラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。溶出画分は１０
ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸
法により測定した。糖含量がピークを形成している画分
を集め、１０ｍＭとなるように酢酸を添加後、塩酸でｐ
Ｈ３．５とし、２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）の導電率と同じになるよ
うに塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ２０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．
５）で平衡化した３０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイン
Ａ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で
洗浄後、２０ｍＭから１２０ｍＭの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は３ｍｌずつ分
取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測
定した。６５ｍＭから８０ｍＭ付近の塩化ナトリウムで
溶出される画分を集め、４０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）の導電率と同じ
になるように水で希釈し、あらかじめ４０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）で
平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄
後、４０ｍＭから８０ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエ
ントにより溶出させた。溶出画分は３ｍｌずつ分取し、
それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定し
た。５０ｍＭから６５ｍＭ付近の塩化ナトリウムで溶出
される画分を集め、スピードバック（サバントインスト
ルメンツ社製；SAVANT Instruments Inc.）で２ｍｌに
濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化した２
００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）
のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は２ｍ
ｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法
により測定した。糖含量がピークを形成している画分に
ついて質量分析したところ、前半の画分には（Ａ）と同
じ物質が存在したが、後半の画分には実質的に（Ａ）と
同じ物質が含まれていなかったので、後半の画分を集
め、（Ｃ）とした。
【００９５】一方上記の２２０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）に
関しては、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のイミダゾール−塩酸緩衝液の導電率と同じになるよう
に水を添加し、あらかじめ１００ｍＭの塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）
で平衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、１００ｍＭから３００ｍＭの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は１３ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。１４０ｍＭから１７０ｍＭ付近の塩化ナトリ
ウムで溶出される画分を集め、エバポレーターで３０ｍ
ｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化し
た１２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ
社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分
は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール
−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成してい
る画分を集め、質量分析を行ったところ、実施例５
（３）記載の（Ｂ）と同じ物質であると推定された。
関しては、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のイミダゾール−塩酸緩衝液の導電率と同じになるよう
に水を添加し、あらかじめ１００ｍＭの塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）
で平衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、１００ｍＭから３００ｍＭの塩化ナトリウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は１３ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。１４０ｍＭから１７０ｍＭ付近の塩化ナトリ
ウムで溶出される画分を集め、エバポレーターで３０ｍ
ｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタノールで平衡化し
た１２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ
社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分
は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール
−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成してい
る画分を集め、質量分析を行ったところ、実施例５
（３）記載の（Ｂ）と同じ物質であると推定された。
【００９６】また上記の２７０ｍＭ溶出画分（ｉｉ）に
関しては、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）と同じ導電率に
なるように水を添加し、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）で平衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから３００ｍＭの塩化ナト
リウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は１
２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫
酸法により測定した。１６０ｍＭから１８０ｍＭ付近の
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバッ
ク（サバントインストルメンツ社製；SAVANT Instrumen
ts Inc.）で２ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタ
ノールで平衡化した２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ
−２５（チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出さ
せた。溶出画分は２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量
をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピーク
を形成している画分を集め、（Ｄ）とした。
関しては、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ８）と同じ導電率に
なるように水を添加し、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）で平衡化した２００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同
緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭから３００ｍＭの塩化ナト
リウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は１
２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫
酸法により測定した。１６０ｍＭから１８０ｍＭ付近の
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバッ
ク（サバントインストルメンツ社製；SAVANT Instrumen
ts Inc.）で２ｍｌに濃縮後、あらかじめ１０％のエタ
ノールで平衡化した２００ｍｌのセルロファインＧＣＬ
−２５（チッソ社製）のカラムにかけ、同溶液で溶出さ
せた。溶出画分は２ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量
をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピーク
を形成している画分を集め、（Ｄ）とした。
【００９７】実施例６
（１）硫酸化フコガラクタンの酵素消化物（ｉｉｉ）の
調製 実施例３で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分１５ｇを１５００ｍｌの３００ｍＭの塩化ナ
トリウム、２０ｍＭの塩化カルシウム、及び１０％のエ
タノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解後、排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能
な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加す
る緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のもの
を用いた。限外ろ過内液に、実施例５（１）で使用した
フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を１Ｕ添加し、２５
℃で３日間反応させた。
調製 実施例３で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコース含
有多糖画分１５ｇを１５００ｍｌの３００ｍＭの塩化ナ
トリウム、２０ｍＭの塩化カルシウム、及び１０％のエ
タノールを含む２０ｍＭのイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解後、排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、ろ過可能
な物質を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時に添加す
る緩衝液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のもの
を用いた。限外ろ過内液に、実施例５（１）で使用した
フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素を１Ｕ添加し、２５
℃で３日間反応させた。
【００９８】上記反応液を排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、フコイダンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた
緩衝液と同じ組成のものを用いた。
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、フコイダンの低分子化物を徹底的に除去し
た。なお、限外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた
緩衝液と同じ組成のものを用いた。
【００９９】該限外ろ過内液に、実施例５（１）で使用
したフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を１Ｕ添加し、
２５℃で５日間反応させた。
したフコース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素を１Ｕ添加し、
２５℃で５日間反応させた。
【０１００】上記反応液を排除分子量１０万のホロファ
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化物
を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には２００ｍＭ
の塩化ナトリウム及び１０％のエタノールを含む１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。
イバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコ
ース硫酸含有多糖−Ｕ分解酵素で低分子化された物質、
すなわち、硫酸化フコグルクロノマンナンの低分子化物
を徹底的に除去した。なお、限外ろ過時には２００ｍＭ
の塩化ナトリウム及び１０％のエタノールを含む１０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を添加した。
【０１０１】次に限外ろ過内液に、実施例２（１）記載
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を６００ｍＵ添加し、
２５℃で５日間反応させた。反応液を排除分子量１０万
のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過
し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化され
た物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物
を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む１０％のエタノールを添加し
た。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵
素消化物（ｉｉｉ）とした。
の硫酸化フコガラクタン分解酵素を６００ｍＵ添加し、
２５℃で５日間反応させた。反応液を排除分子量１０万
のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過
し、上記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化され
た物質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物
を徹底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時には２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む１０％のエタノールを添加し
た。こうして得られたろ過液を硫酸化フコガラクタン酵
素消化物（ｉｉｉ）とした。
【０１０２】（２）硫酸化フコガラクタン酵素消化物
（ｉｉｉ）の分離精製 実施例６（１）で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物（ｉｉｉ）を電気透析装置により脱塩し、エバポレ
ーターで５０ｍｌに濃縮後、あらかじめ５０ｍＭの酢酸
アンモニウム（ｐＨ５．５）で平衡化した１００ｍｌの
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）の
カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから４Ｍの
酢酸アンモニウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。４２０ｍＭから６２０
ｍＭ付近の酢酸アンモニウムで溶出される画分が糖含量
のピークを形成していたので、その画分を集め４２０か
ら６２０ｍＭ溶出画分とした。
（ｉｉｉ）の分離精製 実施例６（１）で得られた硫酸化フコガラクタン酵素消
化物（ｉｉｉ）を電気透析装置により脱塩し、エバポレ
ーターで５０ｍｌに濃縮後、あらかじめ５０ｍＭの酢酸
アンモニウム（ｐＨ５．５）で平衡化した１００ｍｌの
ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ社製）の
カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、５０ｍＭから４Ｍの
酢酸アンモニウムのグラジエントにより溶出させた。溶
出画分は１０ｍｌずつ分取し、それぞれの糖含量をフェ
ノール−硫酸法により測定した。４２０ｍＭから６２０
ｍＭ付近の酢酸アンモニウムで溶出される画分が糖含量
のピークを形成していたので、その画分を集め４２０か
ら６２０ｍＭ溶出画分とした。
【０１０３】（３）４２０から６２０ｍＭ溶出画分の精
製 該画分を、電気透析装置により脱塩し、５０ｍＭの酢酸
アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ５０ｍ
Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）で平衡化した１０
０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ
社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１００ｍＭ
の酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）で洗浄し、１００ｍ
Ｍから８００ｍＭの酢酸アンモニウムのグラジエントに
より溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ分取し、それ
ぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。４
４０ｍＭから５３０ｍＭ付近の酢酸アンモニウムで溶出
される画分を集めた。
製 該画分を、電気透析装置により脱塩し、５０ｍＭの酢酸
アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あらかじめ５０ｍ
Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）で平衡化した１０
０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（チッソ
社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、１００ｍＭ
の酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）で洗浄し、１００ｍ
Ｍから８００ｍＭの酢酸アンモニウムのグラジエントに
より溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ分取し、それ
ぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。４
４０ｍＭから５３０ｍＭ付近の酢酸アンモニウムで溶出
される画分を集めた。
【０１０４】該画分を、電気透析装置により脱塩し、２
００ｍＭの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あ
らかじめ２００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）
で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、２００ｍＭから７００ｍＭの酢酸アンモニウムの
グラジエントにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌず
つ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法によ
り測定した。４２０ｍＭから４７０ｍＭ付近の酢酸アン
モニウムで溶出される画分を集めた。該画分について質
量分析及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）分析を行っ
たところ実施例５（３）記載の（Ｂ）と同じ物質である
と推定された。なお、質量分析はＡＰＩ−ＩＩＩ質量分
析器（パーキンエルマー・サイエクス社製）を用いて行
った。ＮＭＲ分析は核磁気共鳴装置ＪＭＮ−Ａ５００
（日本電子社製）を用いて行った。
００ｍＭの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率とし、あ
らかじめ２００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）
で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液で洗
浄後、２００ｍＭから７００ｍＭの酢酸アンモニウムの
グラジエントにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌず
つ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法によ
り測定した。４２０ｍＭから４７０ｍＭ付近の酢酸アン
モニウムで溶出される画分を集めた。該画分について質
量分析及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）分析を行っ
たところ実施例５（３）記載の（Ｂ）と同じ物質である
と推定された。なお、質量分析はＡＰＩ−ＩＩＩ質量分
析器（パーキンエルマー・サイエクス社製）を用いて行
った。ＮＭＲ分析は核磁気共鳴装置ＪＭＮ−Ａ５００
（日本電子社製）を用いて行った。
【０１０５】（４）硫酸化フコガラクタン酵素消化物の
再酵素消化及び分離精製 実施例６（２）の４２０から６２０ｍＭ溶出画分以外は
比較的分子量が大きかったので再度硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素により分解した。すなわち、４２０から６２
０ｍＭ溶出画分以外の溶出画分を集め、電気透析装置で
脱塩後、該溶液が２００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０
％のエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）となるように調整し、実施例２（１）記載の硫酸化
フコガラクタン分解酵素を４６０ｍＵ添加し、２５℃で
８日間反応させた。反応液を電気透析装置により脱塩
し、５０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率と
し、あらかじめ５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．
５）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液
で洗浄後、１００ｍＭから１Ｍの酢酸アンモニウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。１８０ｍＭから２８０ｍＭ付近の酢酸アンモ
ニウム溶出画分及び３６０ｍＭから４３０ｍＭ付近の酢
酸アンモニウムで溶出される画分を集め、それぞれ、
（Ｅ）及び（Ｆ）とした。
再酵素消化及び分離精製 実施例６（２）の４２０から６２０ｍＭ溶出画分以外は
比較的分子量が大きかったので再度硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素により分解した。すなわち、４２０から６２
０ｍＭ溶出画分以外の溶出画分を集め、電気透析装置で
脱塩後、該溶液が２００ｍＭの塩化ナトリウム及び１０
％のエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）となるように調整し、実施例２（１）記載の硫酸化
フコガラクタン分解酵素を４６０ｍＵ添加し、２５℃で
８日間反応させた。反応液を電気透析装置により脱塩
し、５０ｍＭの酢酸アンモニウム溶液と同じ導電率と
し、あらかじめ５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．
５）で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００（チッソ社製）のカラムにかけ、同緩衝液
で洗浄後、１００ｍＭから１Ｍの酢酸アンモニウムのグ
ラジエントにより溶出させた。溶出画分は１０ｍｌずつ
分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により
測定した。１８０ｍＭから２８０ｍＭ付近の酢酸アンモ
ニウム溶出画分及び３６０ｍＭから４３０ｍＭ付近の酢
酸アンモニウムで溶出される画分を集め、それぞれ、
（Ｅ）及び（Ｆ）とした。
【０１０６】実施例７ 硫酸化フコガラクタン酵素消化
物の構造決定 実施例５及び６で得られた６つの画分（Ａ）、（Ｂ）、
（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）についてそれぞれ
電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び質
量を分析した。質量分析は、ＡＰＩ−ＩＩＩ質量分析機
（パーキンエルマー・サイエクス社製）を用いた。ま
た、ＮＭＲ分析は、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置
（日本電子社製）を用いた。分析試料は、定法により重
水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、
1Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行っ
た。1Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨ
ＯＨＡＨＡ法を、13Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を
用いた。
物の構造決定 実施例５及び６で得られた６つの画分（Ａ）、（Ｂ）、
（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）についてそれぞれ
電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び質
量を分析した。質量分析は、ＡＰＩ−ＩＩＩ質量分析機
（パーキンエルマー・サイエクス社製）を用いた。ま
た、ＮＭＲ分析は、ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置
（日本電子社製）を用いた。分析試料は、定法により重
水で置換後、構造解析を行った。構成糖の結合様式は、
1Ｈ−検出異種核検出法であるＨＭＢＣ法を用いて行っ
た。1Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨ
ＯＨＡＨＡ法を、13Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨＳＱＣ法を
用いた。
【０１０７】（１）低分子化物（Ａ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図３に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４
に、マススペクトルを図５にそれぞれ示した。即ち、図
３は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図４は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の13Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図であり、図５は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物（Ａ）のマススペクトルを示す
図である。図３、図４において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図５
において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値
を示す。 分子量； ６３２ ＭＳ ｍ／ｚ ６５３．２ [Ｍ＋Ｎａ+−２Ｈ+]-、３１
５．０ [Ｍ−２Ｈ+] 2- 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．４，４．
３Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
７．６Ｈｚ，Ｇ１−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ−
ｄ，Ｊ＝１０．７，３．１Ｈｚ，Ｆ２−３−Ｈ），４．
３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），
４．１４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５−
Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｆ１−４
−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，Ｆ２−
４−Ｈ），３．９７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．４，
４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．９０（１Ｈ，ｂｒ−
ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１
０．７，３．７Ｈｚ，Ｆ２−２−Ｈ），３．５９（１
Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−
５−Ｈ），３．５９（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．
５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），１．１９（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表１に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図３に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４
に、マススペクトルを図５にそれぞれ示した。即ち、図
３は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図４は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ａ）の13Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図であり、図５は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物（Ａ）のマススペクトルを示す
図である。図３、図４において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図５
において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値
を示す。 分子量； ６３２ ＭＳ ｍ／ｚ ６５３．２ [Ｍ＋Ｎａ+−２Ｈ+]-、３１
５．０ [Ｍ−２Ｈ+] 2- 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．４，４．
３Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
７．６Ｈｚ，Ｇ１−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ−
ｄ，Ｊ＝１０．７，３．１Ｈｚ，Ｆ２−３−Ｈ），４．
３６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），
４．１４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５−
Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｆ１−４
−Ｈ），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，Ｆ２−
４−Ｈ），３．９７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．４，
４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．９０（１Ｈ，ｂｒ−
ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１
０．７，３．７Ｈｚ，Ｆ２−２−Ｈ），３．５９（１
Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−
５−Ｈ），３．５９（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．
５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），１．１９（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表１に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
糖組成 Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：１
硫酸基 ２分子
なお、1Ｈ-ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は、下記
式（Ｖ）の通りである。
式（Ｖ）の通りである。
【化１９】
【０１１０】（２）低分子化物（Ｂ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図６に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図７
に、マススペクトルを図８にそれぞれ示した。即ち、図
６は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図７は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の13Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図であり、図８は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物（Ｂ）のマススペクトルを示す
図である。図６、図７において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図８
において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値
を示す。 分子量； １１１６ ＭＳ ｍ／ｚ １１８１．２ [Ｍ＋３Ｎａ+−４Ｈ+]-、
５７９．０ [Ｍ＋２Ｎａ +−４Ｈ+]2-、３７８．６ [Ｍ
＋Ｎａ+−４Ｈ+] 3- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６４（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．５５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．７，１．
８Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４７（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
３−Ｈ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ３
−１−Ｈ），４．４２（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−
Ｈ），４．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−５
−Ｈ），４．２８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．２
０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１７（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．１４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１．８Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），４．０１（１Ｈ，ｍ，
Ｇ２−６−Ｈ），３．９７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．
７，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｂ
ｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
５−Ｈ），３．８３（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．
８２（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．６８（１Ｈ，
ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−
Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６２
（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．６１（２Ｈ，ｍ，Ｇ
１−６−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），
３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１
Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ１−６−Ｈ），１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表２に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図６に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図７
に、マススペクトルを図８にそれぞれ示した。即ち、図
６は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図７は本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｂ）の13Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図であり、図８は本発明の硫酸化フ
コガラクタン低分子化物（Ｂ）のマススペクトルを示す
図である。図６、図７において縦軸はシグナルの強度
を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図８
において、縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値
を示す。 分子量； １１１６ ＭＳ ｍ／ｚ １１８１．２ [Ｍ＋３Ｎａ+−４Ｈ+]-、
５７９．０ [Ｍ＋２Ｎａ +−４Ｈ+]2-、３７８．６ [Ｍ
＋Ｎａ+−４Ｈ+] 3- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６４（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．５５（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．７，１．
８Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４７（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
３−Ｈ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ３
−１−Ｈ），４．４２（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−
Ｈ），４．３８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−５
−Ｈ），４．２８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．２
０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１７（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．１４（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
１．８Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝１．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），４．０１（１Ｈ，ｍ，
Ｇ２−６−Ｈ），３．９７（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．
７，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ）、３．９０（１Ｈ，ｂ
ｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
５−Ｈ），３．８３（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．
８２（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．６８（１Ｈ，
ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−
Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６２
（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．６１（２Ｈ，ｍ，Ｇ
１−６−Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），
３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１
Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ１−６−Ｈ），１．１５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表２に示す。
【表２】
【０１１１】
糖組成 Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：３
硫酸基 ４分子
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記
式（ＶＩ）の通りである。
式（ＶＩ）の通りである。
【化２０】
【０１１２】（３）低分子化物（Ｃ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図９に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１
０に、マススペクトルを図１１にそれぞれ示した。即
ち、図９は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｃ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
０は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１１は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）のマススペ
クトルを示す図である。図９、図１０において縦軸はシ
グナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１１において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；５０２ ＭＳ ｍ／ｚ ５２３ [Ｍ＋Ｎａ+−２Ｈ+]-、 ２５０
[Ｍ−２Ｈ+]2- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ４．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ１−１−
Ｈ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−３−Ｈ），
４．２０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），４．２０
（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，
ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），３．９５（１Ｈ，ｍ，Ｇ１
−６−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），
３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６３（２
Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．６２（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
５−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．
５０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表３に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図９に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１
０に、マススペクトルを図１１にそれぞれ示した。即
ち、図９は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｃ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
０は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１１は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｃ）のマススペ
クトルを示す図である。図９、図１０において縦軸はシ
グナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１１において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；５０２ ＭＳ ｍ／ｚ ５２３ [Ｍ＋Ｎａ+−２Ｈ+]-、 ２５０
[Ｍ−２Ｈ+]2- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ４．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ１−１−
Ｈ），４．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−３−Ｈ），
４．２０（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），４．２０
（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，
ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），３．９５（１Ｈ，ｍ，Ｇ１
−６−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），
３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６３（２
Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．６２（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
５−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．
５０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表３に示す。
【表３】
【０１１３】
糖組成 Ｄ−ガラクトースのみ
硫酸基 ２分子
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記
式（ＶＩＩ）の通りである。
式（ＶＩＩ）の通りである。
【化２１】
【０１１４】（４）低分子化物（Ｄ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１２に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図
１３に、マススペクトルを図１４にそれぞれ示した。即
ち、図１２は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
３は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１４は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）のマススペ
クトルを示す図である。図１２、図１３において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１４において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１３５８ ＭＳ ｍ／ｚ ７１１．２ [Ｍ＋３Ｎａ+−５Ｈ+]2-、４
６６．６ [Ｍ＋２Ｎａ+−５Ｈ+]3-、３４４．２ [Ｍ＋
Ｎａ+−５Ｈ+] 4- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６２（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ２−１−
Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，２．７
Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．
６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
３−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−
Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１
−Ｈ），４．３７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−
５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．
２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．２１（１
Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−
３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ４−４−
Ｈ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５
−Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｆ１−
４−Ｈ），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｆ２
−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ）、
３．９６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，
Ｆ１−２−Ｈ），３．９３（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−
Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），
３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８１（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
２−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．
８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６６（１Ｈ，
ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−
Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６４
（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ
４−５−Ｈ），３．５８（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），
３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．５６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−
２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．
５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２０（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表４および５に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１２に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図
１３に、マススペクトルを図１４にそれぞれ示した。即
ち、図１２は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
３は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１４は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｄ）のマススペ
クトルを示す図である。図１２、図１３において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１４において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１３５８ ＭＳ ｍ／ｚ ７１１．２ [Ｍ＋３Ｎａ+−５Ｈ+]2-、４
６６．６ [Ｍ＋２Ｎａ+−５Ｈ+]3-、３４４．２ [Ｍ＋
Ｎａ+−５Ｈ+] 4- 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６２（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ２−１−
Ｈ），４．５４（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，２．７
Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．
６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
３−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ２−４−
Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１
−Ｈ），４．３７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ２−
５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−３−Ｈ），４．
２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．２１（１
Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−
３−Ｈ），４．１５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ４−４−
Ｈ），４．１３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｆ１−５
−Ｈ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｆ１−
４−Ｈ），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｆ２
−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ）、
３．９６（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，
Ｆ１−２−Ｈ），３．９３（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−
Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），
３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８１（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
２−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．
８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６６（１Ｈ，
ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−
Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．６４
（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ
４−５−Ｈ），３．５８（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），
３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．５６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−
２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．
５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．２０（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），１．１４（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表４および５に示す。
【表４】
【表５】
【０１１５】
糖組成 Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：４
硫酸基 ５分子
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記
式（ＶＩＩＩ）の通りである。
式（ＶＩＩＩ）の通りである。
【化２２】
【０１１６】（５）低分子化物（Ｅ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１５に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図
１６に、マススペクトルを図１７にそれぞれ示した。即
ち、図１５は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
６は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１７は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）のマススペ
クトルを示す図である。図１５、図１６において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１７において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１０３６ ＭＳ ｍ／ｚ ５２８．０[Ｍ＋Ｎａ+−３Ｈ+]2-、３４
４．０ [Ｍ−３Ｈ+] 3- 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６３（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．７，
１．８Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４０（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．
１６（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．１２（１
Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０６
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），３．９
９（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝
１０．７，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．８６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−３−Ｈ），３．
６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），
３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
２−Ｈ），３．６３（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．
６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．６１（２Ｈ，
ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−
Ｈ），３．５３（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５３
（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６．４，Ｆ１−６−Ｈ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表６に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１５に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図
１６に、マススペクトルを図１７にそれぞれ示した。即
ち、図１５は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物
（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１
６は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）の
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図１７は本発
明の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｅ）のマススペ
クトルを示す図である。図１５、図１６において縦軸は
シグナルの強度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示
す。また、図１７において、縦軸は相対強度（％）を、
横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１０３６ ＭＳ ｍ／ｚ ５２８．０[Ｍ＋Ｎａ+−３Ｈ+]2-、３４
４．０ [Ｍ−３Ｈ+] 3- 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６３（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇ２−１
−Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．７，
１．８Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４０（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
３−Ｈ），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．
１６（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−Ｈ），４．１２（１
Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０６
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），３．９
９（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ１−４−Ｈ），３．８８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝
１０．７，４．３Ｈｚ，Ｆ１−２−Ｈ），３．８６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ）、３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
６−Ｈ），３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−３−Ｈ），３．
６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｆ２−４−Ｈ），
３．６６（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（１
Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，ｍ，Ｆ２−
２−Ｈ），３．６３（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−６−Ｈ），３．
６１（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），３．６１（２Ｈ，
ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６０（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−
Ｈ），３．５３（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５３
（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−２−Ｈ），１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ
＝６．４，Ｆ１−６−Ｈ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表６に示す。
【表６】
【０１１７】
糖組成 Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：３
硫酸基 ３分子
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記
式（ＩＸ）の通りである。
式（ＩＸ）の通りである。
【化２３】
【０１１８】（６）低分子化物（Ｆ）の物性
質量分析及びＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１８に、13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°ス
ペクトルを図１９に、マススペクトルを図２０にそれぞ
れ示した。即ち、図１８は本発明の硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
であり、図１９は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子
化物（Ｆ）の13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°スペクトルを示
す図であり、図２０は本発明の硫酸化フコガラクタン低
分子化物（Ｆ）のマススペクトルを示す図である。図１
８、図１９において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２０において、
縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１２７８ ＭＳ ｍ／ｚ 660.0 [Ｍ＋2Ｎａ+−４Ｈ+]2-、 432.0
[Ｍ＋Ｎａ+−４Ｈ+]3 -、318.2 [Ｍ−４Ｈ+] 4 - 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６１（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、Ｇ２−１−
Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６， ２．
７Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
３−Ｈ），４．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−
Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．２０
（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−３−Ｈ），４．１６（１Ｈ，ｂｒ−
ｓ，Ｇ４−４−Ｈ），４．１２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７
Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．
７Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
６−Ｈ），３．９４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．
８９（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，Ｆ１
−２−Ｈ）、３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−
Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８６
（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｍ，Ｆ
２−３−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），
３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８，Ｆ２−４−Ｈ），３．６６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−
６−Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．
６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，
ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．６２（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−５−
Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），３．５４
（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ
３−２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−２−Ｈ），
１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），
１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表７および８に示す。
の硫酸化フコガラクタン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭ
Ｒスペクトルを図１８に、13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°ス
ペクトルを図１９に、マススペクトルを図２０にそれぞ
れ示した。即ち、図１８は本発明の硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
であり、図１９は本発明の硫酸化フコガラクタン低分子
化物（Ｆ）の13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°スペクトルを示
す図であり、図２０は本発明の硫酸化フコガラクタン低
分子化物（Ｆ）のマススペクトルを示す図である。図１
８、図１９において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図２０において、
縦軸は相対強度（％）を、横軸は、ｍ／Ｚ値を示す。 分子量；１２７８ ＭＳ ｍ／ｚ 660.0 [Ｍ＋2Ｎａ+−４Ｈ+]2-、 432.0
[Ｍ＋Ｎａ+−４Ｈ+]3 -、318.2 [Ｍ−４Ｈ+] 4 - 1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） δ；５．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｆ１−１−
Ｈ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｆ２−１
−Ｈ），４．６１（１Ｈ，ＨＯＤと重複，Ｇ１−１−
Ｈ），４．５９（１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、Ｇ２−１−
Ｈ），４．５３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６， ２．
７Ｈｚ，Ｆ１−３−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
７．６Ｈｚ，Ｇ３−１−Ｈ），４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝７．６Ｈｚ，Ｇ４−１−Ｈ），４．４１（１Ｈ，ｂｒ
−ｓ，Ｇ２−４−Ｈ），４．３２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ，Ｆ２−５−Ｈ），４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
３−Ｈ），４．２４（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ３−４−
Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−３−Ｈ），４．２０
（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−３−Ｈ），４．１６（１Ｈ，ｂｒ−
ｓ，Ｇ４−４−Ｈ），４．１２（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７
Ｈｚ，Ｆ１−５−Ｈ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．
７Ｈｚ，Ｆ１−４−Ｈ），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−
６−Ｈ），３．９４（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．
８９（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１０．６，４．３Ｈｚ，Ｆ１
−２−Ｈ）、３．８８（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，Ｇ１−４−
Ｈ），３．８６（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−５−Ｈ），３．８６
（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−６−Ｈ），３．８２（１Ｈ，ｍ，Ｆ
２−３−Ｈ），３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−５−Ｈ），
３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｇ３−６−Ｈ），３．６９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８，Ｆ２−４−Ｈ），３．６６（１
Ｈ，ｍ，Ｇ１−３−Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ１−
６−Ｈ），３．６５（２Ｈ，ｍ，Ｇ４−６−Ｈ），３．
６４（１Ｈ，ｍ，Ｇ２−２−Ｈ），３．６４（１Ｈ，
ｍ，Ｆ２−２−Ｈ），３．６２（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−５−
Ｈ），３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−２−Ｈ），３．５４
（１Ｈ，ｍ，Ｇ１−５−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ
３−２−Ｈ），３．５４（１Ｈ，ｍ，Ｇ４−２−Ｈ），
１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７，Ｆ１−６−Ｈ），
１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４，Ｆ２−６−Ｈ）13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ） 各炭素の13Ｃ−ＮＭＲ分析時
のケミカルシフト値を表７および８に示す。
【表７】
【表８】
【０１１９】
糖組成 Ｌ−フコース：Ｄ−ガラクトース＝２：４
硫酸基 ４分子
なお、1Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下記
式（Ｘ）の通りである。
式（Ｘ）の通りである。
【化２４】
【０１２０】実施例８
（１）本発明の硫酸化フコガラクタンの主要構造の解析
実施例１（２）で調製した硫酸化フコガラクタン画分の
全構造及び硫酸化フコガラクタン分解酵素の切断部位を
決定するために、ＮＭＲ分析を行った。質量分析及びＮ
ＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガ
ラクタンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１に、13Ｃ−
ＮＭＲスペクトルを図２２に、赤外吸収（ＩＲ）スペク
トルを図２３にそれぞれ示した。即ち、図２１は本発明
の硫酸化フコガラクタンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示
す図であり、図２２は本発明の硫酸化フコガラクタンの
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図２３は本発
明の硫酸化フコガラクタンの赤外吸収スペクトルを示す
図である。図２１、図２２において縦軸はシグナルの強
度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図
２３において、縦軸は透過率（％）を、横軸は、波数
（ｃｍ-1）を示す。1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲによ
る分析結果を表９および１０に示す。
全構造及び硫酸化フコガラクタン分解酵素の切断部位を
決定するために、ＮＭＲ分析を行った。質量分析及びＮ
ＭＲの帰属の結果を以下に示し、本発明の硫酸化フコガ
ラクタンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２１に、13Ｃ−
ＮＭＲスペクトルを図２２に、赤外吸収（ＩＲ）スペク
トルを図２３にそれぞれ示した。即ち、図２１は本発明
の硫酸化フコガラクタンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示
す図であり、図２２は本発明の硫酸化フコガラクタンの
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図であり、図２３は本発
明の硫酸化フコガラクタンの赤外吸収スペクトルを示す
図である。図２１、図２２において縦軸はシグナルの強
度を、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。また、図
２３において、縦軸は透過率（％）を、横軸は、波数
（ｃｍ-1）を示す。1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲによ
る分析結果を表９および１０に示す。
【表９】
【表１０】
【０１２１】表９および１０に示した帰属より、本発明
の硫酸化フコガラクタンは、実施例７（４）に記載の
（Ｄ）の化合物が主骨格であり、さらに本発明の硫酸化
フコガラクタンは、該化合物が繰り返し結合している構
造である事が判明した。また、繰り返し構造間の結合
は、下記式（ＸＩＩＩ）に示すようにＧ２のガラクトー
スがβ結合でＧ４のガラクトースの６位に結合したもの
であった。すなわち硫酸化フコガラクタンは、下記に示
す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。
の硫酸化フコガラクタンは、実施例７（４）に記載の
（Ｄ）の化合物が主骨格であり、さらに本発明の硫酸化
フコガラクタンは、該化合物が繰り返し結合している構
造である事が判明した。また、繰り返し構造間の結合
は、下記式（ＸＩＩＩ）に示すようにＧ２のガラクトー
スがβ結合でＧ４のガラクトースの６位に結合したもの
であった。すなわち硫酸化フコガラクタンは、下記に示
す主骨格の繰り返し構造を有することが判明した。
【化２５】
【０１２２】また、本発明の硫酸化フコガラクタンの化
学構造及び本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の
化学構造から、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、硫酸化フコガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいは
ガラクトースの間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエ
ンド的に分解する酵素であることが判明した。さらに、
本発明の硫酸化フコガラクタンの分子量は、実施例１
（３）の条件で測定したところ、その平均値は約１３万
であった。またその分子量分布は約１万〜約２０万であ
った。
学構造及び本発明の硫酸化フコガラクタン低分子化物の
化学構造から、本発明の硫酸化フコガラクタン分解酵素
は、硫酸化フコガラクタンのＤ−硫酸化ガラクトースあ
るいはガラクトースとＤ−硫酸化ガラクトースあるいは
ガラクトースの間のβ１−６結合及びβ１−４結合をエ
ンド的に分解する酵素であることが判明した。さらに、
本発明の硫酸化フコガラクタンの分子量は、実施例１
（３）の条件で測定したところ、その平均値は約１３万
であった。またその分子量分布は約１万〜約２０万であ
った。
【０１２３】（２）本発明の硫酸化フコガラクタンのＨ
ＧＦ産生誘導活性 実施例１（２）記載の方法で得られた本発明の硫酸化フ
コガラクタンのＨＧＦ産生誘導活性を測定した。ＨＧＦ
産生誘導活性は、以下のようにして測定した。すなわ
ち、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛
胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ-５細胞
懸濁液（ＣＣＬ１７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０
２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに
入れ、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養後に１
％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、
試料として実施例１−（２）に記載の方法で得られた硫
酸化フコガラクタンを最終濃度が１、１０、１００μｇ
／ｍｌとなるように添加し、さらに２４時間培養した
後、培地を回収し、Quantikine Human Hepatocyte G
rowth Factor（HGF）ELISA Kit（フナコシ社製、Ｃｏ
ｄｅ．ＲＳ-０６４１-００）を用いて、培地中のＨＧＦ
の量を測定した。一方、コントロールとして試料と同量
の蒸留水を添加した。コントロールのＨＧＦ量は４．３
ｎｇ／ｍｌであり、この値を１００％とした、各試料添
加区のＨＧＦ産生量を表１１に示す。なお、実験は全て
２連で行い、その平均値を採用した。
ＧＦ産生誘導活性 実施例１（２）記載の方法で得られた本発明の硫酸化フ
コガラクタンのＨＧＦ産生誘導活性を測定した。ＨＧＦ
産生誘導活性は、以下のようにして測定した。すなわ
ち、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％牛
胎児血清を含んだＤＭＥ培地に懸濁したＭＲＣ-５細胞
懸濁液（ＣＣＬ１７１：大日本製薬社製、ｃｏｄｅ．０
２−０２１）５００μｌを４８穴の細胞培養プレートに
入れ、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養後に１
％牛胎児血清を含んだＤＭＥ培地に交換した。その後、
試料として実施例１−（２）に記載の方法で得られた硫
酸化フコガラクタンを最終濃度が１、１０、１００μｇ
／ｍｌとなるように添加し、さらに２４時間培養した
後、培地を回収し、Quantikine Human Hepatocyte G
rowth Factor（HGF）ELISA Kit（フナコシ社製、Ｃｏ
ｄｅ．ＲＳ-０６４１-００）を用いて、培地中のＨＧＦ
の量を測定した。一方、コントロールとして試料と同量
の蒸留水を添加した。コントロールのＨＧＦ量は４．３
ｎｇ／ｍｌであり、この値を１００％とした、各試料添
加区のＨＧＦ産生量を表１１に示す。なお、実験は全て
２連で行い、その平均値を採用した。
【表１１】
【０１２４】表１１に示したように、本発明の硫酸化フ
コガラクタンがＨＧＦの産生を誘導することを確認し
た。即ち、本発明の硫酸化フコガラクタンは、ＨＧＦ産
生誘導物質として有用であることを確認した。
コガラクタンがＨＧＦの産生を誘導することを確認し
た。即ち、本発明の硫酸化フコガラクタンは、ＨＧＦ産
生誘導物質として有用であることを確認した。
【０１２５】実施例９
（１）実施例３で得られたガゴメ昆布由来の硫酸化フコ
ース含有多糖画分７０ｇを３００ｍＭの塩化ナトリウ
ム、及び１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、排除分子量
１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外
ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限
外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ
組成のものを用いた。
ース含有多糖画分７０ｇを３００ｍＭの塩化ナトリウ
ム、及び１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾ
ール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、排除分子量
１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外
ろ過し、ろ過可能な物質を徹底的に除去した。なお、限
外ろ過時に添加する緩衝液は溶解に用いた緩衝液と同じ
組成のものを用いた。
【０１２６】次に、限外ろ過内液に、ＷＯ９７／２６８
９６号公報記載の方法でフラボバクテリウム ｓｐ．Ｓ
Ａ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分
解酵素を２０Ｕ添加し、２５℃で５日間反応させた。上
記反応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着さ
せた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多
糖−Ｕ分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸
化フコグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去
した。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に２００
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐＨ８）に置換した。
９６号公報記載の方法でフラボバクテリウム ｓｐ．Ｓ
Ａ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ分
解酵素を２０Ｕ添加し、２５℃で５日間反応させた。上
記反応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着さ
せた限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多
糖−Ｕ分解酵素で低分子化された物質、すなわち、硫酸
化フコグルクロノマンナンの低分子化物を徹底的に除去
した。なお、限外ろ過時には水を添加し、最後に２００
ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのイミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐＨ８）に置換した。
【０１２７】次に、限外ろ過内液に、実施例２（１）記
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を２Ｕ添加し、２５
℃で５日間反応させた。反応液を排除分子量１０万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上
記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化された物
質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹
底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝
液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用い
た。
載の硫酸化フコガラクタン分解酵素を２Ｕ添加し、２５
℃で５日間反応させた。反応液を排除分子量１０万のホ
ロファイバーを装着させた限外ろ過機で限外ろ過し、上
記硫酸化フコガラクタン分解酵素で低分子化された物
質、すなわち、硫酸化フコガラクタンの低分子化物を徹
底的に限外ろ過した。なお、限外ろ過時に添加する緩衝
液は上記反応液に用いた緩衝液と同じ組成のものを用い
た。
【０１２８】次に、限外ろ過内液に最終濃度が２０ｍＭ
になるように塩化カルシウムを添加し、さらにＷＯ９７
／２６８９６公報記載の方法でアルテロモナス ｓｐ．
ＳＮ−１００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ分
解酵素を５Ｕ添加し、２５℃で３日間反応させた。上記
反応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖
−Ｆ分解酵素で低分子化された物質を徹底的に限外ろ過
した。なお、限外ろ過時には水を添加した。こうして得
られたろ過液に含まれているフコース硫酸含有多糖の低
分子化物について理化学的性質を調べた。
になるように塩化カルシウムを添加し、さらにＷＯ９７
／２６８９６公報記載の方法でアルテロモナス ｓｐ．
ＳＮ−１００９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を培養
し、該培養物から得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ分
解酵素を５Ｕ添加し、２５℃で３日間反応させた。上記
反応液を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させ
た限外ろ過機で限外ろ過し、上記フコース硫酸含有多糖
−Ｆ分解酵素で低分子化された物質を徹底的に限外ろ過
した。なお、限外ろ過時には水を添加した。こうして得
られたろ過液に含まれているフコース硫酸含有多糖の低
分子化物について理化学的性質を調べた。
【０１２９】（２）上記（１）で得られたろ過液を集
め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離
した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リ
ットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上
清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器によ
り脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシ
ウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。
この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより
平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リッ
トル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭ
の塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭ
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。こ
の時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した
画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティ
カル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０
２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウ
ム濃度が約０．４Ｍで溶出される画分（以下、０．４Ｍ
溶出画分と称す。）が均一であることが判明した。ま
た、約０．６Ｍの濃度で溶出される画分（以下０．６Ｍ
溶出画分と称す。）も電気泳動的にほぼ均一であった。
め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた
限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離
した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リ
ットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上
清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器によ
り脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシ
ウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。
この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより
平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リッ
トル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭ
の塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭ
の塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。こ
の時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した
画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティ
カル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７巻、第１９７〜２０
２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウ
ム濃度が約０．４Ｍで溶出される画分（以下、０．４Ｍ
溶出画分と称す。）が均一であることが判明した。ま
た、約０．６Ｍの濃度で溶出される画分（以下０．６Ｍ
溶出画分と称す。）も電気泳動的にほぼ均一であった。
【０１３０】そこで、まず０．４Ｍ溶出画分の液を１５
０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウ
ムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平
衡化したＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（樹脂量２００
ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄し
た。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００
の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０
５ｍｌを得た。
０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウ
ムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平
衡化したＰｈｅｎｙｌ−セルロファイン（樹脂量２００
ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄し
た。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量３００
の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０
５ｍｌを得た。
【０１３１】得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％の
エタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平
衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．
１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取
は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
エタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平
衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．
１ｃｍ×８７ｃｍ）にかけて、ゲルろ過を行った。分取
は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
【０１３２】全フラクションに対して総糖量の分析をフ
ェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analyt
ical Chemistry）、第２８巻、第３５０頁（１９５
６）〕により行った。
ェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analyt
ical Chemistry）、第２８巻、第３５０頁（１９５
６）〕により行った。
【０１３３】この結果、硫酸化糖は１つのピークを形成
したので、そのピークの中央部分を集め、排除分子量３
００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾
燥し、１１２ｍｇの本発明の硫酸化糖の乾燥品を得た。
該乾燥品の一部を取り糖組成分析及び質量分析を行っ
た。また、乾燥品のうちの１０ｍｇを常法により重水置
換し、ＮＭＲ分析に供した。
したので、そのピークの中央部分を集め、排除分子量３
００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾
燥し、１１２ｍｇの本発明の硫酸化糖の乾燥品を得た。
該乾燥品の一部を取り糖組成分析及び質量分析を行っ
た。また、乾燥品のうちの１０ｍｇを常法により重水置
換し、ＮＭＲ分析に供した。
【０１３４】糖組成分析の結果、０．４Ｍ溶出画分は、
フコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。
フコースのみからなる硫酸化糖であることが判明した。
【０１３５】また、ＡＰＩ−ＩＩＩ質量分析機（パーキ
ンエルマー・サイエクス社）を用いた、硫酸化糖の質量
分析の結果を図２４に示し、以下に解析結果を示す。す
なわち図２４は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であ
り、縦軸は相対強度（％）を、横軸はｍ／ｚ値を示す。
その結果、分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になって
いる状態で２２６４±１であった。つまり、構成糖がフ
コースだけの硫酸化糖であることから、フコースが７分
子、硫酸基が１２分子結合したもので、その硫酸基がす
べてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は
２２６５であることが判明した。
ンエルマー・サイエクス社）を用いた、硫酸化糖の質量
分析の結果を図２４に示し、以下に解析結果を示す。す
なわち図２４は硫酸化糖の質量分析の結果を示す図であ
り、縦軸は相対強度（％）を、横軸はｍ／ｚ値を示す。
その結果、分子量は、全硫酸基がナトリウム塩になって
いる状態で２２６４±１であった。つまり、構成糖がフ
コースだけの硫酸化糖であることから、フコースが７分
子、硫酸基が１２分子結合したもので、その硫酸基がす
べてナトリウム塩になっているもので、理論的分子量は
２２６５であることが判明した。
【０１３６】つまり、本物質をＭとすると、図２４中の
主なシグナルは下記のように帰属することができる。 ｍ／ｚ １１０９．０５--- ［Ｍ−２Ｎａ+ ］2- （理論値 １１０９．５） ７３１．４５--- ［Ｍ−３Ｎａ+ ］3- （理論値 ７３２） ５４２．７５--- ［Ｍ−４Ｎａ+ ］4- （理論値 ５４３．２５） ４３０．０５--- ［Ｍ−５Ｎａ+ ］5- （理論値 ４３０） この結果、本物質はフコース７分子、硫酸基１２分子の
オリゴ糖である。
主なシグナルは下記のように帰属することができる。 ｍ／ｚ １１０９．０５--- ［Ｍ−２Ｎａ+ ］2- （理論値 １１０９．５） ７３１．４５--- ［Ｍ−３Ｎａ+ ］3- （理論値 ７３２） ５４２．７５--- ［Ｍ−４Ｎａ+ ］4- （理論値 ５４３．２５） ４３０．０５--- ［Ｍ−５Ｎａ+ ］5- （理論値 ４３０） この結果、本物質はフコース７分子、硫酸基１２分子の
オリゴ糖である。
【０１３７】次に、フコースの結合様式、及び硫酸基の
結合位置を決定するために、ＪＮＭ−α５００ 型核磁
気共鳴装置（日本電子社製）を用い、ＮＭＲ分析を行っ
た。構成糖の結合様式は1Ｈ−検出異種核検出法である
ＨＭＢＣ法を用いて行った。1Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤ
ＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、13Ｃ−ＮＭＲ
の帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
結合位置を決定するために、ＪＮＭ−α５００ 型核磁
気共鳴装置（日本電子社製）を用い、ＮＭＲ分析を行っ
た。構成糖の結合様式は1Ｈ−検出異種核検出法である
ＨＭＢＣ法を用いて行った。1Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤ
ＱＦ−ＣＯＳＹ法及びＨＯＨＡＨＡ法を、13Ｃ−ＮＭＲ
の帰属にはＨＳＱＣ法を用いた。
【０１３８】ＮＭＲの帰属の結果を以下に示し、０．４
Ｍ溶出画分の硫酸化糖の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２
５に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２６にそれぞれ示し
た。但し、1Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサン
の化学シフト値を３．５３ｐｐｍに、13Ｃ−ＮＭＲでは
ジオキサンの化学シフト値を６６．５ｐｐｍとして表し
た。測定は両方共に６０℃で行った。すなわち図２５
は、０．４Ｍ溶出画分の硫酸化糖の1Ｈ−ＮＭＲスペク
トルを示す図であり、図２６は０．４Ｍ溶出画分の硫酸
化糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２
５、図２６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−
ＮＭＲによる分析結果を表１２および１３に示す。
Ｍ溶出画分の硫酸化糖の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２
５に、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２６にそれぞれ示し
た。但し、1Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサン
の化学シフト値を３．５３ｐｐｍに、13Ｃ−ＮＭＲでは
ジオキサンの化学シフト値を６６．５ｐｐｍとして表し
た。測定は両方共に６０℃で行った。すなわち図２５
は、０．４Ｍ溶出画分の硫酸化糖の1Ｈ−ＮＭＲスペク
トルを示す図であり、図２６は０．４Ｍ溶出画分の硫酸
化糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２
５、図２６において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−
ＮＭＲによる分析結果を表１２および１３に示す。
【表１２】
【表１３】
【０１３９】なお、ＮＭＲのピークの帰属の番号は下記
式（ＸＶ）の通りである。
式（ＸＶ）の通りである。
【化２６】
（式中、ＲはＨ又はＯＳＯ3Ｈである）
【０１４０】以上の結果より、本物質は下記式（ＸＶ
Ｉ）で表される硫酸化糖であることが判明した。
Ｉ）で表される硫酸化糖であることが判明した。
【化２７】
【０１４１】（３）実施例９（２）に記載した、ＤＥＡ
Ｅ−セルロファインの０．６Ｍ溶出画分に関しても０．
４Ｍ溶出画分と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。
この標品は、ＨＰＬＣによる分析の結果、０．４Ｍ溶出
画分よりも分子量の大きな硫酸化糖であることが判明し
たが、ＮＭＲの分析結果によると０．４Ｍ溶出画分とほ
ぼ同じスペクトルが得られた。
Ｅ−セルロファインの０．６Ｍ溶出画分に関しても０．
４Ｍ溶出画分と全く同様に精製して凍結乾燥品を得た。
この標品は、ＨＰＬＣによる分析の結果、０．４Ｍ溶出
画分よりも分子量の大きな硫酸化糖であることが判明し
たが、ＮＭＲの分析結果によると０．４Ｍ溶出画分とほ
ぼ同じスペクトルが得られた。
【０１４２】図２７に０．６Ｍ溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、1Ｈ−
ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を
３．５３ｐｐｍとして表した。測定は６０℃で行った。
すなわち図２７は０．６Ｍ溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸
は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
スペクトルを示した。但し、溶媒は重水を用い、1Ｈ−
ＮＭＲでの化学シフト値はジオキサンの化学シフト値を
３．５３ｐｐｍとして表した。測定は６０℃で行った。
すなわち図２７は０．６Ｍ溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示す図であり、縦軸はシグナルの強度を、横軸
は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【０１４３】この結果、０．６Ｍ溶出画分は０．４Ｍ溶
出画分が数分子結合した構造を持つことが強く示唆され
た。そこで、０．６Ｍ溶出画分を実施例９（１）記載の
フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素によりさらに分解し
て得た分解物をＨＰＬＣにより分析したところ、反応生
成物の多くが実施例９（２）に記載したＤＥＡＥ−セル
ロファインの０．４Ｍ溶出画分の硫酸化糖と同じ位置に
溶出されてきた。
出画分が数分子結合した構造を持つことが強く示唆され
た。そこで、０．６Ｍ溶出画分を実施例９（１）記載の
フコース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素によりさらに分解し
て得た分解物をＨＰＬＣにより分析したところ、反応生
成物の多くが実施例９（２）に記載したＤＥＡＥ−セル
ロファインの０．４Ｍ溶出画分の硫酸化糖と同じ位置に
溶出されてきた。
【０１４４】なお、ＨＰＬＣの分析条件は下記の通りで
ある。 カラム Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ８０２．５（昭和電工社
製） カラム温度 ２５℃ 溶液 ５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩
化ナトリウム 検出 示差屈折率検出器 Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１ 上記０．６Ｍ溶出画分、０．４Ｍ溶出画分につきプルラ
ン（昭和電工社製）を標準物質としたゲルろ過法により
分子量を測定したところ、０．４Ｍ溶出画分はプルラン
換算で分子量約８５００、０．６Ｍ溶出画分は分子量約
２６０００であり、０．６Ｍ溶出画分は０．４Ｍ溶出画
分の硫酸化糖の３量体であることが判明した。また、７
糖残基の繰り返しの結合位置は約０．６Ｍ溶出画分の1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを詳細に検討することにより、式
（ＸＶ）中のＦのフコースの３位にα−（１→３）結合
でつながっていることが明らかとなった。さらに、上記
の方法に準じ、上記フコース硫酸含有多糖の低分子化物
中より、（ＸＶＩ）で表される硫酸化糖の５量体、すな
わち下記一般式（ＸＩＶ）においてｎ＝５で表される硫
酸化糖を得た。
ある。 カラム Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ８０２．５（昭和電工社
製） カラム温度 ２５℃ 溶液 ５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭの塩
化ナトリウム 検出 示差屈折率検出器 Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１ 上記０．６Ｍ溶出画分、０．４Ｍ溶出画分につきプルラ
ン（昭和電工社製）を標準物質としたゲルろ過法により
分子量を測定したところ、０．４Ｍ溶出画分はプルラン
換算で分子量約８５００、０．６Ｍ溶出画分は分子量約
２６０００であり、０．６Ｍ溶出画分は０．４Ｍ溶出画
分の硫酸化糖の３量体であることが判明した。また、７
糖残基の繰り返しの結合位置は約０．６Ｍ溶出画分の1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルを詳細に検討することにより、式
（ＸＶ）中のＦのフコースの３位にα−（１→３）結合
でつながっていることが明らかとなった。さらに、上記
の方法に準じ、上記フコース硫酸含有多糖の低分子化物
中より、（ＸＶＩ）で表される硫酸化糖の５量体、すな
わち下記一般式（ＸＩＶ）においてｎ＝５で表される硫
酸化糖を得た。
【化２８】
（式中、ＲはＨ又はＯＳＯ3Ｈである）
【０１４５】以上のことから、ガゴメ昆布のような褐藻
類から得られた硫酸化フコース含有多糖をフコース硫酸
含有多糖−Ｕ分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素で処理することにより、硫酸化フコース含有
多糖−Ｆ分解酵素によって低分子化され、下記一般式で
表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖
が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分
子量は、実施例１（３）の方法で測定したところ、抽出
時の処理条件が、ｐＨ６〜８、９５℃ 約２時間の場合
は、平均分子量は約２０万（分子量分布は、約１万〜約
１００万）であった。また、抽出時の処理条件が、ｐＨ
６〜８、２５℃ 約２４時間の場合は、平均分子量は約
１，３００万（分子量分布は、約１０万〜約２，０００
万）であった。
類から得られた硫酸化フコース含有多糖をフコース硫酸
含有多糖−Ｕ分解酵素及び本発明の硫酸化フコガラクタ
ン分解酵素で処理することにより、硫酸化フコース含有
多糖−Ｆ分解酵素によって低分子化され、下記一般式で
表される硫酸化糖を構成糖の必須成分とする硫酸化多糖
が得られることが確認できた。また、該硫酸化多糖の分
子量は、実施例１（３）の方法で測定したところ、抽出
時の処理条件が、ｐＨ６〜８、９５℃ 約２時間の場合
は、平均分子量は約２０万（分子量分布は、約１万〜約
１００万）であった。また、抽出時の処理条件が、ｐＨ
６〜８、２５℃ 約２４時間の場合は、平均分子量は約
１，３００万（分子量分布は、約１０万〜約２，０００
万）であった。
【発明の効果】本発明により糖鎖工学用試薬あるいはＨ
ＧＦ産生誘導物質として有用な硫酸化フコガラクタン及
びその低分子化物が提供される。また、該硫酸化フコガ
ラクタンの構造解析や分解、硫酸化フコガラクタンの低
分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規な
硫酸化フコガラクタン分解酵素が提供される。また、該
酵素の製造方法についても提供される。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素により硫酸化フコース含
有多糖の混合物から硫酸化フコガラクタンを選択的に除
去する方法が提供される。さらに、本発明の硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素と他のフコース硫酸含有多糖分解酵
素を組み合せて使用することにより、新規の硫酸化糖が
提供される。
ＧＦ産生誘導物質として有用な硫酸化フコガラクタン及
びその低分子化物が提供される。また、該硫酸化フコガ
ラクタンの構造解析や分解、硫酸化フコガラクタンの低
分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規な
硫酸化フコガラクタン分解酵素が提供される。また、該
酵素の製造方法についても提供される。また、本発明の
硫酸化フコガラクタン分解酵素により硫酸化フコース含
有多糖の混合物から硫酸化フコガラクタンを選択的に除
去する方法が提供される。さらに、本発明の硫酸化フコ
ガラクタン分解酵素と他のフコース硫酸含有多糖分解酵
素を組み合せて使用することにより、新規の硫酸化糖が
提供される。
【図１】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
分解酵素のｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフで
ある。
分解酵素のｐＨと相対活性（％）の関係を表すグラフで
ある。
【図２】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
分解酵素の温度と相対活性（％）の関係を表すグラフで
ある。
分解酵素の温度と相対活性（％）の関係を表すグラフで
ある。
【図３】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ａ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物（Ａ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
【図４】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ａ）の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物（Ａ）の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
【図５】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ａ）の質量分析（マス）スペクトルを示す
図である。
低分子化物（Ａ）の質量分析（マス）スペクトルを示す
図である。
【図６】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ｂ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物（Ｂ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
【図７】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ｂ）の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物（Ｂ）の 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
【図８】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ｂ）の質量分析（マス）スペクトルを示す
図である。
低分子化物（Ｂ）の質量分析（マス）スペクトルを示す
図である。
【図９】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタン
低分子化物（Ｃ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
低分子化物（Ｃ）の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。
【図１０】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｃ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｃ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１１】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｃ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物（Ｃ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
【図１２】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｄ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１３】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｄ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｄ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１４】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｄ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物（Ｄ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
【図１５】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｅ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１６】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｅ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｅ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１７】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｅ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物（Ｅ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
【図１８】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
ン低分子化物（Ｆ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図
である。
【図１９】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｆ）の13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°スペク
トルを示す図である。
ン低分子化物（Ｆ）の13Ｃ−ＤＥＰＴ−１３５°スペク
トルを示す図である。
【図２０】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ン低分子化物（Ｆ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
ン低分子化物（Ｆ）の質量分析（マス）スペクトルを示
す図である。
【図２１】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
ンの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２２】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
ンの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２３】 本発明により得られる硫酸化フコガラクタ
ンの赤外吸収スペクトルを示す図である。
ンの赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図２４】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の０．
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の質量分析（マス）スペク
トルを示す図である。
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の質量分析（マス）スペク
トルを示す図である。
【図２５】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の０．
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
【図２６】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の０．
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
４Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
【図２７】 フコース硫酸含有多糖の低分子化物の０．
６Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
６Ｍ塩化ナトリウム溶出画分の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２
(72)発明者 嶋中 一夫
大阪府高槻市寺谷町14番20号
(72)発明者 猪飼 勝重
滋賀県甲賀郡甲南町希望ケ丘本町９−
421−45
(72)発明者 加藤 郁之進
京都府宇治市南陵町１−１−150
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/14 - 9/46
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＪＳＴｐｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする硫酸化フコガラクタン分解酵素： （１）作用：構成糖としてガラクトースとフコースを含
有し、そのモル比が１：１〜６：１である硫酸化フコガ
ラクタン又はその塩に作用して該硫酸化フコガラクタン
を低分子化させ、還元性末端に硫酸化ガラクトースある
いはガラクトースを持つオリゴ糖を生成させる、 （２）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは約７〜９である、 （３）至適温度：本酵素の至適温度は約２５〜４５℃で
ある、 （４）フラボバクテリウムｓｐ．（Flavobacterium s
p.）ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）由来
である。 - 【請求項２】 オリゴ糖が、下記一般式（Ｉ）〜（Ｉ
Ｖ）で表される化合物より選択されるオリゴ糖である請
求項１記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 （式中、ＲはＨ又はＳＯ3Ｈである）。 - 【請求項３】 請求項１記載の硫酸化フコガラクタン分
解酵素生産能を有するフラボバクテリウム属細菌を培養
し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする
請求項１記載の硫酸化フコガラクタン分解酵素の製造方
法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| JP4475299 | 1999-02-23 | ||
| JP23280999 | 1999-08-19 | ||
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| JP11-44752 | 1999-12-09 | ||
| JP11-350112 | 1999-12-09 | ||
| JP35011299 | 1999-12-09 | ||
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