ES2236420T3 - Oligosacarido de fucano sulfatado. - Google Patents
Oligosacarido de fucano sulfatado.Info
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Abstract
Un fucano sulfatado que tiene las siguientes propiedades químicas y físicas: (1) contiene fucosa como un sacárido constitutivo (2) contiene un sacárido sulfatado de la fórmula general (I), como un componente esencial del sacárido constitutivo: **(Fórmula)** donde R es H o SO3H, al menos uno de los restos R es SO3H, y n es un número entero de 1 o más; y (3) se convierte en moléculas más pequeñas mediante una enzima de digestión de fucano sulfatado derivado de Alteromonas sp. SN-1009, para generar al menos un compuesto seleccionado de un grupo que consiste en los compuestos de las fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI): **(Fórmulas)**.
Description
Oligosacárido de fucano sulfatado.
La presente invención se refiere a un
oligosacárido de fucano sulfatado que es útil en el campo de la
glicotecnología, y a un método para producirlo.
Las algas pardas contienen una variedad de
polisacáridos sulfatados. Estos polisacáridos se denominan
frecuentemente, de forma genérica, fucoidanos o fucoidinas. En
muchos casos, sus estructuras varían dependiendo de las algas de las
que se derivan. Por ejemplo, los polisacáridos sulfatados extraídos
de Fucus vesiculosus, Laminaria japonica, Cladosiphon okamuranus,
Nemacystus decipiens y los esporofilos de Undaria
pinnatifida, tienen estructuras diferentes unas de otras. Por
eso, es necesario obtener enzimas que digieran los respectivos
polisacáridos sulfatados, para obtener oligosacáridos de los
polisacáridos sulfatados, mediante digestión enzimática de los
mismos, o para determinar sus estructuras.
Se han descrito las especies moleculares de los
polisacáridos sulfatados, incluyendo fucanos sulfatados,
fucoglucuronomananos sulfatados y fucogalactanos sulfatados, así
como diversas otras especies moleculares.
El Documento WO 90/15823 A describe polisacáridos
sulfatados, obtenidos de fucanos extraídos de Phaeophylaceae, que se
caracterizan porque se obtienen mediante lisis controlada de un
fucano crudo extraído de Phaeophylaceae, un procedimiento para
obtener el mismo, agente anticoagulante y antitrombótico, así como
un agente que inhibe la activación del complemento.
El Documento WO 97/08206 A describe un método
para obtener polisacáridos sulfatados, utilizando la
despolimerización de un fucano crudo de Phaeophylaceae, y un
polisacárido sulfatado obtenido por dicho método.
Los polisacáridos sulfatados generalmente tienen
algunas actividades biológicas en muchos casos. Por ejemplo, se ha
descrito una fracción de fucano sulfatado que tiene fuerte actividad
anticoagulante, y se ha descrito una fracción de fucoglucuromanano
sulfatado, que tiene una actividad de inducción de la apoptosis
contra células tumorales.
Si un polisacárido sulfatado va a desarrollarse
como fármaco, es necesario determinar su estructura. Es muy
ventajoso determinar la estructura, utilizando una enzima que
digiera el polisacárido sulfatado. Sin embargo, no existe ninguna
enzima que digiera un polisacárido sulfatado de algas pardas
disponible comercialmente. Además, se requiere una enzima de
digestión que digiera específicamente el polisacárido sulfatado cuya
estructura va a determinarse. Esto es debido a que los polisacáridos
sulfatados de las algas pardas varían dependiendo de las especies de
algas en muchos casos. Se han estudiado las estructuras de los
polisacáridos sulfatados derivados de las algas que pertenecen a las
Laminariales, aunque las estructuras se han revelado solo para unos
pocos tipos entre muchas especies moleculares.
Como se ha descrito anteriormente, se desea un
oligosacárido de fucano sulfatado, estructuralmente homogéneo, que
se produzca mediante métodos enzimáticos, utilizando una enzima que
digiere un polisacárido sulfatado nuevo, derivado de un alga que
pertenece a las Laminariales (es decir, una enzima que digiere
específicamente un fucano sulfatado).
Así, el principal objetivo de la presente
invención es proporcionar una molécula más pequeña, que se obtenga
permitiendo a una enzima de digestión del fucano sulfatado, que
digiera un polisacárido sulfatado nuevo, derivado de un alga que
pertenece a las Laminariales, actuando sobre un fucano sulfatado, y
un método para producirla.
El primer aspecto de la presente invención se
refiere a un fucano sulfatado que tiene las siguientes propiedades
químicas y físicas:
(1) contener fucosa como un sacárido
constitutivo;
(2) contener un sacárido sulfatado de la fórmula
general (I), como un componente esencial del sacárido
constitutivo:
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donde R es H o SO_{3}H, al menos
uno de los restos R es SO_{3}H, y n es un número entero de 1 o
más;
y
(3) convertirse en moléculas más pequeñas
mediante una enzima de digestión de fucano sulfatado, derivada de
Alteromonas sp. SN-1009, para generar al
menos un compuesto seleccionado de un grupo que consiste en los
compuestos de la fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV), (XV)
y (XVI):
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y
donde R es H o SO_{3}H, y al
menos uno de los restos R es SO_{3}H en todas las fórmulas
anteriores,
o una de sus sales.
El segundo aspecto de la presente invención se
refiere a un oligosacárido de fucano sulfatado, de la fórmula
general (I):
donde R es H o SO_{3}H, al menos
uno de los restos R es SO_{3}H, y n es 1 a
5.
El tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método para preparar un oligosacárido de fucano
sulfatado, comprendiendo dicho método:
permitir a una enzima de digestión de fucano
sulfatado derivada de Alteromona sp. SN-1009,
actuar sobre un fucano sulfatado del primer o el segundo aspecto;
y
recolectar un producto de digestión.
Según el tercer aspecto, el fucano sulfatado se
deriva de Kjellmaniella crassiofolia, Laminaria japonica o
Lessonia nigrescens.
El cuarto aspecto de la presente invención se
refiere a un oligosacárido de fucano sulfatado, que se obtiene
mediante el método de preparación del tercer aspecto.
El quinto aspecto de la presente invención se
refiere a un oligosacárido de fucano sulfatado, que tiene una
estructura química seleccionada del grupo que consiste en las
fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI):
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y
donde R es H o SO_{3}H, y al
menos uno de los restos R es SO_{3}H en todas las fórmulas
anteriores,
o una de sus sales.
Como resultado de un estudio intensivo, los
presentes inventores han encontrado un método para producir un
oligosacárido de fucano sulfatado, mediante digestión de un
polisacárido sulfatado nuevo, derivado de un alga que pertenece a
las Laminariales, utilizando una enzima de digestión de fucano
sulfatado. El oligosacárido de fucano sulfatado puede utilizarse
como reactivo para glicotecnología, y es estructuralmente homogéneo.
Además, los presentes inventores han determinado la estructura del
oligosacárido. Así, se ha completado la presente invención.
Figura 1: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(1), según la presente invención.
Figura 2: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(1), según la presente invención.
Figura 3: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 1-(1), según la presente
invención.
Figura 4: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(2), según la presente invención.
Figura 5: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(2), según la presente invención.
Figura 6: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 1-(2), según la presente
invención.
Figura 7: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(3), según la presente invención.
Figura 8: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(3), según la presente invención.
Figura 9: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 1-(3), según la presente
invención.
Figura 10: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(4), según la presente invención.
Figura 11: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(4), según la presente invención.
Figura 12: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 1-(4), según la presente
invención.
Figura 13: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
2-(1)-2, según la presente invención.
Figura 14: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(1)-2, según la presente invención.
Figura 15: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 1-(1)-2,
según la presente invención.
Figura 16: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
2-(2), según la presente invención.
Figura 17: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
2-(2), según la presente invención.
Figura 18: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado 2-(2), según la presente
invención.
Figura 19: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado de
Lessonia nigrescens 1-(1), según la presente invención.
Figura 20: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
de Lessonia nigrescens 1-(1), según la presente
invención.
Figura 21: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(1), según la presente invención.
Figura 22: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado de
Lessonia nigrescens 1-(2), según la presente invención.
Figura 23: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
de Lessonia nigrescens 1-(2), según la presente
invención.
Figura 24: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(2), según la presente invención.
Figura 25: una figura que ilustra el espectro de
^{1}H-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado de
Lessonia nigrescens 1-(3), según la presente invención.
Figura 26: una figura que ilustra el espectro de
^{13}C-NMR del oligosacárido de fucano sulfatado
de Lessonia nigrescens 1-(3), según la presente
invención.
Figura 27: una figura que ilustra el espectro de
masa del oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(3), según la presente invención.
La presente invención se explicará con
detalle.
Aunque no se pretende limitar la presente
invención, por ejemplo, un fucano sulfatado derivado de un alga que
pertenece a las Laminariales puede utilizarse de acuerdo con la
presente invención. Este polisacárido tiene un grupo sulfato y
fucosa como principales constituyentes. La cadena principal de un
fucano sulfatado derivado de un alga que pertenece a las
Laminariales, se compone de L-fucosa, que es más
ácido-lábil que los sacáridos generales. De este
modo, puede convertirse fácilmente en moléculas más pequeñas
mediante tratamiento con calor o con
ácido.
ácido.
Un fucano sulfatado que tiene las características
mencionadas arriba puede utilizarse de acuerdo con la presente
invención. Aunque no existe una limitación específica en lo que
concierne al origen, por ejemplo, como materiales crudos se utilizan
preferiblemente las algas que pertenecen a las Laminariales, tales
como la Kjellmaniella crassifolia, Laminaria japonica y
Lessonia nigrescens, ya que su contenido en fucano sulfatado
es elevado.
La enzima que digiere el fucano sulfatado según
la presente invención, actúa sobre un fucano sulfatado, un
oligosacárido de fucano sulfatado y similares, e hidroliza un puente
\alpha-L-fucosil entre fucosas, de
una forma endotípica, para generar un oligosacárido que tiene
L-fucosa en su extremo reductor.
El oligosacárido de fucano sulfatado de la
presente invención es un oligosacárido que se obtiene, permitiendo a
la enzima que digiere el fucano sulfatado según la presente
invención, que actúe sobre un fucano sulfatado y que tenga
L-fucosa como sacárido en el extremo reductor.
Primero se obtiene un extracto de la fracción
soluble en agua de un alga parda, para producir el fucano sulfatado
utilizado según la presente invención. En este caso, es preferible
obtener el extracto de la fracción soluble en agua a pH
4-9, a una temperatura de 100ºC o inferior, para
prevenir la conversión del fucano sulfatado en moléculas más
pequeñas. Además, los aminoácidos, las pequeñas moléculas de
pigmento o similares, pueden ser eficazmente eliminados del extracto
mediante ultrafiltración. El tratamiento con carbón activado o
similar, es efectivo para eliminar las sustancias hidrófobas.
Una fracción de polisacárido sulfatado puede
obtenerse de un alga parda como se ha descrito anteriormente. Esta
fracción puede utilizarse como fracción de fucano sulfatado, por
ejemplo, como sustrato para la enzima de digestión de fucano
sulfatado, según la presente invención. Puede obtenerse un fucano
sulfatado mucho más altamente purificado, separando la fracción
utilizando una columna de intercambio aniónico. Tanto la fracción de
polisacárido sulfatado como el fucano sulfatado purificado
utilizando una columna de intercambio aniónico, pueden utilizarse
como materiales crudos para la producción del oligosacárido fucano
sulfatado de la presente invención.
El principal esqueleto del fucano sulfatado de la
presente invención se representa mediante la fórmula (I), más
adelante. Los fucanos sulfatados de la presente invención incluyen
aquellos de la fórmula general en la que n es un número entero de 1
o más, por ejemplo 1 a 20.000, preferiblemente 1 a 10.000. Los
fucanos sulfatados de la presente invención incluyen los que tienen
una estructura en la que la fórmula general (I) se repite
continuamente, y los que tienen una estructura en la que la fórmula
general (I) se incluye discontinuamente, siendo intervenida por
otras estructuras, siempre que estén dentro de la definición que se
describió previamente.
donde R es H o SO_{3}H, y al
menos uno de los restos R es
SO_{3}H;
La cepa de bacterias que produce la enzima de
digestión del fucano sulfatado para utilizarse según la presente
invención, se clasifica como una bacteria que pertenece al género
Alteromonas según la clasificación básica que se describe en
el Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, Vol. 9 (1994). La
clasificación de las bacterias que pertenecen al género
Alteromonas ha sido recientemente reorganizado. Así, no es
apropiado clasificar la bacteria basándose solo en las propiedades
bacteriológicas. La secuencia de nucleótidos de 16S rDNA de esta
cepa bacteriana ha sido determinada. La comparación de homologías
con secuencias de bacterias conocidas reveló que una bacteria que
pertenece al género Thalassomonas tiene la secuencia más
homóloga. Sin embargo, como la distancia genética es de 0,05
(cambio/posición de nucleótido media) o más, no se ha determinado
que la bacteria pertenezca a este género. Así, los presentes
inventores concluyeron que esta bacteria no pertenece a un género
conocido, sino que pertenece a un género nuevo, basándose en la
homología de secuencias del 16S rDNA, y la denominaron
Fucanobacter lyticus SN-1009. Como aquí se
utiliza, Alteromonas sp. SN-1009 es lo mismo
que Fucanobacter lyticus SN-1009.
Esta cepa bacteriana se denominó
Alteromonas sp. SN-1009 y se depositó el 13
de febrero de 1996 (fecha del depósito original), en el Organismo
Depositario de Patentes Internacionales, Instituto Nacional de
Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, AIST Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken
305-8566, Japón, con el número de acceso FERM
BP-5747 (trasmitido a la autoridad depositaria
internacional bajo el Tratado de Budapest, el 15 de noviembre de
1996). La secuencia de rDNA de 16S de esta cepa bacteriana se
muestra en la SEQ ID NO:1.
De este modo, la enzima de digestión de fucano
sulfatado, utilizada según la presente invención puede producirse
cultivando una bacteria que pertenece al mismo género que
Fucanobacter lyticus SN-1009, basado en la
secuencia de rDNA de 16S. Según la presente invención, se pueden
utilizar la Alteromonas sp. SN-1009, un
mutante espontáneo o artificial de Alteromonas sp.
SN-1009, y los microorganismos que pertenecen al
género Alteromonas y al género Fucanobacter, capaces
de producir la enzima de digestión de fucano sulfatado, utilizados
según la presente invención.
La enzima de digestión de fucano sulfatado para
usar según la presente invención, puede obtenerse de los
microorganismos mencionados previamente según el método que se
describe en el Ejemplo 1.
El oligosacárido de fucano sulfatado de la
presente invención puede prepararse permitiendo que una enzima de
digestión de fucano sulfatado actúe sobre un material que contenga
fucano sulfatado. Por ejemplo, una preparación parcialmente
purificada de fucano sulfatado, una fracción de polisacárido
sulfatado derivada de alga parda que contenga fucosa, un producto
obtenido mediante extracción de un alga parda con un disolvente
acuoso, o un alga parda en si misma, pueden utilizarse
preferiblemente como material que contiene fucano sulfatado.
Para preparar el oligosacárido de fucano
sulfatado de la presente invención, un fucano sulfatado o un
material que contiene fucano sulfatado, pueden disolverse según un
método convencional. El fucano sulfatado o el material que contiene
fucano sulfatado de la presente invención, pueden disolverse en la
solución a la concentración máxima. Sin embargo, la concentración
generalmente se selecciona teniendo en consideración su operabilidad
y la cantidad de la enzima de digestión del fucano sulfatado
utilizada en la reacción, según la presente invención. El disolvente
para el fucano sulfatado puede seleccionarse entre agua, soluciones
de tampón, y similares, dependiendo del objetivo. Generalmente, el
pH de la solución está cercano a la neutralidad. La reacción
enzimática se lleva a cabo generalmente a alrededor de 30ºC. El peso
molecular del oligosacárido de fucano sulfatado puede controlarse
ajustando la razón o la cantidad de la enzima de digestión de fucano
sulfatado utilizada en la reacción, según la presente invención, la
composición de la mezcla de la reacción, el tiempo de reacción y
similares. El oligosacárido de fucano sulfatado de la presente
invención, que tiene distribución de peso molecular más homogénea, o
distribución de densidad de carga más homogénea, puede prepararse
sometiendo al oligosacárido de fucano sulfatado de la presente
invención, como se describió anteriormente, a fraccionamiento de
peso molecular o fraccionamiento utilizando una columna de
intercambio aniónico. Puede aplicarse un método convencional para el
fraccionamiento de peso molecular. Por ejemplo, pueden utilizarse
filtración en gel o membrana de fraccionamiento de peso molecular.
Opcionalmente, las moléculas más pequeñas pueden purificarse más
utilizando tratamiento con resina de intercambio iónico, tratamiento
con carbón activado o similares, o pueden desalarse, esterilizarse o
liofilizarse. De este modo, puede obtenerse el oligosacárido de
fucano sulfatado de la presente invención, con una estructura tan
homogénea que se puede determinar su estructura mediante análisis de
NMR, como se describe más adelante.
Aunque no se pretende limitar la presente
invención, por ejemplo, un oligosacárido de fucano sulfatado que
tiene una estructura química seleccionada del grupo que consiste en
las fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI):
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y
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donde R es H o SO_{3}H, y al
menos uno de los restos R es SO_{3}H en todas las fórmulas
anteriores,
o una de sus sales, ejemplifican el oligosacárido
de fucano sulfatado de la presente invención.
El oligosacárido de fucano sulfatado de la
presente invención tiene grupos sulfato dentro de las moléculas, y
dichos grupos reaccionan con diversas bases para formar sales. El
oligosacárido de fucano sulfatado de la presente invención es
estable cuando está en forma de sal. Generalmente se proporciona en
forma de sal sódica y/o potásica y/o cálcica. El oligosacárido de
fucano sulfatado de la presente invención en forma libre puede
derivarse de una de sus sales, utilizando una resina de intercambio
catiónico, como Dowex 50W. Opcionalmente, puede someterse a
intercambio de sal convencional, para convertirlo en una de sus
diversas sales deseables.
Pueden utilizarse sales farmacéuticamente
aceptables, como las sales del oligosacárido de fucano sulfatado de
la presente invención. Ejemplos de las sales incluyen sales con
metales alcalinos tales como sodio y potasio, y metales de tierra
alcalinos, tales como calcio, magnesio y zinc, así como sales de
amonio.
Adicionalmente, el oligosacárido de fucano
sulfatado de la presente invención puede utilizarse como reactivo
para glicotecnología. Por ejemplo, una sustancia que es muy útil
como reactivo de glicotecnología (es decir, que puede utilizarse
como molécula estándar marcada con fluorescencia para el
oligosacárido de fucano sulfatado), puede proporcionarse sometiendo
al oligosacárido a marcaje con 2-aminopiridina (PA),
según el método descrito en el Documento JP-B
5-65108, para preparar un oligosacárido marcado con
PA.
Los siguientes ejemplos ilustran mejor la
presente invención en detalle, pero no se presentan para limitar su
alcance.
En los siguientes ejemplos, los pesos moleculares
de los oligosacáridos de fucano sulfatado son sus pesos moleculares
medios, que se calcularon a partir de sus resultados de análisis de
masa.
Ejemplo de referencia
1
Se trituraron dos kg de cultivo seco de
Kjellmaniella crassifolia, utilizando un molinillo de corte
(Masuko Sangyo), equipado con una membrana que tenía un tamaño de
poro de 1 mm de diámetro, y se suspendieron en 20 litros de etanol
al 80%. La suspensión se agitó a 25ºC durante 3 horas, y se filtró a
través de un filtro de papel. El residuo se suspendió en 40 litros
de solución de tampón de fosfato (pH 6,5) 30 mM, que contenía
cloruro sódico 100 mM. La suspensión se trató a 95ºC durante 2
horas, y se filtró a través de una pantalla de acero inoxidable, que
tenía un diámetro de poro de 106 \mum. Se añadieron al filtrado
200 g de carbón activo, 4,5 litros de etanol y 12.000 U de
alginato-liasa K (Nagase Biochemicals). La mezcla
se agitó a 25ºC durante 20 horas, y después se centrífugo. El
sobrenadante se concentró hasta 4 litros, utilizando un instrumento
de ultrafiltración equipado con fibras huecas con un peso molecular
de exclusión de 100.000, se centrífugo para eliminar las sustancias
insolubles, y se dejó reposar a 5ºC durante 24 horas. El precipitado
formado se eliminó mediante centrifugación. El sobrenadante se
sometió a intercambio de disolventes con cloruro sódico 100 mM,
utilizando un aparato de ultrafiltración. La solución se enfrió
hasta 4ºC o menos, y el pH se ajustó a 2,0 con ácido clorhídrico. El
precipitado formado se eliminó mediante centrifugación. El pH del
sobrenadante se ajustó a 8,0 con hidróxido sódico. El sobrenadante
se concentró hasta 4 litros. El concentrado se sometió a intercambio
de disolvente con cloruro sódico 20 mM, utilizando un aparato de
ultrafiltración. Las sustancias insolubles en la solución se
eliminaron mediante centrifugación. El sobrenadante se liofilizó
después, para obtener 76 g de una preparación seca de fucoidano de
Kjellmaniella crassifolia.
\newpage
Ejemplo de Referencia
2
7 g de la preparación seca de fucoidano descrita
en el Ejemplo de Referencia 1 se disolvieron en 700 ml de solución
de tampón de imidazol-clorhídrico (pH 8,0) 20 mM,
que contenía cloruro sódico 50 mM y etanol al 10%, y la solución se
centrifugó para eliminar las sustancias insolubles. El sobrenadante
se aplicó sobre una columna DEAE-Cellulofine
A-800 (11,4 x 48 cm), equilibrada con la misma
solución de tampón. Después de lavarla con la misma solución de
tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro
sódico de 50 mM a 1,95 M. Cada fracción contenía 250 ml de eluido.
El contenido total de azúcar y el contenido de ácido urónico de cada
fracción se midieron según el método de fenol-ácido sulfúrico, y el
método de carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Las fracciones
43-49, 50-55 y 56-67
se combinaron, se desalaron mediante electrodiálisis y se
liofilizaron. Se obtuvieron 340 mg, 870 mg y 2,64 g de productos
secos, de las fracciones 43-49,
50-55 y 56-67, respectivamente. La
fracción obtenida de las fracciones 56-67 se utilizó
como fracción de fucano sulfatado.
Ejemplo de Referencia
3
Se mezclaron 12 \mul de una solución de la
fracción de fucano sulfatado al 2,5%, 60 \mul de solución de
tampón de imidazol-clorhídrico (pH 7,5) 50 mM, 9
\mul de cloruro sódico 4 M, 6 \mul de cloruro cálcico 1 M, 21
\mul de agua y 12 \mul de una solución de la enzima de digestión
de fucano sulfatado según la presente invención. Después de dejarla
reaccionar a 30ºC durante 3 horas, la mezcla de reacción se trató a
100ºC durante 10 minutos. Después de la centrifugación, 100 \mul
del sobrenadante se analizaron utilizando HPLC, para determinar el
grado de conversión a moléculas más pequeñas. Como testigos, se
utilizaron una mezcla de reacción obtenida mediante una reacción en
la que se utilizó la solución de tampón utilizada para disolver la
enzima de digestión de fucano sulfatado, en lugar de la solución de
la enzima de digestión, y una mezcla de reacción obtenida mediante
una reacción en la que se utilizó agua en lugar de la fracción de
fucano sulfatado, y se analizaron de forma similar utilizando
HPLC.
Una unidad de actividad de una enzima de
digestión de fucano sulfatado se definió como la cantidad de una
enzima que escinde los puentes fucosil en 1 \mumol de un fucano
sulfatado en 1 minuto, en el sistema de reacción mencionado
anteriormente. La actividad de una enzima de digestión de fucano
sulfatado se calculó según la siguiente ecua-
ción:
ción:
\{(12x1000x2,5/100)MG\}x\{(MG/M)-1\}x\{1/(180x0,012)\}=U/ml
12x1000x2,5/100: fracción de fucano sulfatado
añadida (\mug);
MG: el peso molecular medio del fucano sulfatado
como sustrato;
M: el peso molecular medio del producto de
reacción;
(MG/M)-1: el número de lugares
escindidos por la enzima en una molécula de fucano sulfatado;
180: el tiempo de reacción (minutos); y
0,0012: el volumen de la solución de enzima
(ml).
La HPLC se llevó a cabo como sigue:
- Instrumento: L-6200 (Hitachi);
- Columna: Ohpak SB-806HQ (8 x 300 mm; Showa Denko);
- Eluyente: cloruro sódico 50 mM, que contiene azida sódica 5 mM;
- Detección: detector de índice refractivo diferencial (Shodex RI-71, Showa Denko);
- Tasa de flujo: 1 ml/minuto; y
- Temperatura de la columna: 25ºC.
Se llevó a cabo el siguiente procedimiento, para
determinar el peso molecular medio del producto de reacción. Se
analizó pululano disponible comercialmente (STANDARD
P-82, Showa Denko), del que se conoce su peso
molecular, bajo las mismas condiciones que las mencionadas
previamente para el análisis de HPLC. La relación entre el peso
molecular del pululano y el tiempo de retención se expresó como una
curva, que se utilizó como una curva estándar para determinar el
peso molecular del producto de reacción. La cantidad de proteína se
determinó midiendo la absorbancia de la solución de la enzima a 280
nm. Los cálculos se realizaron asumiendo que la absorbancia de una
solución que contiene una proteína a una concentración de 1 mg/ml
era de 1,0.
Se inoculó Fucanobacter lyticus
SN-1009 en 4 ml de un medio que consistía en agua de
mar artificial (Jamarine Laboratory) (pH 8,2), que contenía
fucoidano, preparado como se describió en el Ejemplo de Referencia
1, al 0,2%, y peptona, que había sido autoclavada a 120ºC durante 20
minutos, y cultivada a 25ºC durante 24 horas, al 0,3%, para preparar
un cultivo de siembra. El cultivo de siembra se inoculó en 600 ml de
un medio que consistía en agua de mar artificial (pH 8,2), que
contenía glucosa al 0,25%, peptona al 1%, extracto de levadura al
0,05% y agente antiespumoso (KM70, Shin-Etsu
Chemical), en un frasco de Erlenmeyer de 2 litros, que había sido
autoclavado a 120ºC durante 20 minutos, y se cultivó a 25ºC durante
20 horas. Se mezclaron 20 litros de un medio que consistía en agua
de mar artificial (pH 8,2), que contenía peptona la 1%, extracto de
levadura la 0,02% y agente antiespumoso (KM70,
Shin-Etau Chemical), en un recipiente de
fermentación que había sido autoclavado a 120ºC durante 20 minutos,
con el fucoidano preparado como se describió en el Ejemplo de
Referencia 1, que había sido tratado a 100ºC durante 20 minutos. El
cultivo se inoculó en la mezcla, y se cultivó a 25ºC durante 28
horas. Después de cultivarlo, el cultivo se centrífugo para
recolectar las células y el sobrenadante del cultivo.
El sobrenadante del cultivo se concentró
utilizando un aparato de ultrafiltración, equipado con fibras huecas
con peso molecular de exclusión de 10.000. El concentrado se sometió
a intercambio de disolventes con solución de tampón de
Tris-clorhídrico (pH 8,2), que contenía cloruro
cálcico 10 mM y cloruro sódico 150 mM, y se centrífugo para obtener
un sobrenadante.
El sobrenadante se aplicó sobre una columna
DEAE-Cellulofine A-800, equilibrada
con la misma solución de tampón. Después de lavarla con la misma
solución de tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de
cloruro sódico de 150 mM a 400 mM, de tal forma que cada fracción
contenía 63 ml del eluído, para recolectar la fracción activa.
La fracción activa se concentró utilizando un
aparato de ultrafiltración equipada con fibras huecas con peso
molecular de exclusión de 10.000. El concentrado se sometió a
intercambio de disolvente con solución de tampón de
Tris-clorhídrico (pH 8,2), que contenía cloruro
cálcico 10 mM y cloruro sódico 100 mM. La solución de enzima se
aplicó sobre una columna DEAE-Cellulofine
A-800 de 200 ml, equilibrada con la misma solución
de tampón. Después de lavarla con la misma solución de tampón, se
llevó a cabo la elución con un gradiente de cloruro sódico de 100 mM
a 300 mM, de tal forma que cada fracción contenía 19 ml del eluido,
para recolectar la fracción activa.
La fracción activa se concentró utilizando un
aparato de ultrafiltración equipado con una membrana con peso
molecular de exclusión de 10.000. Después se añadió cloruro sódico a
una concentración final de 4 M. La solución se aplicó sobre una
columna Phenyl-Sepharose CL-4B,
equilibrada con solución de tampón de
Tris-clorhídrico (pH 8,0) 20 mM, que contenía
cloruro cálcico 100 mM y cloruro sódico 4 M. Después de lavarla con
la misma solución de tampón, se llevó a cabo la elución con un
gradiente de cloruro sódico de 4 M a 1 M, de tal forma que cada
fracción contenía 9,4 ml de eluído. De esta forma, se obtenía una
preparación purificada de enzima de digestión de fucano
sulfatado.
Se sumergieron 200 g de cultivo seco de
Kjellmaniella crassifolia en 10 litros de solución de tampón
de imidazol-clorhídrico (pH 7,0) 18 mM, que contenía
cloruro cálcico 45 mM, cloruro sódico 500 mM, y etanol al 9%.
Después se añadieron 30 U de enzima de digestión de fucano
sulfatado. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días,
y se filtró a través de un papel de filtro. Una pequeña fracción
molecular, recuperada del filtrado, utilizando un aparato de
ultrafiltración equipado con fibras huecas con peso molecular de
exclusión de 100.000, se denominó como fracción 1 de oligosacárido
de fucano sulfatado.
La fracción 1 de oligosacárido de fucano
sulfatado obtenida en el ejemplo 2-(1), se desaló utilizando un
aparato de desalación (Micro Acilyzer G3, Asahi Kasei), y se
concentró utilizando un evaporador de rotación. Se añadieron
imidazol y cloruro sódico a la solución 1 de oligosacárido de fucano
sulfatado, a una concentración final de 10 mM y 300 mM,
respectivamente. La mezcla resultante se aplicó sobre una columna
DEAE-Cellulofine A-800 de 1 litro,
equilibrada con solución de tampón de
imidazol-clorhídrico (pH 6,0) 10 mM, que contenía
cloruro sódico 300 mM. Después de lavarla adecuadamente con la misma
solución de tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de
cloruro sódico de 300 mM a 1200 mM. El contenido total de azúcar y
el contenido total de ácido urónico de cada una de las fracciones
eluídas, se midieron según el método de fenol-ácido sulfúrico y el
método de carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Como resultado,
las fracciones eluídas formaban al menos cuatro picos diferentes.
Las fracciones en los respectivos picos se sometieron a análisis de
espectrometría de masa. La determinación de las composiciones de
sacárido para los respectivos picos, mostró que contenían solo
fucosa, pero que no contenían ácido urónico. Las composiciones de
los oligosacáridos que tenían las masas respectivas, estimadas a
partir de las composiciones de sacáridos se muestran en la Tabla
1.
Las fracciones que constituían cada pico se
combinaron, se concentraron utilizando un evaporador y se
purificaron como sigue:
- Columna: YMC Pack Polyamine II (20 x 250 mm, YMC);
- Tasa de flujo: 8 ml/minuto;
- Temperatura de la columna: 30ºC;
- Solución para equilibrar: dihidrogenofosfato sódico 0,5 M, que contenía acetonitrilo al 10%;
- Solución de elución: gradiente desde dihidrogenofosfato sódico 0,5 M que contenía acetonitrilo al 10% hasta dihidrogenofosfato sódico 1,5 M que contenía 10% de acetonitrilo; para el pico número 1-(4), el gradiente para la elución iba desde dihidrogenofosfato sódico 785,5 mM que contenía acetonitrilo al 10%, hasta dihidrogenofosfato sódico 1462,5 mM que contenía acetonitrilo al 10%;
- Fraccionamiento: fracciones de 4 ml; y
- Detección: el método de fenol-ácido sulfúrico.
Las fracciones obtenidas mediante la
cromatografía en columna, se sometieron a análisis de
espectrofotometría de masa. Como resultado, se observaron sustancias
que tenían masas de 1914, 2264, 2366 y 3460 como picos principales
para los picos números 1-(1), 1-(2), 1-(3) y 1-(4), respectivamente.
Las fracciones que constituían cada pico se combinaron, se aplicaron
sobre una columna Cellulofine GCL-25, equilibrada
con etanol al 10%, y se eluyeron utilizando etanol al 10% para
desalación. De esta forma, se obtuvieron los oligosacáridos de
fucano sulfatado 1-(1) a 1-(4) de la presente invención.
Los oligosacáridos de fucano sulfatado 1-(1) a
1-(4) de la presente invención obtenidos en el Ejemplo 2-(2), se
sometieron a análisis de sacáridos en los extremos reductores, y las
composiciones de sacáridos según el método de marcación de
fluorescencia, utilizando 2-aminopiridina. Como
resultado, se determinó que los sacáridos del extremo reductor, y
los sacáridos que constituyen cada uno de los oligosacáridos 1-(1) a
1-(4) eran únicamente fucosa. A continuación, se llevaron a cabo la
determinación del contenido de ácido sulfúrico (medido según el
método turbidimétrico utilizando cloruro de bario), y del contenido
de ácido urónico (medido según el método de carbazol-ácido
sulfúrico), y el análisis de NMR, utilizando un aparato de
resonancia magnética nuclear JNM \alpha-500
(Nippon Denshi). Las muestras a analizar se sometieron a análisis
estructural después de intercambio para agua dura, según el método
convencional. Los puentes de los sacáridos constitutivos se
analizaron utilizando el método HBMC, un método para la detección de
heteronúcleos. El método DQF-COSY y el método HOHAHA
se utilizaron para identificación en ^{1}H-NMR. El
método HSQC se utilizó para identificación en
^{13}C-NMR.
Las propiedades físicas de los oligosacáridos
1-(1) a 1-(4) se muestran más adelante.
Los resultados del análisis de espectrometría de
masa y de identificación en análisis NMR se muestran más adelante.
El espectro ^{3}H-NMR, el espectro
^{13}C-NMR y el espectro de masa del oligosacárido
de fucano sulfatado 1-(1) de la presente invención, se ilustran en
las Figuras 1, 2 y 3, respectivamente. En las Figuras 1 y 2, los
ejes verticales representan la intensidad de señal, y los ejes
horizontales representan el valor de desplazamiento químico (ppm).
En la Figura 3, el eje vertical representa la intensidad relativa y
el eje horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 1914
MS m/z 455,0
[M-4Na^{+}]^{4-}, 614,8
[M-3Na^{+}]^{3-}, 933,8
[M-2Na^{+}]^{2-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 2 y 3.
- Composición de sacáridos: L-fucosa (6 moléculas)
- Grupo sulfato: 10 moléculas
- Sodio: 10 moléculas
Los números para la identificación del pico en
los análisis ^{1}H-NMR y
^{13}C-NMR, son como los que se indican en la
fórmula (IV), a continuación:
Los resultados del análisis de espectrometría de
masa y de identificación en análisis NMR se muestran más adelante.
El espectro ^{3}H-NMR, el espectro
^{13}C-NMR y el espectro de masa del oligosacárido
de fucano sulfatado 1-(2) de la presente invención, se ilustran en
las Figuras 4, 5 y 6, respectivamente. En las Figuras 4 y 5, los
ejes verticales representan la intensidad de señal, y los ejes
horizontales representan el valor de desplazamiento químico (ppm).
En la Figura 6, el eje vertical representa la intensidad relativa y
el eje horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 2264
MS m/z 354,2
[M-6Na^{+}]^{6-}, 429,8
[M-5Na^{+}]^{5-}, 543,0
[M-4Na^{+}]^{4-}, 731,6
[M-3Na^{+}]^{3-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 4 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- Composición de sacáridos: L-fucosa (7 moléculas)
- Grupo sulfato: 12 moléculas
- Sodio: 12 moléculas
Los números para la identificación del pico en
los análisis ^{1}H-NMR y
^{13}C-NMR, son como los que se indican en la
fórmula (V), a continuación:
Se observó una actividad de inducción de la
producción de HGF, determinada según el método descrito en el
Ejemplo 1-(2) en el Documento WO 00/62785, para el sacárido
sulfatado de la fórmula (V).
Los resultados del análisis de espectrometría de
masa y de identificación en análisis NMR se muestran más adelante.
El espectro ^{3}H-NMR, el espectro
^{13}C-NMR y el espectro de masa del oligosacárido
de fucano sulfatado 1-(3) de la presente invención, se ilustran en
las Figuras 7, 8 y 9, respectivamente. En las Figuras 7 y 8, los
ejes verticales representan la intensidad de señal, y los ejes
horizontales representan el valor de desplazamiento químico (ppm).
En la Figura 9, el eje vertical representa la intensidad relativa y
el eje horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 2366
MS m/z 371,4
[M-6Na^{+}]^{6-}, 450,3
[M-5Na^{+}]^{5-}, 568,6
[M-4Na^{+}]^{4-}, 765,7
[M-3Na^{+}]^{3-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 6 y 7.
\vskip1.000000\baselineskip
- Composición de sacáridos: L-Fucosa (7 moléculas)
- Grupo sulfato: 13 moléculas
- Sodio: 13 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis ^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR
son como los indicados en la fórmula (VI), a continuación:
Los resultados del análisis de espectrometría de
masa y de identificación en análisis NMR se muestran más adelante.
El espectro ^{3}H-NMR, el espectro
^{13}C-NMR y el espectro de masa del oligosacárido
de fucano sulfatado 1-(4) de la presente invención, se ilustran en
las Figuras 10, 11 y 12, respectivamente. En las Figuras 10 y 11,
los ejes verticales representan la intensidad de señal, y los ejes
horizontales representan el valor de desplazamiento químico (ppm).
En la Figura 12, el eje vertical representa la intensidad relativa y
el eje horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 3460
MS m/z 409,6
[M-8Na^{+}]^{8-}, 471,4
[M-7Na^{+}]^{7-}, 553,8
[M-6Na^{+}]^{6-}, 669,3
[M-5Na^{+}]^{5-}, 842,3
[M-4Na^{+}]^{4-}, 1130,8
[M-3Na^{+}]^{3-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 8 a 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- Composición de sacáridos: L-fucosa (11 moléculas)
- Grupo sulfato: 18 moléculas
- Sodio: 18 moléculas
Los números para la asignación de señal en
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR son como
los indicados en la fórmula (VII), a continuación:
Se prepararon pequeños pedazos de cultivo seco de
Kjellmaniella crassifolia, utilizando un molinillo de cortar
(Masuko Sangyo), equipado con una pantalla que tenía un diámetro de
poro de 1 mm. Se suspendieron 250 g de pequeños pedazos de
Kjellmaniella crassifolia en 5 litros de etanol al 80%. La
suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y se
filtró. El lavado en etanol al 80% se repitió cuatro veces para
obtener pequeños pedazos de Kjellmaniella crassifolia
lavados. Se suspendieron 250 g de los pedazos lavados en 5 litros de
solución de tampón de imidazol-clorhídrico (pH 7,5),
que contenía cloruro cálcico 125 mM, cloruro sódico 250 mM y etanol
al 10%. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 24
horas, se filtró y se centrifugó, para obtener un solución de
fucoidano de Kjellmaniella crassifolia. Se añadieron 10 U de
la enzima de digestión de fucano sulfatado a 1 litro del extracto.
La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante tres
días, y después se filtró a través de un filtro de papel. Se obtuvo
un sobrenadante mediante centrifugación del filtrado. Una pequeña
fracción molecular recuperada del sobrenadante utilizando un aparato
de ultrafiltración equipado con fibras huecas con peso molecular de
exclusión de 10.000, se denominó como fracción 2 de oligosacárido de
fucano sulfatado.
La fracción 2 de oligosacárido de fucano
sulfatado obtenida en el Ejemplo 3-(1) se cargó sobre una columna
DEAE-Cellulofine A-800 de 1 litro,
equilibrada con solución de tampón de
imidazol-clorhídrico (pH 6,5) 10 mM, que contenía
cloruro sódico 100 mM. Después de lavarla adecuadamente con la misma
solución de tampón, se llevó a cabo la elución con un gradiente de
cloruro sódico de 100 mM a 1 M. El contenido total de azúcar y el
contenido total de ácido urónico de cada una de las fracciones
eluídas, se midieron según el método de fenol-ácido sulfúrico y el
método de carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Como resultado,
las fracciones eluídas formaban dos picos. Las fracciones en los
respectivos picos se sometieron a análisis de espectrofotrometría de
masa. Las determinaciones de las composiciones de sacáridos para los
respectivos picos mostraban que contenían solo fucosa, pero que no
contenían ácido urónico. Las composiciones de los oligosacáridos que
tienen las masas estimadas, basadas en las composiciones de
sacáridos, se muestran en la Tabla 11.
Las fracciones que constituían cada pico se
combinaron, se concentraron utilizando un evaporador, y se
purificaron mediante el mismo método descrito en el Ejemplo
2-(2).
Las fracciones obtenidas mediante la
cromatografía en columna YMC Pack Polyamine II se sometieron a
análisis de espectrometría de masa, y se obtuvieron como los picos
principales las sustancias que tenían masas de 1914 y 2016 del pico
número 2-(1), y una sustancia que tenía una masa de 3110 del pico
número 2-(2).
Las fracciones que constituían cada pico que
contenían sustancias que tenían masas de 1914, 2016 y 3110 se
combinaron, se aplicaron a una columna Cellulofine
GCL-25, equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron
utilizando etanol al 10% para desalar. De esta forma se obtuvieron
los oligosacáridos de fucano sulfatado 2-(1)-1,
2-(1)-2, y 2-(2) de la presente invención.
Los oligosacáridos de fucano sulfatado
2-(1)-1, 2-(1)-2, y 2-(2) de la
presente invención obtenidos en el Ejemplo 3-(2), se sometieron a
análisis de la reducción de azúcar terminal y de componentes de
azúcar, según el método de marcaje de fluorescencia, utilizando
2-aminopiridina. Como resultado, su terminal de
reducción y el componente de azúcar fueron solamente fucosa. A
continuación, se determinaron su contenido en sulfato (mediante el
método turbidimétrico utilizando cloruro de bario), y su contenido
en ácido urónico (mediante el método de carbazol-ácido sulfúrico).
También se llevó a cabo su análisis NMR utilizando un aparato de
resonancia magnética nuclear JNM \alpha-500
(Nippon Denshi). Las uniones entre los sacáridos constituyentes se
analizaron utilizando el método HMBC, un método para la detección de
^{1}H de heteronúcleos. El método DQF-COSY y el
método HOHAHA se utilizaron para la asignación de los datos de
^{1}H-NMR, y el método HSQC se utilizó para la
asignación de los datos de ^{13}C-NMR.
Las propiedades físicas de los oligosacáridos de
fucano sulfatado 2-(1)-1, 2-(1)-2, y
2-(2) de la presente invención se muestran más adelante.
El resultado de todos los análisis anteriores
mostraron que el oligosacárido de fucano sulfatado
2-(1)-1 es la misma sustancia que el oligosacárido
de fucano sulfatado 1-(1) de la presente invención.
Los resultados para el análisis de espectrometría
de masa y la asignación en el análisis de NMR se muestran más
adelante. El espectro de ^{1}H-NMR, el espectro de
^{13}C-NMR, y el espectro de masa de este
oligosacárido, se muestran en las Figuras 13, 14, y 15,
respectivamente. En las Figuras 13 y 14, los ejes verticales
representan la intensidad de señal, y los ejes horizontales
representan el valor de desplazamiento químico (ppm). En la Figura
15, el eje vertical representa la intensidad relativa y el eje
horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 3460
MS m/z 313,1
[M-6Na^{+}]^{6-}, 380,3
[M-5Na^{+}]^{5-}, 481,1
[M-4Na^{+}]^{4-}, 649,1
[M-3Na^{+}]^{3-}, 985,0
[M-2Na^{+}]^{2-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 12 y 13.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (6 moléculas)
- Residuos de sulfato: 11 moléculas
- Sodio: 11 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis ^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR
son como los indicados en la fórmula (VIII), a continuación:
Los resultados para el análisis de espectrometría
de masa y la asignación en el análisis de NMR se muestran más
adelante, y el espectro de ^{1}H-NMR, el espectro
de ^{13}C-NMR, y el espectro de masa del
oligosacárido de fucano sulfatado 2-(2) de la presente invención, se
muestran en las Figuras 16, 17, y 18, respectivamente. En las
Figuras 16 y 17, los ejes verticales representan la intensidad de
señal, y los ejes horizontales representan el valor de
desplazamiento químico (ppm). En la Figura 18, el eje vertical
representa la intensidad relativa y el eje horizontal representa el
valor m/z.
Peso molecular: 3111
MS m/z 365,8
[M-8Na^{+}]^{8-}, 421,4
[M-7Na^{+}]^{7-}, 495,2
[M-6Na^{+}]^{6-}, 599,1
[M-5Na^{+}]^{5-}, 755,0
[M-4Na^{+}]^{4-}, 1013,7
[M-3Na^{+}]^{3-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en las tablas 14 a 16.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- Composición de sacáridos: L-fucosa (10 moléculas)
- Grupo sulfato: 16 moléculas
- Sodio: 16 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis de ^{1}H-NMR y de
^{13}C-NMR son como los indicados en la fórmula
(IX), a continuación:
Se trituró en pequeños pedazos cultivo seco de
Laminaria japonica, utilizando un molinillo de cortar (Masuko
Sangyo), equipado con una pantalla que tenía un diámetro de poro de
1 mm. Quinientos gramos de pedazos de Laminaria japonica se
suspendieron en 4,5 litros de etanol al 80%, se agitaron a
temperatura ambiente durante 24 horas, y se filtraron. El residuo se
lavó tres veces con etanol al 80%, mediante el mismo método que el
descrito previamente, y se obtuvieron pequeños pedazos de
Laminaria japonica lavados. Todos los pedazos lavados se
suspendieron en 10 litros de solución de tampón de
imidazol-HCl (pH 8,0) 50 mM, que contenía cloruro
cálcico 50 mM, cloruro sódico 200 mM, y etanol al 10%, a la
suspensión se le añadieron 2 U de la enzima de digestión de fucano
sulfatado, se agitó a temperatura ambiente durante 5 días, se filtró
a través de un filtro de papel, el filtrado así obtenido se
centrifugó, y el sobrenadante se fraccionó utilizando un aparato de
ultrafiltración equipado con fibras huecas con exclusión de peso
molecular de 10.000, y la fracción de bajo peso molecular se
recuperó y se denominó fracción 1 de oligosacárido de fucano
sulfatado de Laminaria japonica.
La conductividad de la solución de la fracción 1
de oligosacárido de fucano sulfatado de Laminaria japonica
obtenida en el Ejemplo 4-(1), se ajustó añadiendo etanol al 10%
hasta la misma conductividad que la de la solución de equilibrio
descrita más adelante, y la solución se aplicó a una columna
DEAE-Cellulofine A-800 de 500 ml,
equilibrada con solución de tampón de imidazol-HCl
(pH 6,5) 20 mM, que contenía cloruro sódico 200 mM y etanol al 10%,
después la columna se lavó con la misma solución de tampón, y se
eluyó con un gradiente lineal de cloruro sódico de 200 mM a 1,2 M.
Para la elución, se utilizaron 4,5 litros de la solución de tampón,
y se recolectaron fracciones de 50 ml. El contenido total de azúcar
y el contenido total de ácido urónico de cada una de las fracciones
eluídas, se midieron mediante el método de fenol-ácido sulfúrico y
el método de carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Como
resultado, las fracciones eluídas formaban 3 picos. Las fracciones
alrededor del segundo pico (44-48) se combinaron, se
concentraron hasta 40 ml mediante un evaporador, se aplicaron a una
columna Cellulofine GCL-25 (4,1 x 90 cm),
equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con etanol al 10%. El
contenido total de azúcar de cada una de las fracciones eluídas se
determinó mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Las
fracciones en los que se detectó azúcar se combinaron, se
concentraron hasta 8,4 ml con un evaporador, y se purificaron con
las condiciones descritas más adelante.
- Columna: YMC Pack Polyamine II (20 x 250 mm, YMC)
- Tasa de flujo: 8 ml/minuto
- Temperatura de la columna: 30ºC
- Solución de equilibrio: Dihidrógenofosfato sódico 875 mM que contenía acetonitrilo al 10%
- Elución: Gradiente desde dihidrógenofosfato sódico 875 mM que contiene acetonitrilo al 10%, hasta dihidrógenofosfato sódico 1,4 M que contiene acetonitrilo al 10%.
- Fraccionamiento: 4 ml/fracción
- Detección: mediante el método de fenol-ácido sulfúrico
Las fracciones obtenidas mediante la
cromatografía de columna descrita anteriormente (3 veces, números de
fracción alrededor del 50-59), se combinaron. Se
dializaron contra etanol al 10%, utilizando un tubo de diálisis cuyo
peso molecular de exclusión era de 3.500, se concentraron hasta
alrededor de 40 ml con un evaporador, se aplicaron a una columna
Cellulofine GCL-25 equilibrada con etanol al 10%, y
se eluyeron con etanol al 10%.
El contenido total de azúcar de cada una de las
fracciones eluídas se determinó mediante el método de fenol-ácido
sulfúrico. Las fracciones alrededor del pico principal se combinaron
y se purificaron de nuevo con Cellulofine GCL-25,
como se describió anteriormente. Las fracciones alrededor del pico
principal de estas fracciones eluídas se combinaron, se concentraron
mediante Speed Vac, y se liofilizaron. De esta forma se obtuvo el
oligosacárido 1 de fucano sulfatado de Laminaria
japonica.
Se determinó que la estructura del oligosacárido
1 de fucano sulfatado de Laminaria japonica, obtenida
mediante el análisis estructural del oligosacárido mostrado en el
Ejemplo 2, era la misma estructura que el oligosacárido 1-(3) de
fucano sulfatado mostrado en el Ejemplo 2.
Mediante el método mostrado en el Ejemplo de
Referencia 1, se preparó fucoidano de Lessonia nigrescens a
partir de pedazos de Lessonia nigrescens.
Se disolvieron 10 g de fucoidano de Lessonia
nigrescens en 2 litros de solución de tampón de
imidazol-HCl (pH 8,0) 50 mM, que contenía cloruro
cálcico 50 mM, cloruro sódico 300 mM y etanol al 10%. A la solución
se le añadió 1 U de enzima de digestión de fucano sulfatado, se
agitó a temperatura ambiente durante 40 horas, y se recuperó su
fracción de bajo peso molecular utilizando un aparato de
ultrafiltración equipado con fibras huecas con exclusión de peso
molecular de 10.000, y la fracción obtenida de esta forma s denominó
fracción 1 de oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens.
La fracción 1 de oligosacárido de fucano
sulfatado de Lessonia nigrescens obtenida en (1) se aplicó a
una columna DEAE-Cellulofine A-800
de 1000 ml, equilibrada con solución de tampón de
imidazol-HCl (pH 6,0) 10 mM, que contenía cloruro
sódico 200 mM y etanol al 10%, después la columna se lavó con la
misma solución de tampón, y se eluyó con un gradiente lineal de
cloruro sódico, desde 200 mM hasta 700 mM. Para la elución, se
utilizaron 5 litros de solución de tampón, y se recolectaron
fracciones de 56 ml. El contenido total de azúcar y el contenido
total de ácido urónico de cada una de las fracciones eluídas se
midieron mediante el método de fenol-ácido sulfúrico y el método de
carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Como resultado, las
fracciones eluídas formaban 4 picos. Las fracciones alrededor de
cada pico se combinaron separadamente, se concentraron hasta 40 ml
con un evaporador (se denominaron oligosacáridos de fucano sulfatado
de Lessonia nigrescens 1-(1) a 1-(7)), se aplicaron a una
columna Cellulofine GCL-25 (4,1 x 90 cm),
equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con etanol al 10%. El
contenido total de azúcar de cada una de las fracciones eluídas se
determinó mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Las
fracciones en las que se detectó azúcar se combinaron, se
concentraron con un evaporador, y se purificaron con las condiciones
descritas más adelante.
- Columna: YMC Pack Polyamine II (20 x 250 mm, YMC)
- Tasa de flujo: 8 ml/minuto
- Temperatura de la columna: 30ºC
- Solución de equilibrio: Para los oligosacáridos de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(1), (2), y (3), dihidrógenofosfato sódico 90 mM que contiene acetonitrilo al 10%. Para los oligosacáridos de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(4) y (5), dihidrógenofosfato sódico 630 mM que contiene acetonitrilo al 10%. Para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(6), dihidrógenofosfato sódico 720 mM que contiene acetonitrilo al 10%. Para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(7), dihidrógenofosfato sódico 900 mM, que contiene acetonitrilo al 10%.
- Elución: Para los oligosacáridos de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(1), (2), y (3), con el gradiente desde dihidrógenofosfato sódico 90 mM que contiene acetonitrilo al 10% hasta dihidrógenofosfato sódico 900 mM que contiene acetonitrilo al 10%. Para los oligosacáridos de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(4) y (5), con el gradiente desde dihidrógenofosfato sódico 630 mM que contiene acetonitrilo al 10%, hasta dihidrógenofosfato sódico 1260 mM que contiene acetonitrilo al 10%. Para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(6), con el gradiente desde dihidrógenofosfato sódico 720 mM que contiene acetonitrilo al 10%, hasta dihidrógenofosfato sódico 1440 mM, que contiene acetonitrilo al 10%. Para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(7), con el gradiente desde dihidrógenofosfato sódico 900 mM que contiene acetonitrilo al 10%, hasta dihidrógenofosfato sódico 1620 mM, que contiene acetonitrilo al 10%.
- Fraccionamiento: 4 ml/fracción
- Detección: mediante el método de fenol-ácido sulfúrico
Los oligosacáridos de fucano sulfatado de
Lessonia nigrescens desde 1-(1) hasta 1-(7), se fraccionaron
mediante la cromatografía en columna mostrada anteriormente, y las
fracciones en las que se detectó azúcar se combinaron, se
concentraron hasta alrededor de 40 ml con un evaporador, se
aplicaron a una columna Cellulofine GCL-25
equilibrada con etanol al 10%, y se eluyeron con etanol al 10%.
El contenido total de azúcar de cada una de las
fracciones eluídas se determinó mediante el método de fenol-ácido
sulfúrico. Las fracciones alrededor del pico principal se combinaron
y se purificaron de nuevo mediante Cellulofine
GCL-25 como se describió anteriormente. Para el
oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens
1-(7), se observaron dos picos principales, de esta forma, los dos
picos se denominaron oligosacáridos de fucano sulfatado de
Lessonia nigrescens 1-(7)-1 y
1-(7)-2.
Las fracciones alrededor de los picos principales
de cada una de las fracciones eluídas se combinaron, se concentraron
con Speed Vac, y se liofilizaron. De esta forma se obtuvieron los
oligosacáridos de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens
1-(1) a 1-(7)-2.
El análisis estructural de estos oligosacáridos
se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 2.
Las propiedades físicas de los oligosacáridos de
fucano sulfatado de Lessonia nigrescens 1-(1) a
1-(7)-2 de la presente invención se muestran más
adelante.
Los resultados para el análisis de espectrometría
de masa y la asignación en el análisis de NMR se muestran más
adelante, y el espectro de ^{1}H-NMR, el espectro
de ^{13}C-NMR, y el espectro de masa de este
oligosacárido, se muestran en las Figuras 19, 20, y 21,
respectivamente. En las Figuras 19 y 20, los ejes verticales
representan la intensidad de señal, y los ejes horizontales
representan el valor de desplazamiento químico (ppm). En la Figura
21, el eje vertical representa la intensidad relativa y el eje
horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 718
MS m/z 216,5
[M-3Na^{+}]^{3-}, 336,0
[M-2Na^{+}]^{2-}, 695,0
[M-Na^{+}]^{-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en la tabla 17.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (2 moléculas)
- Residuos de sulfato: 4 moléculas
- Sodio: 4 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis de ^{1}H-NMR y
^{13}C-NMR son como los indicados en la fórmula
(X), a continuación:
Los resultados para el análisis de espectrometría
de masa y la asignación en el análisis de NMR se muestran más
adelante, y el espectro de ^{1}H-NMR, el espectro
de ^{13}C-NMR, y el espectro de masa del
oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens
1-(2), se muestran en las Figuras 22, 23, y 24, respectivamente. En
las Figuras 22 y 23, los ejes verticales representan la intensidad
de señal, y los ejes horizontales representan el valor de
desplazamiento químico (ppm). En la Figura 24, el eje vertical
representa la intensidad relativa y el eje horizontal representa el
valor m/z.
Peso molecular: 966
MS m/z 459,9
[M-2Na^{+}]^{2-}, 942,9
[M-Na^{+}]^{-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en la tabla 18.
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (3 moléculas)
- Residuos de sulfato: 5 moléculas
- Sodio: 5 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis de ^{1}H-NMR y
^{13}C-NMR son como los indicados en la fórmula
(XI), a continuación:
Los resultados para el análisis de espectrometría
de masa y la asignación en el análisis de NMR se muestran más
adelante, y el espectro de ^{1}H-NMR, el espectro
de ^{13}C-NMR, y el espectro de masa se muestran
en las Figuras 25, 26, y 27, respectivamente. En las Figuras 25 y
26, los ejes verticales representan la intensidad de señal, y los
ejes horizontales representan el valor de desplazamiento químico
(ppm). En la Figura 27, el eje vertical representa la intensidad
relativa y el eje horizontal representa el valor m/z.
Peso molecular: 1068
MS m/z 332,9
[M-3Na^{+}]^{3-}, 511,0
[M-2Na^{+}]^{2-}, 1045,0
[M-Na^{+}]^{-}
Los resultados de los análisis
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR se
muestran en la tabla 19.
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (3 moléculas)
- Residuos de sulfato: 6 moléculas
- Sodio: 6 moléculas
Los números para la asignación de señal en los
análisis de ^{1}H-NMR y
^{13}C-NMR son como los indicados en la fórmula
(XII), a continuación:
Mediante el análisis estructural del
oligosacárido como el descrito en el Ejemplo 2, la estructura del
oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens
1-(4), se determinó que su estructura era la misma que la del
oligosacárido de fucano sulfatado 1-(2) descrito en el Ejemplo
2.
Mediante el análisis estructural del
oligosacárido como el descrito en el Ejemplo 2, la estructura del
oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia nigrescens
1-(5), se determinó que su estructura era la misma que la del
oligosacárido de fucano sulfatado 1-(3) descrito en el Ejemplo
2.
Los resultados del análisis de espectrometría de
masas para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(6) de la presente invención se muestran más
adelante.
Peso molecular: 3461
MS m/z 361,5
[M-9Na^{+}]^{9-}, 409,62
[M-8Na^{+}]^{8-}, 471,42
[M-7Na^{+}]^{7-}, 553,81
[M-6Na^{+}]^{6-}, 669,31
[M-5Na^{+}]^{5-}, 842,32
[M-4Na^{+}]^{4-}, 1130,83
[M-3Na^{+}]^{3-}
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (11 moléculas)
- Residuos de sulfato: 18 moléculas
- Sodio: 18 moléculas
Los resultados del análisis de espectrometría de
masas para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(7)-1 de la presente invención se
muestran más adelante.
Peso molecular: 4659
MS m/z 442,82
[M-10Na^{+}]^{10-}, 494,72
[M-9Na^{+}]^{9-}, 559,32
[M-8Na^{+}]^{8-}, 642,62
[M-7Na^{+}]^{7-}, 753,52
[M-6Na^{+}]^{6-}, 908,82
[M-5Na^{+}]^{5-}, 1141,43
[M-4Na^{+}]^{4-}
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (15 moléculas)
- Residuos de sulfato: 24 moléculas
- Sodio: 24 moléculas
Los resultados del análisis de espectrometría de
masas para el oligosacárido de fucano sulfatado de Lessonia
nigrescens 1-(7)-2 de la presente invención se
muestran más adelante.
Peso molecular: 3564
MS m/z 373,12
[M-9Na^{+}]^{9-}, 422,52
[M-8Na^{+}]^{8-}, 486,32
[M-7Na^{+}]^{7-}, 571,01
[M-6Na^{+}]^{6-}, 689,61
[M-5Na^{+}]^{5-}, 862,02
[M-4Na^{+}]^{4-}, 1164,93
[M-3Na^{+}]^{3-}
- Componente de azúcar: solamente L-fucosa (11 moléculas)
- Residuos de sulfato: 19 moléculas
- Sodio: 19 moléculas
Se disolvieron 10 g del fucoidano de cultivo de
Kjellmaniella crassifolia como el descrito en el Ejemplo de
Referencia 1, en 4,8 litros de solución de tampón de
imidazol-clorhídrico (pH 7,5) 17 mM, que contenía
cloruro cálcico 125 mM, cloruro sódico 250 mM y etanol al 10%. Se le
añadieron 10 U de enzima de digestión de fucano sulfatado. La mezcla
resultante se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas, para
obtener una solución de oligosacárido de fucoidano de
Kjellmaniella crassifolia. Una fracción de pequeña molécula
recuperada de la solución, utilizando un aparato de ultrafiltración
equipado con fibras huecas con una exclusión de peso molecular de
10.000, se denominó fracción 3 de oligosacárido de fucano
sulfatado.
La fracción 3 de oligosacárido de fucano
sulfatado obtenida en (1) anteriormente, se aplicó a una columna
DEAE-Cellulofine A-800 de 1 litro,
equilibrada con solución de tampón de
imidazol-clorhídrico (pH 6,5) 10 mM, que contenía
cloruro sódico 100 mM. Después de lavarla adecuadamente con la misma
solución de tampón, la elución se llevó a cabo con un gradiente de
cloruro sódico de 100 mM a 1 M. El contenido total de azúcar y el
contenido total de ácido urónico de cada una de las fracciones
eluídas se midió según el método de fenol-ácido sulfúrico, y según
el método de carbazol-ácido sulfúrico, respectivamente. Como
resultado, las fracciones eluídas formaban dos picos. Las fracciones
en los respectivos picos se sometieron a análisis de espectrometría
de masa. La determinación de las composiciones de sacáridos para los
respectivos picos mostró que contenían solamente fucosa, pero no
contenían ácido urónico. Las composiciones de oligosacáridos que
tenían las respectivas masas estimadas basadas en las composiciones
de sacáridos se muestran en la Tabla 20.
Se ha demostrado que la fracción 3 de
oligosacárido de fucano sulfatado contenía varios oligosacáridos de
fucano sulfatado como se muestra en la tabla anterior.
(1) Además de los cuatro picos distintos
observados en la cromatografía de columna
DEAE-Cellulofine descritos en el Ejemplo 2-(2), se
observó un pico amplio eluído con una mayor concentración de sal. Se
recolectó, se denominó oligosacárido 4, y se sometió a análisis NMR
como se describió en el Ejemplo 2. Como resultado, se observó un
espectro casi idéntico al el oligosacárido de fucano sulfatado
1-(2). Estos resultados sugerían fuertemente que el oligosacárido 4
tenía una estructura en la que varias moléculas del oligosacárido
1-(2) estaban conectadas entre sí. Después, el oligosacárido 4 se
digirió utilizando la enzima de digestión de fucano sulfatado como
se describió en el Ejemplo 1, y el producto de digestión se analizó
utilizando HPLC. La mayor parte del producto de reacción se eluyó en
la misma posición que la del oligosacárido de fucano sulfatado
1-(2).
El peso molecular del oligosacárido 4,
determinado mediante filtración en gel utilizando pululano como
sustancia estándar, demostró ser alrededor del triple del
oligosacárido 1-(2).
El análisis preciso del espectro
^{3}H-NMR para el oligosacárido 4, reveló que la
repetición de siete residuos de sacárido estaban unidos en la
posición 3 de la mucosa F6 en la fórmula (IV), a través de un puente
\alpha-(1-3).
Un monómero a pentámero del sacárido sulfatado
representado mediante la fórmula general (I) (es decir, sacáridos
sulfatados de la fórmula general (I) en la que n = 1 a 5), se obtuvo
de los productos de digestión de un polisacárido sulfatado, según el
método descrito anteriormente.
donde R es H o SO_{3}H y al menos
uno de los restos R es
SO_{3}H.
Como se ha descrito anteriormente, se confirmó
que el polisacárido que contenía fucano sulfatado obtenido de un
alga parda como la Kjellmaniella crassifolia se convertía en
moléculas más pequeñas tras su tratamiento utilizando una enzima de
digestión de fucano sulfatado, y que se obtenía un polisacárido
sulfatado que contenía sacáridos sulfatados de la fórmula general
anterior, como un componente esencial del sacárido constituyente. El
peso molecular medio del polisacárido sulfatado extraído a pH
6-8 a 95ºC durante alrededor de 2 horas, determinado
por filtración en gel, estaba alrededor de 200.000.
(2) Se examinaron las actividades fisiológicas de
los sacáridos obtenidos anteriormente en (1), Como resultado, se
observó una actividad de inducción de producción de HGF, determinada
según el método descrito en el Ejemplo 1-(2) en el Documento WO
00/62785, para el polisacárido sulfatado de la fórmula (I). Además,
los sacáridos sulfatados de la fórmula (I) demostraron ser muy
útiles para retener la humedad, como se determinó según el método
descrito en los Ejemplos 8 y 9 en el Documento WO 99/41288.
La presente invención proporciona un método para
producir un oligosacárido de fucano sulfatado que tiene una variedad
de pesos moleculares, que es útil como reactivo para
glicotecnología, utilizando una enzima de digestión de fucano
sulfatado. La presente invención también proporciona varios
oligosacáridos de fucano sulfatado, cuya estructura se ha
determinado.
TAKARA BIO INC.
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Oligosacárido de fucano sulfatado
\vskip1.000000\baselineskip
JF 2001-325960
2001-10-24
\vskip1.000000\baselineskip
1
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1
\vskip1.000000\baselineskip
1506
DNA
Fucanobacter
lyticus
\vskip1.000000\baselineskip
1
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Claims (5)
1. Un fucano sulfatado que tiene las siguientes
propiedades químicas y físicas:
(1) contiene fucosa como un sacárido
constitutivo
(2) contiene un sacárido sulfatado de la fórmula
general (I), como un componente esencial del sacárido
constitutivo:
donde R es H o SO_{3}H, al menos
uno de los restos R es SO_{3}H, y n es un número entero de 1 o
más;
y
(3) se convierte en moléculas más pequeñas
mediante una enzima de digestión de fucano sulfatado derivado de
Alteromonas sp. SN-1009, para generar al
menos un compuesto seleccionado de un grupo que consiste en los
compuestos de las fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV),
(XV) y (XVI):
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
donde R es H o SO_{3}H y al menos
uno de los restos R es SO_{3}H en todas las fórmulas
anteriores,
o una de sus sales.
2. Un oligosacárido de fucano sulfatado de la
fórmula general (I):
Donde R es H o SO_{3}H, al menos uno de los
restos R es SO_{3}H, y n es 1 a 5.
3. Un oligosacárido de fucano sulfatado que tiene
una estructura química seleccionada de un grupo que consiste en las
fórmulas generales (II), (III), (XIII), (XIV), (XV) y (XVI):
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R es H o SO_{3}H y al menos
uno de los restos R es SO_{3}H en todas las fórmulas
anteriores,
o una de sus sales
4. Un método para preparar un oligosacárido de
fucano sulfatado, según las reivindicaciones 2 ó 3, comprendiendo
dicho método:
permitir a una enzima de digestión de fucano
sulfatado derivada de Alteromonas sp.
SN-1009, actuar sobre un fucano sulfatado definido
mediante las reivindicaciones 1 ó 2; y
recolectar un producto de digestión.
5. El método según la reivindicación 4, en el que
el fucano sulfatado es derivado de Kjellmaniella crassifolia,
Laminaria japonica o Lessonia nigrescens.
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| JP2001325960 | 2001-10-24 |
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