CN100379748C

CN100379748C - 硫酸化藻聚糖寡糖

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Publication number: CN100379748C
Application number: CNB021471398A
Authority: CN
Inventors: 酒井武; 余目眸; 河合高志; 児岛薰; 中一夫; 猪饲勝重; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Takara Bio Inc
Priority date: 2001-10-24
Filing date: 2002-10-24
Publication date: 2008-04-09
Anticipated expiration: 2022-10-24
Also published as: KR20030035913A; US6927289B2; ES2236420T3; EP1306389B1; KR100903771B1; US6720419B2; ATE286075T1; US20030171571A1; EP1306389A2; EP1306389A3; US20040146995A1; DE60202427T2; DE60202427D1; CN1421533A

Abstract

使对来源于海带目海藻的新的硫酸化多糖进行分解的硫酸化藻聚糖分解酶作用于硫酸化藻聚糖而得到的低分子化物，及其制造方法。

Description

硫酸化藻聚糖寡糖

技术领域

本发明关于在糖工业领域非常有用的硫酸化藻聚糖寡糖、及其制备方法。

背景技术

褐藻类中含有各种硫酸化多糖。这些多糖多总称为岩藻依聚糖或岩藻多糖，但它们的结构多因来源海藻的不同而不同。例如，分别从墨角藻、海带、冲绳海蕴(オキナワモズク)、海蕴、裙带菜中提取的硫酸化多糖具有不同的结构。因此，为了使硫酸化多糖经过酶分解得到其寡糖、或规定它们的结构，有必要获得使它们分解的酶。

作为硫酸化多糖的分子种，已知的有，硫酸化藻聚糖、硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖(Sulfated fucoglucuronomannans)、硫酸化岩藻半乳聚糖等(Sulfated fucogalactans)，此外还有其它的各种分子种。硫酸化多糖一般多具有某些生物活性，例如有报道指出，硫酸化藻聚糖部分具有强抗凝血活性，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖部分具有对癌细胞的脱噬诱导活性。

硫酸化多糖作为医药品开发时，有必要规定其结构，如果使用分解这些硫酸化多糖的酶，则对规定其结构非常有利。不过，没有市售的分解褐藻类硫酸化多糖的酶，而且褐藻类硫酸化多糖多因海藻种类而不同，所以为了决定一种硫酸化多糖的结构，对此硫酸化多糖进行特异分解的分解酶是非常必要的。目前有对来源于海带目海藻的硫酸化多糖的结构的研究，这些只不过证明了多个分子种中的几种结构。

发明概述

由上述可知，目前需要结构均一的硫酸化藻聚糖寡糖，其是通过使用对来源于海带目海藻的新的硫酸化多糖进行分解的酶、也就是特异分解硫酸化藻聚糖的酶而制得的。

即，本发明旨在提供使对来源于海带目海藻的新的硫酸化多糖进行分解的硫酸化藻聚糖分解酶作用于硫酸化藻聚糖而得到的低分子化物，及其制造方法。

本发明的第1发明是关于硫酸化藻聚糖或其盐，其特征在于，具有下述物理化学性质

(1)组成糖：含有岩藻糖，

(2)以下述一般式(I)表示的硫酸化糖为组成糖的必须成分

(式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H、n为1以上的整数)，(3)被来源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶所低分子化，生成选自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)表示的化合物中一种以上的化合物

(全部式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

本发明的第2发明是关于硫酸化藻聚糖寡糖，其特征在于，下述一般式(I)中n为1～5

(式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

本发明的第3发明是关于制备硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其特征在于，使来源于Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶与本发明第1或第2发明中的硫酸化藻聚糖作用，收集其分解物。

在本发明第3发明中，上述硫酸化藻聚糖也可以来源于龙目(Kjellmaniella crassifolia)、海带或巨藻黑(Lessonianigrescens)。

本发明的第4发明是关于用本发明第3发明的方法制备的硫酸化藻聚糖寡糖。

本发明的第5发明是关于具有选自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化学结构的硫酸化藻聚糖寡糖或其盐

(全部式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

也就是说，本发明者们深入研究后，发现了用硫酸化藻聚糖分解酶分解来源于海带目海藻的新的硫酸化多糖、从而制备可以用作糖工程用试剂的、结构均一的硫酸化藻聚糖寡糖的方法，并可以决定这些寡糖的结构，从而完成了本发明。

发明详述

下面具体说明本发明。

本发明中没有特别限制，例如可以使用来源于海带目海藻的硫酸化藻聚糖。该多糖以硫酸基和岩藻糖为主要构成成分。此外，来源于海带目海藻的硫酸化藻聚糖的主链由比一般的糖更不耐酸的L-岩藻糖组成，所以通过加热和酸处理很容易低分子化。

本发明可以使用具备前述特征的硫酸化藻聚糖。其来源没有特别限制，不过作为硫酸化藻聚糖含量多的原料，优选例如龙目、海带、或巨藻黑等海带目海藻。

本发明的硫酸化藻聚糖分解酶，与硫酸化藻聚糖和硫酸化藻聚糖寡糖等作用、将岩藻糖与岩藻糖之间的α-L-岩藻糖键从内部加水分解，生成还原性末端具有L-岩藻糖的寡糖。

本发明的硫酸化藻聚糖寡糖是使硫酸化藻聚糖与本发明的硫酸化藻聚糖分解酶作用所得的寡糖，其还原性末端糖是L-岩藻糖。

制备本发明所用的硫酸化藻聚糖时，首先得到褐藻类的水溶性部分提取液。此时为防止硫酸化藻聚糖的低分子化，优选pH 4～9、温度100℃以下。此外，上述提取液中的氨基酸和低分子性的色素等可以通过超滤有效除去。用活性炭处理等还可以有效除去疏水性物质。

这样可以得到褐藻类的硫酸化多糖部分。该部分可以作为硫酸化藻聚糖部分、例如作为本发明的硫酸化藻聚糖分解酶的底物使用。将此部分用阴离子交换柱分离可以得到纯度更高的硫酸化藻聚糖。上述的硫酸化多糖部分和用阴离子交换柱精制后的硫酸化藻聚糖都可以用作制造本发明的硫酸化藻聚糖寡糖的原料。

本发明硫酸化藻聚糖的主骨架由下述一般式(I)表示。下述一般式中，n为1以上的整数，例如1～20,000的范围，进一步优选1～10,000范围的包含在本发明的硫酸化藻聚糖中。此外，只要在上述范围内，具有下述一般式(I)连续重复结构的、以及具有夹杂了其它结构、非连续地包含下述一般式(I)结构的，都可包含在本发明的硫酸化藻聚糖中。

(式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

生产本发明所用硫酸化藻聚糖分解酶的菌株，根据Bergey’sManual of Determinative Bacteriology，第9卷(1994)上记载的基本分类可以被分类为交替单胞菌属细菌。不过，近年来对交替单胞菌属细菌进行了再编，仅根据细菌学性质分类并不恰当。这里，规定了本菌株的16S rDNA的碱基序列，与已知的细菌进行了相同性的比较，相同性最高的细菌为Thalassomonas属。不过，其遗传距离为0.05(变化/平均核苷酸位置)以上，不能确定为同族。这里，本发明者们根据16S rDNA序列的相同性，确定本菌株为不属于已知属的新属细菌，并将本菌株命名为藻聚糖菌属SN-1009(fucanobacter lyticusSN-1009)。本说明书中交替单胞菌属sp.SN-1009(Alteromonas sp.SN-1009)与藻聚糖菌属SN-1009为相同物质。

此外，作为上述菌株，Alteromonas sp.SN-1009由305-8566日本茨城县つくば市东1-1-1中央第6、独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心自平成8年2月13日(原保藏日)起作为FERMBP-5747保藏，根据布达佩斯条约自平成8年11月15日(移交保管日)起由国际保藏。序列表的序列号1中显示了本菌株的16S rDNA序列。

因此，培养经16S rDNA序列判断与藻聚糖菌属SN-1009同族的细菌，可以制备本发明所用的硫酸化藻聚糖分解酶。此外，本发明中除了上述Alteromonas sp.SN-1009株以外，可以利用Alteromonas sp.SN-1009株的自然或人工变异株、以及其他属于交替单胞菌属、Thalassomonas属的菌种等、具有产生本发明用硫酸化藻聚糖分解酶能力的微生物。

本发明的硫酸化藻聚糖寡糖可以通过使硫酸化藻聚糖分解酶与硫酸化藻聚糖含有物作用来制备。作为硫酸化藻聚糖含有物，优选使用例如，硫酸化藻聚糖的部分精制品、来源于褐藻类的含硫酸化岩藻糖多糖部分、褐藻类水性溶剂提取物、或者褐藻类藻体。

制备本发明硫酸化藻聚糖寡糖时，若使用通常方法溶解硫酸化藻聚糖、或硫酸化藻聚糖含有物的话比较好，溶液中本发明硫酸化藻聚糖、或硫酸化藻聚糖含有物也可以用其最高溶解浓度，不过一般考虑其操作性、反应中所用本发明硫酸化藻聚糖分解酶的量而定比较好。作为硫酸化藻聚糖溶解液，可以根据需要选择水、缓冲液等。溶解液的pH通常为中性附近、酶反应通常在30℃附近进行。对反应所用本发明硫酸化藻聚糖分解酶的混合比例和使用量、反应液的组成、反应时间等进行调整，可以调整硫酸化藻聚糖寡糖的分子量。将这样所得的本发明硫酸化藻聚糖寡糖通过分子量分级或阴离子交换柱分级，可以进一步制备成具有均一分子量或均一电荷密度分布的本发明硫酸化藻聚糖寡糖。分子量分级可以使用常用的方法，若使用例如凝胶过滤法和分子量分级膜比较好。低分子化物，根据需要可以进一步进行离子交换树脂处理、活性炭处理等精制操作，根据需要还可以进行脱盐处理、无菌处理、冷冻干燥处理。根据这些方法，后述可以得到的具有均一结构的本发明硫酸化藻聚糖寡糖，其结构可以由NMR分析判定。

本发明硫酸化藻聚糖寡糖，没有特别限制，例如具有选自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化学结构的硫酸化藻聚糖寡糖或其盐

(全部式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

本发明硫酸化藻聚糖寡糖，其分子中有硫酸基，此基团与各种碱基反应形成盐。本发明硫酸化藻聚糖寡糖成盐后的形态稳定，通常被以钠和/或钾和/或钙等的盐的形态提供。这些物质的盐可以通过Dowex50W等阳离子交换树脂导入到游离的本发明硫酸化藻聚糖寡糖。此外，根据需要可以进行已知惯用的盐交换，交换成各种所需的盐。

本发明硫酸化藻聚糖寡糖的盐，可以使用可药用的盐，例如可以举出钠、钾等碱金属、钙、镁、锌等碱土金属、铵等的盐。

此外，本发明硫酸化藻聚糖寡糖可以用作糖工程用试剂。例如，根据特公平5-65108号公报记载的方法进行2-氨基吡啶化(PA化)、制备该寡糖的PA-化物，可以得到可用作硫酸化藻聚糖寡糖的荧光标识标准物的、作为糖工程用试剂极为有用的物质。

实施例

下面用实施例对本发明进行具体说明，不过本发明并不只限于以下实施例范围。

本实施例中硫酸化藻聚糖寡糖的分子量为由质量分析结果算出的平均分子量。

参考例1 制备来源于龙目的岩藻依聚糖

将2kg养殖后的干燥龙目用安装有孔径1mm的筛子的切割机(增幸产业社制造)粉粹，在20升80％乙醇中悬浊后，在25℃搅拌3小时后，用滤纸过滤。将所得的残渣在40升含100mM氯化钠的30mM磷酸缓冲液(pH 6.5)中悬浊，在95℃下处理2小时后，用孔径106μm的不锈钢筛子过滤。在所得滤液中添加200g活性炭、4.5升的乙醇、12,000U的藻酸裂解酶K(ナカゼ生化学工业社制造)，25℃下搅拌20小时后，离心分离。将所得上清液，用安装有排除分子量10万的中空纤维的超滤机浓缩成4升后，离心分离除去不溶物，5℃下放置24小时。离心分离除去生成的沉淀，所得上清液用超滤机在100mM氯化钠中进行溶剂置换。此溶液在4℃以下冷却后，用盐酸调pH为2.0，离心分离除去生成的沉淀。用氢氧化钠将所得上清液pH调为8.0，浓缩成4升后，用超滤机在20mM氯化钠中进行溶剂置换。离心分离除去此溶液中的不溶物后，冷冻干燥，得到76g来源于龙目的岩藻依聚糖的干燥物。

参考例2 制备硫酸化藻聚糖部分

将7g参考例1中记载的岩藻依聚糖干燥物溶解在含有50mM氯化钠和10％乙醇的700ml 20mM咪唑盐酸缓冲液(pH 8.0)中，离心分离除去不溶物。所得上清液倒入经相同缓冲液平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱(11.4×48cm)中，用相同缓冲液洗净后，由50mM到1.95M的氯化钠浓度梯度洗脱。洗脱液以每250ml分别取出。各部分的总糖量用苯酚硫酸法、糖醛酸量用咔唑硫酸法测定。按洗脱顺序归整43-49、50-55、56-67部分的部分，分别用电透析脱盐后冷冻干燥，由43-49部分得到340mg，50-55部分得到870mg，56-67部分得到2.64g干燥物。以由56-67部分得到的部分作为硫酸化藻聚糖部分。

参考例3 硫酸化藻聚糖分解酶活性测定方法

12μl 2.5％的硫酸化藻聚糖部分的溶液与60μl 50mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 7.5)、9μl 4M氯化钠、6μl 1M氯化钙、21μl水、12μl本发明硫酸化藻聚糖分解酶溶液混合，30℃下反应3小时后，将反应液在100℃处理10分钟，离心分离后取100μl用HPLC分析，测定低分子化程度。作为对照，用HPLC对下列物质进行同样的分析，即，用溶解酶溶液的缓冲液代替硫酸化藻聚糖分解酶溶液进行反应所得的物质以及用水代替硫酸化藻聚糖部分进行反应得到的物质。

1单位硫酸化藻聚糖分解酶活性为，上述反应体系中1分钟内切断1μmol硫酸化藻聚糖的岩藻糖键的酶的量。硫酸化藻聚糖分解酶活性由下式求出。

{(12×1000×2.5/100)/MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.012)}＝U/ml

12×1000×2.5/100：已添加的硫酸化藻聚糖部分(μg)

MG：底物硫酸化藻聚糖的平均分子量

M：反应生成物的平均分子量

(MG/M)-1∶1分子的硫酸化藻聚糖被酶切断部位数

180：反应时间(分钟)

0.012：酶液量(ml)

此外，HPLC条件如下，

装置：L-6200型(日立制作所制造)，

柱：OHpak SB-806HQ(8×300mm、昭和电工社制造)，

洗脱液：含5mM的迭氮化钠的50mM氯化钠，

检测：视差折射率检测器(Shodex RI-71、昭和电工社制造)，

流速：1ml/分，

柱温：25℃。

为了测定反应生成物的平均分子量，将市售的分子量已知的支链淀粉(STANDARD P-82、昭和电工社制造)在与上述HPLC分析相同条件下进行分析，用曲线表示支链淀粉分子量与保留时间的关系，作为测定上述反应生成物分子量的标准曲线。此外，蛋白质的定量是通过测定酶液280nm处的吸光度来进行的。此时1mg/ml蛋白质溶液的吸光度按1.0计算。

实施例1制备硫酸化藻聚糖分解酶

将藻聚糖菌属SN-1009接种到培养基上，25℃下培养24小时成为种培养液，其中此培养基为，将4ml由含有0.2％按参考例1方法制备的岩藻依聚糖和0.3％胨的pH 8.2的人工海水(ジヤマリンラボラトリ-制造)所组成的培养基在120℃高压灭菌处理20分钟后所得。将600ml由含有0.25％葡萄糖、1％胨、0.05％酵母膏以及消泡剂(KM70、信越化学工业制造)的pH 8.2的人工海水所组成的培养基放入到2升三角烧瓶中，120℃下高压灭菌处理20分钟，将上述种培养物接种到此处理后的培养基上，25℃下培养20小时，然后将此培养后的物质放入到另一培养基上、与对按参考例1方法制备的岩藻依聚糖在100℃下处理20分钟后的物质混合，接种上述种培养物，其中上述另一培养基为，将20升由含有1％胨、0.02％酵母膏及消泡剂(KM70、信越化学工业制造)的pH 8.2的人工海水所组成的培养基放入到30升广口发酵缸中，120℃下高压灭菌处理20分钟后得到。培养在25℃进行28小时。培养结束后，离心分离培养液得到菌体和培养上清液。

所得培养上清液经装有排除分子量1万的中空纤维的超滤装置浓缩后，在含有10mM氯化钙和150mM氯化钠的20mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 8.2)中进行溶剂置换，离心分离得到上清液。

将所得上清液装在经相同缓冲液平衡化后的2升DEAE-Cellulofine-800的柱子中，用相同缓冲液洗净后，经从150mM到400mM的氯化钠浓度梯度洗脱，将洗脱液按每63ml分开，收集活性部分。

所得活性部分经装有排除分子量1万的中空纤维的超滤装置浓缩后，在含有10mM氯化钙和100mM氯化钠的20mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 8.2)中进行溶剂置换。将此酶溶液装在经相同缓冲液平衡化后的200ml DEAE-Cellulofine-800柱中，用相同缓冲液洗净后，经从100mM到300mM的氯化钠浓度梯度洗脱，将洗脱液按每19ml分开，收集活性部分。

所得活性部分经装有排除分子量1万的超滤膜的超滤装置浓缩后，添加氯化钠使其浓度达到4M，然后装入经含有100mM氯化钙和4M氯化钠的20mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡化后的苯基-琼脂糖CL-4B的柱子中，用相同缓冲液洗净后，经从4M到1M的氯化钠浓度梯度洗脱，将洗脱液按每9.4ml分开。这样得到硫酸化藻聚糖分解酶的精制物。

实施例2 使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制以及结构分析-(1)

(1)制备

200g养殖后的龙目干燥物浸入10升含45mM氯化钙、500mM氯化钠、9％乙醇的18mM咪唑盐酸缓冲液(pH 7.0)中，添加30U硫酸化藻聚糖分解酶，室温下搅拌2天后，用滤纸过滤，使用装有排除分子量10万的中空纤维的超滤机回收低分子部分，作为硫酸化藻聚糖寡糖部分1。

(2)精制

实施例2-(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分1经脱盐装置(Micro Acilyzer G3、旭化成工业制造)脱盐后，用旋转蒸发器浓缩。向此硫酸化藻聚糖寡糖溶液1中添加咪唑、并使其浓度为10mM和添加氯化钠、并使其浓度为300mM，然后装入1升经含300mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.0)平衡化后的DEAE-CellulofineA-800柱子中，用相同缓冲液充分洗净后经从300mM到1200mM的氯化钠浓度梯度洗脱。归总洗脱后的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。结果洗脱部分存在至少4个明显峰，所以对各个峰部分进行了质量分析。此外查找各个峰的糖组成时，发现只含岩藻糖不含糖醛酸。由糖组成考虑的各质量寡糖被认为具有表1所示组成。

表1

接着收集形成各峰的部分，分别用蒸发器浓缩后在下述条件下精制。

柱：YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)

流速：8ml/分

柱温：30℃

平衡化溶液：0.5M含有10％乙腈的磷酸二氢钠

洗脱溶液：从0.5M含有10％乙腈的磷酸二氢钠到1.5M含有10％乙腈的磷酸二氢钠浓度梯度。不过对于峰号1-(4)，使用从787.5mM含有10％乙腈的磷酸二氢钠到1462.5mM含有10％乙腈的磷酸二氢钠浓度梯度。

收集：每份4ml

检测：苯酚硫酸法

对上述经柱色谱收集后的部分进行质量分析，作为主峰，分别由峰1-(1)得到质量1914的物质、由峰1-(2)得到质量2264的物质、由峰1-(3)得到质量2366的物质、由峰1-(4)得到质量为3460的物质。收集各峰部分，装入经10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脱、脱盐。这样得到本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～(4)。

(3)结构分析

根据使用2-氨基吡啶的荧光标识法，对实施例2-(2)中所得本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～(4)进行还原末端糖和糖组成的分析，发现寡糖1-(1)～(4)的还原末端糖和糖组成都是岩藻糖。接着测定硫酸含量(利用氯化钡比浊法)、糖醛酸含量(根据咔唑-硫酸法)。此外，使用JNMα-500型核磁共振装置(日本电子社制造)进行NMR分析。根据规定方法用重水置换分析试样后，进行结构分析。使用作为¹H-异核检测的检测法的HMBC法分析组成糖的键。使用DQF-COSY法和HOHAHA法对¹H-NMR进行归属，使用HSQC法对¹³C-NMR进行归属。

下面显示寡糖1-(1)～(4)的物性。

(a)寡糖1-(1)的物性

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的¹H-NMR谱图如图1、¹³C-NMR如图2、质谱图如图3所示。图1、图2中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图3中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；1914

MS m/z 455.0[M-4Na⁺]^4-、614.8[M-3Na⁺]^3-、933.8[M-2Na⁺]^2-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表2和表3中。

表2

表3

糖组成仅L-岩藻糖(6分子)

硫酸基 10分子

钠 10分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中峰归属序号按照下式(IV)。

(b)寡糖1-(2)的物性

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的¹H-NMR谱图如图4、¹³C-NMR如图5、质谱图如图6所示。图4、图5中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。

此外，图6中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；2264

MS m/z 354.2[M-6Na⁺]^6-、429.8[M-5Na⁺]^5-、543.0[M-4Na⁺]^4-、731.6[M-3Na⁺]^3-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表4和表5中。

表4

表5

糖组成仅L-岩藻糖(7分子)

硫酸基 12分子

钠 12分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中峰归属序号按照下式(V)。

对上式(V)的硫酸化糖，用国际公开第00/62785号文本、实施例1-(2)中记载的方法查找诱导HGF产生的活性，可以确认其有此活性。

(c)聚糖1-(3)的物性

质量分析的结果如下所示，本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的¹H-NMR谱图如图7、¹³C-NMR如图8、质谱图如图9所示。图7、图8中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图9中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；2366

MS m/z 371.4[M-6Na⁺]^6-、450.3[M-5Na⁺]^5-、568.6[M-4Na⁺]^4-、765.7[M-3Na⁺]^3-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表6和表7中。

表6

表7

糖组成仅L-岩藻糖(7分子)

硫酸基 13分子

钠 13分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(VI)。

(d)寡糖1-(4)的物性

质量分析的结果如下所示，本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的¹H-NMR谱图如图10、¹³C-NMR如图11、质谱图如图12所示。图10、图11中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图12中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；3460

MS m/z 409.6[M-8Na⁺]^8-、471.4[M-7Na⁺]^7-、553.8[M-6Na⁺]^6-、669.3 [M-5Na⁺]^5-、842.3[M-4Na⁺]^4-、1130.8[M-3Na⁺]^3-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表8～表10中。

表8

表9

表10

糖组成仅L-岩藻糖(11分子)

硫酸基 18分子

钠 18分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(VII)。

实施例3 使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制以及结构分析-(2)

(1)制备

养殖后的龙目干燥物用装有孔径1mm筛子的切割机(增幸产业制造)作成片。将250g龙目片在5升80％乙醇中悬浊，室温下搅拌2小时后，过滤。用此80％乙醇重复4次洗净，得到龙目洗净物。将250g此龙目洗净物在5升含有125mM氯化钙、250mM氯化钠和10％乙醇的17mM咪唑盐酸缓冲液(pH 7.5)中悬浊，室温下搅拌24小时后，过滤，离心分离，得到龙目岩藻依聚糖溶液。在1升此提取液中添加10U硫酸化藻聚糖分解酶，室温下搅拌3天后，用滤纸过滤，离心分离滤液，得到上清液，用装有排除分子量1万的中空纤维的超滤机，回收低分子部分，作为硫酸化藻聚糖寡糖部分2。

(2)精制

实施例3-(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分2，装入1升经含100mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液充分洗净后，经从100mM到1M的氯化钠浓度梯度洗脱。归总洗脱后的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。结果洗脱部分形成2个峰，所以对各个峰部分进行了质量分析。此外查找各个峰的糖组成时，发现只含岩藻糖不含糖醛酸。根据糖组成考虑的各质量寡糖被认为具有表11所示组成。

表11

接着收集形成各峰的部分，分别用蒸发器浓缩后在与实施例2-(2)相同的条件下精制。

对用YMC Pack Polyamine II柱进行柱色谱分别取得的部分进行质量分析，作为主峰，分别由峰2-(1)得到质量1914和2016的物质、由峰2-(2)得到质量3110的物质。

收集含有质量1914、2016和3110的物质峰附近的部分，装入经10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脱、脱盐。这样得到本发明硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)。

(3)结构分析

根据使用2-氨基吡啶的荧光标识法，对实施例3-(2)中所得本发明硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)进行还原性末端糖和糖组成的分析，发现还原性末端糖和糖组成都是岩藻糖。接着测定硫酸含量(使用氯化钡比浊法)、糖醛酸含量(根据咔唑-硫酸法)。此外，使用JNMα-500型核磁共振装置(日本电子社制造)进行NMR分析。根据规定方法用重水置换分析试样后，进行结构分析。使用作为¹H-异核检测的检测法的HMBC法对组成糖的键进行分析。使用DQF-COSY法和HOHAHA法对¹H-NMR进行归属，使用HSQC法对¹³C-NMR进行归属。

下面显示寡糖2-(1)-1、2-(1)-2和2-(2)的物性。

(a)硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1的物性。

上述分析结果表明，硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-1与本发明硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)为相同物质。

(b)硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的物性。

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，¹H-NMR谱图如图13、¹³C-NMR如图14、质谱图如图15所示。图13、图14中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图15中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；2016

MS m/z 313.1[M-6Na⁺]^6-，380.3[M-5Na⁺]^5-，481.1[M-4Na⁺]^4-，649.1[M-3Na⁺]^3-，985.0[M-2Na⁺]^2-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表12和表13中。

表12

表13

糖组成仅L-岩藻糖(6分子)

硫酸基 11分子

钠 11分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(VIII)。

(c)寡糖2-(2)的物性

质量分析结果如下所示，本发明硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的¹H-NMR谱图如图16、¹³C-NMR如图17、质谱图如图18所示。图16、图17中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图18中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；3111

MS m/z 365.8[M-8Na⁺]^8-、421.4[M-7Na⁺]^7-、495.2[M-6Na⁺]^6-、599.1[M-5Na⁺]^5-、755.0[M-4Na⁺]^4-、1013.7[M-3Na⁺]^3-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表14～表16中。

表14

表15

表16

糖组成仅L-岩藻糖(10分子)

硫酸基 16分子

钠 16分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(IX)。

实施例4 使用硫酸化藻聚糖分解酶的海带硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制以及结构分析-(3)

(1)制备

养殖后的海带干燥物用装有孔径1mm筛子的切割机(增幸产业制造)作成片。将500g海带片在4.5升80％乙醇中悬浊，室温下搅拌24小时后，过滤。用此80％乙醇重复3次洗净，得到海带片洗净物。将全部此海带片洗净物在10升含有50mM氯化钙、200mM氯化钠和10％乙醇的、50mM pH 8.0咪唑盐酸缓冲液中悬浊，向其中添加2U硫酸化藻聚糖分解酶，室温下搅拌5天后，用滤纸过滤，离心分离滤液，得到上清液，用装有排除分子量1万的中空纤维的超滤机，回收低分子部分，作为海带硫酸化藻聚糖寡糖部分1。

(2)精制

向上述(1)中所得的海带硫酸化藻聚糖寡糖部分1中添加10％乙醇，使其与下述平衡化用缓冲液具有相同的电导率，装入500ml经含200mM氯化钠和10％乙醇的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液洗净后，经从200mM到1.2M的氯化钠浓度梯度洗脱。洗脱时使用4.5升缓冲液，收集时每份50ml。归总洗脱后的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。结果洗脱部分形成3个峰。收集第2个峰附近的部分(44-48)，用蒸发器浓缩成40ml后，装入经10％乙醇平衡化后的4.1×90cm Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脱。归总洗脱的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。收集被检出糖的部分，用蒸发器浓缩成8.4ml后，在下述条件下精制。

柱：YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)

流速：8ml/分

柱温：30℃

平衡化溶液：875mM含有10％乙腈的磷酸二氢钠

洗脱溶液：从875m M含有10％乙腈的磷酸二氢钠到1.4M含有10％乙腈的磷酸二氢钠浓度梯度。

分取：每根4ml

检出：苯酚硫酸法

收集上述经柱色谱分级的部分(分3次，第50-59部分附近)，用排除分子量3500的透析管相对于10％乙醇进行透析，用蒸发器浓缩成约40ml后，装入经10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脱。

归总洗脱的部分，用苯酚硫酸法测定总糖量。收集主峰的附近，同样再用Cellulofine GCL-25精制。收集本洗脱部分的主峰，用SpeedVac浓缩后，冷冻干燥，得到海带硫酸化藻聚糖寡糖1。

(3)结构分析

用实施例2中记载的方法进行寡糖的结构分析，发现海带硫酸化藻聚糖寡糖1的结构与实施例2中记载的硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)相同。

实施例5 巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制和结构分析

(1)制备

按照参考例1中记载的方法由巨藻黑的干燥片制备来源于巨藻黑的岩藻依聚糖。

即，将10g来源于巨藻黑的岩藻依聚糖溶解在2升含有50mM氯化钙、300mM氯化钠和10％乙醇的、50mM pH 8.0咪唑-盐酸缓冲液中，向其中添加1U硫酸化藻聚糖分解酶，室温下搅拌40小时后，用装有排除分子量1万的中空纤维的超滤机，回收低分子部分，作为巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖部分1。

(2)精制

上述(1)中所得的巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖部分1，装入1000ml经含200mM氯化钠和10％乙醇的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.0)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱中，用相同缓冲液洗净后，经从200mM到700mM的氯化钠浓度梯度洗脱。洗脱时使用5升的缓冲液，收集时每份56ml。归总洗脱后的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。结果洗脱部分形成7个峰。收集各峰附近的部分，用蒸发器浓缩成40ml后，(下面将其称为巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7))装入经10％乙醇平衡化后的4.1×90cmCellulofine GCL-25柱子中，用10％乙醇洗脱。归总洗脱的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。收集被检出糖的部分，用蒸发器浓缩后，在下述条件下精制。

柱：YMC Pack Polyamine II(20×250mm、YMC社制造)

流速：8ml/分

柱温：30℃

平衡化溶液：对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)、(2)、(3)，使用含有10％乙腈的90mM磷酸二氢钠。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)、(5)，使用含有10％乙腈的630mM磷酸二氢钠。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)，使用含有10％乙腈的720mM磷酸二氢钠。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，使用含有10％乙腈的900mM磷酸二氢钠。

洗脱：对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)、(2)、(3)，使用从含有10％乙腈的90mM磷酸二氢钠到含有10％乙腈的900mM磷酸二氢钠浓度梯度。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)、(5)，使用从含有10％乙腈的630mM磷酸二氢钠到含有10％乙腈的1260mM磷酸二氢钠浓度梯度。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)，使用从含有10％乙腈的720mM磷酸二氢钠到含有10％乙腈的1440mM磷酸二氢钠浓度梯度。对于巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，使用从含有10％乙腈的900mM磷酸二氢钠到含有10％乙腈的1620mM磷酸二氢钠浓度梯度。

收集：每份4ml

检测：苯酚硫酸法

在巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)的上述经柱色谱分级的部分中，收集各自的糖洗脱部分，用蒸发器浓缩成约40ml后，装入经10％乙醇平衡化后的Cellulofine GCL-25柱中，用10％乙醇洗脱。

归总洗脱的部分，用苯酚硫酸法测定总糖量。收集主峰的附近，同样再用Cellulofine GCL-25精制。不过，对于，巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)，由于认为其有2个主峰，所以分别记为巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1和1-(7)-2。收集各个洗脱部分的主峰，用Speed Vac浓缩后，冷冻干燥，得到巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)-2。

(3)结构分析

用实施例2中记载的方法进行寡糖的结构分析。

下面显示了巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)～1-(7)-2的物性。

(a)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的物性

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，¹H-NMR谱图如图19、¹³C-NMR如图20、质谱图如图21所示。图19、图20中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图21中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；718

MS m/z 216.5[M-3Na⁺]^3-，336.0[M-2Na⁺]² ^-，695.0[M-Na⁺]^-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表17中。

表17

糖组成仅L-岩藻糖(2分子)

硫酸基 4分子

钠 4分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(X)。

(b)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的物性

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，¹H-NMR谱图如图22、¹³C-NMR如图23、质谱图如图24所示。图22、图23中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图24中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；966

MS m/z 459.9[M-2Na⁺]^2-，942.9[M-Na⁺]^-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表18中。

表18

糖组成仅L-岩藻糖(3分子)

硫酸基 5分子

钠 5分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(XI)。

(c)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的物性

质量分析和NMR分析的归属结果如下所示，¹H-NMR谱图如图25、¹³C-NMR如图26、质谱图如图27所示。图25、图26中纵轴表示信号强度、横轴表示化学位移值(ppm)。此外，图27中纵轴表示相对强度(％)、横轴表示m/z值。

分子量；1068

MS m/z 332.9[M-3Na⁺]^3-，511.0[M-2Na⁺]² ^-，1045.0[M-Na⁺]^-

¹H-NMR与¹³C-NMR的分析结果示于表19中。

表19

糖组成仅L-岩藻糖(3分子)

硫酸基 6分子

钠 6分子

此外¹H-NMR与¹³C-NMR中信号归属序号按照下式(XII)。

(d)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的物性

用实施例2中记载的方法进行结构分析，发现巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的结构与实施例2中记载的硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)相同。

(e)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(5)的物性

用实施例2中记载的方法进行结构分析，发现巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(5)的结构与实施例2中记载的硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)相同。

(f)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)的物性

本发明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(6)的质量分析结果如下所示。

分子量；3461

MS m/z 361.5[M-9Na⁺]^9-，409.62[M-8Na⁺]⁸ ^-，471.42[M-7Na⁺]^7-，553.81[M-6Na⁺]^6-，669.31[M-5Na⁺]^5-，842.32[M-4Na⁺]^4-，1130.83[M-3Na⁺]^3-

糖组成仅L-岩藻糖(11分子)

硫酸基 18分子

钠 18分子

(g)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1的物性

本发明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-1的质量分析结果如下所示。

分子量；4659

MS m/z 442.82[M-10Na⁺]^10-，494.72[M-9Na⁺]^9-，559.32[M-8Na⁺]^8-，642.62[M-7Na⁺]⁷ ^-，753.52[M-6Na⁺]^6-，908.82[M-5Na⁺]^5-，1141.43[M-4Na⁺]^4-

糖组成仅L-岩藻糖(15分子)

硫酸基 24分子

钠 24分子

(h)巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-2的物性

本发明巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(7)-2的质量分析结果如下所示。

分子量；3564

MS m/z 373.12[M-9Na⁺]^9-，422.52[M-8Na⁺]^8-，486.32[M-7Na⁺]^7-，571.01[M-6Na⁺]^6-，689.61[M-5Na⁺]^5-，868.02[M-4Na⁺]^4-，1164.93[M-3Na⁺]^3-

糖组成仅L-岩藻糖(11分子)

硫酸基 19分子

钠 19分子

实施例6 使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制以及结构分析-(3)

(1)制备

10g参考例1中记载的、来源于养殖后的龙目的岩藻依聚糖溶解在4.8升含125mM氯化钙、250mM氯化钠、10％乙醇的17mM咪唑盐酸缓冲液(pH 7.5)中，添加10U硫酸化藻聚糖分解酶，室温下搅拌72小时后，得到龙目岩藻依聚糖寡糖溶液。使用装有排除分子量1万的中空纤维的超滤机，回收低分子部分，作为硫酸化藻聚糖寡糖部分3。

(2)分析

上述(1)中所得的硫酸化藻聚糖寡糖部分3，装入1升经含100mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.5)平衡化后的DEAE-Cellulofine A-800柱子中，用相同缓冲液充分洗净后，经从100mM到1M的氯化钠浓度梯度洗脱。归总洗脱后的部分，用苯酚-硫酸法计算总糖量，咔唑-硫酸法计算总糖醛酸量。结果洗脱部分形成2个峰，所以对各个峰部分进行了质量分析。此外查找各个峰的糖组成时，发现只含岩藻糖不含糖醛酸。根据糖组成考虑的各质量寡糖被认为具有表20所示组成。

表20

结果表明上表所示的各种硫酸化藻聚糖寡糖包含在硫酸化藻聚糖寡糖部分3中。

实施例7使用硫酸化藻聚糖分解酶的硫酸化藻聚糖寡糖的制备、精制、结构分析以及生理活性。

(1)除了实施例2-(2)中所得的DEAE-Cellulofine柱色谱中的4个明显峰以外，还发现了用更高盐浓度洗脱所得的宽峰，以其作为寡糖4收集，用与实施例2同样的方法进行NMR分析。结果得到与硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)几乎相同的谱图。由此可推知，寡糖4具有多个分子寡糖1-(2)相结合的结构。所以，将寡糖4用实施例1记载的硫酸化藻聚糖分解酶分解，对分解物进行HPLC分析时，发现反应生成物大部分在与硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)相同位置洗脱。

使用以支链淀粉作为标准物的凝胶过滤法测定上述寡糖4的分子量，结果表明寡糖(4)的分子量是寡糖1-(2)的3倍左右。

此外，通过对寡糖4的¹H-NMR谱图的详细研究，发现7糖残基的重复结合位置是用α-(1→3)键连接在式(IV)中的F6的岩藻糖的3位上。

进一步根据上述方法，由硫酸化多糖的分解物中得到(I)表示的硫酸化糖的1～5量体，即下述一般式(I)中n＝1～5表示的硫酸化糖

(式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H)。

由上可知，由龙目等褐藻类得到的含硫酸化藻聚糖多糖用硫酸化藻聚糖分解酶处理、低分子化后，得到硫酸化多糖，此多糖以上述一般式表示的硫酸化糖为组成糖必须成分的。此外，用凝胶过滤法测定此硫酸化多糖的分子量，当提取条件为pH 6～8、95℃、约2小时时，所得平均分子量为约20万。

(2)测定上述(1)所得的硫酸化糖的生理活性。对式(1)所示的硫酸化糖，用国际公开第00/62785号文本、实施例1-(2)中记载的方法测定HGF产生诱导活性，结果表明，其具有此活性。此外，对式(1)的硫酸化糖，用国际公开第99/41288号文本、实施例8和实施例9中记载的方法测定保湿性，结果发现其非常有用。

本发明提供了使用硫酸化藻聚糖分解酶的、制备作为糖工程试剂非常有用的、各种分子量的硫酸化藻聚糖寡糖的方法。此外本发明还提供了可知其结构的各种硫酸化藻聚糖寡糖。

序列表

<110>宝生物工程株式会社

<120>硫酸化藻聚糖寡糖

<130>

<160>1

<210>1

<211>1506

<212>DNA

<213>Fucanobacter lyticus

<400>1

agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60

ggaaacgaga atagcttgct attcggcgtc gagcggcgga cgggtgagta atgcttggga 120

atatgcctaa tggtggggga caacagttgg aaacgactgc taataccgca taatgtctac 180

ggaccaaagg aggggattct tcggaacctt tcgccatttg attagcccaa gtgagattag 240

ctagtaggta aggtaatggc ttacctaggc gacgatctct agctggtttg agaggatgat 300

cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360

tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 420

gtaaagcact ttcagcgagg aggaaagggt gtagattaat actctgcatc tgtgacgtta 480

ctcgcagaag aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aggggtgcaa 540

gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgtaggtg gtttgttaag caagatgtga 600

aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatt ttgaactggc aaactagagt tttgtagagg 660

gtagtggaat ttccagtgta gcggtgaaat gcgtagagat tggaaggaac atcagtggcg 720

aaggcggcta cctggacaga gactgacact gaggcacgaa agcgtgggga gcaaacagga 780

ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcaact agccgtctgt agacttgatc 840

tgtgggtggc gtagctaacg cgctaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa 900

aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960

aacgcgaaga accttaccat cccttgacat cctactaagt tactagagat agtttcgtgc 1020

cttcgggaaa gtagtgacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg 1080

ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tccttatttg ctagcgcgta atggcgagaa 1140

ctctaaggag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200

gcccttacgg gatgggctac acacgtgcta caatggcaag tacagagggc agcaataccg 1260

cgaggtggag cgaatcccac aaagcttgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact 1320

ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg 1380

gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt ggctagttta 1440

acccttcggg gaggacggtc accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag 1500

gtagcc 1506

附图的简要说明

图1为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的¹H-NMR谱图。

图2为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的¹³C-NMR谱图。

图3为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的质量分析谱图。

图4为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的¹H-NMR谱图。

图5为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的¹³C-NMR谱图。

图6为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的质量分析谱图。

图7为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的¹H-NMR谱图。

图8为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的¹³C-NMR谱图。

图9为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的质量分析谱图。

图10为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的¹H-NMR谱图。

图11为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的¹³C-NMR谱图。

图12为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖1-(4)的质量分析谱图。

图13为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的¹H-NMR谱图。

图14为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的¹³C-NMR谱图。

图15为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(1)-2的质量分析谱图。

图16为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的¹H-NMR谱图。

图17为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的¹³C-NMR谱图。

图18为本发明所得硫酸化藻聚糖寡糖2-(2)的质量分析谱图。

图19为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的¹H-NMR谱图。

图20为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的¹³C-NMR谱图。

图21为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(1)的质量分析谱图。

图22为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的¹H-NMR谱图。

图23为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的¹³C-NMR谱图。

图24为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(2)的质量分析谱图。

图25为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的¹H-NMR谱图。

图26为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的¹³C-NMR谱图。

图27为本发明所得巨藻黑硫酸化藻聚糖寡糖1-(3)的质量分析谱图。

Claims

1.硫酸化藻聚糖或其盐，其特征在于具有下列物理化学性质，

(1)组成糖：含有岩藻糖，

(2)以下述一般式(I)表示的硫酸化糖为组成糖的必须成分

式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H、n为1以上的整数，

(3)被来源于保藏号为FERMBP-5747的Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶所低分子化，生成选自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)表示的化合物中一种以上的化合物

全部式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H.

2.硫酸化藻聚糖寡糖，其特征在于下述一般式(I)中n为1～5

式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H。

3.制备硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其特征在于，使来源于保藏号为FERM BP-5747的Alteromonas sp.SN-1009的硫酸化藻聚糖分解酶与权利要求1中的硫酸化藻聚糖作用，收集其分解物。

4.根据权利要求3的制备硫酸化藻聚糖寡糖的方法，其中硫酸化藻聚糖来源于龙目(Kjellmaniella crassifolia)、海带(Laminariajaponica)或巨藻黑(Lessonia nigrescens).

5.硫酸化藻聚糖寡糖，其用权利要求3的方法制备。

6.硫酸化藻聚糖寡糖或其盐，其具有选自下述一般式(II)、(III)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)的化学结构

全部式中，R为H或SO₃H、R的至少一个为SO₃H。