JP2001226408A - フコース硫酸含有多糖 - Google Patents

フコース硫酸含有多糖

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JP2001226408A JP2000400282A JP2000400282A JP2001226408A JP 2001226408 A JP2001226408 A JP 2001226408A JP 2000400282 A JP2000400282 A JP 2000400282A JP 2000400282 A JP2000400282 A JP 2000400282A JP 2001226408 A JP2001226408 A JP 2001226408A
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信司 中山
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薫 児島
Hitomi Kimura
ひとみ 木村
Yoshikuni Nakanishi
芳邦 中西
Kaoru Katayama
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隆生 冨永
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一夫 嶋中
Katsushige Igai
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Ikunoshin Kato
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】医薬品として利用可能なアポトーシス誘発剤、
制がん剤及び発がん予防剤に関する。又、アポトーシス
機構解明、アポトーシス誘発阻害剤スクリーニング等に
有用なアポトーシス誘発方法、更に本発明により純化さ
れたフコース硫酸含有多糖及びその分解物、フコース硫
酸含有多糖分解物の製造、構造究明に有用なフコース硫
酸含有多糖分解酵素の提供。 【解決手段】下記理化学的性質を有することを特徴とす
るフコース硫酸含有多糖。 （１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品として利用
可能なアポトーシス誘発剤、制がん剤及び発がん予防剤
に関する。また、本発明はアポトーシス機構解明、アポ
トーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトー
シス誘発方法を提供する。更に本発明により純化された
フコース硫酸含有多糖及びその分解物が提供され、フコ
ース硫酸含有多糖分解物の製造や、構造究明に有用なフ
コース硫酸含有多糖分解酵素が提供される。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞組織の死に関し、アポトーシ
ス（apoptosis 、アポプトーシスともいう；自爆死ある
いは細胞自滅）と言う様式が注目されている。
【０００３】このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれて
いる死であると考えられている。すなわち何らかの外部
的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプロ
グラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプロ
グラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したプロ
グラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至
ると考えられている。
【０００４】このようなアポトーシスを所望の組織、細
胞で発現せしめることができれば、不要若しくは病原細
胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極
めて意義深いものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アポ
トーシスを誘発する作用を有する安全性の高い化合物を
開発し、該化合物を含有するアポトーシス誘発剤、制が
ん剤、発がん予防剤、及び該化合物を有効成分として使
用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。ま
た本発明の化合物の分解物の製造に有用な該化合物分解
酵素を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はアポトーシス誘発剤に関し、フコー
ス硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有することを
特徴とする。
【０００７】本発明の第２の発明はアポトーシス誘発方
法に関し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物
を有効成分として使用することを特徴とする。
【０００８】本発明の第３の発明は制がん剤に関し、本
発明の第５又は第６の発明のフコース硫酸含有多糖及び
／又はその分解物を含有することを特徴とする。
【０００９】本発明の第４の発明は発がん予防剤に関
し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有
することを特徴とする。
【００１０】本発明の第５の発明は下記理化学的性質を
有するフコース硫酸含有多糖に関する。 （１）構成糖：ウロン酸を含有する。 （２）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２） の生産
するフコイダン分解酵素により低分子化し、少なく と
も下記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物よ
り選択される一種以上 の化合物が生成する。
【化１】
【化２】
【化３】
【００１１】本発明の第６の発明は下記理化学的性質を
有するフコース硫酸含有多糖に関する。 （１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （２）フラボバクテリウム(Flavobacterium）ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。
【００１２】本発明の第７の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のあ
る薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含すること
を特徴とする。
【００１３】本発明の第８の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イオ
ン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含
することを特徴とする。
【００１４】本発明の第９の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第
５の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存
する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基
を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特
徴とする。
【００１５】本発明の第１０の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、ウロン酸を含むフコース硫酸含
有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解酵
素をもつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を
包含することを特徴とする。
【００１６】本発明の第１１の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能
のある薬剤で目的の多糖を沈殿させる工程を包含するこ
とを特徴とする。
【００１７】本発明の第１２の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イ
オン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包
含することを特徴とする。
【００１８】本発明の第１３の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の
第６の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共
存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換
基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを
特徴とする。
【００１９】本発明の第１４の発明はフコース硫酸含有
多糖混合物の製造方法に関し、海藻から本発明の第７、
８、１０、１１又は１２の発明に使用するフコース硫酸
含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオンとカルシウ
ムイオンを共存させることを特徴とする。
【００２０】本発明の第１５の発明は下記の理化学的性
質を有することを特徴とするエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素に関する。 （ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化
させる。 （ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用
しない。 （ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。 （ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物より選
択される一種以上の化合物が生成する。
【化４】
【化５】
【化６】 （ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近にあ
る。 （iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付
近である。
【００２１】本発明の第１６の発明はカルシウム源と本
発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素を含有する酵素組成物に関する。
【００２２】本発明の第１７の発明は本発明の第１５の
発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の製造方
法に関し、本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテロモナス属細
菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特
徴とする。
【００２３】本発明の第１８の発明はフコース硫酸含有
多糖の低分子化物に関し、本発明の第１５の発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるも
のであることを特徴とする。
【００２４】本発明者らは様々な純化されたフコース硫
酸含有多糖やその分解物を得ることに成功し、次いでそ
れらの生物活性を検討し、それらの物質ががん細胞に対
してアポトーシスを誘発させること及び強い制がん作用
を示すことを見出した。またフコース硫酸含有多糖及び
／又はその分解物が強い発がん抑制作用を示すことを見
い出した。更に本発明の分解物の調製に有用なフコース
硫酸含有多糖分解酵素の単離に成功し、本発明を完成さ
せた。
【００２５】
【発明の実施の形態】以下、本発明に関して具体的に説
明する。本発明に使用されるフコース硫酸含有多糖は特
に限定されるものではなく例えばヒバマタ由来の物、ガ
ゴメ昆布由来の物、マ昆布由来の物、ワカメ由来の物そ
の他すべての褐藻植物由来の物を使用することができ
る。また、ナマコも体壁にフコース硫酸含有多糖を持っ
ていることが知られているが、本発明にはナマコ由来の
フコース硫酸含有多糖も使用することができる。また本
発明にはフコース硫酸含有多糖の分解物も使用すること
ができる。フコース硫酸含有多糖の分解方法としては酸
処理等の化学的に分解する方法、超音波処理など物理的
に分解する方法、あるいは酵素的に分解する方法等が挙
げられる。
【００２６】本発明者らは、上記のような様々なフコー
ス硫酸含有多糖及び／又はその分解物をがん細胞の培養
液に添加したところ添加後１日から数日で癌細胞がアポ
トーシスを起こすことを見出した。また、正常細胞に対
しては毒性を示さないことも確認した。
【００２７】本発明において、フコース硫酸含有多糖と
は、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に
限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されて
いる〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式
会社、昭和３０年１２月１５日発刊、多糖類化学、第３
１９頁、第３２１頁〕。なお褐藻植物由来のフコース硫
酸含有多糖はフコイダン、フコイジン、フカンと通称さ
れ、いくつかの分子種があることが知られているがこれ
らは総称的にフコイダンと呼ばれることが多い。例え
ば、市販シグマ社製のフコイダンを１３種もの分子種に
分けたという報告があり〔カーボハイドレート リサー
チ（Carbohydrate Research)、第２５５巻、第２１３〜
２２４頁（１９９４）〕、その中にはフコースを主成分
とする一群と、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースや
マンノースを多く含む一群の分子種がある。その生物活
性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗
凝血等様々なものが報告されているが、フコース硫酸含
有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種に
あるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精
製して調べる必要があった。フコース硫酸含有多糖に
は、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコー
スのものと、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースやマ
ンノースを含むもの等がある。以下、本明細書において
はウロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多
糖−Ｆとし、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフ
コース硫酸含有多糖−Ｕとし、両者の混合物をフコース
硫酸含有多糖混合物と記載する。
【００２８】これまでに知られているフコース硫酸含有
多糖−Ｆやフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する方法は
分子量分画や陰イオン交換樹脂による分離であり、その
分離は不充分なため薬品や機能性食品として大量調製が
困難なものであった。
【００２９】また、フコース硫酸含有多糖から着色性物
質を完全に除去することは困難なことが知られており、
市販のフコイダン等にも着色性物質が含まれている。通
常この着色性物質はポリフェノールが重合したものであ
り極めて反応性が強く様々な酵素反応を阻害したり細胞
の生育を阻害したり、また、例えば接した樹脂や樹脂性
の容器等に不可逆的に吸着することがある。そのためフ
コース硫酸含有多糖の生物活性を正確に調べるため、ま
た、容器や樹脂等の汚染を防ぐためにはフコース硫酸含
有多糖から反応性の強い着色性物質を除去する必要があ
った。
【００３０】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する
際に可溶性の酢酸バリウムや塩化バリウムや塩化カルシ
ウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができ
るため、後の精製が有利であることが知られているが、
可溶性のバリウム塩は廃液の処理などが容易ではなく、
また塩化カルシウムは海藻と混合するとｐＨが変動する
ため非分解性のフコース硫酸含有多糖を得るにはｐＨ調
整が必要である。このｐＨ調整の際に海藻粉末が粘性を
帯びて凝集することがあるため、その後の抽出効率が低
下したり固液分離とりわけろ過が困難となることがあ
る。
【００３１】すなわち、現在フコース硫酸含有多糖の産
業上の有用性が期待されているにも関わらず、分子種的
に分別が充分なフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコース硫
酸含有多糖−Ｕの市販品もなく、またその効率的な製造
方法に関する報告もない。更には市販のフコース硫酸含
有多糖には上記のように反応性の強い着色性物質が含ま
れている。
【００３２】フコース硫酸含有多糖には様々な活性があ
るが、前述のごとくその分別調製が困難であるためいま
だに実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコ
ース硫酸含有多糖−Ｕは得られていなかった。
【００３３】しかしながら本発明により、実質上純化さ
れたフコース硫酸含有多糖−Ｕ、その簡便な抽出方法及
びフコース硫酸含有多糖−Ｕの製造方法が提供された。
また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除
去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性
の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖−Ｕ
が提供された。
【００３４】更に本発明により、実質上純化されたフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ、その簡便な抽出方法及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆの製造方法が提供された。
【００３５】また本発明により、通常、フコース硫酸含
有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をも
たらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸
含有多糖−Ｆが提供された。
【００３６】本発明に使用するフコース硫酸含有多糖と
しては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含
有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、
またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含
有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良
い。フコース硫酸含有多糖抽出液の調製方法、抽出液か
らの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はな
い。
【００３７】また、本発明に使用する、フコース硫酸含
有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的
方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるも
のであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学
的方法を使用することができる。
【００３８】また、本発明に使用するフコース硫酸含有
多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許
容される塩を包含する。
【００３９】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物
としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、
昭和５２年発刊の原色日本海藻図鑑、第２２〜５２頁に
記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evan
escens) 、ガゴメ昆布（Kjellmaniella crassifolia)、
マ昆布（Laminaria japonica) 、ワカメ（Undaria pinn
atifida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製する
ことができる。
【００４０】フコース硫酸含有多糖を含有するナマコと
しては、例えば、特開平４−９１０２７号公報記載のナ
マコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus)、
ニセクロナマコ（Holothuria leucospilota)等を使用す
ることができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含
有多糖を調製することができる。
【００４１】フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に
有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。
これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩に
なった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカ
リウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩は
ダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂で処理するこ
とによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれら
の分解物に導くことが可能である。また、これらは、更
に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の塩
に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それ
らの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用い
られ、例えばカリウム、ナトリウム等のアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ
土類金属塩、ピリジニウム等の有機塩基との塩、及びア
ンモニウム塩等が挙げられる。
【００４２】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植
物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フ
コース硫酸含有多糖含有粉体を調製することができる。
【００４３】フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽
出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖
抽出液を調製することができる。
【００４４】フコ−ス硫酸含有多糖含有物からの抽出温
度、時間としては０〜２００℃、１〜３６０分の範囲か
ら目的に応じ選択すれば良いが、通常１０〜１５０℃、
５〜２４０分、好適には５０〜１３０℃、１０〜１８０
分の範囲より選択して行うのが良い。
【００４５】フコース硫酸含有多糖含有率を高めるため
の抽出物精製手段としては、塩化カルシウム、酢酸バリ
ウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化
セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコー
ス硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝
集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応
じこれらを組合せて、精製を行うことができる。
【００４６】フコース硫酸含有多糖の分解方法として
は、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸
分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸
含有多糖分解方法として公知の方法を使用することがで
き、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。
【００４７】通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸含
有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種類
は特に限定されるものではなく、例えばヒバマタ由来の
もの、ガゴメ昆布由来のもの、マ昆布由来のもの、ワカ
メ由来のもの、その他すべての褐藻類由来のものを使用
することができる。
【００４８】フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐
藻類の水系溶媒による抽出液を得る。
【００４９】また、抽出に供する海藻は生海藻でも良い
が、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にし
たり、６０〜１００％のアルコールやアセトン等で洗浄
したり、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけ
ばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に
減少するため有利である。
【００５０】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可
溶性の酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウ
ムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができる
ため後の精製が有利であるが上述した理由により抽出の
際には、１ｍＭ〜１Ｍ程度の酢酸カルシウム溶液で５０
〜１３０℃で抽出するのが好ましい。
【００５１】海藻が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、
最初から０．２Ｍ以上の酢酸カルシウムを用いると抽出
効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したもの
に、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿
を除去すれば良い。
【００５２】しかしながらフコース硫酸含有多糖をアル
ギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解
したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限
定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネ
シウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クエン酸、リ
ン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液
が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液の
ｐＨや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、
一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱
いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分
子化が進行し易い。加熱温度、時間、ｐＨ等を調整する
ことにより、任意の分解物を調製することができ、例え
ばゲルろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の
平均分子量、分子量分布等を調整することができる。
【００５３】すなわち本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量及び糖組成は
フコース硫酸含有多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方
法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸
含有多糖の抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異な
る。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解さ
れ、アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低
分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース
硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆの分子
量、分子量分布はその１例にすぎず、フコース硫酸含有
多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易
に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で１００℃、１
時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ３００の分子ふる
い膜を使用すれば、分子量分布１０００から１万程度の
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
が調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子
量分布の本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆを調製できる。
【００５４】前記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中
性糖等を除くためには、例えば０．２〜０．６Ｍの濃度
の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくな
るまで塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を加
え、沈殿を集めれば良い。
【００５５】必要に応じてこの沈殿を０．２〜０．６Ｍ
の濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セ
チルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、
フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られた
フコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、こ
の沈殿を溶解後陰イオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理
したり限外ろ過等を行ってもよい。また脱塩後凍結乾燥
すれば乾燥標品を得ることもできる。
【００５６】本発明者らは０．６〜３Ｍの１種類又は２
種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多
糖−Ｆと本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性多糖
凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことを見出した。
【００５７】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｕを分離することができる。
【００５８】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６
〜２Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。
【００５９】通常本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆと
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する場合１．
５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる（後記する図１の
説明参照）。 例えば上記塩類の塩濃度を１．５Ｍに調
整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を
これ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫
酸含有多糖−Ｆが沈殿を形成するので、沈殿を除去する
と本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの溶液が得られ
る。必要に応じてこの溶液を濃縮後、４倍量のエタノー
ルなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖−Ｕを沈殿さ
せ、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコ
ールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。
【００６０】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの
みを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニウ
ム等で凝集させる際に、０．２〜０．６Ｍの塩濃度では
なく、例えば２Ｍの塩濃度にすれば沈殿は本発明のフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆのみを含む。
【００６１】本発明者らは、フコース硫酸含有多糖を陰
イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオンが共存す
ると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量
が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなること
も見出した。すなわち、本発明の方法を用いて本発明の
フコース硫酸含有多糖−Ｕを製造する際には、まずフコ
ース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオン源となる薬品
を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次に、陰イオン交換
樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１ｍＭ以上含む液で
平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させ
る。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄
後、例えば塩化ナトリウムのグラジエントによりフコー
ス硫酸含有多糖を溶出させる。本方法を用いる場合、添
加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ以上ならばよいが、
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕをカラムに吸着させ
る目的の時は０．５Ｍ未満が望ましい。また本方法に用
いる２価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリ
ウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定される
ものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使
用することができる。
【００６２】また、褐藻類から通常の方法でフコース硫
酸含有多糖混合物を製造すると上述のように反応性の強
い着色性物質が混入し、それらが接する樹脂や樹脂性容
器を汚染したり、酵素反応や細胞生育を阻害したりす
る。この着色性物質は多糖性の物質あるいは陰イオン交
換基を有する物質に結合あるいは吸着させれば容易に除
去できることを見出した。すなわち、フコース硫酸含有
多糖を含む溶液に例えば、セルロファイン、ＧＣＬ−２
０００（生化学工業社製）や、セファクリルＳ−５０
０、セファデッスクＧ−２００、セファロースＣＬ−２
Ｂ（共にファルマシア社製）等の多糖性の樹脂あるい
は、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業
社製）、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０、ＱＡＥ−セファデックスＡ−５
０、ＤＥＡＥ−セファセル（共にファルマシア社製）、
ＴＳＫ−ゲルＤＥＡＥ−トヨパール６５０、ＴＳＫ−ゲ
ルＤＥＡＥトヨパール５５０（トーソー社製）、アンバ
ーライト系の陰イオン交換樹脂（オルガノ社販売）キト
パール系の陰イオン交換樹脂（富士紡績社製）等の陰イ
オン交換基を有する物質を添加かくはん後除去したり、
あるいはこれらを充てんしたカラムにフコース硫酸含有
多糖を含む溶液を通過させればこの反応性の強い着色性
物質は容易に除去できる。但し、陰イオン交換樹脂の場
合フコース硫酸含有多糖も結合し得るので、着色性物質
を吸着させる時に塩濃度を２Ｍ程度にしておくことが好
ましい。
【００６３】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは例え
ば実施例６に記載のように調製することができる。以
下、このフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質を示
すが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはこの例に限
定されるものではない。
【００６４】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、及び
実施例８で得た本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各
塩化ナトリウム濃度における、過剰量の塩化セチルピリ
ジニウム存在下における沈殿形成性を図１に示す。
【００６５】図１の縦軸は沈殿形成率（％）を示し、横
軸は塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。図中、実線及び
白丸は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナト
リウム濃度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三
角は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリ
ウム濃度（Ｍ）での沈殿形成率を示す。
【００６６】沈殿形成率の測定は、溶液温度３７℃に
て、以下のように行った。本発明のフコース硫酸含有多
糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれ２％の
濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、これらを
様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナト
リウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ溶液を各１２５μｌずつ調製した。
次に、塩化セチルピリジニウムを２．５％の濃度で水及
び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合するこ
とにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した１．２
５％の塩化セチルピリジニウム溶液を調製した。
【００６７】水に溶解している２％の本発明のフコース
硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．
２５％の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿させるに
は容量で３．２倍必要であった。そこで、各濃度の塩化
ナトリウムに溶解した２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各１２５μｌに対して
各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解した塩化セチルピリ
ジニウム溶液を４００μｌ添加後、充分かくはんし、３
０分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−
硫酸法〔アナリティカル ケミストリー（Analytical C
hemistry) 、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕によ
り測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸
含有多糖の沈殿形成率を算出した。
【００６８】得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｕの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過
法により求めたところ、約１９万を中心とした分子量分
布を示した（図２参照）。なお、図２において、縦軸は
フェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４
８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバ
ーを示す。
【００６９】なお、ゲルろ過の条件を下記に示す。 カラムサイズ：３．０８×１６２．５ｃｍ 溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノール
を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０） 流速：１．５ｍｌ／分 サンプル濃度：０．２５％ サンプル液量：２０ｍｌ 分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社
製）
【００７０】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｕの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の
記載に従いフコース量を定量した。
【００７１】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ
の乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、
１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ（GlycoTAG) 及びグライコタッグ
リージェント キット（GlycoTAG Reagent Kit) （共に
宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元
性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、Ｈ
ＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの
条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ：宝酒造社製） 溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃
【００７２】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
【００７３】次に、バイオケミカル ジャーナル（Bioc
hemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）
の記載に従い硫酸含量を定量した。
【００７４】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｕの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトー
ス、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸で
あった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかっ
た。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクト
ース：ウロン酸：硫酸基はモル比で約１０：７：４：
５：２０であった。
【００７５】次に、フコース硫酸含有多糖−Ｕのカルシ
ウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計
ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社製）により
測定したところ図３に示すスペクトルが得られた。な
お、図３において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃ
ｍ−１）を示す。
【００７６】次に、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
のカルシウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核
磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本
電子社製）により測定したところ図４に示すスペクトル
が得られた。
【００７７】図４中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、 １Ｈ−ＮＭＲで
の化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐ
ｍとして表した。１ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．２７（マンノースの１位のＨ）、５．０７（フコ
ースの１位のＨ）、４．４９（フコースの３位のＨ）、
４．３７（グルクロン酸の１位のＨ）、４．０４（フコ
ースの４位のＨ）、３．８２（フコースの２位のＨ）、
３．５４（グルクロン酸の３位のＨ）、３．２８（グル
クロン酸の２位のＨ）、１．０９（フコースの５位のＣ
Ｈ３ のＨ）
【００７８】この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの
凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−
３００（堀場製作所製）により測定したところ、−５
３．６度であった。
【００７９】本発明者らは、以下に述べるごとく得られ
た本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの構造を決定し
た。
【００８０】フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力
を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｕの分
解及び分解物の精製精製したフコース硫酸含有多糖−Ｕ
に下記のエンド型フコイダン分解酵素を作用させ分解物
の精製を行った。
【００８１】すなわち、１％のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ
／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合
し、２５℃で４８時間反応させた。反応の進行と共に２
３０ｎｍの吸光度が増加することを確認し、本酵素によ
りフコース硫酸含有多糖−Ｕが分解されていることが判
明した。この反応液をマイクロアシライザーＧ３（旭化
成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦに
より３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に分離精製
した。
【００８２】なお、上記のエンド型フコイダン分解酵素
は以下の方法により調製される。
【００８３】該エンド型フコイダン分解酵素の生産に用
いる菌株としては、該エンド型フコイダン分解酵素生産
能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体
例としては例えば、フラボバクテリウム（Flavobacteri
um）ｓｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２）が挙げられる。
【００８４】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。 １．フラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２株 ａ．形態的性質 （１）本菌は短かん菌である。 幅 ０．８〜１．０μｍ 長さ １．０〜１．２μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 ３７℃以下で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８
℃である。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）ウレアーゼ 弱陽性 （６）酸の生成 Ｄ−グルコース 陽性 ラクトース 陽性 マルトース 陽性 Ｄ−マンニトール 陽性 スクロース 陰性 トレハロース 陰性 （７）加水分解 デンプン 陰性 ゼラチン 陽性 カゼイン 陰性 エスクリン 陽性 （８）硝酸塩の還元 陰性 （９）インドールの生成 陰性 （１０）硫化水素の生成 陰性 （１１）ミルクの凝固 陰性 （１２）ナトリウムの要求性 陽性 （１３）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （１４）キノン系 メナキノン６ （１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ３２％ （１６）ＯＦ−テスト Ｏ （１７）集落の色調 黄色系 （１８）運動性 なし （１９）滑走性 なし
【００８５】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology) 、第１巻（１９８
４）、及びバージーズ マニュアル オブ ディターミ
ネイティブ バクテリオロジー (Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology)、第９巻（１９９４）に記
載のフラボバクテリウム アクアタイル（Flavobacteri
um aquatile)、及びフラボバクテリウム メニンゴセプ
チカム（Flavobacterium meningosepticum) の類縁細菌
と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形
成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを
分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが
陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できな
い点、３７℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株
をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバ
クテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２と命名した。
【００８６】なお、上記菌株は Flavobacterium ｓｐ．
ＳＡ−００８２と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よ
りＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−５４０２（国際寄託への移管請求日： 平成８年２
月１５日）として寄託されている。
【００８７】本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌
株が利用し、エンド型フコイダン分解酵素を生産するも
のであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海
藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニト
ール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラク
トース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母
エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が
適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩
類を加えてもよい。
【００８８】本エンド型フコイダン分解酵素の生産菌を
培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、
一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜
９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で本エンド
型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条
件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本エンド型フコ
イダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するの
は当然のことである。
【００８９】本エンド型フコイダン分解酵素は菌体中に
も培養物上清中にも存在する。
【００９０】上記のフラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ
−００８２株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、
通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理など
で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【００９１】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本エンド型フコイダン
分解酵素を得ることができる。
【００９２】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在する
ので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製すること
ができる。
【００９３】エンド型フコイダン分解酵素の精製例を示
す。
【００９４】フラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００
８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）をグルコース０．２
５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む
人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５から
なる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２
０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２
４時間培養して種培養液とした。グルコース０．２５
％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％、及び消
泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工
海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる
培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメン
ターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の
種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分
１０リットルの通気量と毎分１２５回転のかくはん速度
の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して
菌体を得た。
【００９５】この菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０
ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超
音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体
抽出液中の本エンド型フコイダン分解酵素の活性を測定
したところ、培地１ｍｌ中に５ｍＵの活性が検出され
た。
【００９６】本抽出液に、終濃度が９０％飽和となるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離
し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５
０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で充分透析した。透析により生じた沈殿を遠
心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む
２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、
吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、５０ｍＭから６００
ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を
集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように
食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファ
ロースＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝
液で充分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントに
より溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を
限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１
０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル Ｓ−３
００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分
子量をセファクリル Ｓ−３００の保持時間から求めた
ところ約４６万であった。次にこの活性画分を２５０ｍ
Ｍの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透
析した。この酵素液を、あらかじめ２５０ｍＭの食塩を
含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したモ
ノ（Mono）Ｑ ＨＲ５／５のカラムに吸着させ、吸着物
を同緩衝液で充分洗浄後、２５０ｍＭから４５０ｍＭの
食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集め、
精製酵素を得た。以上の精製工程を表１に示す。
【００９７】
【表１】
【００９８】本酵素の活性測定は下記の様に行う。
【００９９】２．５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶
液５０μｌと、１０μｌの本酵素と、６０μｌの６６７
ｍＭ塩化ナトリウムを含む８３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ
７．５を混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液
１０５μｌと水２ｍｌを混合かくはんし、その２３０ｎ
ｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定する。対照として、本
酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみを
用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン
溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意
し、それぞれ同様に吸光度を測定する（ＡＢ１及びＡＢ
２）。
【０１００】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのマンノースとウロン酸の間のグリコシ
ド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結
合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミ
リモル分子吸光係数を５．５として計算し行う。なお、
酵素の活性は下記式により求める。 （ＡＴ−ＡＢ１−ＡＢ２）×２．１０５×１２０／５．
５×１０５×０．０１×１８０＝Ｕ／ｍｌ ２．１０５：吸光度を測定するサンプルの液量（ｍｌ） １２０：酵素反応液の液量（μｌ） ５．５：不飽和ウロン酸の２３０ｎｍにおけるミリモル
分子吸光係数（／ｍＭ） １０５：希釈に用いる反応液の液量（μｌ） ０．０１：酵素液量（ｍｌ） １８０：反応時間（分）
【０１０１】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍ
ｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。
【０１０２】なお基質のガゴメ昆布由来のフコイダンは
次の様に調製した。
【０１０３】乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈
良機械製作所製）により粉砕し、１０倍量の８５％メタ
ノール中で７０℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を１０
倍量のメタノール中で７０℃、２時間処理し、ろ過す
る。残渣に２０倍量の水を加え、１００℃、３時間処理
しろ過により抽出液を得る。抽出液の塩濃度を４００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジ
ニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離する。その沈殿を、エタノールで充分洗浄
し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できた
ら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）（アミコ
ン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じ
た沈殿を遠心分離により除去する。この上清を凍結乾燥
して精製ガゴメ昆布フコイダンを得る。
【０１０４】酵素反応生成物の構造解析上記のエンド型
フコイダン分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕ中に
存在するＤ−マンノースとＤ−グルクロン酸の間のα１
→４結合を脱離的に分解する酵素であり、得られたフコ
ース硫酸含有多糖−Ｕに作用させると下記式（Ｉ）、
（II）、及び（III）の構造を有するオリゴ糖が生成し
た。
【化７】
【化８】
【化９】
【０１０５】以下、詳細に説明する。
【０１０６】上記のＤＥＡＥ−セファロースＦＦで分離
精製した３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）をそれ
ぞれ一部だけグライコタッグ及びグライコタッグ リー
ジェント キットを用いて還元性末端を、ピリジル−
（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、各ＰＡ化糖（ＰＡ−
ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）を得た。（ＰＡ
−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）をＨＰＬＣに
より分析した。
【０１０７】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。
【０１０８】（ア）分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ
分析 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＳＨＯＤＥＸ ＳＢ−８０３(４．６×２５０
ｍｍ)（昭和電工社製） 溶離液：０．２Ｍ塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシ
ド＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：５０℃
【０１０９】（イ）逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：Ｌ−カラム（４．６×２５０ｍｍ）〔（財）化
学薬品検査協会〕 溶離液：５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．
５） 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：４０℃
【０１１０】図５、６、及び７には各々ピリジル−
（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−
ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）のＨＰＬＣの各溶出パターンを
示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間
（分）を示す。
【０１１１】下記に式（Ｉ）、式（II）、及び式（II
I）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、及び
（ｃ）の物性を示す。
【０１１２】図８に（ａ）の、図９に（ｂ）の、図１０
に（ｃ）のマスのスペクトルを示し、図１１に（ａ）
の、図１２に（ｂ）の、図１３に（ｃ）のマスマスのス
ペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、
横軸はｍ／ｚ値を示す。
【０１１３】更に図１４は（ａ）の、図１５は（ｂ）
の、図１６は（ｃ）の １Ｈ−ＮＨＲスペクトルを示
し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シ
フト値（ｐｐｍ）を示す。
【０１１４】なお、 １Ｈ−ＮＨＲでの化学シフト値は
ＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。
【０１１５】（ａ）の物性 分子量 ５６４ ＭＳ ｍ／ｚ ５６３〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１５７
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、
１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕−、２２５
〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、２４３
〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３１９〔不飽和Ｄ
−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ
２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルク
ロン酸−Ｈ ＋ 〕− 、４８３〔Ｍ−ＳＯ３ −
Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４″−Ｈ）、
５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１−Ｈ）、５．
１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．０
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，３′−
Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１２
（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ
＝３．７，５．８Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．８６（１Ｈ，
ｍ，３−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．０，
１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，４−
Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７０（２
Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．６５（１Ｈ，ｄ
−ｄ，Ｊ＝５．８，６．１Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０８
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
マンノース＝１：１：１（各１分子） 硫酸塩 １分子（Ｌ−フコースの３位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（IV）の通りである。
【化１０】
【０１１６】（ｂ）の物性 分子量 ７２４ ＭＳ ｍ／ｚ ７２３〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− 、３６１〔Ｍ
−２Ｈ＋ 〕２− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１７５
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕− 、２４３〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３２１〔Ｍ−ＳＯ３
−２Ｈ＋〕２−、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸
−２ＳＯ３−Ｈ＋ 〕− 、４１７（Ｍ−Ｌ−フコース
−２ＳＯ３ −Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、
５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１″−Ｈ）、
５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，′−Ｈ）、５．
２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．５
０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３２
（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．４Ｈｚ，２′−
Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈ
ｚ，３″−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１．
８，１１．０Ｈｚ，５−ＣＨのＨ）、４．１５（１Ｈ，
ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝
５．８，１１．０Ｈｚ、５−ＣＨのＨ）、３．９９（１
Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、
３．９０（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，
３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）３．５４（１
Ｈ，ｂｒ−ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１１
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
マンノース＝１：１：１（各１分子） 硫酸塩 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マ
ンノースの６位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（Ｖ）の通りである。
【化１１】
【０１１７】（ｃ）の物性 分子量 １１２８ ＭＳ ｍ／ｚ １１２７〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１７５
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕− 、２２５〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、２４３〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３７１〔Ｍ−不飽和Ｄ
−グルクロン酸−Ｌ−フコース−ＳＯ３ −２Ｈ＋ 〕
２−、４０５〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが
結合したもの−Ｈ＋ 〕− 、７２１〔Ｍ−Ｄ−マンノ
ース−Ｌ−フコース−ＳＯ３ −Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−
Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｓ，（１）−Ｈ）、５．１６
（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．
０Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ−
ｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．４７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，（３）′
−Ｈ）、４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１″−
Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（２）−Ｈ）、４．
１４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，
（３）″−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、
４．１２（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．０４（１
Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｍ，（４）′−
Ｈ），３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８５（１
Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−
Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７３
（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，５−
Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．７０
（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．７０（２
Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．６７（１
Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，４″−
Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６２
（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
８．９Ｈｚ，３″−Ｈ）、３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３ のＨ３ ）、１．０７
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−
フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルク
ロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子） 硫酸塩 ２分子（各Ｌ−フコースの３位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（VI）の通りである。
【化１２】
【０１１８】得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに上記
エンド型フコイダン分解酵素を作用させると反応の進行
と共に脱離反応が起こって２３０ｎｍの吸光度が増加す
るが、脱離反応の生成物となる不飽和ヘキスロン酸基が
主要反応生成物のすべてにあることから得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕの分子内にヘキスロン酸とマンノー
スが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られた
フコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖の多くはフコースで
あるためフコース硫酸含有多糖−Ｕは一般の多糖より酸
に分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結
合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らは
ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存
在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している
糖鎖中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカー
ボハイドレート リサーチ、第１２５巻、第２８３〜２
９０頁（１９８４）の方法を参考にして、まずフコース
硫酸含有多糖混合物を０．３Ｍのシュウ酸に溶解し１０
０℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が３
０００以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により
吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後４Ｎの塩酸で酸
加水分解し、ｐＨ８に調整後、ＰＡ化し、ＨＰＬＣによ
りウロン酸の分析を行った。なおＨＰＬＣの条件は下記
によった。
【０１１９】装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＮ（４．６ｍｍ×２５０ｍ
ｍ）（宝酒造社製） 溶離液：２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：０．８ｍｌ／分 カラム温度：４０℃
【０１２０】なお、ＰＡ化ヘキスロン酸の標準物質はグ
ルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社
製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェ
リルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロ
ン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィ
カ（Acta Chemica Scandinavica)、第１５巻、第１３９
７〜１３９８頁（１９６１）記載の方法に従い、和光純
薬社製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分
離したものをＰＡ化することにより得た。
【０１２１】この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合
物の糖鎖中に含まれるヘキスロン酸はグルクロン酸のみ
であることが判明した。
【０１２２】更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン
酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍
結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグ
ルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。
【０１２３】また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有
多糖混合物をあらかじめ上記のエンド型フコイダン分解
酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で
酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース
が交互に結合したポリマーは検出されなかった。このこ
とから、上記のエンド型フコイダン分解酵素が脱離反応
により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造はＤ−
グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を
持つことが判明した。
【０１２４】更に、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース
のそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック
配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマ
ーをＮＭＲ分析した。
【０１２５】ポリマーのＮＭＲの測定結果を以下に示
す。但し、 １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はトリエチ
ルアミンのメチル基の化学シフト値を１．１３ｐｐｍ
に、１３Ｃ−ＮＭＲではトリエチルアミンのメチル基の
化学シフト値を９．３２ｐｐｍとして表した。
【０１２６】１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．２５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．３２（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．００（１
Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、３．７１（１Ｈ，ｍ，５′−
Ｈ）、３．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６８
（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ
のＨ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、３．５７
（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，３′−
Ｈ）、３．５３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．２５（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、２′−Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ
（Ｄ２ Ｏ） δ１７５．３（５′−ＣＯＯＨのＣ）、１０２．５
（１′−Ｃ）、９９．６（１−Ｃ）、７８．５（２−
Ｃ）、７７．９（４′−Ｃ）、７７．０（３′−Ｃ）、
７６．７（５′−Ｃ）、７３．９（５−Ｃ）、７３．７
（２′−Ｃ）、７０．６（３−Ｃ）、６７．４（４−
Ｃ）、６１．０（５−ＣＨ２ ＯＨのＣ） なお、ピークの帰属の番号は下記式（VII）の通りであ
る：
【化１３】
【０１２７】Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はその
ビシナル結合定数が７．６Ｈｚであることからβ−Ｄ−
グルクロン酸であると決定した。
【０１２８】また、マンノースの１位の立体配置はその
化学シフト値から５．２５ｐｐｍであることからα−Ｄ
−マンノースであると決定した。
【０１２９】構成糖の結合様式は １Ｈ検出異種核検出
法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。
【０１３０】１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ
法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨ
ＳＱＣ法を用いた。
【０１３１】ＨＭＢＣスペクトルにより１−Ｈと４′−
Ｃの間及び４′−Ｈと１−Ｃの間、１′−Ｈと２−Ｃの
間及び２−Ｈと１′−Ｃの間にそれぞれクロスピークが
認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合で
Ｄ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ
−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明
らかとなった。
【０１３２】上記の結果を考え併せると、（ａ）は、還
元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロ
ン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造
を持つこと、（ｂ）は硫酸基が結合した還元末端残基で
あるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、２個
の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つ
こと、（ｃ）は還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ
−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結
合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合
し、更にそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸
と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持
つことが判明した。
【０１３３】以上、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ
は、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合し
た構造を持ち、少なくとも１つ以上のＤ−マンノースに
Ｌ−フコースが結合している構造を有する。
【０１３４】また、下記一般式（VIII）で表される部分
構造を有する（但し、式中の少なくとも１つのアルコー
ル性水酸基は硫酸エステル化しており、またｎは１以上
の整数を表す）。
【化１４】
【０１３５】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｆと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Ｕが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
は構成糖としてウロン酸を含有し、フラボバクテリウム
ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、
少なくとも上記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される
化合物より選択される１種以上の化合物が生成する。そ
の分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸
含有多糖−Ｕをなんら限定するものではなく、任意の分
子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｕを調製す
ることができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコー
ス硫酸含有多糖を提供することができる。
【０１３６】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆの有する強い抗凝血活性を有さ
ず、抗凝血活性を実質上示さないフコース硫酸含有多糖
が提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは純
化されたフコース硫酸含有多糖として制がん剤、抗転移
剤、発がん予防剤等に使用でき、また抗フコース硫酸含
有多糖抗体の抗原としても有用である。更にこのフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕより、上記式（Ｉ）、（II）、（II
I）等の構造を有するオリゴ糖が製造でき、これらの新
規化合物の製造にも有用である。
【０１３７】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ及
びその製造方法について記載する。本発明の方法を用い
て本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際には
フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解
酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよ
く、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多
糖−Ｕを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素
はフコース硫酸含有多糖−Ｕを選択的に分解できる酵素
であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例え
ば、フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ． Ｓ
Ａ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）が生産す
る上記のエンド型フコイダン分解酵素が挙げられる。
【０１３８】本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利
に進むように基質濃度や温度、ｐＨ等を設定すればよい
が、基質濃度は通常０．１から１０％程度、温度は２０
から４０℃付近、ｐＨは６から９付近が望ましい。
【０１３９】また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地
に添加し、フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を
有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養
し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物
はフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分
解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよ
いが、具体的には上記記載のフラボバクテリウム ｓ
ｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）
又はフコイダノバクター マリナス（Fucoidanobacter
marinus) ＳＩ−００９８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
３）が挙げられる。
【０１４０】培地に加える栄養源は使用する菌株が利用
し、該分解酵素を生産するものであればよく、炭素源と
しては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコ
ース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッ
カロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用
でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミ
ノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、
硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナト
リウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜
鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。
【０１４１】また、培養条件は使用する菌株、培地組成
等に応じ、フコース硫酸含有多糖−Ｕの分解活性が最大
になるように設定するのはもちろんのことであるが、一
般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９で、
５〜７２時間の通気かくはん培養を行えばよい。培養終
了後、低分子化したフコース硫酸含有多糖−Ｕや培地中
のフコース硫酸含有多糖−Ｆ以外の成分は限外ろ過など
で除去すればよい。
【０１４２】なお、上記のフコイダノバクター マリナ
スＳＩ−００９８株は、青森県の海水中より本発明者ら
が新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通
りである。 １．フコイダノバクター マリナス ＳＩ−００９８ ａ．形態的性質 （１）本菌は双球菌（短かん菌）である。 幅 ０．５〜０．７μｍ 長さ ０．５〜０．７μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 ３７℃で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陰性 （５）ウレアーゼ 陰性 （６）加水分解 デンプン 陽性 ゼラチン 陰性 カゼイン 陰性 エスクリン 陽性 （７）硝酸塩の還元 陰性 （８）インドールの生成 陰性 （９) 硫化水素の生成 陽性 （10) ミルクの凝固 陰性 （11）ナトリウムの要求性 陽性 （12）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （13）キノン系 メナキノン７ （14）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ６１％ （15）細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性 （16）グリコリル試験 陰性 （17）ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性 （18）ＯＦ−テスト Ｏ （19）集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず （20）運動性 あり （21）滑走性 なし （22）鞭毛 極単毛
【０１４３】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
ディターミネイティブ バクテリオロジー、第９巻
（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グ
ラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかし
ながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、Ｇ
Ｃ含量が６１％の点でグループ４に属する菌と大いに異
なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノ
ンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。
【０１４４】グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム
属及びシトファーガ（Cytophaga)属は例外的に電子伝達
鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細
菌のＧＣ含量は、土壌細菌であるシトファーガ アーベ
ンシコラ（Cytophaga arvensicola)が４３〜４６％、海
洋細菌であるシトファーガ ジフルエンス（Cytophaga
diffluens)、シトファーガ ファーメンタンス（Cytoph
aga fermentans) 、シトファーガ マリーナ（Cytophag
a marina) 、及びシトファーガ ウリギノーサ（Cytoph
ags uliginosa)が４２％であり、本菌株の性質とは全く
異なる。更に、本菌株と既同定株の１６ＳｒＤＮＡ配列
の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株
ベルコミクロビウム スピノサム（Verrucomicrobium s
pinosum)においてもその相同性は、７６．６％であっ
た。１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性が９０％以下の場合、
両細菌の属が異なることは一般に広く知られていること
から、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属
の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバク
ター マリナス ＳＩ−００９８と命名した。
【０１４５】なお上記菌株は Fucoidanobacter marinus
ＳＩ−００９８と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よ
りＦＥＲＭ Ｐ−１４８７３として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−５４０３（国際寄託への移管請求日： 平成８年２
月１５日）として寄託されている。
【０１４６】本発明者らは前述のように０．６〜３Ｍの
１種類又は２種類以上の塩類の存在下で本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性
多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことも見出し
た。
【０１４７】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｆを分離することができる。
【０１４８】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６
〜３Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こう
して塩濃度を調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸
性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、沈殿を集めると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が得られる。
【０１４９】しかし上記塩濃度を２Ｍ超にすると本発明
のフコース硫酸含有多糖−Ｆが塩化セチルピリジニウム
により沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖
−Ｕを分離する目的では通常１．５Ｍ程度の塩濃度で目
的は達成できる（図１の説明参照）。
【０１５０】次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿
中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗
い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを得る。
こうして得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。
【０１５１】本発明者らは、前述の様にフコース硫酸含
有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオ
ンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸
含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良
くなることも見出している。すなわち、本発明の方法を
用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際
には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオ
ン源となる薬品を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次
に、陰イオン交換樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１
ｍＭ以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖
混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化し
た液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェン
トによりフコース硫酸含有多糖−Ｆを溶出させる。本方
法を用いる場合、添加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ
以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽イオン源
となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果
が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。
【０１５２】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは例え
ば実施例８に記載のように得ることができる。以下、こ
のフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆはこの例に限定されるも
のでは無い。
【０１５３】得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子
量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により
求めたところ、約１９万を中心とした分子量分布を示し
た（図１７参照）。なお、図１７において、縦軸はフェ
ノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０
ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバーを
示す。
【０１５４】また、ゲルろ過の条件を下記に示す。 カラムサイズ： ３．０８×１６２．５ｃｍ 溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノール
を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０） 流速：１．５ｍｌ／分 サンプル濃度：０．２５％ サンプル液量：２０ｍｌ 分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社
製）
【０１５５】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｆの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の
記載に従いフコース量を定量した。
【０１５６】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、
１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ及びグライコタッグ リージェント
キットを用いて加水分解して得られた単糖の還元性末
端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬ
Ｃにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件
は下記によった。
【０１５７】装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ） 溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励
起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃
【０１５８】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。
【０１５９】次に、バイオケミカル ジャーナル（Bioc
hemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）
の記載に従い硫酸含量を定量した。
【０１６０】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｆの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル
比は約１０：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖
は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫
酸基のモル比は約１：２であった。
【０１６１】１％のフコイダン−Ｆ溶液１６ｍｌと、５
０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの
塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの前出のフラボ
バクテリウムｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素溶液８
ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応によ
る分解物の生成は認められず、その低分子化も認められ
なかった。
【０１６２】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
のカルシウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分
光光度計 ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社
製）により測定したところ図１８に示すスペクトルが得
られた。なお、図１８において縦軸は透過率（％）、横
軸は波数（ｃｍ−１）を示す。
【０１６３】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
のナトリウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核
磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本
電子社製）により測定したところ、図１９に示すスペク
トルが得られた。
【０１６４】図１９中、縦軸はシグナルの強度、横軸は
化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、 １Ｈ−ＮＭＲ
での化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐ
ｐｍとして表した。１ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） ５．３０（フコースの１位のＨ）、１．１９（フコース
の５位のＣＨ３のＨ）
【０１６５】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ
−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−１
３５度であった。
【０１６６】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｕと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Ｆが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
は構成糖としてウロン酸を実質的に含有せず、フラボバ
クテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分
子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成は本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆをなんら限定するもので
はなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有
多糖−Ｆを調製することができ、糖組成、還元末端等の
理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース
硫酸含有多糖−Ｆを提供することができる。
【０１６７】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは、実
質上抗凝血活性を有さないフコース硫酸含有多糖−Ｕと
分離しているため、強い抗凝血活性を有しており、該フ
コース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又はその分解物は純化さ
れたフコース硫酸含有多糖として抗凝血剤に使用でき、
また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用で
ある。
【０１６８】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物をがん細胞の培養液に１μｇ／ｍｌ以上の濃度で添加
すれば、添加後１日から数日で癌細胞はアポトーシスを
起こす。すなわち、本発明のフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物は強いアポトーシス誘発作用を有する。なお、
これらの物質は正常細胞にはアポトーシスを誘発せず、
毒性も示さない。特に、食用褐藻植物、ナマコ由来のフ
コース硫酸含有多糖、その分解物は安全性が高い。
【０１６９】本発明のアポトーシス誘発剤を製剤化する
には、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有
効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せればよ
い。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／
又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の
担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化
剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤
等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤
等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とするこ
とができる。またこれを使用前に適当な担体を添加する
ことにより液状となし得る乾燥品とすることができる。
【０１７０】本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤、
あるいは注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっ
ても投与することができる。
【０１７１】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデン
プン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセル
ロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また
経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活
性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等
を配合することもできる。これらの具体例としては、以
下に示す物が挙げられる。 （結合剤）デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、
ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロ
キシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。 （崩壊剤）デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロー
ス、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。 （界面活性剤）ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチ
ン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０。 （潤沢剤）タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン
酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレ
ングリコール。 （流動性促進剤）軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウ
ム。
【０１７２】また、経口用の液剤としては、懸濁液、エ
マルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることが
でき、これらの各種剤型には矯味、矯臭剤、着色剤を配
合してもよい。
【０１７３】一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発
明の有効成分であるフコース硫酸含有多糖及び／又はそ
の分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、
ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ
油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、
必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を
加えることにより調製される。
【０１７４】本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態
に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に
限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。
注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与
し得、外用剤には座剤等も包含される。
【０１７５】本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、
その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用され
る患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定
ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が
成人１日当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２０
０ｍｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって
変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合も
あるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。
【０１７６】制がん作用を有する、本発明のフコース硫
酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又は
その分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と
組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。
制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一
般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はそ
の分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と
配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝
剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加え
て、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形
剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができ
る。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状
となし得る乾燥品とすることができる。
【０１７７】制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点
滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することが
できる。
【０１７８】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。
【０１７９】制がん剤としては、製剤形態に応じた適当
な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、
内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例
えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤
には座剤等も包含される。
【０１８０】制がん剤としての投与量は、その製剤形
態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年
齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが
一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当
り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇであ
る。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するの
で、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あ
るいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤は
そのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日
常的に摂取させることもできる。
【０１８１】発がん抑制作用を有する、フコース硫酸含
有多糖及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公
知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば発がん予防剤を製
造することができる。発がん予防剤の製造は上記方法に
準じ行うことができる。一般的には、フコース硫酸含有
多糖及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又
は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散
剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊
剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、
カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液
剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体
の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができ
る。
【０１８２】発がん予防剤としては、経口剤や、注射
剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与する
ことができる。
【０１８３】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。
【０１８４】発がん予防剤としては、製剤形態に応じた
適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はな
く、内用、外用及び注射によることができる。注射剤
は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、
外用剤には座剤等も包含される。
【０１８５】発がん予防剤としての投与量は、その製剤
形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の
年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではない
が一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日
当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇで
ある。もちろん投与量は、種々の条件によって変動する
ので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、
あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤
はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して
日常的に摂取させることもできる。
【０１８６】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物は天然由来物質であり、マウスに経口投与を行っても
毒性は認められない。
【０１８７】本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又
は昂進あるいはがん疾患、ウイルス性疾患等の治療剤と
して用いることが期待される。発がん予防剤として健康
保持に使用することができる。また本発明のアポトーシ
ス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウ
イルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害
剤の開発等に有用である。特に、食用褐藻植物、食用ナ
マコから、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物
を調製すれば、これらは食品として長い歴史を有するも
のであり、これらから調製したフコース硫酸含有多糖、
その分解物は、経口投与の場合において、極めて安全性
の高いものである。
【０１８８】次にフコース硫酸含有多糖は極めて分子量
が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用い
るより、抗原性、均一性、抗凝血活性などの改善のた
め、フコース硫酸含有多糖をある程度分解することが必
要とされているが、本発明により、フコース硫酸含有多
糖−Ｆのみを選択的に分解する酵素、該酵素を作用させ
て得られるフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物が提
供された。
【０１８９】本発明に使用される菌株としては、アルテ
ロモナス（Alteromonas）属細菌に属し、本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株
であればいかなる菌株でもよい。また、該エンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株の具体例
としては、例えば、アルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１
００９株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖に作用さ
せれば、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化
物を得ることができる。
【０１９０】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。 ａ．形態的性質 （１）本菌はかん菌である。 幅 約１μｍ 長さ 約２μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 好適な生育温度は１５−３０℃である。４℃あるいは４
０℃では生育できない。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）リパーゼ 陽性 （６）資化性 グルコース 陽性 マンノース 陰性 スクロース 陽性 ラクトース 陰性 セロビオース 陽性 メリビオース 陰性 マンニトール 陽性 グリセリン 陽性 メタノール 陰性 ＤＬ−リンゴ酸 陰性 コハク酸 陰性 フマル酸 陰性 クエン酸 陰性 サリシン 陰性 （７）加水分解 デンプン 陰性 ゼラチン 陰性 （８）硝酸塩の還元 陰性 （９）脱窒反応 陰性 （１０）アルギン酸の分解 陽性 （１１）β−ヒドロキシ酪酸の利用 陰性 （１２）ポリヒドロキシ酪酸の蓄積 陰性 （１３）ナトリウムの要求性 陽性 （１４）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （１５）キノン系 ユビキノン８ （１６）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ３６％ （１７）ＯＦ−テスト Ｏ （１８）集落の色調 特徴的色素を生成せず （１９）発光性 陰性 （２０）運動性 陽性 （２１）鞭毛 極単毛
【０１９１】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー、第１巻、第
３４３〜３５２頁（１９８４）、及びバージーズ マニ
ュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジ
ー、第９巻、第７５頁、第１３２〜１３３頁（１９９
４）に記載されているアルテロモナス属細菌と同定し
た。しかしながら、本細菌の生理的性状は文献に記載さ
れているいずれの菌種とも一致せずＧＣ含量も低い値で
あった。そこで、本菌株をアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ
−１００９と命名した。
【０１９２】なお上記菌株はAlteromonas ｓｐ． ＳＮ
−１００９と表示され、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号（郵便番号３０５）］に平成８年２月１３日よりＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５４３６として寄託され、前記通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
５７４７（国際寄託への移管請求日： 平成８年１１月
１５日）として寄託されている。
【０１９３】本発明に使用する菌株の培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、本発明のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、
アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マ
ンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース
等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、
脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。そ
の他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシ
ウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよ
い。
【０１９４】また本菌株は上記栄養源を含んだ海水ある
いは人工海水中で非常に良く生育する。
【０１９５】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件に
より変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、
培地のｐＨは６〜９がよく、５〜７２時間の通気かくは
ん培養で本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵
素の生産量は最高に達する。
【０１９６】培養条件は使用する菌株、培地組成等に応
じ、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の
生産量が最大になるように設定するのは当然のことであ
る。
【０１９７】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。
【０１９８】上記のアルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１
００９を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用
いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。
【０１９９】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を得ることができる。
【０２００】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵
素と同様の精製手段により精製することができる。
【０２０１】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。 （ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｆに作用し
て、該フコース硫酸含有多糖−Ｆを低分子化させる。 （ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すな
わちフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用しない。 （ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。 （ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式（Ｉ）、（II）、（III）より選択される少なくと
も一種以上の化合物が生成する。
【化１５】
【化１６】
【化１７】 （ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近である
（図２０）。すなわち図２０は本酵素のｐＨと相対活性
の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横
軸はｐＨを示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた曲
線であり、点線は下記（ｖ）−（２）記載のフコース硫
酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。 （iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付
近である（図２１）。すなわち図２１は、本酵素の温度
と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
（％）、横軸は温度（℃）を示す。実線は、還元性末端
をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）
を基質に用いた場合の曲線であり、点線は下記（ｖ）−
（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた
場合の曲線である。 （iv）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Seph
acryl）Ｓ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲル
ろ過法により求めたところ、約１０万であった。
【０２０２】（ｖ）酵素活性の測定方法：本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素活性の測定は次のよ
うにして行った。
【０２０３】まず、本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
及びＰＡ−ＦＦを下記（１）から（３）の工程により調
製した。
【０２０４】（１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混
合物の調製 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械
製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノー
ル中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程をさらに３
回繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残
渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理
し、ろ過により抽出液を得た。 抽出液の塩濃度を４０
０ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセ
チルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくな
るまで添加し、遠心分離した。 その沈殿を、８０％の
エタノールで繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロ
リドを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリ
ウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化
ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂
を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化
した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除
分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この
際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍
結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物
８２．２ｇを得た。
【０２０５】（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製 上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇ
を６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじ
め０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩
化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を、３．３ｇ得た。
【０２０６】（３）ＰＡ−ＦＦの調製 上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品１２ｍ
ｇを水４８０μｌに溶解し、１２μｌずつ３６本に分注
後、凍結乾燥しグライコタッグ及びグライコタッグ リ
ージェント キットを用いて還元性末端を、ＰＡ化し、
ＰＡ−ＦＦを得た。 得られたＰＡ−ＦＦを、１５ｍｌ
の１０％のメタノールを含む１０ｍＭの酢酸アンモニウ
ム溶液に溶解し、セルロファインＧＣＬ−３００のカラ
ム（４０ｘ９００ｍｍ）によりゲルろ過し、高分子画分
を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ３５００の
透析膜を用いて充分透析して脱塩し、次にエバポレータ
ーにより５ｍｌに濃縮して本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖−Ｆ分解酵素の基質用ＰＡ−ＦＦとした。ま
た、こうして得られたＰＡ−ＦＦを、市販のピリジル−
（２）−アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度
（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）と比較す
ることにより定量したところ約４０ｎｍｏｌであった。
【０２０７】上記（１）及び（２）の工程により得られ
たフコース硫酸含有多糖−Ｆを用いて本発明のエンド型
フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは
下記の要領で行った。
【０２０８】すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多
糖−Ｆ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶
液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの
５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩
衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌの本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素とを混合し、３０℃、
３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理
し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、
低分子化の程度を測定した。
【０２０９】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有
多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用
意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。
【０２１０】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル
結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合
の定量は下記式により求めた。 ｛（12 ×2.5)/(100 ×MF) ｝×｛(MF/M)-1｝×｛0.12/
(180 ×0.01) ｝＝U/ml （１２×２．５）／１００：反応系中に添加したフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ） ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量 Ｍ：反応生成物の平均分子量 （ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が酵素により切断された数 １８０：反応時間（分） ０．０１：酵素液量（ｍｌ） ０．１２：反応液総量（ｍｌ）
【０２１１】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４（８ｍｍ×３００ｍ
ｍ）（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カ
ルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８） 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃
【０２１２】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で
分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４
の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物
の分子量測定のための標準曲線とした。
【０２１３】上記（１）〜（３）の工程により得られた
ＰＡ−ＦＦを用いて本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行っ
た。
【０２１４】すなわち、８ｐｍｏｌ／μｌのＰＡ−ＦＦ
溶液２μｌと、５μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１０
μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、２３μｌの水と、５
０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸
を含む緩衝液（ｐＨ８．２）と、１０μｌの本発明のエ
ンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素とを混合し、３０
℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間
処理し、遠心分離後、８０μｌをＨＰＬＣにより分析
し、低分子化の程度を測定した。
【０２１５】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びＰＡ−ＦＦ溶液の
代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ
同様にＨＰＬＣにより分析した。
【０２１６】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖のフコシル結合
を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定
量は下記式により求めた。 16×10−６×｛（MF/M)-1 ｝×｛1/(180×0.01) ｝＝Ｕ
／ml １６ｘ１０−６：反応系中に添加したＰＡ−ＦＦ（μｍ
ｏｌ） ＭＦ：基質ＰＡ−ＦＦの平均分子量 Ｍ：反応生成物の平均分子量 （ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が酵素により切断された数 １８０：反応時間（分） ０．０１：酵素液量（ｍｌ）
【０２１７】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０３（8 mm ×300 mm）
（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０％のジメチ
ルスルホキシドを含む２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液 検出：蛍光検出器 F-1150（日立製作所製）にて励起波
長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：５０℃
【０２１８】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）をグライコタッグ及びグライコタ
ッグリージェント キットを用いて還元性末端を、ＰＡ
化し、様々な分子量のＰＡ化プルランを得た。得られた
様々な分子量のＰＡ化プルランを上記のＨＰＬＣ分析と
同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ ＳＢ
−８０３の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反
応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。
【０２１９】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。
【０２２０】本発明者らは、以下に述べるように、本発
明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の作用機作
を決定した。
【０２２１】（１）エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｆの分解及び分解物
の調製 精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆに
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用
させ、分解物の調製を行った。
【０２２２】まず、フコース硫酸含有多糖分解酵素の生
産を行った。すなわち、アルテロモナスｓｐ． ＳＮ−
１００９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を、グルコー
ス０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５
％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ
８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１
２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、
２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン
１．０％、酵母エキス０．０２％、前記のガゴメ昆布由
来のフコース硫酸含有多糖０．２％、及び消泡剤（信越
化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ
８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジ
ャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌し
た。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４
℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０
回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた
培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後
８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集
め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６０
０ｍｌの粗酵素を得た。
【０２２３】こうして得られた粗酵素のうち４０ｍｌ
と、人工海水４４ｍｌと、前記のフコース硫酸含有多糖
−Ｆ５１０ｍｇと水３６ｍｌを混合し、ｐＨを８に調整
し、２５℃で４８時間反応後、セルロファインＧＣＬ−
３００によりゲルろ過を行い、４画分に分け、分子量の
大きな方から順に、Ｆ−Ｆｄ−１（分子量２５０００
超）、Ｆ−Ｆｄ−２（分子量２５０００〜１２０００
超）、Ｆ−Ｆｄ−３（分子量１２０００〜６５００
超）、及びＦ−Ｆｄ−４（分子量６５００以下）とし
た。これらの４画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれ
ぞれ１７０ｍｇ、２７０ｍｇ、３００ｍｇ、及び３４０
ｍｇ得た。
【０２２４】フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物、
すなわち低分子化物のセルロファインＧＣＬ−３００に
よるゲルろ過の結果を図２２に示す。図２２において縦
軸は４８０ｎｍの吸光度（フェノール硫酸法による発色
量）、横軸はフラクションナンバーを示し、１フラクシ
ョン１０ｍｌである。カラムボリュームは１０７５ｍｌ
であり、溶出液は１０％のエタノールを含む０．２Ｍの
酢酸アンモニウム溶液である。
【０２２５】図２２中、白丸印はフコース硫酸含有多糖
−Ｆの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース
硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれゲルろ過した結果を表す。
【０２２６】上記セルロファインＧＣＬ−３００の結果
から、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の反応生
成物の分子量分布は約１０００〜３万程度であることが
判明した。
【０２２７】（２）酵素反応生成物の還元末端糖及び中
性糖組成の分析 上記のＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４の一部をグライコタッグ及びグライコタ
ッグ リージェント キットを用いて還元性末端をＰＡ
化し、得られた各ＰＡ化糖（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、
（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及
び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）を４規定の塩酸、１００℃、
３時間処理により加水分解し、ＨＰＬＣにより還元末端
糖を調べた。
【０２２８】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（4.6 mm× 150 mm）（宝
酒造社製） 溶離液：７００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ ９）：アセト
ニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃
【０２２９】この結果、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（Ｐ
Ａ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び
（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）の還元末端糖は総てフコースで
あった。
【０２３０】また、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−
Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の中性糖組成を下記の方法
により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有
多糖−Ｆを硫酸加水分解後グライコタッグ及びグライコ
タッグ リージェント キットを用いて構成糖の還元性
末端をＰＡ化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を
分析したときと同じＨＰＬＣ条件で分析したところ、フ
コースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立
体配位はそれぞれＬ及びＤであったので生成物に関して
もＬ−フコースとＤ−ガラクトースのみを測定した。
【０２３１】すなわち、構成糖の一つであるＤ−ガラク
トースの含量を調べるためにＦ−キット 乳糖／ガラク
トース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ社製）を用
い、説明書に従ってＤ−ガラクトースのみを測定できる
反応系を構築し、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間
加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。
【０２３２】更にもう一方の構成糖であるＬ−フコース
を定量するために、クリニカル ケミストリー（Clinic
al Chemistry)、第３６巻、第４７４〜４７６頁（１９
９０）記載の方法に従って、別に４規定の塩酸で１００
℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、
Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で
測定した。
【０２３３】以上の結果Ｌ−フコースとＤ−ガラクトー
スの比率はＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４それぞれおよそ１００：４４、１
００：２７、１００：５、及び１００：１であった。
【０２３４】以上の結果をまとめると、本発明のエンド
型フコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース硫酸含有
多糖−Ｆに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量
約１０００〜３万程度の低分子化物を生成し、その低分
子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高いこ
とが判明した。なお、低分子化物の還元性末端はすべて
Ｌ−フコースであった。
【０２３５】次に、本酵素の基質特異性を調べるために
フコース硫酸含有多糖−Ｕに本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素を作用させた。
【０２３６】すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多
糖−Ｕ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶
液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの
５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８
μｌの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
（１．６ｍＵ／ｍｌ）とを混合し、３０℃、３時間反応
させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分
離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の
程度を測定した。
【０２３７】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代わりに、本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用い
て同様の条件により反応させたものを用意し、同様にＨ
ＰＬＣにより分析した。
【０２３８】なお、ＨＰＬＣの条件は次の通りである。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４（8 mm× 300 mm）
（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カ
ルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８） 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃
【０２３９】その結果、本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕを全く低分子化
しなかった。
【０２４０】既述のように、本発明は、上記した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素と、カルシウム源とを
含有する酵素組成物に関する。
【０２４１】使用可能なカルシウム源としては、固形組
成物においては、例えば塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、酢酸カルシウムのようなカルシウム塩、酸化カルシ
ウム、水酸化カルシウム、あるいはそれらの水和物など
が挙げられる。他方、水、アルコール等の溶媒中に溶
解、懸濁、乳化させた液状組成物においては、カルシウ
ム源は、前記したような単体であっても、あるいは溶解
などによりイオン化した状態のものであってもよい。
【０２４２】これらカルシウム源は、当該酵素を賦活又
は安定化するので有効である。
【０２４３】したがって、上記酵素組成物は上記したカ
ルシウム源の作用効果を阻害しない範囲で、用途に応じ
て常用の添加剤を含有していてもよい。
【０２４４】本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素を
フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物に作用させることによ
って、フコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を調製す
ることができる。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物とし
ては、例えばフコース硫酸含有多糖−Ｆ精製品でもよ
く、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更
に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸
含有多糖−Ｆ含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、
溶解液中のフコース硫酸含有多糖濃度はその最高溶解濃
度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して
選定すればよい。
【０２４５】フコース硫酸含有多糖−Ｆ溶解液としては
水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液
のｐＨは通常中性で、酵素反応は通常３０℃付近で行
う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低
分子化物の分子量を調整することができる。
【０２４６】次に低分子化物を分子量分画することによ
って、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖−
Ｆ低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩
処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本
発明の低分子化物の乾燥品を調製することもできる。
【０２４７】
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定される
ものではない。なお、実施例における％は重量％を意味
する。
【０２４８】実施例１ ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機
（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末
を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時
間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この
残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３
回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０
リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出
液１．８リットルを凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖
標品１５．４ｇを得た。次に残りの抽出液に０．４Ｍと
なるように食塩を加え、更に５％の塩化セチルピリジニ
ウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離
により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ
食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を
３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加
し、よくかくはん後エタノールを８０％となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操
作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り
返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、
不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化
した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、
非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備
えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を
完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除
去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混
合物の重量は７６ｇであった。
【０２４９】実施例２ マ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機（奈良
機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リ
ットルの８０％エタノールに懸濁し、８０℃、２時間処
理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残
渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回
繰り返し、エタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０
リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多
糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出液に
０．４Ｍとなるように食塩を加え、更に５％の塩化セチ
ルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リット
ルの０．３Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。こ
の洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ
食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを８０％と
なるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得
た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離
するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０に
なるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リット
ルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食
塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん
後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食
塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
カラムにかけ、非吸着分を排除分子量１０万以下のホロ
ファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性
物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により
不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース
硫酸含有多糖混合物の重量は５２ｇであった。
【０２５０】実施例３ マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出 マ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製
作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットル
の８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。
処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して
上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエ
タノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの
０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間
処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カ
ルシウム溶液で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖
混合物の抽出液３６リットルを得た。
【０２５１】実施例４ マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の調製 実施例３で得られたろ液に、５％の塩化セチルピリジニ
ウムを、それ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分
離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．３
Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作
を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添
加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作
を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返
した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化し
た１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非
吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備え
た限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完
全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去
し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合
物の重量は５２ｇであった。また、このフコース硫酸含
有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含
まなかった。
【０２５２】実施例５ 実施例４記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化
ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を
０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カル
シウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分に
洗浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエ
ントで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化
マグネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫
酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食
塩で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸
含有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムに
おいても、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕは実質的に分離された。
【０２５３】実施例６ ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機
械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リッ
トルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットル
の０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時
間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。このろ液を排
除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器によ
り２リットルに濃縮し、次に、終濃度が１．５Ｍとなる
ように食塩を添加し５％の塩化セチルピリジニウムをこ
れ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を
遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過によ
り１リットルに濃縮し、４リットルのエタノールを添加
し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に１
００ｍｌの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノー
ルを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離に
より沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁
し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸
光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩
水２リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、２Ｍの食塩水で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セ
ルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、
かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を
２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下
のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、
着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過
により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥し
たフコース硫酸含有多糖−Ｕの重量は１５ｇであった。
また、この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは多糖性
の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこの
フコース硫酸含有多糖−Ｕは、前記エンド型フコイダン
分解酵素を作用させると上記式（Ｉ）、（II）、及び
（III）で表されるオリゴ糖を生じた。
【０２５４】実施例７ ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機
械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リッ
トルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットル
の０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時
間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。得られたろ液
に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じ
なくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この
沈殿を３リットルの０．４Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離
し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に
１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノ
ールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離
により沈澱を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸
濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの
吸光度を０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食
塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−
セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加
し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ
液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万
以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過
し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及び
ろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾
燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は９０ｇであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖混合物は多糖性の
樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。 このフコ
ース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を７ｇ秤量し、
０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解した。次に、４０００
ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを０．２Ｍ
の塩化カルシウムで平衡化した。０．２Ｍの塩化カルシ
ウムに溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をＤＥＡＥ
−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カ
ルシウムで充分洗浄し、次に、０〜４Ｍの塩化ナトリウ
ムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内塩化ナト
リウム濃度が０．０５〜０．８Ｍの画分を集め透析によ
り脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖−
Ｆと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｕを２．１ｇ得
た。また、上記溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が０．
９〜１．５Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥
し、実質的にフコース硫酸含有多糖−Ｕと分離されたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆを４．７ｇ得た。
【０２５５】実施例８ フコース硫酸含有多糖−Ｆの製造 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１．
２ｇ秤量し、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液に終濃度
０．２％となるように溶解し、１．２５％の塩化セチル
ピリジニウムの１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液をこれ以上
沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分
離により集め、この沈殿を５００ｍｌの１．５Ｍ食塩水
に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰
り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよく
かくはん後エタノールを８０％となるように添加し、か
くはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％
エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清
中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。こ
の沈殿を２Ｍの食塩水５００ｍｌに溶解し、不溶物を遠
心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１ｍｌ
のＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社
製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除
去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分
子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠
心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は７１０
ｍｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは
多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。ま
たこのフコース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まずフ
コースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｆであった。
【０２５６】実施例９ フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素的精製方法 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１０
ｇ秤量し、５００ｍｌの人工海水に溶解後、前記フラボ
バクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素を５
Ｕ添加し２５℃、５０時間反応させた。反応液を排除分
子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離
及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍
結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は６ｇであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹
脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まず、フコースを
構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｆであることが判明した。
【０２５７】実施例１０ フコース硫酸含有多糖−Ｆの培養的精製方法 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０
ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２
００ｇと酵母エキス４ｇを加え、３０リットルのジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、前記フラボバクテリウム
ｓｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
２）を植菌して２５℃、２４時間培養した。培養液を遠
心分離し菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロフ
ァイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性
物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物
質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有
多糖−Ｆの重量は３６ｇであった。また、このフコース
硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質
を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Ｆは
ウロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆであることが判明した。
【０２５８】実施例１１ 実施例７記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化
ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を
０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カル
シウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分洗
浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジェン
トで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化マ
グネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸
含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩
で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸含
有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムにお
いても、フコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有
多糖−Ｕは実質的に分離された。
【０２５９】実施例１２ 実施例１記載のフコース硫酸含有多糖混合物を７ｇ秤量
し、８００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解し
た。次に、４リットルのＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムを０．２Ｍの塩化カルシウムで平衡化し、上記フ
コース硫酸含有多糖溶液を全量カラムにかけ、８リット
ルの０．２Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄後、０から４Ｍ
の塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。溶出画
分の内ウロン酸が検出される画分（塩化ナトリウム濃度
約０．９Ｍ以下：フコース硫酸含有多糖−Ｕ）、ウロン
酸が検出されない画分（塩化ナトリウム濃度約１．２Ｍ
付近：フコース硫酸含有多糖−Ｆ）のそれぞれを脱塩後
凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ１．４ｇ及び４．８ｇ得
た。
【０２６０】実施例１３ 実施例１で得られるフコース硫酸含有多糖混合物に、フ
ラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４０２）の生産するエンド型フコイダン分解
酵素を作用させると下記の構造を有するオリゴ糖を生成
する。
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【０２６１】本発明者らは、下記の酵素反応を行い、上
記オリゴ糖を得た。
【０２６２】すなわち、２．５％の実施例１のフコース
硫酸含有多糖混合物溶液８０ｍｌと、５０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）６０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム
２０ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵
素溶液４０ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させ
た。
【０２６３】反応液をセルロファインＧＣＬ−３００
（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子
量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロア
シライザーＧ３により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロース
ＦＦにより３つの画分を分離し、再度脱塩後、凍結乾燥
した。こうして上記各式（Ｉ）、（II）、（III）のオ
リゴ糖をそれぞれ２５０ｍｇ、３１０ｍｇ、５２ｍｇ得
た。
【０２６４】実施例１４ 実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物１０ｇ
を０．２Ｍのクエン酸５００ｍｌに溶解し、ｐＨを２．
９に調整後、１００℃で３時間処理した。この加水分解
物に１Ｍの酢酸カルシウム溶液を１５０ｍｌ添加し、生
じた沈殿を遠心分離により除去後セルロファインＧＣＬ
−２５によるゲルろ過で分子量分画し（分子量５０００
以上、５０００〜３０００超、３０００〜２０００超、
２０００〜１０００超、１０００〜５００超、５００以
下）、分子量の大きい方から順に、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−
１、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−２、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−３、ＧＦｄ
−Ｏｌｉ−４、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−５、及びＧＦｄ−Ｏｌ
ｉ−６とした。これらの６画分を脱塩後凍結乾燥し、乾
燥品をそれぞれ２．３ｇ、１．７ｇ、０．８８ｇ、１．
８ｇ、１．４ｇ、及び０．７２ｇ得た。
【０２６５】実施例１５ 実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０
ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２
００ｇと酵母エキス４ｇを加え３０リットル容のジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、フラボバクテリウム ｓ
ｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を
植菌し２５℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離
し、菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロファイ
バーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質
を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を
除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖
−Ｆの重量は３６ｇであった。
【０２６６】実施例１６ マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集め
た。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加
え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着
色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を
吸引乾燥し１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．
４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間
処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄
し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％の
セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなく
なるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈
殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られ
た沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイ
ザーで処理後、かくはんしながら４リットルのエタノー
ルを添加し、１時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。
この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過とい
う工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り
返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁
し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子
量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完
全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのフコース硫酸含有多
糖を得た。
【０２６７】実施例１７ ヒバマタ（Fucus vesiculosus ）を充分乾燥後、乾燥物
２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕
し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノール
に懸濁し、８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙により
ろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール
洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残
渣を得た。この残渣を４０リットルの水に懸濁後、１０
０℃、２時間処理し、ろ過した。ろ液に０．５Ｍとなる
ように塩化ナトリウムを加え、更に５％の塩化セチルピ
リジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、
遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの
０．４Ｍ塩化ナトリウムに懸濁後遠心分離し、洗浄し
た。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に２５０ｇの
塩化ナトリウムを加え、３リットルのエタノール中に懸
濁し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エ
タノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清
中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。こ
の沈殿を２Ｍの塩化ナトリウム３リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化し
た１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの塩化ナトリウムで
平衡化したＤＥＡＥーセルロファインＡ−８００カラム
にかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバ
ーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び
塩化ナトリウムを完全に除去後、遠心分離及びろ過によ
り不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコー
ス硫酸含有多糖の重量は９２ｇであった。
【０２６８】実施例１８ わかめ（Undaria pinnatifida)を充分乾燥後、２ｋｇを
自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られ
た乾燥粉末を９リットルのエタノールに懸濁し、７５
℃、１時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を
得た。この残渣に対して８０％のエタノールを９リット
ル添加、かくはんし、８０℃、１時間処理後、ろ紙によ
りろ過し、残渣を得た。この残渣に対して、上記８０％
エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返し、エタ
ノール洗浄残渣１９０８ｇを得た。この残渣のうち６８
４ｇを９リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウムに懸濁後、
９５℃、１時間処理し、２４時間静置後その上清を得
た。上清を除去した沈殿に９リットルの０．２Ｍ酢酸カ
ルシウムを添加かくはんし、１時間静置後上清を得、上
記上清と合せた。こうして得られた上清をろ紙でろ過
後、排除分子量１０，０００のホロファイバーを備えた
限外ろ過装置により限外ろ過し、３５０ｍｌに濃縮し
た。濃縮液を遠心分離し、沈殿を除去後、２ｍＭの塩化
ナトリウムを添加しながら限外ろ過し、完全に酢酸カル
シウムを除去後、凍結乾燥し、凍結乾燥物３．２ｇを得
た。凍結乾燥物中のフコース硫酸含有多糖の重量は３．
１ｇであった。
【０２６９】実施例１９ （１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械
製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノー
ル中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程を更に３回
繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣
に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、
ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭ
の塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピ
リジルクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離した。その沈殿を、８０％のエタノールで
繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に
除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解
し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウム
で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。
このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００
ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムに
かけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０
万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈
殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して
精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇ
を得た。
【０２７０】（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製 上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇ
を６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじ
め０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩
化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を３．３ｇ得た。
【０２７１】（３）エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素の調製 アルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン
１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャ
マリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６０
０ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リッ
トルの三角フラスコに接種し、２５℃で２５時間培養し
て種培養液とした。 ペプトン２００ｇ、酵母エキス４
ｇ、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）４ｍｌを
含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地１８リットルを３
０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃
で２０分殺菌した。冷却後、別に１２０℃、１５分殺菌
した２リットルの人工海水に溶解した２０ｇの実施例８
の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸
含有多糖−Ｆ及び上記の種培養液６００ｍｌを接種し、
２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２
５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。培
養上清中の本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の活
性をフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いて測定した
ところ、５ｍＵ／ｍｌ・培養液であった。得られた培養
上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後、生
じた沈殿を遠心分離により除去し、８５％飽和硫安塩析
し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度
の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、４００
ｍｌの粗酵素を得た。
【０２７２】得られた粗酵素液を、あらかじめ５ｍＭの
アジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工海水（ジャ
マリンＳ）を含む２０ｍＭのトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ
８．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（生化学工業社製）のカラムに吸着させ、吸着物を
同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に１００ｍＭ、２
００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、及び６００ｍＭの
塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集め
た。得られた部分精製酵素の活性はフコース硫酸含有多
糖−Ｆを基質に用いて測定したところ、１０２００ｍＵ
（１０．２Ｕ）であった。なお、他のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の混入は認められなかった。得られた部分
精製酵素の一部をあらかじめ１０分の１濃度の人工海水
（ジャマリンＳ）及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む
１０ｍＭのトリス−塩酸酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したセファクリル Ｓ−２００でゲルろ過を行い、そ
の分子量を求めたところ約１０万であった。
【０２７３】（４）上記実施例で得た部分精製酵素及び
ＰＡ−ＦＦをそれぞれ酵素源及び基質として本酵素の活
性に及ぼすカルシウム濃度の検討を行った。酵素反応に
用いる緩衝液には５０ｍＭの酢酸、イミダゾール、及び
トリス−塩酸を含むｐＨ７の緩衝液を用いた。また、反
応液には終濃度４００ｍＭの塩化ナトリウムを溶存させ
た。反応液中の塩化カルシウム濃度を０〜１００ｍＭま
で変化させ、酵素活性を測定したところ、図２３に示す
ような結果が得られた。なお、図２３において、縦軸は
相対活性（％）、横軸は反応液中カルシウム濃度（ｍ
Ｍ) を示す。この結果、本酵素はカルシウム塩の存在下
著しく活性が高められることが判明した。
【０２７４】（５）本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素を下記６種類の緩衝液で透析しながら５℃
で２０時間保持した後、残存活性を測定した。 １．２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ２．５ｍＭアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．２） ３．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ４．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ５．５ｍＭアジ化ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、及び１０ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ６．５ｍＭアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工
海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．２） 以上の結果、１、２、及び３の緩衝液で透析した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素は失活し、４、５、及
び６の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は活性が保持された。このことから本酵素は５
００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下あるいは１０ｍＭの
カルシウムイオンの存在下で安定化されることが判明し
た。
【０２７５】（６）上記実施例で調製したフコース硫酸
含有多糖−Ｆを５ｇ秤量し、４７１ｍｌの５０ｍＭイミ
ダゾール緩衝液（ｐＨ８）、１２．５ｍｌの４Ｍ塩化ナ
トリウム、６．２５ｍｌの４Ｍ塩化カルシウム、及び実
施例１９−（３）で得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の部分精製品１０ｍｌ（６ｍＵ相当）を混
合し、２５℃で１２０時間反応させたところフコース硫
酸含有多糖−Ｆの低分子化物が得られた。得られた低分
子化物のＩＲ及びＮＭＲの分析結果はそれぞれ図２５及
び図２６に示すとおりであった。また、セルロファイン
ＧＣＬ−３００でゲルろ過したところ、図２４に示す結
果が得られた。すなわち、本物質は分子量１０００〜３
００００にわたって分布するものである。また、本物質
の硫酸含量はＳＯ４（分子量９６）として４６％であ
り、中性糖組成はフコース：ガラクトース＝１００：４
であった。なお、図２４〜図２６における縦軸及び横軸
は、それぞれ図２〜図４と同義である。
【０２７６】実施例２０ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６４）をＡＳＦ１
０４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌと
なるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを４つ用意し、
それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１２、及び１５で
得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（５ｍ
ｇ／ｍｌ）のフィルター処理液〔ポアサイズ０．２０μ
ｍのセルロースアセテート膜（コーニング社製）でろ過
したもの（以下フィルター処理はこの条件で行った）〕
を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４０
時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分
離した。得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテ
トラアセテート及び０．５％のナトリウムラウロイルサ
ルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌ
クレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加して５０℃、
３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネース
Ｋを１μｌ添加して５０℃、１時間処理した。処理後の
細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて
１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルを
エチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランス
イルミネータを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認した
ところ、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認され
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液
を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操
作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有多糖
の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。この結果よ
り、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１２、及び１５で得ら
れたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発さ
れることが明らかとなった。ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ−２４０）を用い、実施例１、１２、及び１５で得
られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとな
るように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭの
ヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、２０
分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発
作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２７７】実施例２１ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌとな
るように懸濁した。この懸濁液９ｍｌに対し、実施例１
５で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で２０時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を「アポトーシス実験プロトコール」（秀潤社、田
沼靖一監修、第９３〜９５頁、１９９５年）に従ってギ
ムザ染色した。すなわち得られた細胞をカルノア固定液
（酢酸：メタノール＝１：３）を用いてスライドグラス
上に固定し、ギムザ色素（メルク社製）を用いて染色
し、光学顕微鏡により観察したところアポトーシス特有
の核の断片化が観察された。この結果よりＨＬ−６０細
胞は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖により
アポトーシスを起こすことが明らかとなった。実施例１
５で得られたフコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌ
となるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍ
Ｍのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、
２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２７８】実施例２２ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０５ コ／４．５ｍｌ
となるように懸濁した。この懸濁液４．５ｍｌを４つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１５、及び
１８で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ
／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２
１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕及び１２
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液
を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
培養し、培養開始後２４時間及び４０時間後に細胞数を
トリパンブルー染色法で計測した。
【０２７９】この結果を図２７に示す。図２７はＨＬ−
６０細胞の培養液に実施例１、１５、及び１８で得られ
たフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌとなるように添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表
す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中
の生細胞数（×１０５ コ／５ｍｌ）を示す。図２７
中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、□
印が無添加（対照）、＋印が実施例１、・印が実施例１
５、×印が実施例１８で得られたフコース硫酸含有多糖
であることを示す。
【０２８０】また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片
化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれ
らの結果から、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１５、及び
１８で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシ
スを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明し
た。実施例１、１５、及び１８で得られた各フコース硫
酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）に溶解し、フィルター処理したもの〕のアポ
トーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得
た。
【０２８１】実施例２３ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）９ｍｌにヒト急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＯ
ＬＴ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５２）を５×１０５
個／９ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌ
を５つ用意し、それぞれに実施例１、２、１２、及び１
６で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で６０時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及
び０．５％のナトリウムラウロイルサルコシネートを含
む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌ
にて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シ
グマ社製）を１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した
後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネースＫを１μｌ添加し
て５０℃、１時間処理した。処理後の細胞をサンプルと
して、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧
の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミ
ド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネータを用
いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、アポトー
シスに特有のＤＮＡラダーが確認された。更に確認のた
めアポトーシスを誘発する試薬として知られているアク
チノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記のフコース
硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培
養２０時間で、フコース硫酸含有多糖の場合と同じＤＮ
Ａラダーが確認できた。この結果より実施例１、２、１
２、及び１６で得られたフコース硫酸含有多糖はＭＯＬ
Ｔ−３細胞に対してアポトーシスを誘発することが判明
した。実施例１、２、１２及び１６で得られた各フコー
ス硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ
（８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、
２．９ｇのリン酸水素二ナトリム１２水和物、及び０．
２ｇのリン酸二水素カリウムを１リットルの水に溶解し
たもの）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ
処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測
定し、同様の結果を得た。
【０２８２】実施例２４ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト急性リンパ芽球性白
血病細胞ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５２）
をＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０３ コ／ｍｌとな
るように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート
上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶
解後ろ過滅菌した実施例１で得られたフコース硫酸含有
多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含
有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純
薬社製）の溶液をそれぞれ０．２ｍｌずつ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
２日、４日、６日、８日後の生細胞数をトリパンブルー
染色法により計測した。この結果を図２８に示す。すな
わち図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られ
たフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を０．
５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時
間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４ コ／
２ｍｌ）を示す。図２８中、培地に添加した硫酸化多糖
の種類は、○印が無添加（対照）、●印が実施例１２で
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、□印が実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖、△印が実施例１７で得
られたフコース硫酸含有多糖、■印が実施例１５で得ら
れたフコース硫酸含有多糖であることを示す。デキスト
ラン硫酸は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖
の場合と実質的に同じ曲線を示した。また、この時死細
胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態
を示した。すなわちこれらの結果から、ＭＯＬＴ−３細
胞は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例
１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５
及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキス
トラン硫酸によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著
しく抑制されることが判明した。実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫
酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコー
ス硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０
万、和光純薬社製）の各溶液（０．５ｍｇ／ｍｌとなる
ようにＰＢＳに溶解後、１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理したもの）のアポトーシス誘発作用を上記に準
じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８３】実施例２５ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０４ 個／９００μｌ
となるように懸濁した。この懸濁液９００μｌを９つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、生理食塩水、及び実施
例１で得たフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜
Ｆ−Ｆｄ−４、及び実施例１３で得られた３種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）フィルター処理液を１００μｌ添加し、３７℃、５
％二酸化炭素存在下で４０時間培養した。培養した細胞
を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−
１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖
を添加したＨＬ−６０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断
片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩
水を添加したＨＬ−６０細胞は細胞数が約４倍に増加し
たが、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−
Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加し
たＨＬ−６０細胞は細胞数が全く増加しないものから１
０分の１以下になるものまでが見られ、これらフコース
硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３
種のフコース硫酸含有オリゴ糖のアポトーシス誘発作用
によりＨＬ−６０細胞の増殖が抑えられることが判明し
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液
を上記のフコース硫酸含有オリゴ糖の代りに用いて同様
に操作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有
オリゴ糖の場合と同じように、細胞の縮小及び細胞断片
化がみられた。この結果より、ＨＬ−６０細胞は実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１
〜Ｆ−Ｆｄ−及び実施例１３で得られたフコース硫酸含
有オリゴ糖によりアポトーシスを誘発されることが明ら
かとなった。実施例１で得たフコース硫酸含有多糖標
品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び実施例１３で得ら
れた３種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各溶液〔１０ｍ
ｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、１２１
℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２８４】実施例２６ 肺癌細胞Ａ−５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、Ｓ
Ｖ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−７５．１）、及び肝癌細胞ＨｅｐＧ２（Ａ
ＴＣＣ ＨＢ−８０６５）をそれぞれ１０４ 個／１．
８ｍｌとなるよう、５６℃、３０分間処理した牛胎児血
清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ
１６４０培地に懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ
分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食
塩水、及び実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸
含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）のフ
ィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、５％二酸
化炭素存在下で６日間培養した。培養した細胞を顕微鏡
で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。この結
果実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、
及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリ
ゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加した肺癌
細胞Ａ−５４９、ＳＶ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３
８ＶＡ１３、及び肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２はすべて細胞縮
小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。ま
た、生理食塩水を添加した各癌細胞は著しく細胞数が増
加したが、実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸
含有オリゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加
した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫
酸含有多糖及びオリゴ糖のアポトーシス誘発作用により
各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明した。実施例
１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施
例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各
ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オー
トクレーブ処理物のアポトーシス誘発作用を上記に準じ
測定し、同様の結果を得た。
【０２８５】実施例２７ 結腸癌細胞ＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４
７）、及び胃癌細胞ＡＧＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３
９）をそれぞれ１０４ 個／１．８ｍｌとなるよう、５
６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイ
エンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ' ｓ５ａ培地（ギブ
コ社製）、Ｈａｍ' ｓ Ｆ１２培地（ギブコ社製）にそ
れぞれ懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ分注し、
それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及
び実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）のフィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、
５％二酸化炭素存在下で４８時間培養した。培養した細
胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果実施例１、１２、及び１５で得られたフコ
ース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４
種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した結腸癌細胞Ｈ
ＣＴ １１６及び胃癌細胞ＡＧＳはすべて細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生
理食塩水を添加した各種癌細胞は著しく細胞数が増加し
たが、実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫
酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフ
コース硫酸含有オリゴ糖を添加した各種癌細胞は細胞数
が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖
のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑え
られることが判明した。実施例１、１２、及び１５で得
られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆ
ｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各ＰＢＳ溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定
し、同様の結果を得た。
【０２８６】実施例２８ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ
１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３ コ
／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェ
ルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／
ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、
フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、
Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−
Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖
の各溶液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパ
リン（和光純薬社製）及びデキストラン硫酸（分子量５
０万、和光純薬社製）を１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二
酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳの
みを同量添加し、同様に培養した。培養開始１日、２
日、３日、４日後の生細胞数を「組織培養の技術」（第
２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０
年））記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測し
た。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色によ
る方法で計測した。
【０２８７】得られた結果を図２９に示す。すなわち図
２９はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施例１で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ
−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆ
ｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を
１ｍｇ／ｍｌ、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を
０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間
と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培
養時間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４
コ／２ｍｌ）を示す。図２９中、培地に添加したフコー
ス硫酸含有多糖あるいはオリゴ糖の種類は、○印が無添
加（対照）、●印が実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、■印が実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖混合物である。実施例１２で得られたフコース硫
酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆ
ｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−
４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖は
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物の場合
と実質的に同じ曲線を示した。またヘパリン及びデキス
トラン硫酸は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の場合と実質的に同じ曲線を示した。
【０２８８】この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ １１６
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−
２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得
られたフコース硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキスト
ラン硫酸を添加したＨＣＴ １１６細胞は細胞数がほと
んど増加しないか、あるいは減少した。
【０２８９】また、実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２
で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含
有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース
硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸を添加
したＨＣＴ １１６細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片
化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、これら
のフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖、ヘパリン、及び
デキストラン硫酸のアポトーシス誘発作用によりＨＣＴ
１１６細胞の増殖が抑制されることが判明した。ＰＢ
Ｓに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−
２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得
られたフコース硫酸含有多糖の各溶液のフィルター処理
液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパリン、
及びデキストラン硫酸の各フィルター処理液のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９０】実施例２９ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ
１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３ コ
／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェ
ルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／
ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１
℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ
添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。な
お、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養し
た。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」
（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０
年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。
すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方
法で計測した。
【０２９１】得られた結果を図３０に示す。すなわち図
３０はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施例１で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したと
きの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であ
り、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞
数（×１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３０中、培地へ
のフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
（対照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、
黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９２】この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ １１６
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ １１６細
胞は細胞数が減少した。また、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ １１６細胞は
すべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴
を呈した。すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸
含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＣＴ
１１６細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細
胞の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに溶解さ
せた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／
ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の
溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記
に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９３】実施例３０ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト胃癌細胞ＡＧＳを
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地にて５×１０３ コ／ｍｌとな
るように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート
上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０
ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間
オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し同様に培養した。培養開始後
経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝
倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法
（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球
計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。
【０２９４】得られた結果を図３１に示す。すなわち図
３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養
時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸
は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１
０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３１中、培地へのフコー
ス硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対
照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三
角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９５】この結果ＰＢＳを添加したＡＧＳ細胞は著
しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース
硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加した
ＡＧＳ細胞は細胞数が減少し、２ｍｇ／ｍｌを添加した
ものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＡＧＳ
細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシス
の特徴を呈した。すなわち、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度で
ＡＧＳ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞
の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに溶解させ
た２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍ
ｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶
液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に
準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９６】実施例３１ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＬ−１５培地（ギブコ社製）
にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−２２８）をＬ−１５培地にて５×１０
３ コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２
４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注し
た。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０
ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実
施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１
２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２
ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し
た。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に
培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の
技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１
９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測
した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色に
よる方法で計測した。
【０２９７】得られた結果を図３２に示す。すなわち図
３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの
培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、
横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数
（×１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３２中、培地への
フコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
（対照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、
黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０２９８】この結果ＰＢＳを添加したＳＷ４８０細胞
は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加
したＳＷ４８０細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを
添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加し
たＳＷ４８０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等の
アポトーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／
ｍｌの濃度でＳＷ４８０細胞に対してアポトーシス誘発
作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、
及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸
含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０２９９】実施例３２ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）
を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃
で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−２１８）を上記培地にて５×１０３ コ／ｍｌとなる
ように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上
の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２
で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及
びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫
酸含有多糖の各溶液を１２１℃、２０分間オートクレー
ブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸
化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみ
を同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生
細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日
本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜
２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上の
トリパンブルー染色による方法で計測した。
【０３００】得られた結果を図３３に示す。すなわち図
３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４及
び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ
／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中
の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時
間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４ コ／２ｍ
ｌ）を示す。図３３中、培地に添加したフコース硫酸含
有多糖の種類は、○印が無添加（対照）、■印が実施例
１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、●印が実施
例１５で得られたフコース硫酸含有多糖である。Ｆ−Ｆ
ｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４は実施例１５で得られたフコー
ス硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。
【０３０１】この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース
硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及
び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を添加し
たＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少した。また、実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ
−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含
有多糖を添加したＷｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細
胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施
例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ
−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコ
ース硫酸含有多糖はＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス
誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明し
た。ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−
Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有
多糖の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０３０２】実施例３３ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）
を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃
で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−２１８）を上記培地にて５×１０３ コ／ｍｌとなる
ように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上
の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍ
ｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オ
ートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）
（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の
方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、
血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測し
た。
【０３０３】得られた結果を図３４に示す。すなわち図
３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培
養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横
軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×
１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３４中、培地へのフコ
ース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対
照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三
角印が５ｍｇ／ｍｌである。
【０３０４】この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加し
たＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを添加
したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＷ
ｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポト
ーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの
濃度でＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持
ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに
溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０
ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【０３０５】実施例３４ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０４ コ／９００μｌ
となるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製６ウェルプレー
ト上の各ウェルに４．５ｍｌずつ分注した。それぞれの
懸濁液に対し、実施例１９−（６）記載のフコース硫酸
含有多糖−Ｆの低分子化物を凍結乾燥したものを１０ｍ
ｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、フィルタ
ーろ過処理したものを０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％
二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として上記緩
衝液のみを同量添加し、同様に培養した。培養開始２２
時間後と４６時間後の生細胞数を組織培養の技術（第２
版）（朝倉出版、日本組織培養学会編）記載の方法（第
２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算
板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。この
結果ＨＬ−６０細胞は上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の低分子化物を凍結乾燥したものによりアポトーシスを
誘発され、細胞増殖速度が抑制されることが判明した。
【０３０６】実施例３５ ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を、５６℃、３０分
間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）
を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に５
×１０４ 個／９００μｌとなるように懸濁した。この
懸濁液を６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０
ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液
（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた
実施例１９−（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−
Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞれ１００μｌ添加
し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４６時間培養し
た。培養開始後２２時間及び４６時間に培養液中の生細
胞数を測定した。また、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−
６０を、ＡＳＦ１０４培地（味の素社製）に５×１０４
個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液を
６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）
及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたフコース硫
酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆ
ｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞ
れ１００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
４０時間培養した。培養開始後１６時間及び４０時間に
培養液中の生細胞数を測定した。また、上記２種類の培
養を行った細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞
の形態を調べた。この結果、ＡＳＦ１０４培地で培養し
た細胞においては、フコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆ
ｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−
４を添加した細胞が総て細胞縮小及び細胞断片化等のア
ポトーシスの特徴を呈し、生細胞数はほとんど増加がみ
られなかったかあるいはほぼ完全に死滅していた。緩衝
液のみ添加した培地において細胞数は約３倍に増加して
いた。一方、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した細胞にお
いてはＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４を添加した細胞のみが総て細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈し、細胞はほと
んど死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細
胞数は約３倍に増加し、フコース硫酸含有多糖−Ｆを添
加した培地において細胞数は約２．５倍に増加してい
た。以上の結果から、フコース硫酸含有多糖−Ｆは無血
清培地で癌細胞に対して強いアポトーシス誘発作用を持
つが、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４は、無血清培地でも血清培地でも非常に
強いアポトーシス誘発作用を持つことが判明した。
【０３０７】更に確認のため、ヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０を、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清
（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を１０％含むＲＰＭＩ
１６４０培地（ギブコ社製）に５×１０４ 個／９００
μｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを２本用
意し、それぞれに、１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０
ｍｇ／ｍｌで溶解させたＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理
液をそれぞれ１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存
在下で１６時間培養した。 培養した細胞を遠心分離に
より上清と分離した。 得られた細胞を１０ｍＭのエチ
レンジアミンテトラアセテート及び０．５％のナトリウ
ムラウロイルサルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ
／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加
して５０℃、３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイネースＫを１μｌ添加して５０℃、３０分間処理
した。 処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロ
ースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行
った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸
した後、トランスイルミネーターを用いてゲル中のＤＮ
Ａの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のＤＮ
Ａラダーが確認された。 さらに確認のためアポトーシ
スを誘発する試薬として知られているアクチノマイシン
Ｄを上記のＦ−Ｆｄ−４の代わりに用いて同様に操作し
たところ、Ｆ−Ｆｄ−４の場合と同じＤＮＡラダーが確
認できた。すなわち、本発明のエンド型フコース硫酸含
有多糖−Ｆ分解酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｆを
分解するとがん細胞に対するアポトーシス誘発作用が強
くなることが判明した。
【０３０８】実施例３６ ２１才女性及び３２才男性の健常人静脈血を採血し、１
リットル当りグルコースを１００ｍｇ、ＣａＣｌ２ ・
２Ｈ２ Ｏを０．７４ｍｇ、ＭｇＣｌ２ を１９．９２ｍ
ｇ、ＫＣｌを４０．２６ｍｇ、ＮａＣｌを７３７１ｍ
ｇ、トリス−塩酸を１７５６．５ｍｇを含む液で２倍希
釈後、リンパ球分離溶液（大日本製薬販売）をあらかじ
め希釈血液の２倍容量を入れた遠心分離管の中に静かに
重層し、１８〜２０℃、４００ｇで３０分間遠心分離し
た。遠心後、リンパ球分離溶液の上層のリンパ球画分を
集めた。こうして得られた健常リンパ球を１．９×１０
５ 個ずつ２４ウェルのプレートに添加し、１．８ｍｌ
の１０％牛胎児血清（５６℃、３０分処理後のもの）を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地に０．２ｍｌの５ｍｇ／ｍ
ｌの上記各実施例で得られたフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物を１種類ずつ加えた培地を加え３７℃で培養し
た。コントロールとしてはフコース硫酸含有多糖溶液の
代りに生理食塩水を添加した。培養開始後、顕微鏡で各
ウェルの細胞の形態変化及び生細胞数を測定した。この
結果、各種フコース硫酸含有多糖、その分解物を加えた
ウェルもコントロールのウェルも細胞形態に差がなく、
また生細胞数の差もほとんど無く、１３日目にはどちら
の細胞もほとんど死滅した。この結果より、フコース硫
酸含有多糖、その分解物は癌細胞に対して強くアポトー
シスを誘発させる濃度においても健常細胞に毒性を示さ
ないことが判明した。
【０３０９】実施例３７ フコース硫酸含有多糖−Ｕの固形がんに対する制がん作
用マウス固形がんＭｅｔｈＡ（４×１０６ｃｅｌｌｓ／
マウス）を８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重約２
０ｇ）の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ
箇所に１０日間実施例６記載のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を皮下注射した。一方
コントロール群には生理的食塩水を同様に皮下注射し
た。２週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出
して、その重量を測定した。結果を表２に示す。すなわ
ち、コントロール群では平均癌重量は１．２５ｇであっ
たのに対し、フコース硫酸含有多糖−Ｕ投与群では０．
２８ｇであり、有意（コントロール群に対しｐ＜０．０
１）な制がん作用を示した。抑制率は７７．６％であっ
た。
【０３１０】
【表２】
【０３１１】実施例３８ フコース硫酸含有多糖の発がん予防作用 （１）６週令のＳｐｒａｇｕｒｅ−Ｄａｗｌｅｙラット
（雄）１９匹に、７．４ｍｇ／ｋｇのアゾキシメタン
（ナカライテスク社製）を背部皮下投与し、以降１週間
に１回、１０週目まで背部皮下投与した。なお投与時
は、アゾキシメタンを０．９％の塩化ナトリウムを含む
ｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、毎回１０
０μｌとなるように溶液の濃度を調整した。上記１９匹
中５匹に対しては最初のアゾキシメタン投与と同時に連
日、実施例１の記載に準じ調製した、ガゴメ昆布熱水抽
出液７０ｍｌを３０週目まで飲料水として経口投与し
た。この熱水抽出液は２ｍｇ／ｍｌのフコース硫酸含有
多糖混合物を含有し、１４０ｍｇ／ｋｇのフコース硫酸
含有多糖混合物が連日経口投与された。なお上記１９匹
中１４匹に対してはフコース硫酸含有多糖は投与せず、
水道水を飲料水として与え、対照群とした。３０週目ま
でに対照群の外耳巣がん発生が１４匹中１４匹見られた
のに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は５匹中
１匹であり、顕著な発がん抑制作用が認められた。なお
３０週目までに対照群は３匹死亡したが、フコース硫酸
含有多糖混合物投与群は全匹生存した。また３０週目の
対照群の平均体重が７１６ｇであるのに対し、フコース
硫酸含有多糖混合物投与群の平均体重は８１７ｇであっ
た。一方アゾキシメタン非投与のラット群（５匹）の平
均体重は７８８ｇであり、フコース硫酸含有多糖混合物
投与群の体重増加はアゾキシメタン非投与のラット群と
同等であった。次に、対照群の４匹を選抜し、３０週目
より連日、上記ガゴメ昆布熱水抽出液４０ｍｌ（フコー
ス硫酸含有多糖混合物８０ｍｇ）を飲料水として経口投
与した。３６週目において、４匹中２匹の外耳巣がんが
顕著に退縮し、フコース硫酸含有多糖の制がん作用が認
めらた。以上フコース硫酸含有多糖の経口投与により、
化学発がん剤による発がん予防作用、化学発がん剤によ
る体重増加抑制の防止作用、更にはがん組織の退縮が認
められた。
【０３１２】実施例３９ 注射剤 実施例１で製造したフコース硫酸含有多糖混合物を注射
用蒸留水に溶解し５％溶液とした。この溶液を凍結乾燥
用バイアル瓶１バイアル中に、フコース硫酸含有多糖と
して５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液
として生理食塩水２ｍｌを添加した。
【０３１３】実施例４０ 注射剤 下記処方に従い注射剤を調製した。 フコース硫酸含有多糖−Ｕ［実施例１２］ ４０ｍｇ 生理食塩水 適量 １アンプル当り ２ｍｌ 同様に実施例１２記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを使
用し注射剤を調製した。
【０３１４】実施例４１ 錠剤下記処方に従い錠剤を調
製した。 フコース硫酸含有多糖標品（実施例１） １０ｍｇ コーンスターチ ６５ｍｇ カルボキシメチルセルロース ２０ｍｇ ポリビニルピロリドン ３ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ １錠当り １００ｍｇ
【０３１５】実施例４２ 注射剤 Ｆ−Ｆｄ−１を注射用蒸留水に溶解し５％溶液とした。
この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、フコ
ース硫酸含有多糖として５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を
行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加し
た。
【０３１６】実施例４３ 注射剤 下記処方に従い注射剤を調製した。 実施例１９−（６）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ の低分子化物の凍結乾燥物 ４０ｍｇ 生理食塩水 適量 １アンプル当り ２ｍｌ
【０３１７】実施例４４ 錠剤 下記処方に従い錠剤を調製した。 実施例１９−（６）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ の低分子化物の凍結乾燥物 １０ｍｇ コーンスターチ ６５ｍｇ カルボキシメチルセルロース ２０ｍｇ ポリビニルピロリドン ３ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ １錠当り １００ｍｇ
【０３１８】
【発明の効果】本発明により不要若しくは病原細胞に対
してアポトーシス誘発作用を有し、がん等の異常増殖細
胞疾患や、ウイルス性疾患において、病変細胞にアポト
ーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な薬剤が
提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のが
んの場合、本発明の薬剤を経口投与することによりがん
細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、天
然食品由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解
物を有効成分とする本発明の薬剤は非常に消化器系がん
に適した制がん剤である。またその発がん予防効果によ
り、化学発がん剤等による発がんも予防できる。本発明
の薬剤は、食用の褐藻植物、食用のナマコ等、食用物質
を原料として安価に大量に供給可能であり、且つ安全性
が高い点においても優れている。また、フコース硫酸含
有多糖及び／又はその分解物を含有する食品又は飲料を
日常的に摂取することにより、健康を維持、増強するこ
とができる。また、本発明により簡便なアポトーシス誘
発方法が提供され、本発明の方法を使用することによ
り、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻
害剤の開発等を行うことができる。
【０３１９】また本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Ｆを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な本発明のフコース
硫酸含有多糖−Ｕ及びその分解物が提供され、その効率
的な製造方法も提供された。
【０３２０】更に本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Ｕを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な、本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ及びその分解物が提供され、その効
率的な製造方法も提供された。
【０３２１】本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
の構造解析や分解、フコース硫酸含有多糖−Ｆの生物活
性の検索に有用なフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化
物の製造に用いることができるエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素、その製造方法、及びがん細胞に対する
アポトーシス誘発作用が強いフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の該酵素による低分子化物が提供された。
【０３２２】また、本発明によりこれまで安定的に製造
されなかった本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−
Ｆ分解酵素を、カルシウムイオンの存在下極めて安定的
に製造することができるようになった。さらに、本発明
により、カルシウムイオンの存在下本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖分解酵素を極めて効率よく働かせる
ことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示
したものである。
【図２】図２はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ
過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量
分布を示したものである。
【図３】図３はフコース硫酸含有多糖−ＵのＩＲスペク
トルを示したものである。
【図４】図４はフコース硫酸含有多糖−Ｕの １Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示したものである。
【図５】図５は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。
【図６】図６は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。
【図７】図７は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものある。
【図８】図８は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ
測定）により得られた結果を示したものである。
【図９】図９は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ
測定）により得られた結果を示したものである。
【図１０】図１０は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガテ
ィブ測定）により得られた結果を示したものである。
【図１１】図１１は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。
【図１２】図１２は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。
【図１３】図１３は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。
【図１４】図１４は糖化合物（ａ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。
【図１５】図１５は糖化合物（ｂ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。
【図１６】図１６は糖化合物（ｃ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。
【図１７】図１７はセファクリルＳ−５００を用いたゲ
ルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｆの分
子量分布を示したものである。
【図１８】図１８はフコース硫酸含有多糖−ＦのＩＲス
ペクトルを示したものである。
【図１９】図１９はフコース硫酸含有多糖−Ｆの １Ｈ
−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２０】図２０は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素のｐＨと相対活性の関係を示
すグラフである。
【図２１】図２１は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示
すグラフである。
【図２２】図２２はセルロファインＧＣＬ−３００を用
いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖
−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示した
ものである。
【図２３】図２３は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の反応液中のカルシウムイオ
ン濃度と相対活性の関係を示すグラフである。
【図２４】図２４は実施例１９−（６）においてセルロ
ファインＧＣＬ−３００を用いたゲルろ過法により測定
した、フコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られ
るエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解し
たものの分子量分布を示したものである。
【図２５】図２５はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したもののＩＲスペクトルを示したものであ
る。
【図２６】図２６はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したものの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した
ものである。
【図２７】図２７はＨＬ−６０細胞の培養液に実施例
１、１５、及び１８で得られたフコース硫酸含有多糖を
１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を示したものである。
【図２８】図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で
得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸
を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。
【図２９】図２９はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有
多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース
硫酸含有多糖、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。
【図３０】図３０はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度
で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。
【図３１】図３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加し
たときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示した
ものである。
【図３２】図３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。
【図３３】図３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ
−Ｆｄ−４及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有
多糖を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の
関係を示したものである。
【図３４】図３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加
したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示し
たものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｎ 9/24 (31)優先権主張番号 特願平8−171658 (32)優先日 平成８年６月12日(1996．6．12) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平8−204187 (32)優先日 平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 北野 秀夫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 于 福功 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中山 信司 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 児島 薫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 木村 ひとみ 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中西 芳邦 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 片山 薫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 冨永 隆生 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 嶋中 一夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 猪飼 勝重 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記理化学的性質を有することを特徴と
    するフコース硫酸含有多糖。 （１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （２）フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．
    ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
    るフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。
  2. 【請求項２】 フコース硫酸含有多糖混合物を、ウロン
    酸を含むフコース硫酸含有多糖を分解する能力を有する
    分解酵素、又は該分解酵素をもつ微生物で処理して目的
    の多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求
    項１記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。
  3. 【請求項３】 フコース硫酸含有多糖混合物を、塩類の
    存在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で目的の多糖を沈殿
    させる工程を包含することを特徴とする請求項１記載の
    フコース硫酸含有多糖の製造方法。
  4. 【請求項４】 フコース硫酸含有多糖混合物を、２価の
    陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の
    多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求項
    １記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。
  5. 【請求項５】 請求項１記載のフコース硫酸含有多糖を
    製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質ある
    いは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程
    を包含することを特徴とする請求項１記載のフコース硫
    酸含有多糖の製造方法。
  6. 【請求項６】 海藻から請求項２、３、又は４記載のフ
    コース硫酸含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオン
    とカルシウムイオンを共存させることを特徴とするフコ
    ース硫酸含有多糖混合物の製造方法。
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