JPH0759563A - フコイダン分解酵素及びその製造方法 - Google Patents
フコイダン分解酵素及びその製造方法Info
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- JPH0759563A JPH0759563A JP22784693A JP22784693A JPH0759563A JP H0759563 A JPH0759563 A JP H0759563A JP 22784693 A JP22784693 A JP 22784693A JP 22784693 A JP22784693 A JP 22784693A JP H0759563 A JPH0759563 A JP H0759563A
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- fucoidan
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なエンド型のフコイダン分解酵素及びそ
の製造方法を提供する。 【構成】 フコイダンをエンド的に分解する作用及び基
質特異性、ｐＨ４〜４．５付近の至適ｐＨ、６０℃付近
の至適温度なる理化学的性質を有するフコイダン分解酵
素。真ウニ類に属する動物から抽出、精製する前記のフ
コイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
の製造方法を提供する。 【構成】 フコイダンをエンド的に分解する作用及び基
質特異性、ｐＨ４〜４．５付近の至適ｐＨ、６０℃付近
の至適温度なる理化学的性質を有するフコイダン分解酵
素。真ウニ類に属する動物から抽出、精製する前記のフ
コイダン分解酵素の製造方法。 【効果】 フコイダンの構造解析、分解やフコイダンオ
リゴ糖の調製などに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フコイダンの構造解析
や分解及びフコイダンオリゴ糖の調製等に利用できるフ
コイダン分解酵素及びその製造方法に関する。
や分解及びフコイダンオリゴ糖の調製等に利用できるフ
コイダン分解酵素及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】藻類由来の硫酸化多糖の一種であるフコ
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、フコイダンを分解
する酵素を生産する可能性が報告されている。しかしな
がら、これらの酵素は一般に生体の中に極微量含まれて
いるだけなので、これらの酵素を完全に精製するには様
々な精製方法を駆使する必要があり、フコイダンを分解
する酵素の入手は困難である。実際に、現在までに完全
に精製されたフコイダンを分解する酵素はホタテ貝由来
の酵素〔バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem.
)、第５６巻、第４９０〜４９４頁（１９９２）、日本
農芸化学会誌、第６６巻、第３号、第３５８頁（１９９
２）〕、及びビブリオ属細菌の酵素〔バイオサイエンス
・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー、
第５６巻、第１８２９〜１８３４頁（１９９２）〕しか
ない。また、ブレチン オブ ザ ジャパニーズ ソサ
エティ オブ サイエンティフィック フィッシャリー
ズ（ Bulletin ｏf the Japanese Society of Scientif
ic Fisheries )、第５０巻、第７号、第１２５５〜１２
６０頁（１９８４）には、キタムラサキウニ（ Strongy
locentrotus nudus ) の消化管のホモジネートの未精製
の上清がフコイダンに作用して還元性物質が増加するこ
とをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson ) 法で確認し
たという報告があるが、生成物の確認はなされていな
い。
イダンは以前から腫瘍増殖阻止効果や抗凝血作用や脂血
清澄作用等の重要な生物活性を持つことが知られてい
る。フコイダンはフコースを主成分とする硫酸化多糖で
あり、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース、マン
ノース、グルコース等をも含む物が知られているが、由
来となる海藻の種類によってこれらの構成糖の種類や量
が異なる。またその構造もよくわかっておらず、分子量
も均一ではないため、フコイダンの生物活性に関する研
究はあまり進展していない。フコイダンの構造を解析し
たり分子量の調整を行うに当ってはエキソ（ exo )型や
エンド（ endo ) 型のフコイダンを分解する酵素を利用
するのが有利である。従来より、アワビ、ホタテ貝、海
洋微生物などが、それぞれある種の、フコイダンを分解
する酵素を生産する可能性が報告されている。しかしな
がら、これらの酵素は一般に生体の中に極微量含まれて
いるだけなので、これらの酵素を完全に精製するには様
々な精製方法を駆使する必要があり、フコイダンを分解
する酵素の入手は困難である。実際に、現在までに完全
に精製されたフコイダンを分解する酵素はホタテ貝由来
の酵素〔バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー（ Biosci. Biotech. Biochem.
)、第５６巻、第４９０〜４９４頁（１９９２）、日本
農芸化学会誌、第６６巻、第３号、第３５８頁（１９９
２）〕、及びビブリオ属細菌の酵素〔バイオサイエンス
・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー、
第５６巻、第１８２９〜１８３４頁（１９９２）〕しか
ない。また、ブレチン オブ ザ ジャパニーズ ソサ
エティ オブ サイエンティフィック フィッシャリー
ズ（ Bulletin ｏf the Japanese Society of Scientif
ic Fisheries )、第５０巻、第７号、第１２５５〜１２
６０頁（１９８４）には、キタムラサキウニ（ Strongy
locentrotus nudus ) の消化管のホモジネートの未精製
の上清がフコイダンに作用して還元性物質が増加するこ
とをソモジ−ネルソン（ Somogyi-Nelson ) 法で確認し
たという報告があるが、生成物の確認はなされていな
い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のごとく、現在フ
コイダンを分解する酵素の入手は困難である。本発明の
目的は、フコイダンに関する研究に有用な、新規なエン
ド型のフコイダン分解酵素及びその製造方法を提供する
ことにある。
コイダンを分解する酵素の入手は困難である。本発明の
目的は、フコイダンに関する研究に有用な、新規なエン
ド型のフコイダン分解酵素及びその製造方法を提供する
ことにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエンド的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは４〜４．５付近に
ある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は６０℃付近であ
る。 また本発明の第２の発明は、上記第１の発明のフコイダ
ン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウニ類
に属する動物から抽出、精製することを特徴とする。
発明の第１の発明は、下記の理化学的性質を有すること
を特徴とするフコイダン分解酵素に関する。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエンド的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは４〜４．５付近に
ある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は６０℃付近であ
る。 また本発明の第２の発明は、上記第１の発明のフコイダ
ン分解酵素の製造方法に関する発明であって、真ウニ類
に属する動物から抽出、精製することを特徴とする。
【０００５】以下本発明について詳細に説明する。本発
明に使用される原材料は真ウニ類に属する動物であれば
特に限定されるものではない。また本発明のフコイダン
分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定されない
が、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコイダ
ン分解酵素を抽出精製する際には、例えばキタムラサキ
ウニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、
例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出
液を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、
凍結乾燥などにより精製を行い、純化されたフコイダン
分解酵素を得ることができる。
明に使用される原材料は真ウニ類に属する動物であれば
特に限定されるものではない。また本発明のフコイダン
分解酵素を採取するのに用いる部位は特に限定されない
が、消化管壁や生殖巣が利用できる。本発明のフコイダ
ン分解酵素を抽出精製する際には、例えばキタムラサキ
ウニの消化管壁を集め、通常用いられる細胞破壊手段、
例えば、ホモジナイザー等で細胞を破砕し、無細胞抽出
液を得る。次いで、この抽出液から通常用いられる精製
手段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、
塩析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、疎水結合カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、
凍結乾燥などにより精製を行い、純化されたフコイダン
分解酵素を得ることができる。
【０００６】本発明のフコイダン分解酵素の酵素化学的
及び理化学的性質は次のとおりである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエンド的に分
解する。本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の
フコイダン分解酵素の作用機作を２−アミノピリジンを
用いた蛍光標識方法による分析で決定した。後述の方法
により精製したヒバマタ由来フコイダン（シグマ社製）
２ｍｇを充分に乾燥させ、パルステーションモデル４０
００及びパルステーションピリジルアミネーションリエ
イジェントキット（共に宝酒造社製）を用い、各々の取
扱い説明書に記載の方法に従ってピリジルアミノ化（Ｐ
Ａ化）を行い、ＰＡ化フコイダンを得た。次いで、この
ＰＡ化フコイダンを２００μｌの蒸留水に溶かし、ＨＰ
ＬＣ用カラムＯＨｐａｋ ＳＢ−２００４（昭和電工社
製）により分子量分画を行い高分子画分のみを集め、凍
結乾燥した。５μｇのＰＡ化フコイダンを、３μｇの精
製した本発明のフコイダン分解酵素標品と共に、３時間
反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用
したカラムはショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８０３
（昭和電工社製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−
１１５０、Ｅｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍに設
定）により検出した。対照として、本発明のフコイダン
分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０℃、５
分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標品の３
μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析を行っ
た。その結果を図１に示す。すなわち図１は、ＰＡ化フ
コイダンに本発明のフコイダン分解酵素を作用させ、分
解物の蛍光分析を行った際のクロマトグラムである。図
１において縦軸は相対蛍光強度、横軸及び図中の数字は
保持時間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの各ピークは
ＰＡ化フコイダンの溶出位置を示す。図１によれば、未
変性のフコイダン分解酵素を用いた場合には（矢印
ａ）、変性させた本発明の酵素を用いた場合（矢印ｂ）
に比べて、ＰＡ化フコイダンの溶出位置が低分子側にシ
フトしており、本発明のフコイダン分解酵素の作用によ
りＰＡ化フコイダンが低分子化されていることがわか
る。
及び理化学的性質は次のとおりである。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエンド的に分
解する。本発明者らは、以下に述べるごとく、本発明の
フコイダン分解酵素の作用機作を２−アミノピリジンを
用いた蛍光標識方法による分析で決定した。後述の方法
により精製したヒバマタ由来フコイダン（シグマ社製）
２ｍｇを充分に乾燥させ、パルステーションモデル４０
００及びパルステーションピリジルアミネーションリエ
イジェントキット（共に宝酒造社製）を用い、各々の取
扱い説明書に記載の方法に従ってピリジルアミノ化（Ｐ
Ａ化）を行い、ＰＡ化フコイダンを得た。次いで、この
ＰＡ化フコイダンを２００μｌの蒸留水に溶かし、ＨＰ
ＬＣ用カラムＯＨｐａｋ ＳＢ−２００４（昭和電工社
製）により分子量分画を行い高分子画分のみを集め、凍
結乾燥した。５μｇのＰＡ化フコイダンを、３μｇの精
製した本発明のフコイダン分解酵素標品と共に、３時間
反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用
したカラムはショウデックス（ Shodex ) ＳＢ−８０３
（昭和電工社製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−
１１５０、Ｅｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍに設
定）により検出した。対照として、本発明のフコイダン
分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０℃、５
分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標品の３
μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析を行っ
た。その結果を図１に示す。すなわち図１は、ＰＡ化フ
コイダンに本発明のフコイダン分解酵素を作用させ、分
解物の蛍光分析を行った際のクロマトグラムである。図
１において縦軸は相対蛍光強度、横軸及び図中の数字は
保持時間（分）を示し、図中の矢印ａ、ｂの各ピークは
ＰＡ化フコイダンの溶出位置を示す。図１によれば、未
変性のフコイダン分解酵素を用いた場合には（矢印
ａ）、変性させた本発明の酵素を用いた場合（矢印ｂ）
に比べて、ＰＡ化フコイダンの溶出位置が低分子側にシ
フトしており、本発明のフコイダン分解酵素の作用によ
りＰＡ化フコイダンが低分子化されていることがわか
る。
【０００７】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発
明のフコイダン分解酵素を作用させ、分解物の還元末端
をＰＡ化して、蛍光分析を行った。２ｍｇの精製したヒ
バマタ由来フコイダンを、１５μｇの精製した本発明の
フコイダン分解酵素標品と共に、後述する酵素活性の測
定方法に記載した条件に従って１２時間反応させた後、
反応液をパルステーションモデル４０００及びパルステ
ーションピリジルアミネーションリエイジェントキット
（共に宝酒造社製）を用い、各々の取扱い説明書に記載
の方法に従ってＰＡ化し、ＰＡ化した反応液をＨＰＬＣ
により分析した。使用したカラムはショウデックスＳＢ
−８０３（昭和電工社製）、蛍光検出器（日立製作所
製、Ｆ−１１５０、Ｅｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎ
ｍに設定）により検出した。対照として、本発明のフコ
イダン分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０
℃、５分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標
品の１５μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析
を行った。
明のフコイダン分解酵素を作用させ、分解物の還元末端
をＰＡ化して、蛍光分析を行った。２ｍｇの精製したヒ
バマタ由来フコイダンを、１５μｇの精製した本発明の
フコイダン分解酵素標品と共に、後述する酵素活性の測
定方法に記載した条件に従って１２時間反応させた後、
反応液をパルステーションモデル４０００及びパルステ
ーションピリジルアミネーションリエイジェントキット
（共に宝酒造社製）を用い、各々の取扱い説明書に記載
の方法に従ってＰＡ化し、ＰＡ化した反応液をＨＰＬＣ
により分析した。使用したカラムはショウデックスＳＢ
−８０３（昭和電工社製）、蛍光検出器（日立製作所
製、Ｆ−１１５０、Ｅｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎ
ｍに設定）により検出した。対照として、本発明のフコ
イダン分解酵素標品の代りに、オートクレーブで１２０
℃、５分の処理により変性させた本発明の酵素の精製標
品の１５μｇを用いて同様の条件により反応させ、分析
を行った。
【０００８】結果を図２に示す。すなわち図２は、精製
したヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフコイダン分
解酵素を作用させ、分解物をＰＡ化後蛍光分析を行った
際のクロマトグラムである。図２において縦軸は相対蛍
光強度、横軸及び図中の数字は保持時間（分）を示し、
図中の矢印ａ、ｂの各ピークはＰＡ化されたフコイダン
分解物の溶出位置を示す。変性させた本発明のフコイダ
ン分解酵素を用いた場合には、矢印ｂで示される分子量
の大きなＰＡ化されたフコイダンのピークしか検出され
ないのに対して、未変性のフコイダン分解酵素標品を用
いて反応を行った場合には、矢印ｂで示されるピークの
溶出位置よりも低分子側に矢印ａで示す様々な分子量の
ＰＡ化されたフコイダン分解物のピークが検出された。
すなわち、本発明のフコイダン分解酵素がフコイダンを
エンド型に切断していることがわかる。
したヒバマタ由来のフコイダンに本発明のフコイダン分
解酵素を作用させ、分解物をＰＡ化後蛍光分析を行った
際のクロマトグラムである。図２において縦軸は相対蛍
光強度、横軸及び図中の数字は保持時間（分）を示し、
図中の矢印ａ、ｂの各ピークはＰＡ化されたフコイダン
分解物の溶出位置を示す。変性させた本発明のフコイダ
ン分解酵素を用いた場合には、矢印ｂで示される分子量
の大きなＰＡ化されたフコイダンのピークしか検出され
ないのに対して、未変性のフコイダン分解酵素標品を用
いて反応を行った場合には、矢印ｂで示されるピークの
溶出位置よりも低分子側に矢印ａで示す様々な分子量の
ＰＡ化されたフコイダン分解物のピークが検出された。
すなわち、本発明のフコイダン分解酵素がフコイダンを
エンド型に切断していることがわかる。
【０００９】（II) 活性測定方法 フコイダン分解酵素の活性の測定は以下の様にして行っ
た。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシア
社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、２００ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０００ｍＭの
塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８００〜２００
０ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱塩、濃縮し
４０ｍｌの精製フコイダンを得た。
た。 （１）市販フコイダンの精製 １ｇのヒバマタ由来のフコイダン（シグマ社製）を５０
ｍｌの２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）に溶解し、同緩衝液で
十分透析後、遠心分離して不溶物を除き、あらかじめ２
００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ２．５）で平衡化した２５０ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロース（ Sepharose )ＦＦ（ファルマシア
社製）を詰めたカラムに流す。同カラムを、２００ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ２．５）で洗浄し、次に２００〜３０００ｍＭの
塩化ナトリウムでグラジエント溶出し、８００〜２００
０ｍＭの溶出画分を集め、限外ろ過により脱塩、濃縮し
４０ｍｌの精製フコイダンを得た。
【００１０】こうして得られた精製フコイダンを前述の
方法でＰＡ化し、ＰＡ化フコイダンを得、以下の方法で
フコイダン分解酵素の活性を測定した。 （２）酵素活性の測定 １００μｇ／ｍｌのＰＡ化フコイダン４．８μｌと、２
μｌの本発明のフコイダン分解酵素と、４μｌの５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３．５を混合し、３７℃、３時間反応
させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用した
カラムはショウデックス ＳＢ−８０３（昭和電工社
製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍに設定）により検出
した。対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の
代りに、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により
変性させた本発明の酵素を用いて同様の条件により反応
させ、分析を行った。
方法でＰＡ化し、ＰＡ化フコイダンを得、以下の方法で
フコイダン分解酵素の活性を測定した。 （２）酵素活性の測定 １００μｇ／ｍｌのＰＡ化フコイダン４．８μｌと、２
μｌの本発明のフコイダン分解酵素と、４μｌの５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ３．５を混合し、３７℃、３時間反応
させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析した。使用した
カラムはショウデックス ＳＢ−８０３（昭和電工社
製）で、蛍光検出器（日立製作所製、Ｆ−１１５０、Ｅ
ｘ ３２０ｎｍ／Ｅｍ ４００ｎｍに設定）により検出
した。対照として、本発明のフコイダン分解酵素標品の
代りに、オートクレーブで１２０℃、５分の処理により
変性させた本発明の酵素を用いて同様の条件により反応
させ、分析を行った。
【００１１】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのＰＡ化フコイダンを分解して低分子化
させる酵素量とする。ＰＡ化フコイダンの定量は、市販
のＰＡ化フコース（宝酒造社製）を標準物質とし、上記
のＨＰＬＣの条件で分析した際に１μｍｏｌのＰＡ化フ
コースと等面積のピークを形成するＰＡ化フコイダンの
量を１μｍｏｌとして行った。
間に１μｍｏｌのＰＡ化フコイダンを分解して低分子化
させる酵素量とする。ＰＡ化フコイダンの定量は、市販
のＰＡ化フコース（宝酒造社製）を標準物質とし、上記
のＨＰＬＣの条件で分析した際に１μｍｏｌのＰＡ化フ
コースと等面積のピークを形成するＰＡ化フコイダンの
量を１μｍｏｌとして行った。
【００１２】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。
【００１３】（III)至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは４〜
４．５付近にある（図３）。 すなわち図３は、本酵素のｐＨと相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。
４．５付近にある（図３）。 すなわち図３は、本酵素のｐＨと相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示
す。
【００１４】（IV) 至適温度：本酵素の至適温度は６０
℃付近である（図４）。 すなわち図４は、本酵素の温度と相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度
（℃）を示す。
℃付近である（図４）。 すなわち図４は、本酵素の温度と相対活性の関係を表す
グラフであり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度
（℃）を示す。
【００１５】
【実施例】以下に本発明によるフコイダン分解酵素の製
造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例
の範囲のみに限定されるものではない。
造方法を実施例をもって示すが、本発明が以下の実施例
の範囲のみに限定されるものではない。
【００１６】実施例１ 以下の操作は４℃で行った。キタムラサキウニ（３０ｋ
ｇ）の消化管壁及び一部の消化管内容物１５２０ｇを常
法によりアセトンパウダー（２８６ｇ）とし、４．５リ
ットルの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁し、２０時間かくはん後遠心分離し上清を得た。
その上清に６０％飽和となるように硫安を加え１時間か
くはん後遠心分離し上清を得た。その上清に９０％飽和
となるように硫安を加え１時間かくはん後遠心分離し沈
殿を得た。その沈殿を５０ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、１０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析した。この酵素液を遠
心分離した得られた上清に対し、セファクリルＳ−２０
０ＨＲ（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィーを行った。その活性画分を集め１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）を用いたカラムク
ロマトグラフィーを行った。この活性フラクションを集
め、限外ろ過により濃縮し、セファクリルＳ−２００Ｈ
Ｒを用いたカラムクロマトグラフィーを行った。この活
性フラクションを集め、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）で平衡化したモノ（Mono) Ｓ（ファルマ
シア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行っ
た。この活性画分を集め精製フコイダン分解酵素０．６
８１ｍＵを得た。ゲルろ過法（セファクリルＳ−２００
ＨＲ）により測定された精製フコイダン分解酵素の分子
量は約５万であった。また、マルチゲル１０／２０（第
一化学薬品社製）を用いて非還元条件下で電気泳動を行
って測定した分子量は約５万であった。以上の精製工程
の各結果を表１に示す。
ｇ）の消化管壁及び一部の消化管内容物１５２０ｇを常
法によりアセトンパウダー（２８６ｇ）とし、４．５リ
ットルの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁し、２０時間かくはん後遠心分離し上清を得た。
その上清に６０％飽和となるように硫安を加え１時間か
くはん後遠心分離し上清を得た。その上清に９０％飽和
となるように硫安を加え１時間かくはん後遠心分離し沈
殿を得た。その沈殿を５０ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、１０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）で透析した。この酵素液を遠
心分離した得られた上清に対し、セファクリルＳ−２０
０ＨＲ（ファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグ
ラフィーを行った。その活性画分を集め１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）を用いたカラムク
ロマトグラフィーを行った。この活性フラクションを集
め、限外ろ過により濃縮し、セファクリルＳ−２００Ｈ
Ｒを用いたカラムクロマトグラフィーを行った。この活
性フラクションを集め、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）で平衡化したモノ（Mono) Ｓ（ファルマ
シア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーを行っ
た。この活性画分を集め精製フコイダン分解酵素０．６
８１ｍＵを得た。ゲルろ過法（セファクリルＳ−２００
ＨＲ）により測定された精製フコイダン分解酵素の分子
量は約５万であった。また、マルチゲル１０／２０（第
一化学薬品社製）を用いて非還元条件下で電気泳動を行
って測定した分子量は約５万であった。以上の精製工程
の各結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 工 程 総タン 総活性 比活性 収 率 パク （ミリ単位） （ミリ単位 （％） (mg) ／mg) ─────────────────────────────────── アセトンパウダー抽出液 99,700 25.3 0.000254 100 硫安分画 923 4.92 0.00533 19.4 セファクリルＳ−２００ 49.2 ＳＰ−トヨパール６５０Ｍ 7.44 1.18 0.159 4.66 セファクリルＳ−２００ 3.10 0.820 0.265 3.24 モノＳ 1.67 0.681 0.408 2.06 ───────────────────────────────────
【００１８】
【発明の効果】本発明により、フコイダンの構造解析や
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
フコイダンの分解やフコイダンオリゴ糖の調製などに有
用なフコイダン分解酵素及びその簡便な製造方法が提供
された。
【図１】ＰＡ化フコイダンに本発明のフコイダン分解酵
素を作用させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマト
グラムを示す図である。
素を作用させ、分解物の蛍光分析を行った際のクロマト
グラムを示す図である。
【図２】精製したヒバマタ由来のフコイダンに本発明の
フコイダン分解酵素を作用させ、分解物をＰＡ化後蛍光
分析を行った際のクロマトグラムを示す図である。
フコイダン分解酵素を作用させ、分解物をＰＡ化後蛍光
分析を行った際のクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐＨと相対活性の関係を表すグ
ラフである。
ラフである。
【図４】本発明の酵素の温度と相対活性の関係を表すグ
ラフである。
ラフである。
フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式会 社糖鎖工学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とするフコイダン分解酵素。 （Ｉ）作用及び基質特異性：フコイダンをエンド的に分
解する。 （II) 至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは４〜４．５付近に
ある。 （III)至適温度：本酵素の至適温度は６０℃付近であ
る。 - 【請求項２】 真ウニ類に属する動物から抽出、精製す
ることを特徴とする請求項１記載のフコイダン分解酵素
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22784693A JPH0759563A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22784693A JPH0759563A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759563A true JPH0759563A (ja) | 1995-03-07 |
Family
ID=16867295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22784693A Pending JPH0759563A (ja) | 1993-08-23 | 1993-08-23 | フコイダン分解酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759563A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996034004A1 (fr) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Composes de sucre |
| FR2783523A1 (fr) * | 1998-09-21 | 2000-03-24 | Goemar Lab Sa | Fuco-oligosaccharides, enzyme pour leur preparation a partir des fucanes, bacterie productrice de l'enzyme et applications des fuco-oligosaccharides a la protection des plantes |
| WO2002086116A1 (fr) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Takara Bio Inc. | Fucoglucuronomannane sulfate |
-
1993
- 1993-08-23 JP JP22784693A patent/JPH0759563A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996034004A1 (fr) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Composes de sucre |
| US6054577A (en) * | 1995-04-28 | 2000-04-25 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Oligosaccharides from enzymatic cleavage of fucoidan |
| US6277616B1 (en) | 1995-04-28 | 2001-08-21 | Takara Shuzo Co. Ltd. | Endo-fucoidan-lyase |
| US6379947B2 (en) | 1995-04-28 | 2002-04-30 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Biologically pure culture of Fucoidanobacter marinus SI-0098 (FERM BP-5403) |
| FR2783523A1 (fr) * | 1998-09-21 | 2000-03-24 | Goemar Lab Sa | Fuco-oligosaccharides, enzyme pour leur preparation a partir des fucanes, bacterie productrice de l'enzyme et applications des fuco-oligosaccharides a la protection des plantes |
| WO2000017215A1 (fr) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Laboratoires Goemar S.A. | Endofucanases et procede les mettant en oeuvre pour la preparation des fuco-oligosaccharides a partir des fucanes, bacterie productrice des endofucanases et applications des fuco-oligosaccharides a la protection de plantes |
| US6984630B1 (en) * | 1998-09-21 | 2006-01-10 | Laboratoires Goemar S.A. | Endofucanases and method using same for preparing fuco-oligosaccharides from fucanes, bacterium producing endofucanases and uses of fuco-oligosaccharides for plant protection |
| WO2002086116A1 (fr) * | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Takara Bio Inc. | Fucoglucuronomannane sulfate |
| US7041656B2 (en) | 2001-04-18 | 2006-05-09 | Takara Bio Inc. | Sulfated fucoglucuronomannan |
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