MÉTODO PARA PREPARAR HEPARINA DE CULTIVOS DE MASTOCITOS
La presente invención se refiere a la preparación de heparina a partir de cultivos de células. La heparina pertenece a la familia de los glicosaminoglicanos
(GAG), familia que comprende los polisacáridos lineales que contienen la repetición de una secuencia de disacáridos que se compone con un azúcar aminada (D-glucosamina o galactosamina) y con un ácido urónico (D. glucourónico o idurónico). En el caso de la heparina que, junto con la heparina sulfatada, pertenece a la subfamilia de los glucosaminoglicanos, el azúcar aminada es la D-glucosamina. El ácido urónico es, o bien el ácido glucurónico (Glc) o bien el ácido idurónico (Ide). La glucosamina puede ser N - acetilada, N -sulfatada u O sulfatada. Convencionalmente, con el término heparina se designa a polisacáridos altamente sulfatados en los cuales más del 80% de los residuos de glucosamina son N - sulfatados y el número de O - sulfatados es más importante que el de los N - sulfatados. La relación sulfato / disacárido es generalmente superior, al doble de la relación para la heparina. Sin embargo, la estructura de la heparina es, de hecho, muy heterogénea y existen cadenas que pueden contener relaciones muy diferentes. Al igual que como en todos los GAGs, a la heparina se la sintetiza bajo la forma de proteoglicano. Esa síntesis tiene lugar preferentemente, en una subpoblación de mastocitos, los mastocitos serosos o conjuntivos (CTMC). Esos mastocitos son abundantes en la piel y las submucosas respiratorias. La duración de su vida es muy larga (por lo menos, seis meses). Además de la heparina, contienen heparina sulfatada y cantidades apreciables de histamina (alrededor de 10 pg / célula, según cuál fuere la especie animal). La primera etapa de la síntesis de la heparina es la formación del núcleoproteínico de sergiicina, constituido por los residuos de serina y glicina alternados en forma regular. El alargamiento de la cadena de heparina se realiza a partir de un tetrasacárido, mediante agregados sucesivos de osamina y de ácidos urónicos. El proteoglicano así formado sufre numerosas transformaciones en secuencia: N -desacetilación, N - sulfatación, epimerización del ácido D glucurónico y O - sulfatación. No obstante, esta maduración completa no tiene lugar más que sobre una parte del proteoglicano, lo que genera una gran variabilidad estructural de la heparina, responsable de su heterogeneidad. Después, a las cadenas de polisacáridos se Ies extrae la sergiicina por medio de una endoglucuronidasa. Esas cadenas tienen, entonces, un peso molecular que está comprendido entre 5000 y 30000 Da. Forman complejos con las proteasas básicas y, de ese modo, se las guarda en los gránulos de los mastocitos. La heparina se excreta de modo único en el momento de la desgranulación de los mastocitos. La heparina desempeña un papel biológico importante, en especial en la hemostasis, y se la utiliza en gran medida en terapéutica, en particular en carácter de agente anticoagulante y antitrómbico.
En la actualidad, la mayor parte de la heparina que se utiliza se aisla a partir de la mucosa intestinal de cerdo, de donde se la extrae por proteolisis, a la que sigue la purificación sobre resina de intercambio aniónico (para un repaso de los diferentes procedimientos de la preparación de heparina, véase DUCLOS:: L 'Heparine: fabricación, structure, proprietés, anályse) (Heparina: fabricación, estructura, propiedades, análisis) Ed. Masson, París, 1984). A la heterogeneidad inherente a la heparina se le agrega la diversidad de los lotes de animales a partir de los cuales se la obtiene. Eso da por resultado una variabilidad muy importante que se traduce, en especial, en el nivel de la actividad biológica. Además es difícil disponer de manera regular de una provisión suficiente de materia prima. Ya se ha propuesto la utilización de células provenientes de mamíferos, para la producción de GAG o de proteoglicanos. De ese modo, la solicitud de patente WO 99 / 26983 describe la obtención de compuestos de tipo heparínico, que pueden ser proteoglicanos (HEP - PG) o glicosaminoglicanos (HEP - GAG), a partir de células de mastocitos de rata. Los compuestos no son de heparina; las células así aisladas no son de líneas establecidas. Además, el solicitante de esa solicitud de patente recomienda el co-cultivo de células aisladas con fibroblastos. También el artículo de Wang y Kovanen (Circulation Research, 84, 1 , 74 - 83, 1999) describe el aislamiento de mastocitos serosos de rata y la producción de proteoglicanos a partir de esas células. Al igual que en la solicitud WO 99 / 26983, las células utilizadas para la producción de proteoglicanos no son líneas establecidas sino, simplemente, células aisladas a las que se estimula después para producir los proteoglicanos. La solicitud de patente WO 90 / 14418, a la que se cita en el reporte de búsqueda, describe líneas celulares a las que se obtiene a partir de mastocitomas de ratón, y la utilización de esas líneas para la producción de heparina. Esas células tienen, pues, un origen tumoral, lo que es susceptible de generar problemas sanitarios. Un artículo de Montgomery y cois. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 23, 1 1327 - 1 1331 , 1992), también describe el aislamiento de mastocitomas de ratón. La presente invención propone mitigar los inconvenientes mencionados más arriba y librarse de los problemas de aprovisionamiento, en cuanto a cantidad y calidad, mediante la utilización de una fuente disponible fácilmente de materia prima homogénea y de características estables, lo que facilita la obtención de preparados de heparina de calidad constante. Los inventores de la presente invención comprobaron que era posible producir en cantidad importante, a partir de cultivos de líneas de mastocitos, de heparina que poseía propiedades comparables a las de la heparina que se extrae del mucus intestinal porcino. Además, la utilización de cultivos celulares como materia prima permite controlar las condiciones de síntesis de la heparina y obtener así un producto que posee características reproducibles. La presente invención tiene por objeto un procedimiento para la producción de heparina, caracterizado por comprender el cultivo de líneas de mastocitos de origen porcino y la recuperación de la heparina a partir de los cultivos obtenidos. De preferencia, los mencionados mastocitos son de líneas de mastocitos de origen porcino. El término "cultivo" designa aquí, de manera general, una célula o un ensamble de células cultivadas in vitro. Un cultivo se desarrolla directamente a partir de una célula prevaleciente o un conductor, en un animal que se denomina "cultivo primario". El término "línea" es empleado a partir del momento en donde por lo menos un pasaje, y generalmente varios pasajes consecutivos bajo cultivo son realizados con éxito, y designa todos los cultivos de los cuales son originados. (SCHAEFFER, in vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91 -101 , 1990). Para mayor ventaja, los mencionados mastocitos son provenientes de líneas de mastocitos porcinos que se obtuvo del modo tal como se describe en la solicitud de patente FR 01 13608 titulada "Cultures de mastocytes de porc et leurs utilizations" ("Cultivos de mastocitos de cerdo y sus usos"), que se concediera al INRA y al ENVA. Entre ellas, las líneas de preferencia para la instrumentación del procedimiento que obedece a la presente invención son: - la línea de mastocitos provenientes de hígado fetal de cerdo, depositada por el INRA (14/ rué de l'Université, 75007, París, Francia) junto con la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Mocrooganismes, Instituí Pasteur, 26, rué du Doctor Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia) el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I - 2735; - la línea de mastocitos provenientes de hígado fetal de cerdo y transferidas por medio del antígeno T del virus SV40, depositada por el INRA junto con la CNCM, el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I- 2736; - la línea de mastocitos provenientes de médula ósea de feto de cerdo y transferidas por medio del antígeno T del virus SV40, depositada por el INRA junto con la CNCM, el 17 de octubre de 2001 , bajo el número I - 2734. De preferencia, los mastocitos son mastocitos aireados. A esos mastocitos se los cultivará, de preferencia, en un medio de cultivo definido (MEMa / DMEM, RPMI, IMDM,...) al que se suplementa en factores de crecimiento, a los que se utiliza en combinación o de manera individual, tales como el SCF (Stem Cell Factor = Factor de Estirpe de Células), en una concentración que está comprendida entre 1 ng/ml y 1 µ?/??? y, eventualmente, la IL3 (interleucina 3), en una concentración comprendida entre 0.1 ng/ml y 1 00 ng/ml o la PGE2 (prostaglandina E2), con una concentración que está comprendida entre 1 nM y 1 µ?. Asimismo, a los medios se los puede suplementar con suero bovino, en una concentración comprendida entre 0.5% y 20% (v/v). El agregado de suero bovino en los medios de cultivo se puede reemplazar por la utilización de un medio de cultivo sin suero, tal como AIMV (INVITROGEN), de modo tal de reducir la concentración de proteína del medio y los riesgos que se relacionan con el empleo de compuestos de origen animal (KAMBE y coL, J. Immunol. Methods, 240, 101 - 10, 2001 ). La independencia de las células ante el agregado de suero y/o ante el empleo de factores de crecimiento, se puede obtener por medio de la mutación controlada del fenotipo celular, a través de la acción de agentes transformadores y/o inmortalizantes (TSUJ IMURA, Pathology International, 46, 983 - 8, 1990; PAO y BERNSTEIN, Blood, 87 (8), 31 17 -23, 1996). Los mastocitos se pueden cultivar utilizándose las técnicas desarrollladas para el cultivo en masa de células eucariotas, tal como se describe en, por ejemplo, GRIFFITHS y col. (Animal Cell Biology [Biología Celular Animal], Eds. Spier; y Griffiths. Academic Press, Londres, vol. 3, 179 - 220, 1986). Se puede utilizar bioreactores de capacidad superior a muchos m3, tal como describen PHI LIPS y col. (Large Scale Mammalian Cell Culture [Cultivo en Gran Escala de Células de Mamíferos], Eds. Fodor y Tolbert, Academic Press, Orlando, Estados Unidos de Norteamérica, 1985), o IZRAHI (Process Biochem., Agosto, 9 - 12, 1983). Al cultivo también se lo puede realizar en suspensión o sobre microsoporte, según la técnica que describe VAN MEZEL (Nature, 216, 64 - 65, 1967). Asimismo, también se puede utilizar sistemas de cultivo en lotes (batch), a los que se emplea con frecuencia para los cultivos de células eucariotas, por el hecho de que es mayor la simplicidad de su puesta en funcionamiento en la escala industrial (VOGEL y TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook [Manual de Ingeniería Bioquímica y Fermentación], 2a edición, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S. A., 1997). Las densidades de células que se obtienen con estos sistemas están generalmente comprendidas entre 106 y 5 x 1 06 células / mililitro. La productividad de los cultivos en lote se puede aumentar ventajosamente tomando una parte de las células del bioreactor (70% a 90%>), para las operaciones de extracción de los GAGs y de aislamiento de la heparina, y conservando las células restantes en el seno del mismo bioreactor para iniciar un nuevo cultivo. En esta modalidad de cultivo llamada de lote repetido se puede distinguir, además, los parámetros óptimos de la fase de crecimiento celular, los que permiten una acumulación más grande de GAGs y de heparina en el interior de las células. A los sistemas de cultivo en continuo del tipo de perfusión, con retención celular o sin ella, también se los puede utilizar (VELES y coL, J. Immunol Methods, 102 (2), 275 - 278, 1987; CHAUBARD y col, Gen. Eng. News, 20, 18 - 48, 2000). Dentro del marco de la presente invención se puede utilizar, en especial, sistemas perfundidos de cultivo, que permiten la retención de células en el interior del reactor y desembocan en un crecimiento y una producción superiores a los que se puede obtener en lote. La retención se puede efectuar por intermedio de sistemas de retención del tipo filtro rotatorio (spin filter) , fibras ahuecadas o matriz sólida (WANG y coL, Cytotechnology, 9, 41 - 49, 1992; VELEZ y col, J. Immunol. Methods, 102 (2), 275 - 278, 1987). Las densidades celulares que se obtienen están generalmente comprendidas, entre 07 y 5 x 07 células / mililitro. Por medio de la utilización de colectores de medida en línea, el cultivo en bioreactores permite un mejor control de los parámetros fisicoquímicos del crecimiento celular, así como la acumulación de GAGs y de heparina en el seno de las células: pH, p02, Red / Ox, sustratos de crecimiento tales como vitaminas, aminoácidos, sustratos carbonatados (por ejemplo, glucosa, fructosa, galactosa), metabolitos tales como lactato o amoníaco, y demás. Después de 3 a 30 días de cultivo, de preferencia después de 3 a 10 días, a las células se las recoge y separa del medio de cultivo, generalmente por centrifugación o filtración. Se puede emplear diferentes sistemas de centrifugación, se citará, por ejemplo, los que describen VOGEL y rODARa (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2a edición, Noyes Publication, Westwood, New Jersey. U.S. A.). Alternativamente o en combinación con la centrifugación, se puede efectuar la separación por medio de microfiltración tangencial con ayuda de membranas cuya porosidad es inferior al diámetro medio de las células (5 a 20 µ? ), al mismo tiempo que permiten el paso de los otros compuestos en solución / suspensión. La velocidad de del flujo tangencial y la presión que se aplica sobre la membrana se elegirán de modo tal de generar poca fuerza de cizallamiento (número de Reynolds inferior a 5000 sec"1), con el objeto de reducir ei atascamiento de las membranas y conservar la integridad de las células durante la operación de separación. Se puede utilizar diferentes membranas como, por ejemplo, membranas espirales (A ICON, ILLIPORE), membranas planas o fibras ahuecadas (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GP). También se puede optar por membranas en las cuales la porosidad, la carga o el injerto permiten efectuar una separación y una primera purificación frente a eventuales contaminantes que podrían estar presentes en el medio de cultivo, tales como proteínas celulares, ADN, virus u otras macromoléculas. En general, se preferirá utilizar métodos de producción y recolección de células que permitan conservar los GAGs y la heparina en el contenido intracelular, sin embargo, también se podrá recolectar los GAGs y la heparina en el medio de cultivo después de la lisis o de la desgranulación de las células. A la desgranulación se la puede provocar por medio de la fijación de ligandos específicos sobre los receptores presentes en la superficie de los mastocitos como, por ejemplo, la fijación de agentes de tipo alergogeno (tales como el fragmento Fe de los IgE o los análogos de ese fragmento) sobre los receptores IgE de los mastocitos. Como es el caso en el que a la heparina se la libera del contenido intracelular por desgranulación o lisis de todo o de parte de los mastocitos y está presente en el medio de cultivo en el momento de la etapa de separación, también se puede prever la utilización de membranas de porosidad más reducida. En ese caso, la separación de las células se combina con una etapa de ultrafiltración sobre una membrana, o sobre varias, donde la disposición y la porosidad permiten concentrar la heparina y, de ella, separar otras especies presentes en el medio, en función del tamaño y del peso molecular y, eventualmente, de la carga eléctrica o de las propiedades biológicas. En el marco de esta modalidad de puesta en acción, el umbral de hendidura de las membranas está comprendido, de preferencia, entre 1 000 y 5 Kda. Se puede utilizar sistemas de membranas similares a los que emplea la microfiltración como, por ejemplo, membranas en espiral, membranas planas o fibras ahuecadas. Ventajosamente se puede utilizar membranas que permitan efectuar una separación o una purificación de la heparina por el hecho de que sus propiedades de carga o de injerto de ligandos permiten una afinidad por la heparina (por ejemplo anticuerpos, AT II I, lectina). Otros agentes también pueden inducir una desgranulación de los mastocitos. A esos agentes se los puede clasificados en muchas categorías, tales como los agentes citotóxicos, las enzimas, los polisacáridos, las lectinas, las anafilatoxinas, los compuestos básicos (compuesto 48 / 80, sustancia P, y demás); el calcio (ionóforo A2318, ionomicina, y demás), [D. Lagunoff y 1. W. Martin, 1983: Agents that reléase histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxícol. , 23: 331 -51 1 ] [Agentes que liberan histamina de los mastocitos]. La utilización de un agente de desgranulación se puede efectuar de manera repetida sobre las mismas células que se mantiene en cultivo. En esta modalidad de producción, la productividad se aumenta de manera significativa por medio de la simplificación del procedimiento de recolección a partir del sobrenadante y por medio del mantenimiento en cultivo de las células. En el caso particular del Ionóforo A23187, la desgranulación de los mastocitos se puede inducir por medio del tratamiento de 2.1 06 C/ml de mastocitos con el ionóforo A23187 que tiene concentraciones que están comprendidas entre 1 a 100 µg/ml, o bien tiempos de acción que varían de 1 minuto a 4 horas. La lisis de los mastocitos se puede inducir, por ejemplo, mediante choque osmótico, utilizándose soluciones hipotónicas o hipertónicas; por choque térmico (congelación / descongelación); por choque mecánico (por ejemplo, sonicación o variación de presión); por acción de agentes químicos (NaOH, THESIT ®, NP40 ®, TWEEN 20 ®, B IJ - 58 ®, TRITON, X®- 1 00,....), o mediante la lisis enzimática (papaína, tripsina, ...) o por medio de la combinación de dos o de muchos de esos métodos. Para extraer y purificar la heparina a partir del lisado celular, separar las cadenas de polisacáridos del núcleo ser - glicina y separar las cadenas de heparina de los otros GAGs presentes en el medio de extracción, se podrá utilizar métodos similares a los que se emplea dentro del marco de la extracción y la purificación de heparina a partir de tejidos animales, métodos que son conocidos por sí mismos y se hallan descriptos en obras generales, tales como el manual de DUCLOS que se cita más arriba). A título de ejemplos no limitantes para separar la heparina de los ácidos nucleicos y de las proteínas celulares y solubilizarla, es decir, romper los enlaces con el núcleo de serglicina: se puede someter el lisado celular a una digestión enzimática, o más de una (pronasa, tripsina, pepsina y demás...); a los enlaces heparina - proteína se los puede hidrolizar en medio alcalino, en presencia de sulfatos o de cloruros; también se puede efectuar un tratamiento en medio ácido (por ejemplo, por medio del ácido tricloroacético en frío) para destruir los ácidos nucleicos y las proteínas provenientes de las células, a lo que se completa mediante el empleo de una solución iónica que permite disociar las interacciones GAGs - proteínas; también se puede efectuar una extracción por medio de la guanidina, después de la hidrólisis enzimática; para purificar la heparina solubilizada se puede, por ejemplo, precipitarla mediante acetato de potasio, por medio de un amonio cuaternario, por medio de acetona, y otros similares. A etapas de purificación se las puede completar o reemplazar de modo ventajoso por una etapa de cromatografía , o por más de una, en especial de cromatografía por intercambio de aniones o de cromatografía de afinidad. La presente invención también tiene por objeto las preparaciones de heparina susceptibles de que se las obtuviera a partir de cultivos de mastocitos, instrumentando un procedimiento que obedece a la presente invención. Las preparaciones de heparina de acuerdo con la presente invención, que poseen las propiedades biológicas comparables a las de las preparaciones de heparina que se obtiene en la técnica previa a partir de tejidos animales, se pueden utilizar en toda las aplicaciones usuales de la heparina. La presente invención se comprenderá mejor con ayuda del complemento de descripción que viene a continuación, que se refiere a ejemplos de preparación de la heparina a partir de cultivos de mastocitos y de caracterización de la heparina que se obtuviera.
EJEMPLO 1 : EXTRACCIÓN DE HEPARINA A PARTIR DE CULTIVOS DE MASTOCITOS Cultivo de mastocitos Se utilizó una línea de mastocitos de hígado fetal de cerdo y a una línea de mastocitos de hígado fetal de cerdo transfectadas por medio del antígeno T del virus SV40 de líneas CNCM T-2735 y CNCM T-2736, respectivamente. Las células se siembran a razón de 105 a 5 x 1 0s células / mililitro en medio MEMa completo, en presencia de TL3 porcina (2 ng / mi) y de SCF porcino (80 ng/ml). Los cultivos se llevan a cabo en caja de cultivo o en suspensión en matraz de un litro del tipo "agitador". Al crecimiento de las células se lo sigue diariamente durante 4 a 12 días. A la producción de heparina se la sigue en paralelo, por medio del análisis de los glicosaminoglicanos producidos en cultivo. Los resultados se presentan en las figuras 1 a 5. Las figuras 1 , 2 y 3 ilustran el crecimiento de mastocitos de hígado en cultivo estático en caja (Figura 1 ; siembra inicial: ? : 1 x 105 células; ¦ :2 x 105 células) y en suspensión en matraz (figura 2) y el crecimiento de los mastocitos de hígado transfectados en suspensión en matraz (figura 3). En esas experimentaciones, los cultivos en suspensión en matraz presentan una densidad de células máxima que se encuentra alrededor de 8 x 105 (para las células no transfectadas) hasta alrededor de 1 .5 x 06 células / mililitro (para las células transfectadas). El tiempo de duplicación, calculado durante la fase exponencial de crecimiento está comprendida entre 24 y 48 horas. Purificación de los glicosaminogiicanos Las células sufren una hidrólisis en medio alcalino en presencia de sal, con el objeto de romper los proteoglicanos y evitar las interacciones GAGs / proteínas de tipos iónicos. Este tratamiento comprende las etapas siguientes: 1. Tratamiento por medio de sosa en medio salino: esta etapa apunta a destruir las células y acortar los enlaces entre la heparina y su proteína madre. La etapa consta del agregado de 100 µ? de NaOH 1 M y de 800 µ? de NaCI 0.5M a un disco de 106 células; la mezcla así obtenida se calienta a baño de María a 80°C durante 30 minutos; después se la somete a efecto sónico durante 5 minutos, antes de que se la neutralice con HCI 1 N. 2. Extracción: la muestra hidrolizada se deposita sobre una columna de resina de intercambio aniónico (SAX, Varían), que retiene la heparina. La columna se lava tres veces en solución tampón Tris I HCI de pH 7,4; NaCI 0.5M, con el objeto de eliminar las proteínas y los demás GAGs, en especial el dermatano. Después, a la heparina se la eluye por medio de solución tampón Tris I HCI de pH 7.4; NaCI3M. 3. Desalinización/Liofilización: la eliminación del cloruro de sodio necesario para poder aplicar algunos métodos de análisis, a los que se describe más abajo, se efectúa por cromatografía de exclusión esté rica sobre gel SEPHADEX C10, a lo que sigue conductimetría. A las fracciones de heparina que se recoge enseguida se ias liofiliza, para concentrar la muestra. Análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida Esta técnica permite separar los GAGs en función de su tamaño y de su carga, y constituye un ensayo que permite verificar con rapidez la presencia o la ausencia de la heparina. La preparación purificada que se obtiene tal como se describe más arriba se deposita sobre gel de poliacrilamida Tris/tricina (grad iente de 10 a 20%), que permite separar moléculas de 30 a 1 kD, a razón de 20 µ? de preparación por sedimento. Sobre el mismo gel se deposita 25 ng de dermatano, 35 ng de heparina porcina estándar SPI M (4o patrón internacional de heparina porcina, mucus intestinal) y de la heparina extraída del mucus porcino y purificada por medio del tratamiento por sosa y purificación sobre resina de intercambio aniónico en las mismas condiciones que las que se describe aquí arriba. Una doble coloración con una solución de azul alciano después de nitrato de plata, tal como se describe en AL-HAKI M y LINHARDT (Applied and Theoretical Electrophoresis) (Electroforesis Aplicada y Teórica), 305 - 12, 1 991 ) permite revelar los glicosaminoglicanos (el nitrato de plata solo no revela más que las proteínas). A los geles enseguida se los analiza con un explorador de barrido (BIO - RAD), para cuantificar los diferentes GAGs. El límite de cuantificación de la heparina es de 1 0 ng por banda. Los resultados de un experimento se resumen en la Tabla 1 de más abajo, en la cual la cantidad de heparina producida por las células se expresa en µg I 1 06 células.
Tabla 1
A estos resultados también se los ilustra por medio de la figura 4 (curva = población celular; barras = producción de heparina). La figura 4 ilustra la producción de heparina en el transcurso del crecimiento de mastocitos de hígado en cultivo estático en caja. Las concentraciones de heparina que se observa generalmente están comprendidas entre 2 y 14 µ9 por 06 células, en cultivo estático y en suspensión.
EJEMPLO 2: CARACTERIZACIÓN DE LA PREPARACIÓN DE HEPARINA OBTENIDA A PARTIR DE CULTIVOS DE MASTOCITOS Perfil de disacáridos por medio de CLHP La composición en disacáridos permite diferenciar la heparina de los demás glicosaminoglicanos. El perfil de disacáridos de los glicosaminoglicanos producidos por medio de los mastocitos en cultivo se determinó según el método que describen LINHARDT y col. (Biomethods, 9, 183 - 97, 1997). La preparación de GAG s que se obtiene tal como se describe en el ejemplo de más abajo se despolimerizo por medio de una mezcla de eparinasas de Flavobacterium heparinium (heparinasas I, I I Y III, GRAMPIAN ENZYMES). Las condiciones utilizadas se describen en la publicación de LINHARDT y coL, que se cita más arriba. En carácter de testigo se despolimerizo la heparina estándar
SPIM en las mismas condiciones. En esas condiciones, la despolimerización es completa y produce disacáridos. Los disacáridos principales, en cantidad de ocho, ya fuere N-sulfatados, ya fuere N-acetilados, se representan en la figura 5. Detección por UV Esos disacáridos se separan e identifican por CLHP sobre columna de intercambiador de aniones, tal como describen LINHARDT y col; (trabajo citado más arriba). A los resultados los ilustra la figura 6, que representa el perfil de disacáridos de la preparación de heparina producida por un cultivo en matraz de mastocitos derivados de hígado fetal ( ¦.), respecto del perfil de disacáridos de la heparina estándar ( ). Esos resultados muestran que todos los disacáridos presentes en la heparina porcina de reference SPIM también están presentes en la heparina de mastocito, si bien en proporciones diferentes. La proporción IS / US es de 3.7. Detección por fluorescencia Un método similar, con una detección fluorimétrica, permite cuantificar de modo único los disacáridos IS e IIS, característicos de la heparina y de establecer la proporción. La despolimerización enzimática y la separación CLHP se conducen de la misma manera que la que se describe más arriba. A la separación la sigue una derivatización postcolumna, para formar un complejo fluorescente con la guanidina. Al trisulfato IS de disacárido que posee el factor de respuesta más fuerte mediante esta técnica, se lo detecta y cuantifica en relación con una solución de heparina estándar de concentración conocida. El límite de detección del método es del orden de 5 ng/ml de heparina en las muestras de cultivo celular. La tabla 2 de más abajo ¡lustra la proporción IS / US de cultivos celulares en el transcurso del tiempo. Tabla 2
EJEMPLO 3: CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LA HEPARINA POR DETERMINACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ANTI - XA Y ANTI - HA Actividades biológicas La inactivación de los factores Xa y lia es característica de la heparina y permite diferenciarla del sulfato de heparano y del dermatano. El método que se utiliza es el que se describe en la monografía de las heparinas de baja masa molecular de la Pharmacopée Européenne (Farmacopea Europea). 3a edición, (1997). La reacción se desarrolla en tres etapas: 1 . ATI 11 + Heparina ? [ATI 11 - Heparina} 2. (ATI 11 - Heparina) + Factor (exceso) ? [ATI 11 - Heparina - Factor] + Factor (residual) 3. Factor (residual) + sustrato cromóforo > pNA La cantidad de paraniltroanilina (pNA) que se libera se mide a 405 nm. Es inversamente proporcional a la cantidad de heparina. La actividad anti - Xa o anti - l ia se evalúa en relación con una recta de escalonamiento que se establece con el estándar SPIM. La sensibilidad del método es de 0.006 UT / mi. Los resultados que se obtuvo se representan en la tabla 3 de abajo. Tabla 3 Días de recolección 3 4 5 6 7 10 11 14 Células hígado, caja Anti - Xa 2,1 1 ,8 5,7 4,0 2,4 2,2 - 0,0 Anti - Na - - - - - - - - Relación anti - Xa / anti - - - - - - - - lia
Células hígado transfectadas, caja Anti - Xa 44 11,5 11 ,7 12,3 11,4 13,0 11 ,6 12,9 Anti - lia - - • - - - - Relación anti - Xa / anti - - - - - - - lia Células hígado, matraz Anti - Xa 0,7 - - - - - - - Anti - lia 1,4 - - - - - - - Relación anti - Xa / anti 0,6 - - - - - - - lia Células hígado transfectadas, matraz Anti - Xa - 3,1 - - - - - - Anti - lia - 14 - - - - - - Relación anti - Xa / anti - 0,2 - - - - - - lia
La actividad anti - xa o anti -lia de la heparina que se obtiene a partir de mastocitos en cultivo, se comparó con la actividad anti - Xa o anti - lia, respectivamente, de la heparina que se obtiene a partir de mucus porcino o de la heparina estándar. Los resultados se ilustran en la tabla 4 que viene a continuación:
Tabla 4
Caracterización del enlace con el ATIII El enlace entre la heparina y el A TI N se pone en evidencia a través de un retraso en la migración por medio de las técnicas de electroforesis, tal como se describe en LEE y LANDER (Proc. Nat'l. Acad. Sci. ,88,2/68 - 72, 1991 ). La electroforesis se lleva a cabo sobre gel de agarosa a 0.8%, en una solución con pH 3 (ácido acético / hidróxido de litio). A 100 µ? de muestra que se ha de someter a prueba, se le agregan 100 µ? de solución de concentración creciente de 584 a 183 µg/ml de ATI I I (origen humano; BIOGENIC). Se hace deposiciones de 100 µ? de muestra: la migración es de 30 minutos a 100 voltios. Los geles se fijan por medio de una solución de bromuro dehexadeciltrimetilamonio (CETAVLON - SIGMA) al 0.1 %. El revelado se lleva a cabo por medio del Azul A (0.08% en agua). A los geles se los explora por barrido y se los interpreta con el soporte lógico QUANTITY ONE (BIO- RAD). Los resu ltados se expresan en % de heparina ligada al ATI II . Los resultados que se obtiene en el caso de un cultivo en matraz de células de hígado transfectadas se ilustran en la figura 7. Se observa un enlace de ATI I I de 31 % (valor teórico, 33%) en presencia de parina estándar (SPIM) y de 27% en presencia de la heparina que se obtiene a partir de mastocitos en cultivo (compuesto). EJEMPLO 4: CULTIVO DE MASTOCITOS EN BIOREACTOR, EN MODALI DAD LOTE REPETI DO Se utilizó una línea de mastocitos porcinos provenientes de hígado fetal. A las células se las siembra a razón de 2.0 a 4.0 x 105 células por mililitro, en medio :M EM / F12 completo al que se hubo añadido I L3 porcina (2ng / mi) de SCF porcino (80 ng / mi). Al bioreactor se lo utiliza en una capacidad de 2 litros de medio de cultivo; la tensión de oxígeno del cultivo se mantiene entre 20% y 40% de la saturación; el pH , entre 7.0 y 7.4; la temperatura se mantiene en 1 7°C +/- 0.5°C, por medio de la circulación de agua termoestabilizada en la doble camisa del bioreactor. La agitación del cultivo se llevó a cabo mediante una hélice de tipo marino con un velocidad comprendida entre 80 y 150 vueltas / minuto. Después de 4 horas de cultivo, la densidad de células es de 1 ,3 x 1 06 células por mililitro, lo que corresponde a un tiempo de duplicación comprendido ente 24 y 28 horas. El día de la recolección al 80% del cultivo se lo separa para efectuar la extracción de la heparina; al resto del cultivo se lo mantiene en el bioreactor y se Ip diluye con med io de cultivo fresco, hasta una concentración comprendida entre 2.0 y 3.0 x 105 células / mililitro, de manera tal como se describe para una operación de producción en lote repetido. Tres días después de la dilución en modalidad lote repetido, la densidad de células que se obtiene es de 9.0 x 105 células, lo que corresponde a un tiempo de duplicación comprendido entre 24 Y 48 horas y que es comparable con la primera puesta en cultivo (figura 8). La purificación de la heparina se efectúa como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. La heparina purificada es analizada entonces por HPLC, como se describe en el ejemplo 2, por la utilización de heparina estándar SPIM a título de testimonio. La tabla 5 y la figura 9 presentan el perfil de disacáridos y porcentaje del núcleoproteínico de serglicina (Gly-Ser) de la preparación de heparina producida por el cultivo de mastocitos en suspensión derivados de hígado fetal de cerdo ( ¦.), respecto del perfil de disacáridos de la heparina estándar SPIM ( ). La tabla 6 representa el perfil de N-acetilación, de N-sulfatación y de O-sulfatación de disacáridos de la heparina producida por un cultivo de mastocitos en suspensión derivados de hígado fetal de cerdo respecto a las células de disacáridos de la heparina estándar SPIM.
Tabla 5
Tabla 6
Los resultados obtenidos son similares a los obtenidos en la utilización de una línea de mastocitos transfectados por el antigéno T del virus SV40.
EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DE HEPARINA EN EL SOBRENADANTE DE CULTIVO Y PUESTA EN ACCIÓN DE AGENTE DE DESGRANULACIÓN. Los experimentos son efectuados por una línea de mastocitos de hígado fetal porcino no transfectados. En el día 762 (contado a partir de la primera disposición del cultivo), la concentración se ajustara a 2 x 106 células por mililitro, se lo incuba durante una hora en medio de cultivo MEM que consta de 4 µg / mi de ionóforo A23187, que induce la degranulación de los mastocitos. Los GAGs totales, y los GAGs secretados producidos por las células son cuantificados en PAGE. La figura 1 0 muestra que se recupera del 70 al 75% de los GAGs en el sobrenadante después del tratamiento por ionóforo A23 87, con contra del 10% de las células no tratadas (0 pg/ml de
A231 87). Los mastocitos para los cuales se llevara a cabo la recolección de GAGs en el día 762, fueron puestos nuevamente en cultivo. Sin que se observe ninguna perdida de viabilidad ni velocidad de crecimiento. 21 días a más tardar, los mastocitos son sometidos a una nueva degranulación, y los GAGs son dosificados como se describe anteriormente. Un cultivo de mastocitos del mismo tiempo, se recoge después de la degranulación en el día 762 y son utilizados a titulo de control. Los resultados son ilustrados en la Figura 1 0 que muestra los porcentajes de GAGs secretados y son comparados con las células obtenidas en el momento de la primera degranulación y son comparafas con las células testigo de la misma edad.