CA2462714A1 - Preparation d'heparine a partir de cultures de mastocytes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne la production d'héparine à partir de cultures cellulair es de mastocytes, notamment de mastocytes de porc.

Description

PREPARATION D'HEPARINE A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES.
La présente invention est relative à la préparation d'héparine à partir de cultures de cellules.
L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant _ une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou iduronique).
Dans le cas de l' héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine.
L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (,Glc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-acétylëe, N-sulfatée ou O-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des. polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80~ des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de 0-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/disaccharide est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure ~de l' hêparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.
35~ Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane. Cette synthèse a lieu prêfèrentiellement dans une sous-population de mastocytes, les mastocytes séreux ou conjonctifs (CTMC). Ces mastocytes sont abondants dans la peau, et les sous-muqueuses respiratoires. Leur durée de vie est très longue (au moins 6 mois). Outre l'héparine, ils contiennent de l'héparane sulfate, et des quantités appréciables d'histamine (environ 10 pg/cellule, selon l'espèce animale).
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué

2 de résidus sérine et glycine, régulièrement alternés.
L' élongation de la draine d' héparine se fait à partir d' un tétrasaccharide, par ajouts successifs d'osamine et d'acides uroniques.
Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles . N-désacétylation, N -sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et O-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.
_ Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparïne est excrétée uniquement lors de la dégranulation des mastocytes.
L'héparïne joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique.
Actuellement, la majeure partie de l'héparine ~5 u~ilisëe est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf.
DUCLOS; « L'Héparine . fabrication, structure, propriétés, analyse »; Ed. Masson, Paris, 1984).
A l'hétérogénéité inhérente à l'héparine, s'ajoute 1a diversité des lots d'animaux à partir desquels elle est obtenue. Il en résulte une variabilitë très importante, se traduisant notamment au niveau de l'activité
biologique. En outre, il est difficile de disposer de

3 manière régulière d'un approvisionnement suffisant en matière première.
L'utilisation de cellules issues de mammifères pour la production de GAG ou de ou de protéoglycanes a déjà
Été proposëe.
Ainsi la demande WO 99/26983 décrit l'obtention de composés de type héparinique, qui peuvent ttre des protéoglycanes (HEP-PG) ou des glycosaminoglycanes (HFP-GAG) à partir de cellules de mastocytes de rat. Les composés ne sont pas de l'héparine. Les cellules ainsi solèes ne sont pas des lignëes établies. En outre le demandeur recommande la co-cultivation des cellules isolées ûvec des fibroblastes.
L'article de Wang et Kovanen (Circulation ~e.search,_ 84, 1, 74-83, 1999)décrit lui aussi l'isolement ~de mastocytes séreux de rat et la production de oro~èoglycanes à partir de ces cellules. Comme dans la de~-~ande WO 99/26983, les cellules utilisées pour la __~~duction de protéoglycanes ne sont pas des lignées 2C _rwbl_ies mais simplement des cellules isolées, puis s~__nulées pour produire des protéoglycanes.
La demande WO 90/14418, citée dans le rapport de __~herche, décrit des .lignées cellulaires obtenues à partir mastocytomes de souris et leur utilisation pour la 2~ __~,duction d'héparine. Ces cellules ont donc une origine _.~:unrale ce qui est susceptible de soulever des problèmes sanitaires. Un article de Montgomery et al (Proc Natl Acad Sc_ USA, 89, 23, 11327-11331, 1992) décrit lui aussi ;'-solement de mastocytomes de souris.
30 La présente invention propose de pallier les inconvénients mentionnés ci-dessus et de s'affranchir des problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de qualité, en utilisant une source commodément disponible de matiëre première homogène, et aux caractéristiques stables,

4 facilitant l'obtention de préparations d'héparine de qualité constante.
Les Inventeurs ont constaté qu'il était possible de produire en quantité importante à partir de cultures de lignées de mastocytes, de l'héparine possédant des propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du mucus intestinal porcin. L'utilisation de cultures cellulaires comme matière première permet en outre de co:Ztr~~ler les conditions de synthèse de l' héparine, et d'obtenir ainsi un produit possédant des caractéristiques re~~r ociuctibles .
La présente invention a pour objet un procédé de production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de mastocytes d'origine porcine et la récupération de 1'héparine à partir des cultures obtenues.
De manière préférée, lesdites cultures de mas~c~cytes sont des lignées de mastocytes d'origine :~o~-cine .
Le terme « culture » désigne ici, de manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées ?:~ w?iro. Une culture développée directement à partir d'un ~r-ëlévement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal rs~ dénommée « culture primaire ». Le terme « lignée » est employé à partir du moment où au moins un passage, et ?5 _;~:_~~ral eurent plusieurs passages consécutifs en sous-culture _~n~ été effectués avec succès, et désigne toute culture qui ~n est issue. (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91-101, 1990).
Avantageusement, lesdits mastocytes sont issus de cultures et notamment de lignées de mastocytes porcins obtenues comme décrit dans la Demande FR 0113608, ainsi que dans la Demande PCT intitulée « Cultures de mastocytes de porc et leurs utilisations » au nom de~l'INRA, et de l'ENVA
~_a~posée le même jour que la présente Demande. Parmi celles ci, des lignées préférées pour la mise en ouvre du procédé
conforme à l'invention sont .
- la lignée de mastocytes issus de foie fatal de porc déposée par l'INRA (147 rue de l'Université, 75007

5 Paris, France) auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 26, rue du D~~~cteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France) le 17 octobre ''001, sous le numéro I-2735 ;
- la lignëe de mastocytes issus de foie fatal de porc, et transfectés par l'antigène T du virus SV40 déposée par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous 1e numéro I-2736 ;
- la lignée de mastocytes issus de moelle osseuse de fétus de porc et transfectés par l'antigène T du virus SV40, déposée par l'INRA auprès de la CNCM 1e 17 octobre 2001, sous le numéro I-2734.
Préférentiellement ces mastocytes~ sont des mastocytes séreux.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEMa/DMEM, RPMI, IMDM, ...) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en combinaison ou de façon individuelle, tels que le SCF (Stem Cell Factor) à une concentration comprise entre 1 ng/ml et 1 yg/ml, et éventuellement l'IL3 (Interleukine 3) à une ~'S concentration comprise entre 0,1 ng/ml et 100 ng/ml, ou la PGE~' (prostaglandine E2), à une concentration comprise entre 1 nM et 1 ~~M.
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0, 5 ri et 20 ô (ZT/V) L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à
réduire la concentration protéique du milieu et les risques

6 PCT/FR02/03617 associés à l'utilisation de composés d'origine animale (I,AMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 200).
L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance, peut être obtenue par mutation controlée du phénotype cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933-8, 1996 ; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23, 1996) .
Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, , Eds. Spier et Griffiths, Academic Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986).
On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à
plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Academic Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983).
~'0 La culture peut également être rëalisée en suspension ou sur micro-support selon 1a technique décrite par VAN MEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967).
On peut êgalement utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour 5 les culte-'-es de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicitP de mise en ouvre à l'échelle industrielle (VGGEL e~ TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2"'r edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues 30 avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 :_ 10r cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70~ à 90~) pour les opérations 35 d'extraction des GAGS et d'isolement de l'héparine et en

7 conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'hëparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également étre utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 10''(2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000). Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieures à celles pouvant être obtenues en batch. La rêtention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses, ou matrice solide (V~1ANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992 ; VELEZ et al., J. Immunol.
Methods, 102(2), 275-278, 1987). Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 10~ et 5 x 10~
cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire ainsi que de l'accumulation de GAGS et d' héparine au sein des cellules: pH, pQ2, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbcrnës (par exemple glucose, fructose, galactose), mëtabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
A partir de 3 à 30 jours de culture, gênéralement à partir de 3 à 10 jours, de culture dans ces conditions les cellules peuvent être récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.

8 Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL
et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2"'1 Édition, Noyes Publication, Westwood, New jersey; U.S.A.).
Alternativement, ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à
~0 ~tm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à
gên êrer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds in_~ërieur à 5000 sec~z) afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant 1'~~pération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par el.emple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILT.IPORE, SARTORIUS, PALL, GF) .
On peut aussi choisir des membranes dont 1a ;~~~-r~sité, la charge ou le greffage permettent d' effectuer un e séparation et une première purification vis-à-vis d'~i-entuels contaminants pouvant. être présents dans le ?ru '_ieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, %-~~~us, ou autres macromolécules.
On peut utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver les GAGs et l'hêparine dans le contenu intra-cellulaire ; toutefois on ;peut aussi récolter les GAGS et l'héparine dans le milieu de culture après lyse ou dêgranulation des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fi_~ation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou

9 ' analogues de ce fragment) sur les rëcepteurs IgE des mastocytes. Dans le cas où l'héparine a été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mast~ocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation, l'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagêe. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape d'ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'hëparine et de la séparer des autres espèces presentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique, ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en ceuvre, le seuil de coupure -des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 KDa. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro filtration, par exemple, membranes spirales, membranes plans, ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge, ou du greffage de ligands présentant une affinité
pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine, peptides, nucléotides, etc ).
D'autres agents peuvent aussi induire une ciégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T . W. Martin.
1983. Agents that release his amine from mast tells. Ann.
Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les illF'meS cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à
partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules.
5 Dans le cas particulier de l'ionophore A23187, la dégranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.10 cellules/ml de mastocytes avec l' ionophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 à 100 ~g/ml et des temps d'action variant de 1

10 minute à 4 heures.
La lyse des mastocytes peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermiqûe (con gêlation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d' agents chimiques (NaOH, THESITTM, NP40TM, TWEEN 20TM, BRIJ-58T~~', TRITON XTM-100, . . . ) , ou par lyse enzymatique (papaïne, trypSln e,...), ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces mëthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du no~~au ser-glycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGS présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'ex_traction et la purification d'héparine à
oar-tir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, ~t décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, citê ci-dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et 1a solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine .
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc. . . ) ;

11 les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ;
- on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à
froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines prcwenant des cellules, complété par l'utilisation d'une Solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGS-protéines ;
- on peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, pûr l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions ou chromatographie d' affinitë.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptïbles d'être obtenues à
partir de cultures de mastocytes en mettant en ouvre un ~.~rocédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à
?5 '_'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent âtre utilisëes dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation d'héparine à partir de cultures de mastocytes et de caractérisation de l'héparine obtenue.

12 EXEMPLE 1 . EXTRACTION D'HÉPARINE Ä PARTIR DE CULTURES DE
MASTOCYTES
Culture des mastocytes Une lignée de mastocytes de foie fatal de porc, et une lignée de mastocytes de foie fatal de porc transfectées par l'antigène T du virus SV40 des (lignées CNCM I-?735 et CNCM I-2736, respectivement), ont été
utilisées ;
Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à
5 .. 10r' cellules/ml, dans du milieu MEMa complet en présence d'IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Les cultures sont réalisées en boîte de culture ou en suspension en flacon de 1 litre de type e< spinner ».
La croissance cellulaire est suivie journellement pendant 4 à 12 jours. La production d'héparine est suivie en parallèle, par l'analyse des glycosaminoglycanes produits en culture. Les résultats sont présentés dans les Figures 1 c , Les Figures l, 2 et 3 illustrent la croissance LO des mastocytes de foie en culture statique en boîte (Figure 1 ; ensemencement initial . ~ :1 x 105 cellules ;
~ . ? x 105 cellules) et en suspension en flacon (Figu_re ?), et la croissance des mastocytes de foie transfectés en suspension en flacon (Figure 3).
Dans ces expérimentations, les cultures en suspension en flacon présentent une densité cellulaire rnar~imale allant d'environ 8 x 105 (pour les cellules non transfectées) à environ 1,5 x 10~ cellules/ml (pour les cellules transfectées). Le temps de doublement, calculé
pendant la phase exponentielle de croissance, est compris entre 24 et 48 heures.
Purification des glycosaminoglycanes Les cellules subissent une hydrolyse en milieu alcalin en présence de sel afin de rompre les l3 protéoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de types ioniques.
Ce traitement comprend les étapes suivantes .
1. Traitement par la soude en milieu salin:
cette étape vise à détruire les cellules et à couper les liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
L' étape comprend l' ajout de 100 ~.rl de NaOH 1 M
at de 800 ~.rl de NaCl 0, 5 M à un culot de 106 cellules . Le mélange ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à 80°C
pendant 30 minutes puis soniqué pendant 5 minutes avant d'être neutralisê avec du HCl 1 N.
2. Extraction . l'échantillon hydrolysé est déposé sur une colonne de résine échangeuse d'anions (SAX, ~'arian), qui retient l'héparine. La colonne est lavée trois fois en tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 0,5 M afin d'éliminer les protéines et les autres GAGS, notamment le dermatane.
Puis l'héparine est éluée par 1 ml de tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 3 M.
3. Dessalage/Lyophilisation . l'élïmination du chlorure de sodium (nécessaire pour pouvoir appliquer certaines des méthodes d'analyse qui sont décrites ci zprès) s'effectue par chromatographie d'exclusion stérique sur gel SEPHADEX G10, suivié par conductimétrie. Les _ractions d'héparine collectées sont ensuite lyophilisées ;pour c~>>ncentrer l' échantil lon.
Analyse par électrophorése en gel de polyacrylamide Cette technique permet de séparer les GAGS selon heur taille et leur charge, et constitue un test permettant de vérifie r rapidement 1a présence ou l'absence d'héparine.
La préparation purifiée obtenue comme décrit ,::i-dessus est déposée sur gel de polyacrylamide Tris/tricine (gradient de 10 à 20~) permettant de séparer des molécules de 30 à 1 kDa, à raison de 20 ~~1 de préparation par dëpôt. On dépose sur le même gel 25 ng de wlerrnatane, 25 ng d' héparine porcine standard SPIM ( 4ème étalon international d'héparine porcine, mucus intestinal), et de l'héparine extraite de mucus porcin et purifiée par traitement par la soude et purification sur résine ëchan geuse d'anions dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus.
Une double coloration avec une solution de bleu alcian puis du nitrate d'argent comme décrit dans AL,-HAKIM
et LINHARDT (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, 305-12, 1991) permet de révéler les glycosaminoglycanes (le nitrate d'argent seul ne révèle que les protéines).
Les gels sont ensuite analysés par un scanner (BIO-RAD) pour quantifier les différents GAGS. La limite de quantification de l'héparine est de 10 ng par bande.
Les résultats d'une expérimentation sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous, . dans lequel la quantité
d' héparine produite par les cellules est exprimée en )..~.g/106 cellulés.
Tableau 1 Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14 I Cellules foie, bote 2,6 3,5 4,4 6,5 3,7 4,2 - 8,1 Cellules foie transfectes,2,6 6,9 9,0 11,710,8 8,5 5,4 7,1 bote Cellules foie, flacon 1,2 - - - - - -Cellules foie transfectes,- 2,1 - - - - - -flacon Ces résultats sont également illustrés par 1a Figure 4 (courbe - population cellulaire ; barres production d'héparine).
La Figure 4 illustre la production d'héparine au cours de la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte.
Les concentrations en héparine généralement observées sont comprises entre 2 et 14 ~.~g pour 106 cellules, en culture statique et en suspension.

EXEMPLE 2 . CARACTÉRISATION DE LA PRÉPARATION D'HÉPARINE
OBTENUE Ä PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES
Profil disaccharidique par CLHP
La composition en disaccharides permet de 5 différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes.
Le profil disaccharidique des c~lycosaminoglycanes produits par les mastocytes en culture a été déterminé selon la méthode décrite par LINHARDT et al. (Biomethods, 9, 183-97, 1997).
10 La prëparation de GAGs obtenue comme décrit à
l'Eemple 1 ci-dessus a été dépolymérisée par un mélange d'hêparinases de Flavobacterium heparinium (héparinases I, II, et III, GRAMPIAN ENZYMES). Les conditions utilisées sont décrites dans la publication de LINHARDT et al., citëe 15 ci-dessus.
A titre de témoin, l'héparine standard SPIM a été dépolymérisée dans les mêmes conditions.
Dans ces conditions, la dépolymérisation est complète, et produit des disaccharides.
~0 Les disaccharides principaux, au nombre de huit, qui sont soit N-sulfatés, soit N-acétylés sont représentés sur la Figure 5.
Détection par UV
Ces disaccharides sont sêparés et identifiés par CLHP, sur colonne échangeuse d'anions comme décrit par LINHARDT et al., (cité ci-dessus).
Les résultats sont illustrés par la Figure c~,représentant le profil disaccharidique de la préparation d'héparine produite par une culture en flacon de mastocytes dérivés du foie fcetal (~), par rapport au profil disaccharidique de l'héparine standard (~).
Ces résultats montrent que tous les disaccharides présents dans l'héparine porcine de référence SPIM sont également présents dans l'héparine de mastocyte, bien que dans des proportions différentes. Le rapport IS/IIS est de 3,7.
Détection par fluorescence Une méthode similaire avec une détection fluorimétrique permet de quantifier uniquement les disaccharides IS et IIS, caractéristiques de l'héparine, et d'en faire le rapport.
La dépolymérisation enzymatique et la séparation c_,LHP sr_,nt conduites de la même manière que celle décrite ci-dessus.
La séparation est suivie d'une dérivatisation post-colonne, pour former un complexe fluorescent avec la guanidine .
Le disaccharide trisulfaté IS qui possède le facteur de réponse le plus fort par cette technique, est détecté et quantifié par rapport à une solution d'héparine standard de concentration connue.
La limite de détection de la méthode est de l'ordre de 5 ng/ml d'héparine dans les échantillons de ~0 culture cellulaire.
Le Tableau 2 ci-dessous illustre le rapport IS/TIS de cultures cellulaires au cours du temps.
Tableau 2 Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14 Cellules foie, bote 1,9 1,6 1,6 1,4 1,4 1,3 - 1,4 Cellules foie transfectes,4,1 5 4,6 6,6 3,7 4,9 5,6 5,7 bote Cellules foie, flacon 2,3 - - - - - -Cellules foie transfectes,- 2,9 - - - - - -flacon EXEMPLE 3 . CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HEPARINE PAR
DETERMINATION DES ACTIVITES ANTI-XA ET ANTI-IIA
Activités biologiques L'inactivation des facteurs Xa et IIa est caractëristique de l'héparine, et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane.

La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie des héparines de basse masse moléculaire de la Pharmacopée Européenne 3eme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes .
1. ATIII + Héparine --~, [ATTII - Héparine]
1'. [ATIII - Héparine] + Facteur(excès) -~,[ATIII - Héparine - Facteur] + Facteur(résiduel) 3. Facteur(résiduel) + substrat chromophore ~,pNA
La quantité de paranitroaniline (pNA) libérée est mesurée à 405 nm. Elle est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
L'activitë anti-Xa ou anti-IIa est évaluée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM.
La sensibilitë de la méthode est de 0,006 UI/ml.
Les résultats obtenus sont représentés sur le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14 Cellules foie, boite j Anti-Xa 2,1 1,8 5,7 4,0 2,4 2,2 - 0,0 Anti-Ila - - - - - - - -Ratio anti-Xa/anti-Ila- - - - - - - -Cellules foie transfectes, boite Anti-Xa 44 11,511,7 12,311,4 13,011,6 12,9 Anti-Ila - - - - - - - -Ratio anti-Xa/anti-Ila- - - - - - - -Cellules foie, flacon Anti-Xa 0,7 - - - - - - -Anti-I la 1,4 - - - - - - -Ratio anti-Xa/anti-Ila0,6 - - - - - - -i Cellules foie transfectes, flacon - 3,1 i _ _ - _ _ _ Anti-Xa Anti-Ila - 14 - - - - - -Ratio anti-Xalanti-Ila- 0,2 - - - - - -L'activité anti-Xa ou anti-IIa de l'héparine obtenue à partir de mastocytes en culture a été comparée à
l'activité anti-Xa ou anti-IIa, respectivement, de l'héparine obtenue à partir de mucus porcin ou de l'héparine standard. Les résultats sont illustrés dans le Tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4 Anti-Xa Anti-Ila Xa/Ila UI/m UI/m UI/m Hparine de mastoc tes 18 3,1 14 3 0,2 1 Hparine de mucus 80 81 1 I Hparine standard 180 180 1 ~

Caractérisation de la liaison à l'ATIII
La liaison entre l' héparine et l' ATIII est mise en ëvidence par un retard de migration par des techniques d'electrophorèse comme décrit dans LEE et LANDER (Pros.
Ivatl. Acad. Sci., 88, 2768-72, 1991).
L'électrophorèse est réalisée sur gel d'agarose à ~,,8c. dans une solution à pH 3 (acide acétique/hydroxyde cie l i thium) .
A 100 ~.rl d'échantillon à tester, on ajoute 100 fil de solution de concentration dëcroissantes de 584 à
183 yg/m1 d'ATIII (origine humaine ; BIOGENIC).
Des dépôts de 100 ~.~1 d' échantillon sont faits .
L.a migration est de 30 minutes à 100 volts.
Les gels sont fixés par une solution de bromure ~~i' h.~__adécyltriméthyl ammonium (CETAVLON-SIGMA) à 0, 1$.
La révélation est effectuée par 1'A~ure A (0,08 .~a:~s l' eau) .
Les gels sont scannés et interprétés avec le ~0 1 ,~~=tic? el QUANTITY ONE (BIO-RAD) .
Les résultats sont exprimés en ~ d'héparine liée ~' ATII i .
Les résultats obtenus dans le cas d' une culture ~n flacon de cellules de foie transfectées sont illustrés ~a-- la Fi Bure 7 .
On observe une liaison de l'ATIII de 31~ (valeur Zhéorique 33~) en présence d'héparine standard (SPIM), et ~~ie 27=:,:, en prësence de l'héparine obtenue à partir de mastocytes en culture (composé).

EXEMPLE 4 . CULTURE DE MASTOCYTES EN BIO-RÉACTEUR EN MODE
BATCH RÉPÉTÉ
Une lignée de mastocytes issus du foie fatal ~~orcin non transfectée a ëté utilisée. Les cellules sont ensemencées à raison de 2.0 à 4.0 x105 cellules par ml dans du milieu DMEM/F12 complet additionné d'IL3 porcine(2ng/ml)de SCF porcin (80ng/ml).
Le bioréacteur utilisé a une capacité de 2 litres de milieux de culture, 1a tension d'oxygène de la culture est maintenue entre 20~ et 40~ de la saturation, le pH entre 7.0 et 7.4, la température est maintenue à 37°C
+/- 0.5°C par circulation d'eau thermostatée dans la double enveloppe du bioréacteur. L'agïtation de la culture est réalisée par une hélice de type marine avec une vitesse comprise entre 80 à 150 tours/minutes.
Après 4 jours de culture la densité cellulaire est de 1.3 x 106 cellules/ml, correspondant à un temps de doublement compris entre 24 et 48h. Le jour de la récolte, 80°-,-; de la culture est prélevée pour l'extractïon d'héparine, 1e reste de la culture est maintenue dans le bio-réacteur et diluée avec du milieu frais à une concentration comprise entre 2.0 à 3.0x105 cellules/ml tel que décrit pour une opération de production en batch répété. Trois jours après dilution en mode batch répété, la densité cellulaire obtenue est de ~.U x 105 cellules/ml, correspondant à un temps de doublement compris entre 24 et 98 heures et comparable à la première mise en culture(Figure 8).
La purification de l'héparine s'effectue comme décrit dans l'exemple 1.
L'héparine purifiée est alors analysée par HPLC, comme décrit dans l'ex_emple 2, en utilisant l'héparine standard SPIM à titre de témoin.
Le tableau 5 et la figure 9 représentent le profil disaccharidique et la proportion du noyau protéique serglycine (Gly-Ser) de la préparation d'héparine produite par la culture de mastocytes en suspension dérivés du foie fo~tal porcin (~), par rapport au profil obtenu pour l'l~ëparine standard SPIM
5 Le tableau 6 représente le profil de N-acétylation, de N-sulfatation et de 0-sulfatation des disaccharides de l'héparine produite par la culture de mastocytes en suspension dérivés du foie fatal porcin par rapport à celui des disaccharides de l'héparine SPIM standard.
10 Tableau 5 Standard % Culture GI -Ser 3,5 3,2 IVa 4 5,4 IVs 3,1 7,6 Ila 3,1 4,4 Illa 1,5 0,7 I Is 8,4 11,9 I Ils 7,2 17,1 la 1,3 0,2 Is 62 48,8 Tableau 6 Disaccharides Standard % Culture Actyls 11,8 10,7 2-O-sulfats 23 8 I 6-O-sulfats 42 42 I N-Sulfats 83 85 2-O-sulfats 84 77 6-Osulfats 89 Sulfates/carboxylates 2,4 21 ~

Des résultats similaires sont obtenus lorsque utilise une lignée de mastocytes transfectés par l'rn~igène T du virus SV40.
15 E~EM PLE 5 . PRODUCTION D'HÉPARINE DANS LE SURNAGEANT DE
CULTURE PAR MISE EN OUVRE D'UN AGENT DE DÉGRANULATION.
Les expérimentations ont été effectuées sur une lignée de mastocytes de foie fatal non-transfectés.
Au 762eme jour (compté à partir de la première 20 mise en culture), la concentration de mastocytes a été
ajustée à 2x.10 cellules/ml, et la culture est incubée pendant une heure en milieu MEM comprenant 4ug/ml de l'ionophore A23187, ce qui induit la dégranulation des mastocytes.
Les GAGs totaux, et les GAGs sécrétés produits l~~ar les cellules sont quantifiés en PAGE. La Figure 10 montre que 70 à 75 ô des GAGS sont retrouvés dans le surnageant après traitement par l'ionophore A23187, contre environ 10~ dans les cellules non traitées (0 ug/ml de A23187).
Les mastocytes pour lesquels la récolte de GAGs a été réalisée au 762eme jour de culture ont été remis en culture. On n'observe aucune perte de viabilité et de vitesse de croissance.
21 jours plus tard, ces mastocytes sont soumis à
une nouvelle dégranulation, et les GAGS sont dosés comme décrit ci-dessus. Une culture de mastocytes du même âge, n'ayant pas subi de dégranulation au 762eme jour est utilisée à titre de contrôle.
Les résultats sont illustrés par la Figure 10 qui montre que le pourcentages de GAGS sécrétés est ~0 comparable à celui obtenu lors de la première dégranulatïon et aussi comparable à celui obtenu avec les cellules COn trôle du même âge.
Des rësultats sïmilaires sont obtenus lorsque l'on utilise une lignée de mastocytes transfectés par î'antigëne T du virus SV40.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1) Procédé de production d'héparine, caractérisé
en ce qu'il comprend la culture de mastocytes d'origine porcine et la récupération de l'héparine à partir des cultures obtenues.

2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé
en ce que lesdites cultures de mastocytes sont des lignées de mastocytes d'origine porcine.

3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont issus de moelle osseuse de fétus de porc ou de foie f~tal de porc.

4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont des mastocytes séreux.

5) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont issus d'une lignée de mastocytes choisie parmi :
- la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro I-2735 ;
- la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro I-2736 ;
- la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro I-2734.

6) Préparation d'héparine susceptible d'être obtenue par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5.