KR20040071127A

KR20040071127A - 비만세포 배양물로 부터 헤파린의 제조방법

Info

Publication number: KR20040071127A
Application number: KR10-2004-7005914A
Authority: KR
Inventors: 칸피에르; 쟝-마끄 귈루메; 헬렌 모니크 마리 리갈
Original assignee: 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2004-08-11
Also published as: NZ532414A; ZA200402304B; CA2462714A1; FR2831186A1; NO20041633L; PL368599A1; BR0213478A; MXPA04003740A; IL161066A0; FR2831186B1; CO5570711A2; WO2003035886A3; EP1438415A2; US20050042733A1; HUP0401794A2; JP2005506092A; AR036915A1; CN1575341A; WO2003035886A2

Abstract

본 발명은 비만세포 배양물, 좀 더 구체적으로 돼지 비만 세포로 부터 헤파린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

비만세포 배양물로 부터 헤파린의 제조방법{Method for preparing heparin from mast cell cultures}

헤파린(heparin)은 아미노 당(D-글루코사민 또는 갈락토사민) 및 우론산(D-글루쿠로닉 또는 이두로닉)으로 이루어진 이탄당 서열의 연속을 함유하는 선형 다당류를 포함하는 글리코사미노글리칸(GAG) 패밀리에 속한다.

헤파란 설페이트(heparan sulfate)와 함께, 글루코사미노글리칸 서브패밀리에 속하는 헤파린의 경우, 아미노 당은 D-글루코사민이다. 상기 우론산은 글루쿠론산(Glc) 또는 이두론산(Ido)이다. 상기 글루코사민은 N-아세틸레이트화, N-설페이트화 또는 O-설페이트화될 수 있다.

통상적으로, "헤파린"은 글루코사민 잔기의 80% 이상이 N-설페이트화되고 O-설페이트화된 수가 N-설페이트화된 수보다 많은 설페이트화된 정도가 매우 큰 다당류를 일컫는다. 상기 설페이트/이탄당류 비율은 일반적으로 헤파린의 경우 2보다 크다. 그러나, 헤파린의 구조는 매우 복잡해서, 매우 다른 비율을 함유할 수 있는 사슬들이 존재한다.

모든 GAG와 같이, 헤파린은 프로테오글리칸(proteoglycan)의 형태로 합성된다. 상기 합성은 비만세포(mast cell)의 아집단, 혈청 또는 결합 조직 비만세포(CTMCs)에서 우선적으로 일어난다. 상기 비만 세포는 피부 및 호흡기 점막하(respiratory submucosae)에 풍부하다. 상기 비만세포들은 매우 긴 수명(적어도 6개월)을 갖는다. 비만세포들은 헤파린뿐만 아니라, 헤파란 설페이트와 상당량의 히스타민(동물 종류에 따르면, 대략 10pg/셀)을 함유한다.

헤파린 합성의 첫번째 단계는 규칙적으로 반복되는 세린 및 글리신 잔기로 이루어진 세글리신(serglycine) 단백질 코어의 형성이다. 헤파린 사슬의 연장 단계는 오사민(osamine)과 우론산의 연속적인 첨가를 통해 사탄당으로부터 일어난다.

따라서, 형성된 프로테오글리칸은 N-설페이트화, D-글루쿠론산 에피머화, 및 O-설페이트화의 많은 연속적인 변형을 겪게 된다.

그러나, 이러한 완전한 성숙과정은 단지 프로테오글리칸의 일부에서 일어나며, 헤파린의 이형성(heterogeneity)을 초래하는 매우 큰 구조적 다양성을 생성시킨다.

상기 다당류 사슬은 이후 엔도글루쿠로니데이즈(endoglucuronidase)에 의해 세글리신으로 부터 절단된다. 상기 사슬은 5000 내지 30000Da의 분자량을 갖는다. 이들은 알카라인 프로테아제와 함께 복합체를 형성하고 따라서 비만 세포 그래뉼로 저장된다. 헤파린은 비만세포의 탈과립시에만 배출된다.

헤파린은 생물학적으로 중요한 작용을 하는데, 특히 지혈(hemostasis) 과정에서 중요하며, 구체적으로 항응고제 및 항트롬빈제와 같은 치료학적 분야에서 매우 광범위하게 사용된다.

최근에 사용되는 대부분의 헤파린은 장점막으로 부터 분리되는데, 단백질 가수분해를 통해 추출되고 음이온 교환 수지로 정제하여 분리된다(다양한 헤파린의 제조방법에 대한 리뷰 참조, cf. DUCLOS: "L'Heparine: fabrication, structure, proprietes, analyse"; Ed. Masson, Paris, 1984).

헤파린은 고유한 이형성뿐만 아니라 동물 뱃치로 부터 얻을 수 있는 헤파린의 다양성이 존재한다. 헤파린의 생물학적 활성 정도를 반영하는 상당한 다양성이 존재한다. 따라서, 헤파린을 원료 물질로 충분히 공급하기란 매우 어렵다.

GAG 또는 프로테오글리칸을 제조하기 위해 포유류로 부터 유래된 세포를 사용하는 것은 이미 제안되었었다.

PCT 공개번호 제WO 99/26983호에는 랫트(rat)의 비만세포로 부터 프로테오글리칸(HEP-PG) 또는 글리코사미노글리칸(HEP-GAG)으로 헤파린 타입의 화합물을 얻는 방법에 대해 기술하고 있다. 상기 화합물은 헤파린은 아니다. 상기 분리된 세포는 확립된 세포계가 아니다. 또한, 상기 PCT 출원은 분리된 세포를 섬유아 세포(fibroblast)와 함께 배양하는 것을 추천한다.

왕과 코바넨의 논문(Circulation Research, 84, 1, 74-83, 1999)에는 랫트(rat)의 혈청 비만 세포의 분리 및 이들 세포로 부터 프로테오글리칸을 생산하는 방법에 대해 기술하고 있다. PCT 공개번호 제WO 99/26983호에서와 같이, 상기 프로테오글리칸의 생산에 사용된 세포는 확립된 세포계가 아니고, 단순히 세포를 분리하고 프로테오글리칸을 생산하도록 자극시켰다.

조사 자료에 언급된 PCT 공개번호 제WO 90/14418호에는 마우스(mouse) 비만세포종(mastocytomas)으로 부터 얻은 세포계와 이를 사용하여 헤파린을 생산하는 방법에 대해 기술하고 있다. 상기 세포의 유래는 건강 상 문제를 야기하는 종양이다. 몽고메리 등의 논문(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 23, 11327-11331, 1992)에는 또한 마우스 비만세포종의 분리 방법에 대해 기술하고 있다.

본 발명은 세포 배양물로 부터 헤파린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 목적은 편리하게 사용할 수 있는 안정성을 갖는 균일한 원료 물질원을 사용하고, 일정한 양의 헤파린을 생산하도록 촉진하여 상술한 문제점을 해결하고 양과 질적인 면에서의 문제를 피하는 것이다.

본 발명에서는 비만 세포계 배양물로 부터 돼지 장점막에서 추출한 헤파린과 유사한 특성을 갖는 상당한 양의 헤파린을 생산할 수 있음을 확인하였다. 원료 물질로 세포 배양물을 사용하는 것은 헤파린을 합성하기 위한 조건을 제어할 수 있게 하며, 따라서 복제가능한 특성을 갖는 산물을 얻을 수 있다.

본 발명의 목적은 돼지 유래의 비만 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로 부터 헤파린을 회수하는 단계를 포함하는 헤파린 제조방법을 제공하는 데 있다.

바람직하게, 상기 비만세포 배양물은 돼지 유래의 비만 세포계이다.

일반적으로 "배양"은 시험관내(in vitro)에서 성장시킨 세포 또는 세포의 세트를 의미한다. 동물로 부터 추출한 세포 또는 조직 샘플로 부터 직접 발육시킨 배양을 "초대 배양(primary culture)" 이라 한다. "세포계(line)"는 적어도 한 주기가 지나고, 대체로 몇번의 연속적인 주기로 계대배양이 성공적으로 수행된, 이로부터 유래된 모든 배양을 의미한다(SCHAEFFER, In vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91-101, 1990).

바람직하게, 상기 비만 세포는 돼지 비만세포 배양물 및 좀 더 구체적으로는, 인라 및 엔바(INRA and ENVA)에 의한 본 발명과 동일한 날에 "돼지 비만세포의 배양물 및 이의 사용방법"의 제목으로 프랑스 특허출원 제0113608호 및 PCT 출원에 기술된 바와 같이 얻은 돼지 비만 세포계로 부터 유래되었다. 본 발명에 따른 방법에 바람직한 세포계는 다음과 같다:

- 2001년 10월 17일자에 INRA(프랑스, 파리 75007, 대학 가 147)에 의해 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)(프랑스 국립 미생물 균주 센터, 파스퇴르 연구소, 프랑스, 75724 파리 세덱스 15, 닥터 루 거리 26)에 기탁번호 I-2735호로 기탁된 돼지 태아 간 유래의 비만 세포계;

- 2001년 10월17일자에 INRA에 의해 CNCM에 기탁번호 I-2736호로 기탁된 돼지 태아 간에서 유래되고 SV40 바이러스 T 항체로 트랜스펙션된 비만 세포계;

- 2001년 10월17일자에 INRA에 의해 CNCM에 기탁번호 I-2734호로 기탁된 돼지 태아 간에서 유래되고 SV40 바이러스 T 항체로 트랜스펙션된 비만 세포계.

바람직하게, 상기 비만세포는 혈청 비만세포이다.

상기 비만세포는 바람직하게는 1ng/㎖ 내지 1㎍/㎖ 농도의 SCF(stem cell factor), 0.1ng/㎖ 내지 100ng/㎖ 농도의 IL3(interleukin 3), 또는 1nM 내지 1μM 농도의 PGE2(prostaglandin E2)와 같은 성장 인자가 단독 또는 혼합되어 보충된 특별한 배양 배지(MEMα/DMEDM, RPMI, IMDM 등)에서 배양된다.

상기 배지는 또한 0.5 내지 20%(v/v) 농도로 소의 혈청을 보충할 수 있다.

배양 배지에 소 혈청 첨가는 AIMV(INVITROGEN)과 같은 무혈청 배양 배지 사용으로 교체하여 배지내의 단백질 농도와 동물 유래의 화합물 사용과 관련된 위험성을 줄일 수 있다(KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-110, 200).

혈청 및/또는 성장 인자의 첨가에 의존하지 않고 형질전환제(transformer) 및/또는 불멸화제(immortalizing agent)의 사용을 통해 세포의 표현형을 조절가능하게 돌연변이시킨 세포를 얻을 수도 있다(TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933-8, 1996; PIAO and BERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23, 1996).

상기 비만세포는 예를 들어, 그리피스(Griffiths) 등이 기술한 진핵 세포의 대량 배양을 위해 개발된 기술을 사용하여 배양할 수 있다(Animal Cell Biology, Eds. Spier and Griffiths, Academic Press, London, Vol. 3, 179-220, 1986). 필립스(Philips) 등(Large Scale Mammalian Cell Cultrue, Eds. Feder and Tolbert, Academic Press, Orlando, USA, 1985)이나 미즈라히(Mizrahi)(Process Biochem, August, 9-12, 1983)가 기술한 수 ㎥ 보다 큰 부피를 갖는 생물 반응기를 사용할 수도 있다.

상기 배양은 또한 현탁액 상태로 수행되거나 또는 반 미젤(Van Mezel)(Nature, 216, 64-65, 1967)이 기술한 기술에 따라 미세지지체(microsupport)상에서 수행될 수 있다.

또한 뱃치 배양 시스템을 사용할 수 있는데, 이는 산업적 규모로 사용할 때 보다 간편하게 사용할 수 있어 진핵세포 배양에서 일반적으로 사용된다(Vogel andTodaro, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, USA, 1997). 상기 시스템으로 얻게되는 세포 농도는 일반적으로 10⁶내지 5×10⁶세포/㎖이다.

뱃치 배양의 생산성은 바람직하게 GAG 추출 및 헤파린 분리 조작용으로 생물반응기에서 일부 세포를 제거하고, 새로운 배양을 시작하도록 상기 생물 반응기에 잔여 세포를 남겨두어 증가시킬 수 있다(70% 에서 90%). 이러한 "반복 뱃치" 배양 모드에 있어서, 또한 세포 성장기의 최적 요소와 세포내에서 GAGs 및 헤파린의 축적이 증가되는 최적 요소를 확인할 수 있다. 세포 정체(retention)거나 또는 세포 정체가 아닌 연속 관류-패드 배양 시스템을 또한 사용할 수 있다(Velez et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987; Chaubard et al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000). 본 발명에 있어서, 관류-패드 배양 시스템의 사용은 반응기 내에 세포가 정체되도록 하며, 뱃치 배양보다 세포 성장 및 생산이 높아지게 된다. 상기 정체는 스핀-필터, 중공 섬유 또는 고상 메트릭스 타입의 정체 시스템에 의해 영향을 받을 수 있다(Wang et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992; Velez et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987). 상기에서 얻어지는 세포 농도는 일반적으로 10⁷내지 5×10⁷세포/㎖이다. 생물반응기에서의 배양은 온-라인 측정 센서의 사용을 통해, 세포 성장 및 세포내의 GAGs 및 헤파린 축적의 물리 화학적 요인들: pH, pO₂, 환원/산화, 비타민, 아미노산, 탄소계 기질과 같은 성장기질(예를 들어, 글루코즈, 플룩토즈, 갈락토즈), 유산염 또는 수용성 암모니아같은 대사산물을 보다 잘 제어할 수 있게 한다.

상기 조건하에서, 3 내지 30일간의 배양 이후, 일반적으로는 3 내지 10일간의 배양 이후에 세포를 일반적인 원심분리 또는 여과법을 통해 회수하고 배양 배지와 분리시킬 수 있다.

이때 다양한 원심분리 시스템을 사용할 수 있는데 예를 들어, 보겔 및 토다로에 의해 기술된 것이 있다(Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Edition , Noyes Publication, Westwood, New Jersey, USA).

선택적으로, 원심분리와 결합시킬수도 있는, 분리단계는 세포의 평균 직경(5 내지 20㎛) 미만의 다공도를 갖는 멤브레인(membrane)을 사용하여 용액/현탁액내의 다른 화합물을 동시에 통과시키면서 절선(tangential) 미세여과법을 통해 수행될 수 있다. 상기 멤브레인에 적용되는 절선 흐름 속도 및 압력은 멤브레인의 응고를 줄이고 분리 조작시 세포의 보전성(integrity)을 보호하기 위해 낮은 전단력(5000sec^-1미만의 레이놀드수)이 발생하도록 선택한다.

다양한 멤브레인, 예를 들어, 원형 멤브레인(Amicon, Millipore), 평면 멤브레인 또는 중공 섬유(Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF)를 사용할 수 있다.

또한 세포 단백질, DNA, 바이러스, 또는 다른 고분자등 배양 배지내에 존재하는 불순물의 분리 및 제1 정제를 수행할 수 있는 다공도, 전하 또는 그래프팅(grafting)을 갖는 멤브레인을 선택한다.

세포내의 GAGs 및 헤파린의 함량을 유지시킬 수 있는 생산 방법 및 세포 회수 방법을 사용해야 하는데; 그러나, 상기 GAGs 및 헤파린은 세포를 파쇄 또는 탈과립시킨 이후에 배양 배지로 부터 회수할 수도 있다.

상기 탈과립은 비만세포의 표면에 존재하는 수용체에 특정 리간드(ligand)를 결합시켜서 야기시킬 수 있는데, 예를 들어 비만세포의 IgE 수용체에 알레르겐-타입의 작용제(agent)를 결합시키는 것이 있다. 비만세포 전체 또는 일부의 탈과립 또는 파쇄를 통해 세포 내부로 부터 헤파린이 방출되면, 분리 단계시에 배양 배지내에 헤파린이 존재하게 되며, 보다 작은 다공도를 갖는 멤브레인를 사용할 수 있다. 이러한 경우에는, 상기 세포 분리 단계는 하나 이상의 멤브레인상에서의 초여과단계를 포함하는데, 헤파린을 농축시키고 배지내에 존재하는 다른 종류의 물질들을 크기 및 분자량에 따라서, 선택적으로는 전하 또는 생물학적 특성에 따라서 분리시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 멤브레인의 분리 범위는 1000 내지 5kDa이 바람직하다. 원형 멤브레인, 평면 멤브레인 또는 중공 섬유와 같은 미세 여과법에서 사용되는 것과 유사한 멤브레인 시스템을 사용할 수 있다. 바람직하게는 헤파린의 전하 특성 또는 헤파린에 친화력을 나타내는 리간드(예를 들어, 항체, ATⅢ, 렉틴, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등)의 그래프팅 특성에 따라서 헤파린을 분리하고 정제할 수 있는 멤브레인을 사용한다.

다른 작용제가 또한 비만 세포의 탈과립을 유도시킬 수도 있다. 상기의 작용제는 세포독성 작용제, 효소, 다당류, 렉틴, 과민증독소(anaphylatoxins), 염기성 화합물(화합물 48/80, 기질 P 등), 칼슘(A23187 이온촉진제,아이오노마이신(ionomycin) 등)(D. Lagunoff and T.W. Martin, 1983, Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51)과 같은 몇가지 종류로 나뉘게 된다. 탈과립 작용제를 배양중인 동일 세포에 대해 반복적으로 사용할 수 있다. 상기 생산 방법에 있어서, 생산성은 세포를 배지내에 유지시키고 상층액으로 부터 회수하는 방법을 단순화시켜서 상당하게 증가시킬 수 있다.

A23187 이온촉진제의 경우, 비만세포의 탈과립을 유도시킬 수 있는데, 예를 들어, 1 내지 100㎍/㎖의 농도 및 1분 내지 4시간의 작용 시간으로 A23187 이온 촉진제를 2×10⁶비만세포/㎖에 처리한다.

예를 들어 고장액 또는 저장액을 사용한 삼투압 충격, 열충격(동결/융해), 기계적 충격(예를 들어 초음파 또는 압력 변등 등), 화학 작용제의 작용(NaOH, THESIT™, NP40™,TWEEN20™, BRIJ-58™, TRITON X™-100 등), 또는 상술한 방법을 두개 이상 혼합하여 비만세포를 파쇄할 수 있다.

세포 분해질로 부터 헤파린을 추출 및 분리하고, 세글리신 코어로 부터 다당류 사슬을 분리하며, 추출 배지에 존재하는 다른 GAGs로 부터 헤파린 사슬을 분리하기 위해서, DUCLOS(상기에 언급함)의 매뉴얼등에 기술된 것과 같은, 당 분야에서 잘 알려진, 동물 조직으로 부터 헤파린을 추출 및 정제하는 방법과 유사한 방법을 사용한다.

핵산 및 세포 단백질로 부터 헤파린을 분리하고, 세글리신 코어와의 결합을분해시키기 위한 예는 다음과 같다:

- 세포 분해질을 하나 이상의 효소(프로나제, 트립신, 파파인 등)로 분해함;

- 헤파린-단백질 결합을 황산염 또는 염화물 존재하의 알칼리 배지에서 가수분해시킴;

- 핵산 및 세포 유래의 단백질을 분해하기 위해 GAG-단백질 상호작용을 분리시킬 수 있는 이온 용액을 첨가한 산성 배지(예를 들어 저온 조건하에서 트리클로로아세트산을 처리)에서 또한 수행될 수 있음;

- 또한 효소의 가수분해 이후에 구아니딘 추출법을 수행할 수 있고, 용해된 헤파린을 분리하기 위해, 포타슘 아세테이트, 4가 암모늄, 아세톤 등을 사용하여 침전시킬 수 있다.

상기의 정제 단계는 바람직하게 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 좀 더 구체적으로는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 단계를 추가하거나 또는 대체할 수 있다.

본 발명의 목적은 또한 상기 본 발명의 방법을 사용하여 비만세포 배양물로 부터 얻을 수 있는 헤파린 제제를 제공하는 것이다.

종래 당분야에서 동물 조직으로 부터 얻은 헤파린의 제제의 생물학적 특성과 견줄만한 본 발명에 따른 헤파린의 제제는 헤파린에 대한 모든 응용분야에서 사용될 수 있다.

이하 비만세포 배양물로 부터 헤파린을 제조하고, 이로부터 얻은 헤파린을특징화하는 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 1

비만세포 배양물로 부터 헤파린 추출

비만 세포의 배양

돼지 태아 간 비만 세포계 및 SV40 바이러스 T 항원으로 트랜스펙션된 돼지 태아 간 비만 세포계(각각 CNCM I-2735 계 및 CNCM I-2736 계)를 사용하였다.

상기 세포를 돼지 IL2(2ng/㎖) 및 돼지 SCF(80ng/㎖)가 존재하는 완전 MEMα배지에서 10⁵내지 5×10⁵세포/㎖의 비율로 접종하였다.

상기 세포 배양물은 배양 디쉬(dish) 또는 1-리터 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁액 상태로 준비하였다. 상기 세포의 성장을 4 내지 12일 동안 날마다 관찰하였다. 배양 중 생산되는 글리코사미노글리칸의 분석을 통해서 헤파린 생산을 병행하여 관찰하였다. 상기 결과는 도 1 내지 도 5에 나타내었다.

도 1, 2, 및 3에는 디쉬에서의 정체 배양(도 1: 초기 접종 : ◆ : 1×10⁵세포; ■: 2×10⁵세포) 및 플라스크의 현탁액(도 2) 상태인 간 비만세포의 성장을 나타내며, 플라스크의 현탁액 상태인 트랜스펙션된 간 비만 세포의 성장(도 3)을 나타낸다.

본 실시예에서, 플라스크의 현탁액 상태의 배양물은 약 8×10⁵(트랜스펙션 하지 않은 세포) 내지 1.5×10⁶세포/㎖(트랜스펙션한 세포) 범위의 최대 세포 농도를 나타내었다. 지수 증식기 동안 산출된 배가 시간(doubling time)은 24 내지 48시간이었다.

글리코사미노글리칸의 정제

프로테오글리칸을 절단하고 이온성 GAG/단백질 상호작용을 없애기 위해서 상기 세포를 염이 존재하는 알칼리 배지에서 가수분해시켰다.

상기 처리는 이하의 단계를 포함한다:

1. 식염 배지에 수산화 나트륨을 처리하는 단계 : 이 단계는 세포를 파괴하고 헤파린과 이의 모 단백질간의 결합을 절단하기 위한 단계이다.

상기 단계는 10⁶세포의 펠렛(pellet)에 100㎕의 1M NaOH 및 800㎕의 0.5M NaCl을 첨가하는 단계를 포함한다. 상기 혼합물을 80℃의 수욕조에서 30분간 가열시키고 이후 5분간 초음파 처리하고 1N NaCl로 중화시킨다.

2. 추출 단계 : 상기의 가수분해 샘플을 헤파린을 정체시키는 음이온 교환 수지 컬럼(SAX, Varian) 상에 충진시킨다. 상기 컬럼은 다른 단백질 및 GAGs, 구체적으로는 더마탄(dermatan)을 제거하기 위해 0.5M NaCl을 함유하는 pH7.4인 트리스/염화수소(Tris/HCl) 완충용액으로 세번 세척한다.

3. 탈염화/동결건조 : 염화나트륨 제거(하기에 기술한 분석 방법의 일부를 적용하기 위해 필요함)는 세파덱스 G10 겔상에서 스테릭 익스클루젼(steric exclusion) 크로마토그래피를 통해 수행하고, 전기전도도법(conductimetry)을 수행하였다. 회수된 헤파린 분획을 이후 동결건조하여 농축시켰다.

폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석

GAGs의 크기 및 전하에 따라 분리가 가능하게 하며, 헤파린의 존재 유무를 빠르게 확인할 수 있는 기술이다.

상술한 바와 같이 얻은 정제된 시료를 30 내지 1kDa의 분자를 분리하기 위한 트리스/트리신(Tris/tricine) 폴리아크릴아미드 겔(농도구배 10 내지 20%)에 디포지트(deposit) 당 20㎕의 시료 양으로 로딩하였다. 25ng의 더마탄, 및 25ng의 SPIM 표준 돼지 헤파린(장점막의 돼지 헤파린에 대한 4번째 국제 표준), 및 돼지 점막으로 부터 추출하고 수산화 나트륨을 처리하여 정제하며 상술한 바와 같은 동일한 조건하에서 음이온 교환 수지상에서 정제한 헤파린을 상기의 동일한 겔에 로딩하였다.

알-하킴 및 린하츠(Al-hakin and Linhardt)가 기술한 바와 같이(Applied anc Theoreticl Electrophoresis 1, 305-12, 1991) 알시안(alcian) 블루 용액 및 실버 나이트레이트의 이중 염색으로 글리코사미노글리칸(실버 나이트레이트만은 단지 단백질만 보임)을 확인할 수 있었다.

상기 겔을 이후 스캐너(Bio-Rad)로 분석하여 다양한 GAGs를 정량하였다. 상기 헤파린의 정량 한계는 밴드당 10ng이다.

상기 실험의 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 세포에 의해 생산된 헤파린의 양은 ㎍/10⁶세포로 나타내었다.

회수한 날	3	4	5	6	7	10	11	14
간 세포, 디쉬	2.6	3.5	4.4	6.5	3.7	4.2	-	8.1
트랜스펙션된 간 세포, 디쉬	2.6	6.9	9.0	11.7	10.8	8.5	5.4	7.1
간 세포, 플라스크	1.2	-	-	-	-	-	-	-
트랜스펙션된 간 세포, 플라스크	-	2.1	-	-	-	-	-	-

상기 결과는 도 4에 나타내었다(곡선 = 세포 개체수 ; 막대 = 헤파린 생산).

도 4는 디쉬에서 정체 배양된 간 비만세포의 성장 동안의 헤파린 생산을 나타낸다.

관찰된 상기 헤파린 농도는 정체 배양 또는 현탁액 상태에서 2 내 14㎍/10⁶세포였다.

실시예 2

비만세포 배양물로 부터 얻은 헤파린 시료의 특징

HPLC에 의한 이탄당 프로파일

이탄당 조성은 헤파린을 다른 글리코사미노글리칸과 구별가능하게 한다.

배양중인 비만 세포에 의해 생산된 글리코사미노글리칸의 이탄당 프로파일을 린하츠등이 기술한 방법(Biomethods, 9, 183-97, 1997)에 따라 결정하였다.

실시예 1에 기술된 바와 같이 얻은 GAG 시료를 플라보박테리움 헤파리니움 헤파리네이즈(헤파리네이즈 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ, GRAMPIAN ENZYMES)의 혼합물로 탈중합시켰다. 사용된 조건은 상기 언급한 린하츠 등이 기술한 방법을 따랐다.

대조군인, SPIM 표준 헤파린을 상기와 동일한 조건하에서 탈중합시켰다.

상기 조건하에서, 탈중합반응을 완료하고 이탄당을 생산하였다.

8개의 주요한 이탄당은 N-설페이트화 또는 N-아세틸레이티드화되었으며, 도5에 나타내었다.

UV 탐지

상기 이탄당을 린하츠 등(상술함)이 기술한 바에 따라 음이온 교환 컬럼상에서, HPLC로 분리하고 동정하였다

상기 결과를 도 6에 나타내었으며, 표준 헤파린의 이탄당 프로파일(□)과 비교하여 태아 간-유래 비만 세포의 플라스크 배양을 통해 생산된 헤파린 시료의 이탄당 프로파일(■)을 나타내었다.

상기 결과는 SPIM 대조구 돼지 헤파린에 존재하는 모든 이탄당이 비록 다른 비율이지만, 비만 세포 헤파린에도 존재함을 보여준다. ⅠS/ⅡS 비율은 3.7이다.

형광 탐지

형광분석 탐지와 유사한 방법으로 헤파린의 특징인 ⅠS 및 ⅡS 이탄당을 정량하고 이들의 비율을 산출하였다.

상기 효소 탈중합반응 및 HPLC 분리는 상술한 바와 같은 방법으로 수행하였다.

상기 분리 단계는 구아니딘과 형광 복합체를 형성하도록 포스트-컬럼 유도(derivatization) 후에 수행되었다.

상기 방법에 의해 가장 강한 반응 요소를 갖는 ⅠS 트리설페이트화 이탄당이 관찰되었고 알려진 농도의 표준 헤파린 용액을 사용하여 정량하였다.

상기 방법의 탐지 한계는 세포 배양 샘플에서 5ng/㎖의 헤파린이다.

하기 표 2에는 시간에 따른 세포 배양물에서의 ⅠS/ⅡS 비율을 나타낸다.

회수한 날	3	4	5	6	7	10	11	14
간 세포, 디쉬	1.9	1.6	1.6	1.4	1.4	1.3	-	1.4
트랜스펙션된 간 세포, 디쉬	4.1	5	4.6	6.6	3.7	4.9	5.6	5.7
간 세포, 플라스크	2.3	-	-	-	-	-	-	-
트랜스펙션된 간 세포, 플라스크	-	2.9	-	-	-	-	-	-

실시예 3

항-XA 및 항-ⅡA 활성 측정을 통한 헤파린의 생물학적 특징화

생물학적 활성

인자(factor) Xa 및 Ⅱa를 불활성화시키는 것은 헤파린의 특징이며, 헤파란 설페이트 및 더마탄과 구별되는 특징이다.

사용된 방법은 1997년, 3번째판 유럽 약전(European Pharmacopoeia)의 저분자 헤파린에 대한 논문에 기술된 방법을 사용하였다.

반응은 하기의 세단계를 통해 일어난다.

1. ATⅢ + 헤파린 → [ATⅢ - 헤파린]

2. [ATⅢ - 헤파린] + 인자(과량) → [ATⅢ - 헤파린 - 인자] + 인자(잔여)

3. 인자(잔여) + 발색 기질 → pNA

상기 반응에서 방출되는 파라-니트로아니린(pNA)의 양을 405㎚에서 측정하였다. 상기 양은 헤파린의 양에 대해 반비례하였다.

항-Xa 및 항-Ⅱa 활성을 SPIM 표준을 통해 확립된 표준화 직선(calibration straight line)에 따라 평가하였다.

상기 방법의 감도는 0.006IU/㎖이다.

상기에서 얻은 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

회수한 날	3	4	5	6	7	10	11	14
간 세포, 디쉬:항-Xa항-IIa항-Xa/항-IIa 비율	2.1--	1.8--	5.7--	4.0--	2.4--	2.2--	---	0.0--
트랜스펙션된 간 세포, 디쉬:항-Xa항-IIa항-Xa/항-IIa 비율	44--	11.5--	11.7--	12.3--	11.4--	13.0--	11.6--	12.9--
간 세포, 플라스크:항-Xa항-IIa	0.71.4	--	--	--	--	--	--	--
항-Xa/항-IIa 비율	0.6	-	-	-	-	-	-	-
트랜스펙션된 간 세포, 플라스크:항-Xa항-IIa항-Xa/항-IIa 비율	---	3.1140.2	---	---	---	---	---	---

상기 배양중인 비만세포로 부터 얻은 헤파린의 항-Xa 및 항-IIa 활성을 각각돼지 점막으로 부터 얻거나 또는 표준 헤파린의 항-Xa 또는 항-IIa 활성과 비교하였으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

	항-Xa (IU/㎎)	항-IIa (IU/㎎)	Xa/IIa (IU/㎎)
비만세포 헤파린	18 내지 3.1	14 내지 3	0.2 내지 1
점막 헤파린	80	81	1
표준 헤파린	180	180	1

ATⅢ 결합 특성

헤파린과 ATⅢ간의 결합을 리와 랜더(Lee and Lander)(Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 2768-72, 1991)가 기술한 전기 영동법을 사용한 이동 전이(migration shift)를 통해 확인하였다.

상기 전기영동은 pH 3 용액(아세트산/수산화리튬)의 0.8% 아가로스 겔상에서 수행하였다.

584 내지 183㎍/㎖의 감소된 농도에서 100㎕의 ATIII(인간 유래; BIOGENIC) 용액을 100㎕의 실험 샘플에 첨가하였다.

샘플의 100㎕를 로딩하였다. 이동은 100볼트에서 30분간 수행하였다.

상기 겔을 0.1% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(CETAVLON-SIGMA) 용액에 고정시켰다.

Asure A(물에 0.08% 용액)를 사용하여 탐지가능하도록 하였다.

상기 겔을 스캔하고 QUANTITY ONE 소프트웨어(BIO-RAD)를 사용하여 분석하였다.

결과는 ATII에 결합된 헤파린의 %로 나타내었다.

트랜스펙션된 간 세포의 플라스크 배양 경우에서 얻은 결과를 도 7에 나타내었다.

표준 헤파린(SPIM) 존재시에는 31% ATIII 결합(이론적 수치 33%)이 관찰되었고, 비만 포 배양물로 부터 얻은 헤파린(화합물)의 존재시에는 25% ATIII 결합이 관찰되었다.

실시예 4

반복 뱃치 생물 반응기에서의 비만 세포 배양

돼지 태아 간으로 부터 유래된 트랜스펙션하지 않은 비만 세포계를 사용하였다. 상기 세포를 돼지 IL3(2ng/㎖) 및 돼지 SCF(80ng/㎖)가 보충된 완전 DMEM/F12 배지에서 ㎖ 당 2.0 내지 4.0×10⁵의 양을 접종하였다.

사용된 생물반응기는 2리터의 배양배지 부피를 갖고, 상기 배지의 산소 팽창력은 20 내지 40%의 포화상태로 유지시키며, pH는 7.0 내지 7.4로 유지시키고, 온도는 생물반응기 자켓내에서 자동온도 조절된 물의 순환으로 37℃ +/- 0.5℃로 유지시켰다. 상기 배양은 8. 내지 150rpm의 속도인 수중 프로펠러를 사용하여 교반시켰다.

4일 동안 배양한 후, 상기 세포의 농도는 24 내지 48시간의 배가 시간에 상응하여, 1.3×10⁶세포/㎖이다. 회수하는 날, 배양물의 80%는 헤파린 추출을 위해 덜어내고 나머지는 생물반응기에 유지시켜서 반복-뱃치 생산작동법에 기술된 바와 같이 새로운 배지를 사용하여 2.0 내지 3.0×10⁵세포/㎖의 농도로 희석시켰다. 반복-뱃치 모드에서 희석한 3일 후, 24 내지 48시간의 배가 시간에 상응하며 첫번째 배양시와 유사하게(도 8), 얻은 세포의 농도는 9.0×10⁵세포/㎖였다.

상기 헤파린은 실시예 1에 기술한 바와 같이 정제하였다.

정제된 헤파린은 실시예 2에 기술한 바와 같이 대조구로 SPIM 표준 헤파린을 사용하여 HPLC를 통해 분석하였다.

표 5 및 도 9는 SPIM 표준 헤파린(□)으로 부터 얻은 프로파일과 비교한 돼지 태아 간 유래의 현탁-배양된 비만세포로 부터 생산된 헤파린 시료의 이탄당 프로파일 및 세글리신(Gly-Ser) 단백질 코어의 비율을 나타낸다.

표 6은 SPIM 표준 헤파린(□)으로 부터 얻은 프로파일과 비교한 돼지 태아 간 유래의 현탁-배양된 비만세포로 부터 생산된 헤파린의 이탄당의 N-아세틸화, N-설페이트화 및 O-설페이트화 프로파일을 나타낸다.

	% 표준	% 배양세포
Gly-Ser	3.5	3.2
IVa	4	5.4
IVs	3.1	7.6
IIa	3.1	4.4
IIIa	1.5	0.7
IIs	8.4	11.9
IIIs	7.2	17.1
Ia	1.3	0.2
Is	62	48.8

이탄당	% 표준	% 배양세포
아세틸화	11.8	10.7
2-O-설페이트화	23	8
6-O-설페이트화	42	42
N-설페이트화	83	85
2-O-설페이트화	84	77
6-O-설페이트화	89	71
설페이트/카르복실레이트	2.4	2.1

유사한 결과를 SV40 바이러스 T 항원으로 트랜스펙션된 비만 세포계를 사용한 경우에도 얻을 수 있었다.

실시예 5

탈과립 작용제를 사용하여 배양 현탁액에서 헤파린 생산

트랜스펙션시키지 않은 태아 간 비만 세포계를 사용하여 수행하였다.

762째날(첫 배양일로 부터) 비만세포 농도는 2×10⁶세포/㎖이었고, 세포의 배양은 비만 세포 탈과립을 유도시키는 4㎍/㎖의 이온촉진제 A23187을 포함하는 MEM 배지에서 1시간 동안 수행하였다.

세포로 부터 생산된 총 GAGs 및 분비된 GAGs를 PAGE를 통해 정량하였다. 도10은 이온촉진제 A23187을 처리한 후 상층액에서 확인된 70 내지 75%의 GAGs 대 비처리(0㎍/㎖의 A23187) 세포에서 확인된 약 10%의 GAGs를 나타낸다.

762일간 배양한 GAG를 회수한 비만세포를 다시 배양하였다. 어떠한 생육성 또는 성장률 손실이 관찰되지 않았다.

21일 후, 상기 비만세포를 더욱 탈과립시켰고, 상술한 바와 같이 GAGs를 분석하였다. 동일 연령의 762일에 탈과립시키지 않은 배양된 비만세포를 대조군으로 사용하였다.

결과는 도 10에 나타낸 바와 같으며, 분비된 GAGs의 퍼센트가 첫번째 탈과립동안 얻은 것과 유사하였고 또한 동일 연령의 대조군 세포로 부터 얻은 것과 유사하였다.

Claims

돼지 유래의 비만 세포를 배양하는 단계 및 상기 획득된 배양물로 부터 헤파린을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 헤파린의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 비만세포 배양물은 돼지 유래의 비만 세포계인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비만세포는 돼지 태아의 골수 또는 돼지 태아의 간으로 부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비만세포는 혈청 비만세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비만세포는

2001년 10월17일자에 CNCM(프랑스 국립 균주 센터)에 기탁번호 I-2735호로 기탁된 세포계;

2001년 10월17일자에 CNCM에 기탁번호 I-2736호로 기탁된 세포계; 및 2001년 10월17일자에 CNCM에 기탁번호 I-2734호로 기탁된 세포계로 부터 선택된 비만 세포계로 부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 얻을 수 있는 헤파린의 제제.