WO2003035886A2 - Preparation d'heparine a partir de cultures de mastocytes - Google Patents

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WO2003035886A2
WO2003035886A2 PCT/FR2002/003617 FR0203617W WO03035886A2 WO 2003035886 A2 WO2003035886 A2 WO 2003035886A2 FR 0203617 W FR0203617 W FR 0203617W WO 03035886 A2 WO03035886 A2 WO 03035886A2
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mast
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Pierre Cans
Jean-Marc Guillaume
Hélène Monique Marie RIGAL
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Aventis Pharma S.A.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of heparin from cell cultures.
  • Heparin belongs to the family of glycosaminoglycans (GAG), which groups together the linear polysaccharides containing. a repetition of a disaccharide sequence consisting of an amino sugar (D-glucosamine or galactosamine) and a uronic acid (D- glucuronic or iduronic).
  • GAG glycosaminoglycans
  • the amino sugar is D-glucosamine.
  • Uronic acid is either glucuronic acid (.Glc) or iduronic acid (Ido).
  • Glucosamine can be N-acetylated, N-sulfated or O-sulfated.
  • heparin is used to designate. highly sulfated polysaccharides in which more than 80% of the glucosamine residues are N-sulfated and the number of O-sulfate is greater than that of N-sulfates. The tallow / disaccharide ratio is generally greater than 2 for heparin. However, the structure of heparin is in fact very heterogeneous, and there are chains which may contain very different ratios. Like all GAGs, heparin is synthesized in the form of a proteoglycan. This synthesis preferably takes place in a subpopulation of mast cells, serous or connective mast cells (CTMC).
  • CMC connective mast cells
  • mast cells are abundant in the skin, and the respiratory submucous. Their lifespan is very long (at least 6 months). In addition to heparin, they contain heparan sulfate, and appreciable amounts of histamine (approximately 10 pg / cell, depending on the animal species).
  • the first step in the synthesis of heparin is the formation of the protein nucleus serglycine, consisting serine and glycine residues, regularly alternated.
  • the heparin chain is elongated from a tetrasaccharide, by successive additions of osamine and uronic acids.
  • the proteoglycan thus formed undergoes numerous sequential transformations: N-deacetylation,
  • polysaccharide chains are then cleaved from serglycine by an endoglucuronidase. These chains then have a molecular weight between 5000 and
  • Heparin forms complexes with basic proteases and are thus stored in the granules of mast cells. Heparin is excreted only during the degranulation of mast cells. Heparin plays an important biological role, especially in hemostasis, and is very widely used in therapy, in particular as an anticoagulant and antithrombotic agent.
  • heparin the major part of the heparin used is isolated from the intestinal mucosa of the pig, from where it is extracted by proteolysis, followed by purification on anion exchange resin (for review on the various methods of preparation of l heparin, cf. DUCLOS, "Heparin: fabrication, structure, properties, analysis”; Ed. Masson, Paris, 1984).
  • heparin-type compounds which can be proteoglycans (HEP-PG) or glycosaminoglycans (HEP-GAG) from rat mast cell cells.
  • the compounds are not heparin.
  • the cells thus isolated are not established lines.
  • the applicant recommends the co-cultivation of the isolated cells with fibroblasts.
  • the inventors have found that it is possible to produce in large quantities from cultures of mast cell lines, heparin having properties comparable to those of heparin extracted from porcine intestinal mucus.
  • the use of cell cultures as raw material also makes it possible to control the conditions for the synthesis of heparin, and thus to obtain a product having reproducible characteristics.
  • the present invention relates to a process for the production of heparin, characterized in that it comprises the culture of mast cells of porcine origin and the recovery of heparin from the cultures obtained.
  • said mast cell cultures are lines of mast cells of porcine origin.
  • culture here generally designates a cell or a set of cells cultivated in vitro.
  • a culture developed directly from a cell or tissue sample taken from an animal is called "primary culture”.
  • lineage is used from the moment at least one passage, and generally several consecutive passages in subculture have been carried out successfully, and designates any culture which results therefrom. (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91-101, 1990).
  • said mast cells come from cultures and in particular from pig mast cell lines obtained as described in Application FR 0113608, as well as in PCT Application entitled “Pig mast cell cultures and their uses” in the name of INRA, and of the ENVA filed on the same day as this Application.
  • preferred lines for implementing the process according to the invention are:
  • the mast cell line originating from pig fetal liver, and transfected with the T antigen of the SV40 virus deposited by INRA with the CNCM on October 17, 2001, under the number 1-2736; the line of mast cells from bone marrow of pig fetuses and transfected with the T antigen of the SV40 virus, deposited by INRA with the CNCM on October 17, 2001, under the number 1-2734.
  • these mast cells' are serous mast cells.
  • mast cells will preferably be cultured in a defined culture medium (MEM ⁇ / DMEM, RPMI, IMDM, etc.) supplemented with growth factors, used in combination or individually, such as SCF (Stem Cell Factor) at a concentration between 1 ng / ml and 1 ⁇ g / ml, and possibly IL3 (Interleukin 3) at a concentration between 0.1 ng / ml and 100 ng / ml, or PGE2 (prostaglandin E2), at a concentration between 1 nM and 1 ⁇ M.
  • MEM ⁇ / DMEM, RPMI, IMDM, etc. a defined culture medium
  • growth factors used in combination or individually, such as SCF (Stem Cell Factor) at a concentration between 1 ng / ml and 1 ⁇ g / ml, and possibly IL3 (Interleukin 3) at a concentration between 0.1 ng / ml and 100 ng / ml,
  • the media can also be supplemented with bovine serum, at a concentration of between 0.5% and 20% (v / v).
  • bovine serum to the culture media can be replaced by the use of a culture medium without serum such as AIMV (INVITROGEN) so as to reduce the protein concentration of the medium and the risks associated with the use of compounds of animal origin (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 200).
  • AIMV AIMV
  • the independence of the cells with respect to the addition of serum and / or the use of growth factors can be obtained by controlled mutation of the cell phenotype by the action of transforming and / or immortalizing agents ( TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933-8, 1996; PIAO and BERNSTEIN, Blood, 87 (8), 3117-23, 1996).
  • Mast cells can be cultured using techniques developed for the mass culture of eukaryotic cells, as described for example by GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology,, Eds. Spier and Griffiths, Académie Press, reasonably, vol.3, 179-220, 1986). Bioreactors with a capacity greater than several m 3 can be used as described by PHILIPS et al.
  • the culture can also be carried out in suspension or on micro-support according to the technique described by VAN MEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967).
  • the productivity of batch cultures can be advantageously increased by removing part of the bioreactor cells (70% to 90%) for the operations of extracting GAGs and isolating heparin and by retaining the remaining cells within the same bioreactor to initiate a new culture.
  • this so-called repeated batch culture mode it is also possible to distinguish the optimum parameters of the cell growth phase from those allowing a greater accumulation of GAGs and heparin within the cells.
  • Continuous perfusion-type culture systems with or without cell retention can also be used (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102 (2), 275-278, 1987; CHAUBARD et al., Gen. Eng News, 20, 18-48, 2000).
  • perfused culture systems allowing the retention of the cells inside the reactor, and resulting in growth and a production higher than those obtainable in batch.
  • the retention can be carried out by means of retention systems of the spin filter type, hollow fibers, or solid matrix (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992; VELEZ et al., J. Immunol, Methods, 102 (2), 275-278, 1987).
  • the cell densities obtained are generally between 10 7 and 5 x 10 7 cells / ml.
  • the culture in bio-reactors allows, through the use of online measurement sensors, better control of the physico-chemical parameters of cell growth as well as of the accumulation of GAGs and heparin within cells: pH, p02, Red / Ox, growth substrates such as vitamins, amino acids, carbon substrates (e.g. glucose, fructose, galactose), metabolites such as lactate or ammonia, etc.
  • growth substrates such as vitamins, amino acids, carbon substrates (e.g. glucose, fructose, galactose), metabolites such as lactate or ammonia, etc.
  • From 3 to 30 days of culture generally from 3 to 10 days of culture under these conditions, the cells can be harvested and separated from the culture medium, generally by centrifugation or iltration. Different centrifugation systems can be used, for example those described by VOGEL and TODARO (Fermentation and Biochemical
  • separation can be carried out by tangential microfiltration, using membranes whose porosity is less than the average diameter of the cells (5 to 20 ⁇ m) while allowing the passage of the other compounds in solution. /suspension.
  • the speed of the tangential flow and the pressure applied to the membrane will be chosen so as to generate little shear force (Reynolds number less than 5000 sec "1 ) in order to reduce clogging of the membranes and preserve the integrity of the cells during l separation operation.
  • membranes can be used, for example, spiral membranes (AMICON, MILLIPORE), flat membranes or hollow fibers (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
  • GAGs and heparin can also be harvested from the culture medium after lysis or degranulation of the cells.
  • Degranulation can be caused by the binding of specific ligands to receptors present on the surface of mast cells, for example the binding of allergen-like agents (such as Fc fragment of IgE or 'analogs of this fragment) on mast cell IgE receptors.
  • allergen-like agents such as Fc fragment of IgE or 'analogs of this fragment
  • the use of membranes of more porosity reduced can also be considered.
  • the separation of the cells is combined with an ultrafiltration step on one or more membranes whose arrangement and porosity makes it possible to concentrate the heparin and to separate it from the other species present in the medium, depending on the size and molecular weight, and possibly electrical charge, or biological properties.
  • the cut-off threshold of the membranes is preferably between 1000 and 5 KDa.
  • Membrane systems similar to those used for microfiltration can be used, for example, spiral membranes, flat membranes, or hollow fibers. Can be advantageously used for performing membrane separation and purification of heparin, by virtue of their charge properties, or grafting ligands having an affinity for heparin (e.g. antibody, ATIII, lectin, peptides, nucleotides, etc.). Other agents can also induce mast cell clégranulation.
  • cytotoxic agents can be classified into several categories such as cytotoxic agents, enzymes, polysaccharides, lectins, anaphylatoxins, basic compounds (compound 48/80, substance P, etc.), calcium (ionophore A23187, ionomycin, etc. ).
  • cytotoxic agents enzymes, polysaccharides, lectins, anaphylatoxins, basic compounds (compound 48/80, substance P, etc.), calcium (ionophore A23187, ionomycin, etc. ).
  • degranulating agent can be carried out repeatedly on the same cells maintained in culture. In this mode of production productivity is significantly increased by simplifying the harvesting process from the supernatant and by maintaining the cells in culture.
  • the degranulation of the mast cells can be induced for example by treatment of 2.10 6 cells / ml of mast cells with the isophore A23187 at concentrations between 1 to 100 ⁇ g / ml and times of action varying from 1 minute to 4 hours.
  • Mast cell lysis can be induced, for example, by osmotic shock using hypotonic or hypertonic solutions, by thermal shock (freezing / thawing), by mechanical shock (for example sonication or pressure variation), by the action of chemical agents (NaOH, THESIT TM, NP40 TM, TWEEN 20 TM, BRIJ- 58 ⁇ ' ⁇ TRITON X TM -100, ...), or by enzymatic lysis (papam, trypsin, %), or by a combination of two or many of these methods.
  • osmotic shock using hypotonic or hypertonic solutions
  • thermal shock freezing / thawing
  • mechanical shock for example sonication or pressure variation
  • chemical agents NaOH, THESIT TM, NP40 TM, TWEEN 20 TM, BRIJ- 58 ⁇ ' ⁇ TRITON X TM -100, .
  • enzymatic lysis papam, trypsin,
  • Cell ivsat separate the polysaccharide chains from no ⁇ to ser-glycine, and separate the heparin chains from the other GAGs present in the extraction medium, we can use methods similar to those used in the context of extraction and heparin purification from animal tissues, which are known in themselves, and described in general works, such as the manual of DUCLOS, cited above).
  • the cell lysate can be subjected to one or more enzymatic digestions (pronase, trypsin, papamus, etc.); the heparin-protein bonds can be hydrolysed in an alkaline medium, in the presence of sulfates or chlorides;
  • heparin preparations capable of being obtained from mast cell cultures by implementing a method according to the invention.
  • heparin preparations according to the invention which have biological properties comparable to those of the heparin preparations obtained in the prior art from animal tissues, can be used in all the usual applications of heparin.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of heparin preparation from mast cell cultures and characterization of the heparin obtained.
  • a pig fetal liver mast cell line and a pig fetal liver mast cell line transfected with the SV40 virus T antigen (lines
  • the cells are seeded at a rate of 10 5 to 5:. 10 r cells / ml, in complete MEM ⁇ medium in the presence of porcine IL3 (2 ng / ml) and porcine SCF (80 ng / ml).
  • Cultures are carried out in a culture dish or in suspension in a 1-liter spinner-type bottle. Cell growth is monitored daily for 4 to 12 days. The heparin production is followed in parallel, by the analysis of the glycosaminoglycans produced in culture. The results are presented in Figures 1 to 5.
  • Figures 1, 2 and 3 illustrate the growth of liver mast cells in static culture in a dish ( Figure 1; initial seeding:: 1 x 10 5 cells; H: 2 x 10 5 cells) and in suspension in a bottle ( Figure 2) , and the growth of transfected liver mast cells in vial suspension ( Figure 3).
  • the cultures in suspension in a bottle have a maximum cell density ranging from approximately 8 ⁇ 10 5 (for the non-transfected cells) to approximately 1.5 ⁇ 10 6 cells / ml (for the transfected cells).
  • the doubling time, calculated during the exponential growth phase, is between 24 and 48 hours.
  • the cells undergo hydrolysis in an alkaline medium in the presence of salt in order to break the proteoglycans and avoid interactions GAGs / proteins of ionic types.
  • This treatment includes the following stages:
  • Treatment with sodium hydroxide in a saline environment aims to destroy the cells and cut the links between heparin and its mother protein.
  • the step includes adding 100 ⁇ l of 1 M NaOH and 800 ⁇ l of 0.5 M NaCl to a pellet of 10 6 cells.
  • the mixture thus obtained is heated in a water bath at 80 ° C for 30 minutes and then sonicated for 5 minutes before being neutralized with 1N HCl.
  • Desalting / Lyophilization the elimination of sodium chloride (necessary to be able to apply some of the analysis methods which are described below) is carried out by steric exclusion chromatography on SEPHADEX G10 gel, followed by conductimetry. The collected heparin fractions are then lyophilized to concentrate the sample.
  • This technique makes it possible to separate the GAGs according to their size and their charge, and constitutes a test making it possible to rapidly verify the presence or absence of heparin.
  • the purified preparation obtained as described above is deposited on Tris / tricine polyacrylamide gel (gradient from 10 to 20%) making it possible to separate molecules from 30 to 1 kDa, at the rate of 20 ⁇ il of preparation by deposition. 25 ng of dermatan, 25 ng of SPIM standard porcine heparin (4 th international standard for porcine heparin, intestinal mucus), and for heparin extracted from porcine mucus and purified by treatment with sodium hydroxide and purification on anion exchange resin under the same conditions as those described above.
  • the gels are then analyzed by a scanner (BIO-RAD) to quantify the different GAGs.
  • the limit of quantification of heparin is 10 ng per band.
  • Figure 4 illustrates the production of heparin during the growth of liver mast cells in static dish culture.
  • heparin concentrations generally observed are between 2 and 14 ⁇ g for 10 6 cells, in static culture and in suspension.
  • EXAMPLE 2 CHARACTERIZATION OF THE PREPARATION OF HEPARIN OBTAINED FROM MASTOCYTE CULTURES
  • the disaccharide composition makes it possible to differentiate heparin from other glycosaminoglycans.
  • the disaccharide profile of the glycosaminoglycans produced by the mast cells in culture was determined according to the method described by LINHARDT et al. (Biomethods, 9, 183-97, 1997).
  • the preparation of GAGs obtained as described in Example 1 above was depolymerized by a mixture of heparinases from Flavobacterium heparinium (heparinases I, II, and III, GRAMPIAN ENZYMES). The conditions used are described in the publication by LINHARDT et al., Cited above.
  • Figure 6 representing the disaccharide profile of the heparin preparation produced by a flask culture of mast cells derived from fetal liver (B), compared to the disaccharide profile of standard heparin (D).
  • the separation is followed by a post-column derivatization, to form a fluorescent complex with guanidine.
  • the trisulfated disaccharide IS which has the strongest response factor by this technique, is detected and quantified compared to a standard heparin solution of known concentration.
  • the detection limit of the method is of the order of 5 ng / ml of heparin in cell culture samples.
  • Table 2 illustrates the IS / IIS ratio of cell cultures over time.
  • the reaction takes place in three stages:
  • the amount of paranitroaniline (pNA) released is measured at 405 nm. It is inversely proportional to the amount of heparin.
  • the anti-Xa or anti-IIa activity is evaluated with respect to a calibration line established with the SPIM standard.
  • the sensitivity of the method is 0.006 IU / l.
  • the electrophoresis is carried out on a 2.8 "agarose gel in a solution at pH 3 (acetic acid / lithium hydroxide). To 100 ⁇ l of sample to be tested, add
  • the gels are scanned and interpreted with QUANTITY ONE software (BIO-RAD).
  • a line of mast cells from the non-transfected pig fetal liver was used.
  • the cells are seeded at the rate of 2.0 to 4.0 ⁇ 10 5 cells per ml in complete DMEM / F12 medium supplemented with porcine IL3 (2ng / ml) of porcine SCF (80ng / ml).
  • the bioreactor used has a capacity of 2 liters of culture media, the oxygen tension of the culture is maintained between 20% and 40% of saturation, the pH between 7.0 and 7.4, the temperature is maintained at 37 ° C + / - 0.5 ° C by circulation of thermostatically controlled water in the jacket of the bioreactor.
  • the culture is stirred by a marine type propeller with a speed between 80 to 150 revolutions / minute.
  • the cell density is 1.3 x 10 6 cells / ml, corresponding to a doubling time of between 24 and 48 hours.
  • 80% of the culture is taken for heparin extraction, the rest of the culture is kept in the bio-reactor and diluted with fresh medium to a concentration of between 2.0 and 3.0 ⁇ 10 5 cells / ml as described for a repeated batch production operation.
  • the cell density obtained is 9.0 x 10 5 cells / ml, corresponding to a doubling time of between 24 and 48 hours and comparable to the first cultivation (Figure 8).
  • the purified heparin is then analyzed by HPLC, as described in Example 2, using standard SPIM heparin as a control.
  • Table 5 and Figure 9 represent the disaccharide profile and the proportion of the protein nucleus serglycine (Gly-Ser) of the heparin preparation produced by the culture of suspended mast cells derived from porcine fetal liver (M), compared to the profile obtained for standard heparin SPIM (D).
  • Table 6 shows the N-acetylation, N-sulfation and O-sulfation profile of heparin disaccharides produced by the suspension mast cell culture derived from porcine fetal liver compared to that of SPIM heparin disaccharides standard.
  • EXAMPLE 5 PRODUCTION OF HEPARIN IN THE CULTURE SURNANTANT BY USE OF A DEGRANULATION AGENT.
  • the experiments were carried out on a line of non-transfected fetal liver mast cells.
  • the mast cell concentration has been adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / ml, and the culture is incubated for one hour in MEM medium comprising 4 ⁇ g / ml of 1 lonophore A23187, which induces degranulation of mast cells.
  • the mast cells for which the harvest of GAGs was carried out on the 762nd day of culture were returned to culture. No loss of viability and growth rate was observed.
  • mast cells 21 days later, these mast cells are subjected to a new degranulation, and the GAGS are assayed as described above.
  • FIG. 10 shows that the percentages of GAGs secreted is comparable to that obtained during the first degranulation and also comparable to that obtained with control cells of the same age.

Abstract

L'invention concerne la production d'héparine à partir de cultures cellulaires de mastocytes, notamment de mastocytes de porc.

Description

PREPARATION D'HEPARINE A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES.
La présente invention est relative à la préparation d'héparine à partir de cultures de cellules.
L' héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG) , qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant . une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D- glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D- glucuronique ou iduronique) . Dans le cas de l'héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine . L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (.Glc) , soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N- acétylée, N-sulfatée ou O-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des . polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N- sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport suifate/disaccharide est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure -de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents . Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane . Cette synthèse a lieu préférentiellement dans une sous-population de mastocytes, les mastocytes séreux ou conjonctifs (CTMC) . Ces mastocytes sont abondants dans la peau, et les sous-muqueuses respiratoires. Leur durée de vie est très longue (au moins 6 mois). Outre l'héparine, ils contiennent de l'héparane sulfate, et des quantités appréciables d'histamine (environ 10 pg/cellule, selon l'espèce animale).
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué de résidus serine et glycine, régulièrement alternés.
L' élongation de la chaîne d'héparine se fait à partir d'un tétrasaccharide, par ajouts successifs d' osamine et d'acides uroniques. Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles : N-désacétylation,
N-sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et
O-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.
Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase . Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et
30000 Da . Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparine est excrétée uniquement lors de la degranulation des mastocytes. L'héparine joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu' agent anticoagulant et antithrombotique .
Actuellement, la majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d' anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf. DUCLOS, « L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse »; Ed. Masson, Paris, 1984) .
A l'hétérogénéité inhérente à l'héparine, s'ajoute la diversité des lots d'animaux à partir desquels elle est obtenue. Il en résulte une variabilité très importante, se traduisant notamment au niveau de l'activité biologique. En outre, il est difficile de disposer de manière régulière d'un approvisionnement suffisant en matière première.
L'utilisation de cellules issues de mammifères pour la production de GAG ou de ou de proteoglycanes a déjà été proposée.
Ainsi la demande WO 99/26983 décrit l'obtention de composés de type héparinique, qui peuvent être des proteoglycanes (HEP-PG) ou des glycosaminoglycanes (HEP-GAG) à partir de cellules de mastocytes de rat. Les composés ne sont pas de l'héparine. Les cellules ainsi isolées ne sont pas des lignées établies. En outre le demandeur recommande la co-cultivation des cellules isolées avec des fibroblastes .
L' article de Wang et Kovanen (Circulation Research,- 84, 1, 74-83, 1999)décrit lui aussi l'isolement de mastocytes séreux de rat et la production de proteoglycanes à partir de ces cellules. Comme dans la demande WO 99/26983, les cellules utilisées pour la production de proteoglycanes ne sont pas des lignées établies mais simplement des cellules isolées, puis stimulées pour produire des proteoglycanes.
La demande WO 90/14418, citée dans le rapport de recherche, décrit des lignées cellulaires obtenues à partir de mastocytomes de souris et leur utilisation pour la production d'héparine. Ces cellules ont donc une origine tumorale ce qui est susceptible de soulever des problèmes sanitaires. Un article de Montgomery et al (Proc Natl Acad Sci USA, 89, 23, 11327-11331, 1992) décrit lui aussi l'isolement de mastocytomes de souris. La présente invention propose de pallier les inconvénients mentionnés ci-dessus et de s'affranchir des problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de qualité, en utilisant une source commodément disponible de matière première homogène, et aux caractéristiques stables, facilitant l'obtention de préparations d'héparine de qualité constante.
Les Inventeurs ont constaté qu'il était possible de produire en quantité importante à partir de cultures de lignées de mastocytes, de l'héparine possédant des propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du mucus intestinal porcin. L'utilisation de cultures cellulaires comme matière première permet en outre de contrôler les conditions de synthèse de l'héparine, et d'obtenir ainsi un produit possédant des caractéristiques reproductibles .
La présente invention a pour objet un procédé de production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de mastocytes d' origine porcine et la récupération de l'héparine à partir des cultures obtenues.
De manière préférée, lesdites cultures de mastocytes sont des lignées de mastocytes d'origine porcine .
Le terme « culture » désigne ici, de manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées in vi tro . Une culture développée directement à partir d'un prélèvement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal est dénommée « culture primaire ». Le terme « lignée » est employé à partir du moment où au moins un passage, et généralement plusieurs passages consécutifs en sous-culture ont été effectués avec succès, et désigne toute culture qui en est issue. (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91-101, 1990) .
Avantageusement, lesdits mastocytes sont issus de cultures et notamment de lignées de mastocytes porcins obtenues comme décrit dans la Demande FR 0113608, ainsi que dans la Demande PCT intitulée « Cultures de mastocytes de porc et leurs utilisations » au nom de-l'INRA, et de l'ENVA déposée le même jour que la présente Demande. Parmi celles- ci, des lignées préférées pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention sont :
- la lignée de mastocytes issus de foie fœtal de porc déposée par l'INRA (147 rue de l'Université, 75007 Paris, France) auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 26, rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France) le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2735 ;
- la lignée de mastocytes issus de foie fœtal de porc, et transfectes par l'antigène T du virus SV40 déposée par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2736 ; la lignée de mastocytes issus de moelle osseuse de fœtus de porc et transfectes par l'antigène T du virus SV40, déposée par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2734.
Préférentiellement ces mastocytes ' sont des mastocytes séreux.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEMα/DMEM, RPMI, IMDM, ... ) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en combinaison ou de façon individuelle, tels que le SCF (Stem Cell Factor) à une concentration comprise entre 1 ng/ml et 1 μg/ml, et éventuellement l' IL3 ( Interleukine 3) à une concentration comprise entre 0,1 ng/ml et 100 ng/ml, ou la PGE2 (prostaglandine E2), à une concentration comprise entre 1 nM et 1 μM.
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0, 5% et 20% (v/v) .
L' addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol . Methods, 240, 101-10, 200).
L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance, peut être obtenue par mutation contrôlée du phénotype cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46, 933-8, 1996 ; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23, 1996) . Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, , Eds . Spier et Griffiths, Académie Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Académie Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983) . La culture peut également être réalisée en suspension ou sur micro-support selon la technique décrite par VAN MEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967) .
On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch) , qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en œuvre à l'échelle industrielle (VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd édition, Noyés Publication, West ood, New Jersey, U.S. A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 10e cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70% à 90%) pour les opérations d'extraction des GAGs et d'isolement de l'héparine et en conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD et al., Gen . Eng. News, 20, 18-48, 2000). Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l' intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieures à celles pouvant être obtenues en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin- filter) , fibres creuses, ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992 ; VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987). Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 107 et 5 x 107 cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire ainsi que de l'accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules: pH, p02, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbones (par exemple glucose, fructose, galactose) , métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc. A partir de 3 à 30 jours de culture, généralement à partir de 3 à 10 jours, de culture dans ces conditions les cellules peuvent être récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou iltration . Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering
Handbook, 2nd Edition, Noyés Publication, Westwood, New Jersey, U. S . A. ) .
Alternativement, ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20 μm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec"1) afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE) , des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF) .
On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permettent d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d' éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus, ou autres macromolécules.
On peut utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver les GAGs et l'héparine dans le contenu intra-cellulaire ; toutefois on peut aussi récolter les GAGs et l'héparine dans le milieu de culture après lyse ou dégranulation des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents a la surface des mastocytes, par exemple la fixation d' agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou ' analogues de ce fragment) sur les récepteurs IgE des mastocytes. Dans le cas où l'héparine a été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation, l'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape d' ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique, ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en œuvre, le seuil de coupure -des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 KDa . On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro- filtration, par exemple, membranes spirales, membranes planes, ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge, ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple 'anticorps, ATIII, lectine, peptides, nucléotides, etc ). D' autres ag-ents peuvent aussi induire une clégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc) , le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc) . [D. Lagunoff and T . W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les mêmes cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules . Dans le cas particulier de 1 ' îonophore A23187, la degranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.106 cellules/ml de mastocytes avec 1 ' îonophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 a 100 μg/ml et des temps d'action variant de 1 minute a 4 heures.
La lyse des mastocytes peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation) , par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression) , par action d'agents chimiques (NaOH, THESIT™, NP40™, TWEEN 20™, BRIJ- 58τ'\ TRITON X™-100,...), ou par lyse enzymatique (papame, trypsine, ... ) , ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes . Pour extraire et purifier l'héparine à partir du
Ivsat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noλ au ser-glycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cite ci-dessus) .
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer 1' héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycme :
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papame, etc...) ; les liaisons héparine-protéine peuvent être hvdrolvsées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ;
- on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracetique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs-protéines ; - on peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc. Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d' échange d' anions ou chromatographie d' affinité . La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en œuvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à 1' invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de 1' héparine . La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation d'héparine à partir de cultures de mastocytes et de caractérisation de l'héparine obtenue . EXEMPLE 1 : EXTRACTION D'HEPARINE A PARTIR DE CULTURES DE
MASTOCYTES
Culture des mastocytes
Une lignée de mastocytes de foie fœtal de porc, et une lignée de mastocytes de foie fœtal de porc transfectees par l'antigène T du virus SV40 des (lignées
CNCM 1-2735 et CNCM 1-2736, respectivement), ont été utilisées ;
Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à 5 :. 10r cellules/ml, dans du milieu MEMα complet en présence d' IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Les cultures sont réalisées en boîte de culture ou en suspension en flacon de 1 litre de type « spinner ». La croissance cellulaire est suivie journellement pendant 4 à 12 jours. La production d'héparine est suivie en parallèle, par l'analyse des glycosaminoglycanes produits en culture. Les résultats sont présentés dans les Figures 1 à 5.
Les Figures 1, 2 et 3 illustrent la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte (Figure 1 ; ensemencement initial : :1 x 105 cellules ; H : 2 x 105 cellules) et en suspension en flacon (Figure 2), et la croissance des mastocytes de foie transfectes en suspension en flacon (Figure 3). Dans ces expérimentations, les cultures en suspension en flacon présentent une densité cellulaire maximale allant d'environ 8 x 105 (pour les cellules non transfectees) à environ 1,5 x 106 cellules/ml (pour les cellules transfectees) . Le temps de doublement, calculé pendant la phase exponentielle de croissance, est compris entre 24 et 48 heures.
Purification des glycosaminoglycanes
Les cellules subissent une hydrolyse en milieu alcalin en présence de sel afin de rompre les proteoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de types ioniques.
Ce traitement comprend les étapes suivantes :
1. Traitement par la soude en milieu salin: cette étape vise à détruire les cellules et à couper les liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
L'étape comprend l'ajout de 100 μl de NaOH 1 M et de 800 μl de NaCl 0,5 M à un culot de 106 cellules. Le mélange ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à 80°C pendant 30 minutes puis soniqué pendant 5 minutes avant d'être neutralisé avec du HC1 1 N.
2. Extraction : l'échantillon hydrolyse est déposé sur une colonne de résine échangeuse d'anions (SAX, Varian) , qui retient l'héparine. La colonne est lavée trois fois en tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 0,5 M afin d'éliminer les protéines et les autres GAGs, notamment le dermatane. Puis l'héparine est éluée par 1 ml de tampon Tris/HCl pH 7, , NaCl 3 M.
3. Dessalage/Lyophilisation : l'élimination du chlorure de sodium (nécessaire pour pouvoir appliquer certaines des méthodes d' analyse qui sont décrites ci- après) s'effectue par chromatographie d'exclusion stérique sur gel SEPHADEX G10, suivie par conductimétrie . Les fractions d'héparine collectées sont ensuite lyophilisées pour concentrer l'échantillon.
Analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide
Cette technique permet de séparer les GAGs selon leur taille et leur charge, et constitue un test permettant de vérifier rapidement la présence ou l'absence d'héparine. La préparation purifiée obtenue comme décrit ci-dessus est déposée sur gel de polyacrylamide Tris/tricine (gradient de 10 à 20%) permettant de séparer des molécules de 30 à 1 kDa, à raison de 20 μil de préparation par dépôt. On dépose sur le même gel 25 ng de dermatane, 25 ng d'héparine porcine standard SPIM (4eme étalon international d'héparine porcine, mucus intestinal), et de l'héparine extraite de mucus porcin et purifiée par traitement par la soude et purification sur résine echangeuse d' anions dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus.
Une double coloration avec une solution de bleu alcian puis du nitrate d'argent comme décrit dans AL-HAKIM et LINHARDT (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, 305-12, 1991) permet de révéler les glycosaminoglycanes (le nitrate d'argent seul ne révèle que les protéines) .
Les gels sont ensuite analysés par un scanner (BIO-RAD) pour quantifier les différents GAGs. La limite de quantification de l'héparine est de 10 ng par bande.
Les résultats d'une expérimentation sont résumés dans le Tableau 1 ci-dessous, dans lequel la quantité d'héparine produite par les cellules est exprimée en μg/106 cellules .
Figure imgf000015_0001
Ces résultats sont également illustrés par la Figure 4 (courbe = population cellulaire ; barres = production d'héparine).
La Figure 4 illustre la production d'héparine au cours de la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte.
Les concentrations en héparine généralement observées sont comprises entre 2 et 14 μg pour 106 cellules, en culture statique et en suspension. EXEMPLE 2 : CARACTERISATION DE LA PREPARATION D'HEPARINE OBTENUE À PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES
Profil disaccharidique par CLHP
La composition en disaccharides permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes.
Le profil disaccharidique des glycosaminoglycanes produits par les mastocytes en culture a été déterminé selon la méthode décrite par LINHARDT et al. (Biomethods, 9, 183-97, 1997). La préparation de GAGs obtenue comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus a été dépolymérisée par un mélange d' héparinases de Flavobacterium heparinium (héparinases I, II, et III, GRAMPIAN ENZYMES) . Les conditions utilisées sont décrites dans la publication de LINHARDT et al., citée ci-dessus.
A titre de témoin, l'héparine standard SPIM a été dépolymérisée dans les mêmes conditions.
Dans ces conditions, la dépolymérisation est complète, et produit des disaccharides. Les disaccharides principaux, au nombre de huit, qui sont soit N-sulfatés, soit N-acétylés sont représentés sur la Figure 5.
Détection par UV
Ces disaccharides sont séparés et identifiés par CLHP, sur colonne échangeuse d' anions comme décrit par LINHARDT et al., (cité ci-dessus).
Les résultats sont illustrés par la
Figure 6, représentant le profil disaccharidique de la préparation d'héparine produite par une culture en flacon de mastocytes dérivés du foie fœtal (B) , par rapport au profil disaccharidique de l'héparine standard (D) .
Ces résultats montrent que tous les disaccharides présents dans l'héparine porcine de référence SPIM sont également présents dans l'héparine de mastocyte, bien que dans des proportions différentes. Le rapport IS/IIS est de 3,7.
Détection par fluorescence
Une méthode similaire avec une détection fluorimétrique permet de quantifier uniquement les disaccharides IS et IIS, caractéristiques de l'héparine, et d'en faire le rapport.
La dépolymérisation enzymatique et la séparation CLHP sont conduites de la même manière que celle décrite ci-dessus.
La séparation est suivie d'une dérivatisation post-colonne, pour former un complexe fluorescent avec la guanidine .
Le disaccharide trisulfaté IS qui possède le facteur de réponse le plus fort par cette technique, est détecté et quantifié par rapport à une solution d'héparine standard de concentration connue.
La limite de détection de la méthode est de l'ordre de 5 ng/ml d'héparine dans les échantillons de culture cellulaire.
Le Tableau 2 ci-dessous illustre le rapport IS/IIS de cultures cellulaires au cours du temps.
Tableau 2
Figure imgf000017_0001
EXEMPLE CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HEPARINE PAR
DETERMINATION DES ACTIVITES ANTI-XA ET ANTI-IIA
Activités biologiques
L' inactivation des facteurs Xa et lia est caractéristique de l'héparine, et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane. La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie des heparines de basse masse moléculaire de la Pharmacopée Européenne 3eme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes :
1. ATIII + Héparine ->. [ATIII - Héparine]
2. [ATIII - Héparine] + Facteur (excès ) -». [ATIII - Héparine - Facteur] + Facteur (résiduel)
3. Facteur (résiduel) + substrat chromophore —».pNA
La quantité de paranitroaniline (pNA) libérée est mesurée à 405 nm. Elle est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
L' activité anti-Xa ou anti-IIa est évaluée par rapport à une droite d' étalonnage établie avec le standard SPIM.
La sensibilité de la méthode est de 0,006 Ul/ l.
Les résultats obtenus sont représentés sur le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
L'activité anti-Xa ou anti-IIa de l'héparine obtenue a partir de mastocytes en culture a été comparée à l'activité anti-Xa ou anti-IIa, respectivement, de l'héparine obtenue à partir de mucus porcin ou de l'héparine standard. Les résultats sont illustrés dans le Tableau 4 ci-dessous. Tableau 4
Figure imgf000019_0001
Caractérisation de la liaison à l'ATIII
La liaison entre l'héparine et l' ATIII est mise en évidence par un retard de migration par des techniques d' electrophorese comme décrit dans LEE et LANDER (Proc. Uatl. Acad. Sci . , 88, 2768-72, 1991).
L' electrophorese est réalisée sur gel d' agarose a 2,8" dans une solution à pH 3 (acide acétique/hydroxyde cie lithium) . A 100 μl d'échantillon à tester, on ajoute
100 μl de solution de concentration décroissantes de 584 à 183 μg/ml d'ATIII (origine humaine ; BIOGENIC) .
Des dépôts de 100 μl d'échantillon sont faits. La migration est de 30 minutes à 100 volts. Les gels sont fixés par une solution de bromure α'r.exadécyltriméthyl ammonium (CETAVLON-SIGMA) à 0,1%.
La révélation est effectuée par l'Azuré A (0,08% dans l' eau) .
Les gels sont scannés et interprétés avec le logiciel QUANTITY ONE (BIO-RAD) .
Les résultats sont exprimés en % d'héparine liée a 1 'ATIII.
Les résultats obtenus dans le cas d' une culture en flacon de cellules de foie transfectees sont illustrés par la Figure 7.
On observe une liaison de l'ATIII de 31% (valeur théorique 33%) en présence d'héparine standard (SPIM), et cle 27- en présence de l'héparine obtenue à partir de mastocytes en culture (composé) . EXEMPLE 4 : CULTURE DE MASTOCYTES EN BIO-REACTEUR EN MODE BATCH RÉPÉTÉ
Une lignée de mastocytes issus du foie fœtal porcin non transfectée a été utilisée. Les cellules sont ensemencées à raison de 2.0 à 4.0 xlO5 cellules par ml dans du milieu DMEM/F12 complet additionné d' IL3 porcine (2ng/ml) de SCF porcin (80ng/ml).
Le bioréacteur utilisé a une capacité de 2 litres de milieux de culture, la tension d'oxygène de la culture est maintenue entre 20% et 40% de la saturation, le pH entre 7.0 et 7.4, la température est maintenue à 37 °C +/- 0.5°C par circulation d'eau thermostatée dans la double enveloppe du bioréacteur. L'agitation de la culture est réalisée par une hélice de type marine avec une vitesse comprise entre 80 à 150 tours/minutes.
Après 4 jours de culture la densité cellulaire est de 1.3 x 106 cellules/ml, correspondant à un temps de doublement compris entre 24 et 48h. Le jour de la récolte, 80% de la culture est prélevée pour l'extraction d'héparine, le reste de la culture est maintenue dans le bio-réacteur et diluée avec du milieu frais à une concentration comprise entre 2.0 à 3.0xl05 cellules/ml tel que décrit pour une opération de production en batch répété. Trois jours après dilution en mode batch répété, la densité cellulaire obtenue est de 9.0 x 105 cellules/ml, correspondant à un temps de doublement compris entre 24 et 48 heures et comparable à la première mise en culture (Figure 8).
La purification de l'héparine s'effectue comme décrit dans l'exemple 1.
L'héparine purifiée est alors analysée par HPLC, comme décrit dans l'exemple 2, en utilisant l'héparine standard SPIM à titre de témoin.
Le tableau 5 et la figure 9 représentent le profil disaccharidique et la proportion du noyau protéique serglycine (Gly-Ser) de la préparation d'héparine produite par la culture de mastocytes en suspension dérivés du foie fœtal porcin ( M ) , par rapport au profil obtenu pour l'héparine standard SPIM (D) .
Le tableau 6 représente le profil de N-acétylation, de N- sulfatation et de O-sulfatation des disaccharides de l'héparine produite par la culture de mastocytes en suspension dérivés du foie fœtal porcin par rapport à celui des disaccharides de l'héparine SPIM standard.
Tableau 5
Figure imgf000021_0001
Tableau 6
Figure imgf000021_0002
Des résultats similaires sont obtenus lorsque l' or. utilise une lignée de mastocytes transfectes par l'antigène T du virus SV40.
EXEMPLE 5 : PRODUCTION D'HÉPARINE DANS LE SURNAGEANT DE CULTURE PAR MISE EN ŒUVRE D'UN AGENT DE DÉGRANULATION.
Les expérimentations ont été effectuées sur une lignée de mastocytes de foie fœtal non-transfectés .
Au 762eιne jour (compté à partir de la première mise en culture) , la concentration de mastocytes a été ajustée à 2xl06 cellules/ml, et la culture est incubée pendant une heure en milieu MEM comprenant 4μg/ml de 1 ' lonophore A23187, ce qui induit la dégranulation des mastocytes .
Les GAGs totaux, et les GAGs sécrétés produits par les cellules sont quantifiés en PAGE. La Figure 10 montre que 70 à 75 % des GAGs sont retrouvés dans le surnageant après traitement par l'ionophore A23187, contre environ 10% dans les cellules non traitées (0 μg/ml de A23187) .
Les mastocytes pour lesquels la récolte de GAGs a ete réalisée au 762eme jour de culture ont été remis en culture. On n'observe aucune perte de viabilité et de vitesse de croissance.
21 jours plus tard, ces mastocytes sont soumis à une nouvelle dégranulation, et les GAGS sont dosés comme décrit ci-dessus. Une culture de mastocytes du même âge, n'ayant pas subi de degranulation au 762èrae our est utilisée a titre de contrôle.
Les résultats sont illustrés par la Figure 10 qui montre que le pourcentages de GAGs sécrétés est comparable à celui obtenu lors de la première dégranulation et aussi comparable à celui obtenu avec les cellules contrôle du même âge.
Des résultats similaires sont obtenus lorsque l'on utilise une lignée de mastocytes transfectes par 1' antigène T du virus SV40.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la culture de mastocytes d'origine porcine et la récupération de l'héparine à partir des cultures obtenues.
2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdites cultures de mastocytes sont des lignées de mastocytes d'origine porcine.
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont issus de moelle osseuse de fœtus de porc ou cie foie fœtal de porc.
4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont des mastocytes séreux.
5) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits mastocytes sont issus d'une lignée de mastocytes choisie parmi : la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2735 ; la lignée déposée auprès de la CNCM le 1"? octobre 2001, sous le numéro 1-2736 ; la lignée déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2734. 6) Préparation d'héparine susceptible d'être obtenue par un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 5.
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