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Publication number: BE505256A
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  PERFECTIONNEMENTS   AU'PROCEDE DE   PRODUCTION D'UN PRODUIT'COMPLEXE DE 
POLYSACCHARIDE, A ACTION BIOLOGIQUE. 



   Cette invention a trait à la préparation de produits complexes de polysaccharide à action biologique, d'origine microbiologique, qui, intro- duits dans le corps, provoquent (a) une réaction réticulo-endothéliale ou (b) de la fièvre ou encore (c) une réaction endocrine. Les produits complexes de   polysaccharide   sont préparés à partir de diverses bactéries du sous-ordre des Eubacteriineae, tel que   défini   dans le manuel de   Bergey   (Berge 's Manual) 
Ces préparations sont également utiles pour réduire la motilité gastrique et pour réduire la sécrétion gastrique. 



   L'un des objets de cette invention est de fournir un procédé de préparation de produits complexes de polysaccharide à action biologique qui soient utiles, lorsqu'ils sont introduits dans le corps   humain,  pour donner (a) une réaction réticulo-endothéliale ou (b) de la fièvre ou encore (c) une réaction endocrine.Un autre objet de l'invention est de permettre la prépa- ration de produits ayant les qualités précitées qui soient stables et   de 'com-   position   uniforme.  Enfin un autre objet encore est de fournir un procédé par lequel on puisse préparer les produits de façon répétée et aisée,tout en obtenant le rendement   maximum   de la matière active. D'autres buts et avan- tages spécifiques ressortiront de   1-'exposé   qui va suivre. 



   Dans l'un desmodes de réalisation de   l'invention,   l'inventeur fait croître des cellules bactériennes sur une matière nutritive choisie.On récolte alors les cellules et on les soumet à la protéolyse et à la dialyse, en vue d'éliminer des corps des cellules les produits de dédoublement ou de séparation de la protéine et les autres fragments   dialysables,   tout en récu- pérant la matière à action biologique non dialysable.Le produit complexe de   polysaccharide   à action biologique peut être mis en suspension dans un dissolvant soumis à un effet de tampon, être mis en flacon et être stérilisé 

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 a chaud. 



   On a obtenu d'excellents résultats en appliquant la technique susmentionnée à l'isolation d'une matière à action biologique de la famille des Pseudomonadaceae du sous-ordre des Eubacteriineae et, en particulier, à une espèce Pesudomonas, type M-27, culture du type américain n  9229. Le procédé est également applicable à d'autres familles du sous-ordre des Eu bacteriineae. Il a été démontré que les familles suivantes de ce sous-or- dre, en plus de la famille des Pesudomonadaceae, donnaient des matières à action biologique. 



   On a constaté une activité utile dans les familles des Azoto-   bacteriaceae.   des Rhizobiaceae, des Neisseriaceae, des Lactobacteriaceae, des Achromobacteriaceae, des Enterobacteriaceae, des Bacteriaceae et des Baccillaceae. Ia famille des Parvobacteriaceae comprenddes organismes fé- brigènes bien connustels que les membres de la tribu des   Brucelleae,   ce qui justifie son inclusion dans le groupe général. Il y a aussi quelque possi- bilité d'évidence quant à l'activité utile dans la famille de nitrobacteria- ceae, celle des Micrococcaceae et celle des Corynebacteriaceae, familles qui peuvent également être comprises dans le groupe. 



   Il a été démontré que les membres représentatifs des familles du sous-ordre des   Eubact.eriineae,   sont efficaces pour la production des ma- tières à action physiologique; toutefois,l'application du procédé n'est pas limité à ce sous-ordre mais peut également s'étendre à d'autres micro- organismes. 



   Dans le mode de réalisation de l'invention dans lequel on fait crotte des cellules bactériennes sur une matière nutritive choisie, pour les récolter et les soumettre ensuite à la protéolyse, l'inventeur a em- ployé différentes enzymes protéolytiques ou mélanges d'enzymes convenant à ce but, par exemple,de la trypsine, de la pancréatine, de la papaïne, le produit connu sous le nom de "Polidase-S",   uhe   enzyme de poisson, une pré-   paration   intestinale et de la protéase. On peut encore employer d'autres en- zymes protéolytiques de cette classe générale en dégénérant la protéine pré- sente dans les corps des cellules. 



   En général, la séparation'des protéines ou des produits de dé- doublement de la protéine et autres fragments à faible poids moléculaire des autres composants des cellules bactériennes dissoutes par une lysine, a, pendant des années, représenté un problème des plus difficiles, qu'on a tenté de résoudre de différentes façons, par exemple en extrayant sélec- tivement la protéine des composants cellulaires au moyen de phénol à 95 % ou par la méthode Sevag   d'émulsification   au   chloroform-amyl-alcool.   L'in- venteur a constaté que de tellesméthodes de déprotéinisation donnaient des produits variables.

   L'utilisation de divers agents de précipitation frac- tionnelle, tels que le sulfate d'ammonium, le chlorure mercurique, l'acé- tate de plomb, le sulfate de cuivre, l'acide picrique,   l'acide     sulfosali-   cylique, le tungstate de sodium et l'acide tannique, n'a pas donné de ré- sultats satisfaisants. La précipitation fractionnée   d'une   dispersion aqueu- se par l'addition progressive de liquides organiques nuisibles à l'eau or- dinaire,tels que l'acétone, l'éthanol et   l'alcool     isopropylique,   fut exa- minée et on constata qu'elle était inefficace. L'extraction au glycol dié- thylénique fut également inefficace.

   On tenta, sans y réussir,de purifier par précipitation de dissolvants non   aqueux.De   nombreuses modifications et combinaisons des procédés ci-dessus mentionnés échouèrent comme leur appli- cation directe et ne donnèrent pas un produit uniforme. 



     L'utilisation,  avec succès, de la protéolyse dans le procédé de fractionnement de   l'invention   dépend du caractère physique de,,la mem- brane semi-perméable employée dans la phase subséquente de dialyse. On a trouvé qu'en utilisant une membrane de porosité critique, il était possible d'éliminer les produits de dédoublement provenant de la phase protéolytique   @   

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 de même que les autres entités à faible poids moléculaire, des corps de cel-   lules,   en laissant un produit d'uniformité et pouvoir biologique désirés. 



  Différents types de membranes ont été utilisés,par exemple des enveloppes en boyau de cellulose connue dans le commerce sous le nom de   "Visking     Nojax",   de diamètres et d'épaisseurs différents, des feuilles de cellophane d'épais- seurs différentes et des tuyaux en pellicule de gel de cellulose régénérée au mouillée de diamètres différents (Transparent Package   Co).   D'épaisseur de la membrane ou le genre de .la matière ne déterminent pas leur aptitude.. 



   Les caractéristiques d'aptitude d'une membrane dépendent du trai- tement qu'elle reçoit avant son usage dans le procédé de dialyse; par exem- ple, une membrane séchée et remouillée ne   retrouve   pas sa porosité initiale; une paroi en membrane peut s'aplatir ou   saffaisser   avec le séchage ou sim- plement lorsqu'elle est exposée, ce qui la rend plus'mince mais moins poreu- se; les agents chimiques de gonflement ou l'étirage mécanique augmentent la porosité avec des effets variables sur l'épaisseur de paroi en membrane . 



   L'inventeur a trouvé qu'il était nécessaire de mesurer l'apti- tude de la membrane au moyen   d'un   essai de fonctionnement qui établit les ca- ractéristiques d'aptitude  Un essai fut imaginé qui impliquait la digestion d'une protéine bien définie, telle que   l'albumine   bovine cristalline, de la même manière que celle dont le substrat cellulaire bactérien fut protéolyse. 



  Suite à ce traitement., on procéda à la dialyse et la mesure du pourcentage de matière résiduaire non dialysable indiquait l'aptitude de la membrane à l'utilisation dans la préparation de matières à action biologique à partir des substrats cellulaires bactériens   digérés.  L'inventeur a constaté qu'une membrane permettant le passage de 75 à 90 pour cent d'albumine bovine digé- rée donnait satisfaction. 



   Après la phase de dialyse précitée  dans   le traitement du sub- strat cellulaire bactérien digérée la matière retenue par la membrane peut être utilisée comme produitfinal,avec réglage approprié de la concentra- tion, pour   tre   administré soit par voie parentérale,, soit par voie sublin-   guale.  Si on le désire, le produit peut être lyophilisé ou autrement séché. 



   On a constaté que la matière à action biologique était d'un pH instable et que cette instabilité était accentuée aux températures élevées. 



   L'inventeur a découvert que si la matière était mise en   suspen-   sion dans un dissolvant aqueux soumis à un effet de tampon pour une gamme de p H comprise entre   5, 5   et 8,5,  l'effet   des variations de température était minimum et que l'on pouvait obtenir une matière à action biologique, d'une vie en étagère satisfaisante. 



   On a constaté   qu'on   pouvait soumettre la solution à un effet de tampon en employant un sel, compatible physiologiquement,, d'une base forte et d'un acide faible en combinaison avec de l'acide à   l'état   libre en des quantités suffisantes pour amener le pH à 5,5 - 8,5; par exemple, du r-lac- tate de sodium   M/6   additionné d'acide lactique est très efficace dans la gamme de pH 5,5 à   7,   ou bien une combinaison de phosphates monosidique et bisodique couvre de façon satisfaisante la gamme entière de pH   5, 5   à 8,5. 



    De même,   le citrate de sodium peut être utilisé avec de l'acide citrique. 



  On peut aussi employer d'autres tampons convenables au point de vue physio- -logique. 



   Des exemples spécifiques de procédé sont donnés ci-après: Exemple I 
Une espèce Pseudomonas, type M-27, culture du type américain n  9229, de la famille des Pseudomonadaceae du sous-ordre des Eubacterii- neae, croît sur un bouillon nutritif appelé 'bouillon nutritif Difco", ou sur toute autre nourriture satisfaisante.On récolte la matière cellulaire; on la met en suspension dans 1-'eau (habituellement à une concentration de 

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 0,5 pour cent) et on la met à l'autoclave pour tuer .toutes les cellules via-   bleso   Des suspensions de concentration beaucoup plus élevée ont été   utili-   sées. la suspension est traitée avec un agent de conservation et est soumise à la digestion tryptique aux température et gamme de pH optima de la trypsi- ne.

   (Des agents de conservation tels que le toluène ou le thimerosal   (1/10.000)   sont   appropries).   Un rapport trypsine (substrat cellulaire de 1/50 est approprie, bien qu'on puisse admettre des variations sensibles de ce rapport. La protéolyse se fait rapidement mais de lentes augmentations en amino-N libre continuent à se produire même jusqu'au cinquième jour. 



    L'élimination   des débris cellulaires insolubles du produit digéré est   sui-   vie de la dialyse, en vue de l'élimination des produits de dédoublement de la protéine et autres fragments dialysables. La partie non dialysable est filtrée ou centrifugée, laissant une dispersion aqueuse du produit complexe de polysaccharide à action biologique. décisive L'inventeur a trouvé que la phase de dialyse était d'importance   décisive,   en ce sens que le'élimination satisfaisante des produits de dédou- blement des cellules Pseudomonas   protéolysées   dépendait de la porosité de la membrane de dialyse. On a constate que la seule méthode sûre pour mesu- rer Inefficacité d'une membrane donnée était fonction de ses propriétés de fonctionnement.

   On fait digérer une protéine bien définie, soit de l'al- bumine bovine cristalline, avec de la trypsine, exactement de la manière décrite ci-dessus pour le substrat cellulaire. On soumet alors le produit digéré à la dialyse pendant 24 heures et on détermine la quantité de matière qui a traversé la membrane. En procédant de cette manière,on peut classi- fier les différentes membranes. On a constaté qu'une membrane réellement ef- ficace laissait passer   approximativement   90 pour cent de   1-'albumine   bovine cristalline digérée dans les conditions spécifiées. Les membranes modéré- ment efficaces en laissent passer 75 à 90 pour cent et les membranes pau- vres en laissent passer 55 pour cent. 



     L'utilisation   d'une membrane de dialyse qui laisse passer au moins 75 pour cent et, de préférence, 85 à 90 pour cent, de   l'albumine     di-   gérée est essentielle pour l'élimination satisfaisante des produits de dé- doublement des cellules Pseudomonas protéolysées. Après un jour de dialyse, on constate qu'approximativement 15 à 30 pour cent du produit cellulaire digéré sont retenus par une telle membrane. La matière à action biologique retenue, après centrifugation ou filtration, est diluée pour être utilisée comme produit final ou est isolée sous forme sèche pour l'emmagasinage.

   Si une membrane pauvre (de faible porosité) est employée, 40 à 60 pour cent du produit cellulaire digéré sont retenus et le produit complexe de   poly-     saocharide   est dilué par des matières inactives, ce qui réduit sa   puissan-   ce. 



   Le produit complexe microbien de polysaccharide subit, dans un agent véhiculant aqueux, des changements dégénératifs qui sont en rapport avec le pH de 1-'agent véhiculant. Les températures élevées accentuent l'in stabilité du pH. On a trouvé qu'un excellent procédé pour l'obtention d'un produit modérément stable consiste à mettre l'agent actif en suspension dans du r-lactacte de sodium M/6 et à ajouter de l'acide lactique en quan- tité suffisante pour obtenir un pH final de   5,5   à 7. Des pH plus élevés peuvent être employés avec garantie mais le pouvoir de tampon du tampon de lactate décroît rapidement au-dessus du pH   7.   Ces dispersions'soumises à un effet de tampon supportent avec succès la stérilisation par autoclave. 



   Un produit préparé de cette manière, à partir de cette espèce Pseudomonas permet une   élévation   moyenne de la température rectale d'au moins 1 F., chez les lapins, par les méthodes Standard, endéans les 4 heu- res, lorsqu'il est administré par voie intraveineuse, dans la proportion de 1 micro gramme par kilogramme du poids du corps. 



   Une activation généralisée du système   réticulo-endothélial   se produit également Ceci se caractérise le plus rapidement par une   leuco-   

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   pénie,   qui survient dans les quelques heures qui suivent l'injection de la dose   dressai.  De plusil y a des modifications des tissus dans le système des glandes endocrines, comme indiquée par exemple du fait de modifications 
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 histologiques dans les glandes adréna3, donnant une activité sécrétoire   corticale  et de modifications dans les éléments basophiles de la pituitai- re antérieure, donnant une activité en cet endroits 
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 Eem.,le I2;

   Si on le désire, le produit complexe de polysaccharide peut être 
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 préparé à partir de 1'espèce seudomonas... exactement comme il a été décrit   ci-dessus,   et, ensuite, dispersé dans un tampon aqueux, constitué par une combinaison de phosphates   monosodique   et   bisodique,   choisie pour donner un pH final de   1-9 ordre   de 5,5 à 8,5.L'inventeur a trouvé qu'en dehors de cette gamme de pH, les températures élevées agissaient défavorablement sur le produit complexe de polysaccharide à action biologique. 



   Une combinaison de citrate de sodium et diacide citrique four- nit également un agent véhiculant soumis à un effet de tampon de façon sa- 
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 tisfaieante, pour maintenir Inactivité de la drogue. D'autres variantes de la même méthode générale entraînant l'utilisation de tampons compatibles au point de vue physiologique apparaîtront aux personnes expertes dans cette technique. 



    EXEMPLE   III. 



   Au. lieu de dégénérer la protéine dans la matière cellulaire provenant de l'espèce Pseumodonas, par digestion avec de la trypsine, on peut réaliser la protéolyse au moyen de papaine. On fit digérer une suspension cellulaire avec de la papal'ne,   à   sa gamme optimum de pH, et on employa la dialyse pour éliminer les produits de dédoublement et les autres fragments 
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 dia2ysablesp de la même manière que celle qui est décrite à l'exemple I, en vue d'obtenir un produit complexe de polysaccharide similaire à action biologique. 



   La possibilité   d'utiliser   divers   enzymes   protéolytiques est il- lustrée par un autre cas, dans lequel on fit digérer le substrat cellulaire avec une enzyme protéolytique de poisson et dans lequel on procédé de la manière décrite dans   1-'exemple   I, pour isoler un produit actif similaire. 



   Les exemples précédents suffisent à montrer que l'on doit s'at- tendre à ce que de nombreuses enzymes protéolytiques fassent dégénérer ef-   fectivement   le substrat cellulaire et donnent des produits finals à action biologique   semblables..   pourvu que l'opération de dialyse entraîne   l'utilisa-   tion d'une membrane choisie de façon convenable, de porosité calibrée, com- 
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 me il est indiqué dans 39 eenie Il EX'E'hE IV 1 inventeur a appliqué les mêmes techniques à d'autres membres du sous-ordre des Eub,té .inee Par exemple, on fit croître l'espèce Pro- teus vulgaris, culture du type américain n    6380,   de la famille des Entero- 
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 bteas sur une matière nutritive convenable.

   La matière cellulaire fut récoltée, mise en suspension dans   leau,   tuée par la chaleur et soumise à la protéolyse de la manière décrite dans l'exemple I ou selon les   varian-   tes décrites dans les exemples suivants. De nouveau, le succès de   l'opéra-   tion de dialyse dépend de l'utilisation d'une membrane de porosité satis- faisante, définie par son aptitude à permettre le passage de 75 à 90 pour 
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 cent d9 albn,....e bovine protéolysée dans les conditions définies. Le produit complexe de polysaccharide qui est obtenu peut produire (a) une réaction ré- ticulo-endo+,hë2-ialee (b) de la fièvre et (c) une réaction endocrine. 

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 Exemple V. 



   Pour illustrer encore la possibilité   d'application   des techni- ques précitées dans la préparation de produits complexes de polysaccharide à action biologique, on fit crotte l'espèce Bacillus subtilis,culture du 
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 type américain n  6633 et 9466., de la famille des B,c.Z7.aceae, l'espèce Salmonella trphosa8 culture du type américain n  6539, de la famille des En terobacteri.aceaeg l'espèce Se atia matcescen culture du type américain n  9986, de la famille des bacteriaceae, et l'espèce Escherighle co.li, culture du type américain   n  8739,   de la famille des   Enterobacteriaceae.   



   Dans tous les exemples, les produits finals qu'on obtint en récoltant la matière cellulaire,en la mettant en suspension dans l'eau, en la tuant par la chaleur et en la soumettant à la protéolyse de la manière 
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 décrite dans 1-'exmple I ou selon les variantes données aux exemples sui-   vants étaient à même de produire (a) une réaction réticulo-endothéliale ou (b) de la fièvre ou encore (c) une réaction endocrine.   
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  Exemple VI" De plus, l'inventeur fit crotte l'espèce Azotobacte chrooooccum, culture du type américain n  9544? de la famille des Azotobacteriaceae, l'espèce Ohrom.obacteria violaceun, culture du type américain n  7461, de la famille des Rh3.ob.aceae, l'espèce Nei eria oatarr..l1Mi, culture du type américain n  8176, de la famille des Neisseriaceae, l'espèce Alcaliames faecaltei, culture du type américain n  212? de la famille des Achromo-   bacteriaceae,   et l'espèce   Bacterium     mycoides,,   culture du type américain n    4004,   de la famille des   Bacteriaceae.  On constata que ces espèces pro- duisaient également des matières à action biologique capables de permettre 
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 (a) une réaction réticulo-endothéliale ou (b) de la fièvre ou encore (c)

   une réaction endocrine. 



   Bien quedans la spécification qui précède, on ait exposé des exemples spécifiques du procédé de manière très détaillée, dans le but d'il 
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 lustrer des formes de réalisation de 19invention, on comprendra que les dé- tails puissent être modifiés dans une grande mesure., par les personnes ex- pertes en la matière:, sans que l'on s'écarte, pour cela, de   l'esprit   de   l'invention.   



   REVENDICATIONS. 



     1.   Procédé de préparation d'un produit complexe de   polysaccha-   ride à action biologique,  caractérisé   par le fait   qu'il   comprend l'opéra- tion de dissolution par une lysine d'organismes d'une espèce Pseudomonas et la séparation du produit complexe de polysaccharide à action biologi- que, de la matière cellulaire dissoute.

Claims

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend la protéolyse d'organismes de ladite espèce Pseudomonas et la dialyse des organismes protéolyses, une membrane ayant une porisité suffisante pour laisser passer 75 à 90 pour cent d'albumine bovine cristal- line protéolysée de la même manière étant utilisée.

3.Procédé suivant les revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que les organismes d'une espèce Pseudomonas sont protéolysés avec de la trypsine.

4. Procédé de préparation d'un produit complexe de polysaccha- ride à action biologique, caractérisé par le fait qu'il comprend les opé- rations de dissolution par une lysine d'organismes du sous-ordre des Eubac- teriineae et la séparation produit complexe de polysaccharide à action <Desc/Clms Page number 7> biologique, de la matière cellulaire dissoute, par dialyse, ledit produit complexe étant passe à travers une membrane d'une porosité permettant le passage de 75 à 90 pour cent de l'albumine bovine cristalline digérée.