RU2367686C1 - Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур - Google Patents
Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур Download PDFInfo
- Publication number
- RU2367686C1 RU2367686C1 RU2008111917/13A RU2008111917A RU2367686C1 RU 2367686 C1 RU2367686 C1 RU 2367686C1 RU 2008111917/13 A RU2008111917/13 A RU 2008111917/13A RU 2008111917 A RU2008111917 A RU 2008111917A RU 2367686 C1 RU2367686 C1 RU 2367686C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cona
- supernatant
- sepharose
- culture fluid
- hours
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Культивируют колонии штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573), отобранные по признаку агглютинации с 0,1%-ным раствором конканавалина А в концентрации не ниже 1,75·10-3 на жидкой среде МРС-1. Отделяют клетки центрифугированием и полученный супернатант культуральной жидкости концентрируют над мембраной UM-20 «Диафло». Полученный надосадок удаляют и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конканавалин А-сефарозе. Это обеспечивает получение субстанции с выраженной модулирующей активностью в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида Candida albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида Escherichia coli. 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для лечения дисбактериозов.
Известно, что положительный эффект от пробиотиков опосредован прямой или непрямой модуляцией эндогенной флоры и иммунной системы. В этом случае необходимым условием является непосредственный контакт пробиотической культуры с активными эпителиоцитами терминальной ниши макроорганизма.
Описано для использования в гинекологической практике средство для лечения дисбактериозов. Из штамма Lactobacillus fermentum 90-TS-4 - продуцента эубиотического препарата лактобактерина отобран вариант, агглютинирующийся в присутствии конканавалина-А (конА) и обладающий высокими адгезивными свойствами к влагалищному эпителию (RU 2133272 C1, 20.07.1999). Однако эффективность такой композиции невысока вследствие недостаточной концентрации и чистоты лектинсвязывающих структур. Известны препараты для уменьшения и/или блокирования адгезии патогенных веществ и организмов на основе антиадгезивных углеводов со структурным звеном уроновой кислоты на одном из его концов (RU 2267324 С2, 10.01.2006), которые расширяют арсенал антипатогенных средств для эукариотических клеток, однако они сложны в приготовлении и не являются пробиотиками.
Наиболее близким к патентуемому способу является способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, состоящий в культивировании штамма лактобактерий с получением супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта (Henriksson A., Szewzyk R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactbacillus fermentum 104 // App. and Environmental Microbiol. - 1991 - p.499-502).
Задачей изобретения является получение антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур из культуральной жидкости штамма L. fermentum 90-TS-4 (21), с целью его использования в производстве многокомпонентных пробиотических препаратов.
Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции предусматривает культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта.
Способ отличается тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1% раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре 37(±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок, и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.
Способ может характеризоваться тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об/мин в течение 14-16 мин при температуре 20(±0,05)°С.
Способ может характеризоваться и тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре 20(±0,05)°С в течение 24-48 ч, а также тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.
Способ может характеризоваться также тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0(±0,05) в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.
Способ может характеризоваться, кроме того, тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре 20 (±0,05)°С.
Технический результат изобретения - повышение модулирующей активности субстанции в отношении высокоадгезивных штаммов дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида E.coli и стабильности свойств субстанции.
В основе патентуемого способа получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур лежат следующие положения. В результате собственных экспериментов авторами показано, что наилучшую композицию пробиотического препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов, в которой будут присутствовать как микроорганизмы, несущие на своей поверхности слущивающиеся с поверхности лактобактерии специфические адгезины, так и культуры, адгезивную активность которых определяют лектино-подобные структуры, плотно связанные с бактериальной стенкой. Выделение слущивающихся поверхностных адгезинов позволит микрокапсулировать эти структуры, и создать условия, в которых пробиотический препарат при отсутствии биотопозависимости будет способен экранировать сайты связывания на клетках-мишенях от представителей болезнетворной флоры (см., "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины" стр.192-195, №2, том 145, 2008; "Вестник РУДН" стр.10-13, №2, серия медицина, 2007).
Нами впервые показано, что для лактобактерии характерна вариабельность экспрессии лектинсвязывающего компонента на поверхность клетки: это свойство наибольшим образом выражено для L.fermentum штамм 90 TS-4 (производственный) и L.fructosum штамм 20349. Агглютинация конА лактобациллами обоих штаммов при 8-ом порядке разведения составляет не менее 3,5·10-3 мг/мл. Среди лактобактерий, входящих в состав пробиотических препаратов существуют варианты с выраженной экспрессией таких структур и варианты их не экспрессирующие.
При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выявлено, что лектинсвязывающая субстанция диссоциирует на субединицы с молекулярной массой в пределах от 25 до 30 кДа. Известно, что за фиксацию на муцине клеток-мишеней ответственен белковый термостабильный компонент с молекулярной массой 29,0 кДа (см. упомянутый выше ближайший аналог). С помощью меченных коллоидальным золотом антител к этому компоненту удалось показать, что последний на поверхности лактобактерии присутствует в виде микрокапсулы, интегрирует в цитоплазматический слой и уходит в среду культивирования [Granato D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D., Marvin L., Rouvet M. Cell Surface-associated Elongation Factor Tu Mediates the Attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (Lal) to Human Intestinal Cells and Mucins. // J. Infec. and Immun. - 2004 - p.2160-2169].
Пример осуществления. После рассева штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) (штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-7573) проводился отбор колоний по признаку агглютинации с конА на стекле в концентрации не ниже 1,75·10-3 мг/мл.
Получение лектинсвязывающей субстанции от данного продуцента осуществлялось в следующем процессе.
1. Отобранный вариант штамма L. fermentum 90-TS-4 (21) культивировали на жидкой среде МРС-1 в объеме 1000 мл в CO2-условиях, в течение 15-17 часов при температуре 37(±0,05)°С и постоянном перемешивании.
2. Через 15-17 часов культуру клеток с помощью центрифугирования (14-16 мин, 3000 об/мин (g=9859,6 м/сек2)) отделяли от культуральной жидкости.
3.Супернатант культуральной жидкости переносили на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) и освобождали от низкомолекулярных компонентов и остаточного количества бактериальных клеток с помощью стерилизующих мембран марки «Милипор» с диаметром пор 0,02 мкм.
4. Очищенную культуральную жидкость концентрировали на ячейки фирмы AMICON (США) (2000 мл) с использованием мембран «Диафло» марки UM-20 до объема 100 мл. Одновременно супернатант культуральной жидкости трехкратно отмывали дистиллированной водой от молочной кислоты, доводя рН до значения 6,0±0,05.
5. Полученный концентрат культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) инкубировали 24 часа при комнатной температуре с конА-сефарозой. По истечении суток надосадок удаляли, а конА-сефарозу трехкратно отмывали фосфатным буфером (рН=8,2). Далее добавляли физиологический раствор (рН=3,0) и инкубировали 3 часа при комнатной температуре. Собирали надосадок и доводили его до рН=7,2 с помощью 0,1М NaOH. Наличие лектинсвязывающей субстанции контролировали с помощью 0,1% раствора конА в реакции кольцепреципитации.
Целевой продукт - антиадгезивный компонент на основе лектинсвязывающих структур штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) более технологичен, чем полученный из штамма L.fermentum RC-14 в упомянутой работе Henriksson А. и Szewzyk R., и имеет следующие характеристики:
компонент, содержащий 150,0 мкг/мл белка, агрегативно не устойчив при значениях рН выше 6,0;
молекулярная масса, определенная с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, составляет от 25 до 30 кДа;
свойства лектинсвязывающей субстанции стабильны и не меняются при хранении и в процессе лиофилизации.
При изучении динамики накопления показано, что максимальная концентрация лектинсвязывающей субстанции в культуральной жидкости определяется на 15-17 час культивировании, в СО2-условиях и постоянном перемешивании, что является более выгодными условиями, чем при выращивании культуры в течение 24-48 часов, как это описано в патенте RU 2133272.
Фореграмма очищенной лектинсвязывающей субстанции, выделенной из культуральной жидкости штамма L.fermentum 90 TS-4 представлена на фигуре.
Лектинсвязывающая субстанция оказывает модулирующее действие на адгезивную активность тест-культур дрожжеподобных грибов вида C.albicans и условно-патогенных штаммов микроорганизмов из вида Е.соli к эпителиоцитам влагалища клинически здоровых женщин. Данное утверждение иллюстрируют следующие результаты.
Модулирующее свойство фракции, лишенной способности реагировать с конА и фракции, способной реагировать с конА концентрата культуральной жидкости (КЖ) L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) в тесте торможения адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища дало результаты (см. Таблицу), которые свидетельствуют о том что хроматографически очищенная фракция лектинсвязывающей субстанции активно ингибирует адгезию вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703 Б на эпителиоцитах влагалища и в меньшей степени влияет на адгезию орального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans. На адгезию E.coli штамм К 12 фракция не оказывает никакого эффекта, но значительно блокирует адгезию E.coli штамм 89-1449 на эпителиоцитах влагалища. В тоже время при удалении лектинсвязывающего компонента из КЖ L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) усиливается адгезивная активность части тест-культур E.coli к эпителиоцитам влагалища. Адгезия вагинального изолята дрожжеподобных грибов вида C.albicans штамм 04.703, в этой модельной системе достоверно уменьшается.
| ТАБЛИЦА Модулирующее действие фракций концентрата культуральной жидкости (КЖ) штамма L.fermentum 90 TS-4 (21) на тест-культуры при адгезии на эпителиоцитах влагалища |
||||
| Вид и штамм микроорганизмов | Концентрат (UM-20) КЖ L.fermentum 90-TS-4 (21) (Сбелка=150 мкг/мл) | |||
| Фракция, способная реагировать с конА | Фракция, лишенная способности реагировать с конА | |||
| М±m | M±m | |||
| контроль | опыт | контроль | опыт | |
| C.albicans 04-703 Б (вагинальный изолят) | 4,33±0,4 | 1,20±0,2*) | 1,26±0,2 | 0,64±0,12*) |
| C.albicans (оральный изолят) | 13,04±1,8 | 8,62±1,12*) | 2,74±0,5 | 4,76±1,02 |
| Е.соli К-12 | 12,35±0,84 | 12,12±1,34 | 12,35±0,84 | 20,94±1,51 |
| Е.соli 89-1449 (кишечный изолят) | 33,92±2,2 | 19,92±1,42*) | 13,76±1,6 | 23,64±2,9 |
| *) - достоверное снижение адгезии тест-культур на эпителиоцитах влагалища | ||||
Claims (6)
1. Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающей субстанции, предусматривающий культивирование штамма лактобактерий Lactobacillus fermentum, получение супернатанта культуральной жидкости, его последующую очистку методом аффинной хроматографии и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что осуществляют отбор колоний штамма Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21) (ВКПМ В-7573) по признаку агглютинации с 0,1%-ного раствора конА на стекле в концентрации не ниже 1,75×10-3, культивирование их на жидкой среде МРС-1 при постоянном перемешивании в атмосфере с содержанием 4-6% углекислого газа при температуре (37±0,05)°С в течение 15-17 ч и отделение клеток центрифугированием, затем полученный супернатант культуральной жидкости с молекулярной массой более 20 кДа концентрируют над мембраной, полученный концентрат культуральной жидкости инкубируют с конА-сефарозой, удаляют надосадок и проводят очистку и выделение целевого продукта методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование проводят при скорости вращения ротора 3000 об./мин в течение 14-16 мин при температуре (20±0,05)°С.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку и выделение целевого продукта проводят методом аффинной хроматографии на конА-сефарозе при температуре (20±0,05)°С в течение 24-48 ч.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбирают колонии микроорганизмов, агглютинирующие с раствором конА в течение первых 4-6 с.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что супернатант культуральной жидкости при концентрировании трехкратно отмывают дистиллированной водой до рН 6,0±0,05 в атмосфере азота под давлением 20-25 атм.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что надосадок концентрата культуральной жидкости удаляют по истечении 24-48 ч, а конА-сефарозу трехкратно отмывают фосфатным буфером рН 8,2, а затем к отмытой конА-сефарозе добавляют физиологический раствор с рН 3,0 и инкубируют 2-4 ч при температуре (20±0,05)°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008111917/13A RU2367686C1 (ru) | 2008-03-31 | 2008-03-31 | Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008111917/13A RU2367686C1 (ru) | 2008-03-31 | 2008-03-31 | Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2367686C1 true RU2367686C1 (ru) | 2009-09-20 |
Family
ID=41167878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008111917/13A RU2367686C1 (ru) | 2008-03-31 | 2008-03-31 | Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2367686C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2454238C1 (ru) * | 2010-12-08 | 2012-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "АМИЛИС" | Биопрепарат балис для профилактики и лечения инфекционных болезней |
| RU2486241C1 (ru) * | 2012-04-02 | 2013-06-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью |
-
2008
- 2008-03-31 RU RU2008111917/13A patent/RU2367686C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HENRIKSSON A., SZEWZYK R. Characteristics of the adhesive determinants of Lactobacillus fermentum 104. Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57(2), p.499-502. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2454238C1 (ru) * | 2010-12-08 | 2012-06-27 | Общество с ограниченной ответственностью "АМИЛИС" | Биопрепарат балис для профилактики и лечения инфекционных болезней |
| WO2012099507A2 (ru) * | 2010-12-08 | 2012-07-26 | Dalin Mikhail Viktorovich | Биопрепарат балис для профилактики и лечения инфекционных болезней |
| WO2012099507A3 (ru) * | 2010-12-08 | 2012-12-27 | ДРАБОВСКАЯ, Маргарита Глебовна | Биопрепарат балис для профилактики и лечения инфекционных болезней |
| RU2486241C1 (ru) * | 2012-04-02 | 2013-06-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2627651C2 (ru) | Полибактериальный препарат с преимуществами для здоровья: c антиоксидантным эффектом, снижением концентрации холестерина, противовоспалительным иммуномодулирующим эффектом и высвобождением биоактивных пептидов, ингибирующих ангиотензин-конвертирующий фермент | |
| RU2006113181A (ru) | Способ приготовления кваса | |
| CN109182162B (zh) | 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及应用 | |
| CN114072128B (zh) | 具有皮肤保湿以及皮肤再生功能的皮肤益生菌块组合物的制造方法 | |
| JP6868611B2 (ja) | スーパーオキシドジスムターゼ（ｓｏｄ）に富むテトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得る方法 | |
| FI59024C (fi) | Foerfarande foer framstaellning och rening av en antigen till c-gruppen hoerande meningokockpolysackarid som har hoeg molekylvikt och aer aktiv mot av c-gruppens meningokocker orsakad meningit | |
| RU2367686C1 (ru) | Способ получения антиадгезивного компонента на основе лектинсвязывающих структур | |
| CN113789280B (zh) | 一种降解尿酸的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用 | |
| CN101333245A (zh) | 一种人血白蛋白的分离方法 | |
| KR102094768B1 (ko) | 류코노스톡 메센테로이데스 cjnu 0705 균주 및 이의 용도 | |
| KR20100138664A (ko) | 2단계 방식에 의한 기능성 강화 가공발효녹용 및 그 제조방법 | |
| EP1535999B1 (en) | Milk-coagulating enzyme originating in bacterium and process for producing cheese using the same | |
| TWI746955B (zh) | 第i型過敏用組成物 | |
| WO2007135941A1 (ja) | 酢酸菌型セラミドの製造方法 | |
| FR2573091A1 (fr) | Nouvelle enzyme bacteriolytique et son procede de preparation | |
| Lemée et al. | Autolysis of dairy propionibacteria: isolation and renaturing gel electrophoresis of the autolysins of Propionibacterium freudenreichii CNRZ 725 | |
| Sinkiewicz-Enggren et al. | Stabilization of Lactobacillus reuteri by encapsulation of bacterial cells through spray drying | |
| CN114532399B (zh) | 嗜酸乳杆菌硒纳米颗粒抑制荧光假单胞菌的应用 | |
| RU2788920C2 (ru) | Способ получения бактериального концентрата | |
| JP7391538B2 (ja) | 菌体調製物の亜臨界抽出物および菌体調製物の亜臨界抽出物の製造方法 | |
| RU2805505C2 (ru) | Консорциум штаммов бифидобактерий, используемый для приготовления бифидосодержащей продукции | |
| RU2224018C2 (ru) | Способ получения биологического стимулятора | |
| RU2483112C1 (ru) | Способ получения липополисахарида возбудителя чумы | |
| CN108101964B (zh) | 酸乳中新型ace抑制肽及其基因工程生产方法 | |
| CN116355812A (zh) | 罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)HCLR01及其在制备具有抗衰老作用的产品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20130219 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180401 |