FR2582002A1 - Preparation a base d'acide hyaluronique chimiquement modifie et son procede d'obtention a partir de tissus animaux - Google Patents

Abstract

PREPARATION A BASE D'ACIDE HYALURONIQUE CHIMIQUEMENT MODIFIE ET SON PROCEDE D'OBTENTION A PARTIR DE TISSUS ANIMAUX. LA PREPARATION D'ACIDE HYALURONIQUE CHIMIQUEMENT MODIFIE EST CARACTERISEE PAR LA PRESENCE D'UNE FAIBLE QUANTITE (0,005-0,05 EN POIDS) DE GROUPES ALDEHYDE DE RETICULATION LIES DE MANIERE COVALENTE AUX CHAINES MOLECULAIRES D'ACIDE HYALURONIQUE. LE PROCEDE CONSISTE A TRAITER IN SITU L'ACIDE HYALURONIQUE DANS DES TISSUS ANIMAUX LE CONTENANT, LE TRAITEMENT SE FAISANT AVEC UN MELANGE COMPORTANT UN REACTIF, NOTAMMENT UN ALDEHYDE, QUI REAGIT AVEC L'ACIDE HYALURONIQUE ET LES PROTEINES CONTENUS DANS LE TISSU ANIMAL.

Description

L'invention est relative à une préparation à base d'acide hyaluronique

chimiquement modifié qui se caractérise par de nouvelles propriétés chimiques, physico-chimiques et rhéologiques; elle concerne également un nouveau procédé pour obtenir cette préparation. L'acide hyaluronique (ciaprès dénommé AH) est un

glycosaminoglycane de poids moléculaire élevé qui se rencon-

tre naturellement et qui présente une unité disaccharide ré-

pétée d'acide D-glucuronique et de N-acétylglucosamino-2-

acétamido-2-désoxy-D-glucose reliée par une liaison gluco-

sidique P1 + 3. Les disaccharides sont reliées pour former,

avec des liaisons glucosidiques 1l 4, une chaîne polysaccha-

ride sans embranchement et non réticulée.

L'acide hyaluronique se trouve dans les tissus animaux tels que le cordon ombilical, l'humeur vitrée, le liquide

synovial, les crêtes-de-coq, la peau, etc. Le poids molécu-

laire de l'acide hyaluronique purifié est cité, dans la litté-

rature, comme étant situé dans la gamme de 50 000 à 8 000 000

selon la source, la méthode d'isolation et la méthode de dé-

termination du poids moléculaire (Balazs, E.A., Fed. Proceed.

17, 1086-1093 (1958)).

Plusieurs méthodes ont été suggérées pour obtenir ou

récupérer et purifier l'acide hyaluronique à partir des tis-

sus animaux et des cultures bactérielles. Parmi ces procédés on citera la digestion enzymatique de protéines (E.D.T Atkins, C.F. Phelps et J.K. Sheehan, Biochem. J. 128, 1255-1263, (1972); R. Varma, R.S. Varma, W.S. Alten et A.H. Wardi, Carbohydr. Res. 32, 386-395, (1974)); le traitement par des résines avec échange ionique (T.C.Laurent, J. Biol. Chem. 216, 263-271, (1955); E.R. Berman, Biochim. Biophys. Acta 58, -122 (1962)); la précipitation avec des surfactants ou

tensionactifs cationiques (T.C. Laurent, M. Ryan, et A. Pie-

truszkiewicz, Biochem. Biophys. Acta 42, 476-485 (1960));

le traitement par l'acide trichloroacétique (H. Hofmans,O.

Schmut, H. Sterk, et H. Koop, Naturforsch. 34c, 508-511(1979); D. Schmut, et H. Hofmans, Biochim Biophys. Acta 673, 192-196 (1981)); la sédimentation préparative à gradient de densité (P. Silpanata, J.R. Dunstone, A.G. Ogston, Biochem. J. 109,

43-50 (1968)); et l'électrodéposition (S. Roseman, D.R.

Watson, J.F. Duff, et W.D. Robinson"Annals Rheumatic Disea-

ses", 15, 67-68 (1955)). On peut également utiliser un pro-

cédé qui comporte plusieurs traitements différents, par exem-

ple une digestion et une précipitation enzymatiques avec du chlorure de cétylpyridinium (J.E. Scott, Biochem. J., 62,

31 (1956)).

La principale difficulté rencontrée dans la récupéra-

tion de l'acide hyaluronique à partir d'une source biologique implique la séparation du polymère (AH) à partir de protéines

et des autres polymères biologiques qui sont extraits du tis-

su en même temps que l'acide hyaluronique. Selon la matière brute, la quantité de polymères non désirables peut varier très largement, en dépassant par exemple de plusieurs fois la quantité d'acide hyaluronique. Les procédés cités ci-dessus

pour la récupération de l'acide hyaluronique sont tous utili-

sés pour la préparation de l'acide hyaluronique en laboratoi-

re, mais ils peuvent difficilement être utilisés pour une pro-

duction de l'acide hyaluronique à grande échelle en raison

des divers inconvénients inhérents à chacun de ces procédés.

Le procédé le plus avancé pour la récupération et la

purification de l'acide hyaluronique à une échelle industriel-

le est décrit dans le Brevet américain 4 141 973 (E.A.Balazs).

Selon ce procédé, un acide hyaluronique ultra-pur, avec une teneur en protéine inférieure à 0,5 % en poids et présentant un poids moléculaire supérieur à 1.200.000, est obtenu par extraction aqueuse à partir de crêtes-de-coq ou de cordon

ombilical humain. Les protéines et autres substances sont en-

levées par plusieurs extractions au chloroforme à des valeurs

de pH variables. Dans une extraction au chloroforme de l'ex-

trait aqueux, il se forme un interface dans lequel les pro-

téines dénaturées et les autres substances sont collectées.

Certaines substances, par exemple les graisses, sont solubi-

lisées, probablement dans la phase chloroforme. La procédé

peut également comporter un traitement avec un enzyme protéo-

lytique, par exemple la pronase. En combinant plusieurs trai-

tements trés élaborés, on a développé un procédé qui permet d'obtenir une fraction d'acide hyaluronique ne provoquant pas la fièvre et non inflammatoire. Ce produit est actuellement sur le point d'être commercialisé comme solution à 1 % sous la marque HealonR, et il est utilisé en viscochirurgie dans

laquelle il protège les tissus contre les dommages mécani-

ques, donne de l'espace et permet la manipulation des tissus pendant l'intervention chirurgicale (E.A. Balazs, Healon,

J. Wiley et fils, NY, 1983, pp 5-28).

On comprendra bien l'invention à la lecture de la des-

cription qui va suivre et en référence aux dessins annexés dans lesquels:

FIG. 1 est un graphique montrant la viscosité en fonc-

tion de la vitesse de cisaillement pour une solution à 1 %

de HY dans du NaCl aqueux 0,15 M, V représentant la viscosi-

té et S la contrainte de cisaillement; FIG. 2 est un graphique donnant les résultats d'un test d'oscillation pour une solution à 1 % en poids deHY dans du NaCl aqueux à O,15 M, V étant la viscosité, F l'angle de phase, G' le module de stockage dynamique et G" le module de perte;

FIG.3 est un graphique montrant la courbe de relaxa-

tion pour une solution à 1 % en poids de HY dans du NaCl aqueux à 0,15 M; FIG.4 est un graphique montrant la distribution des diamètres sphériques équivalents pour une solution à 1% en poids d'acide hyaluronique dans du NaCl aqueux à 0,15 M, avec une valeur de viscosité limite de 4.300 cc/g.; FIG.5 est un graphique montrant la distribution des diamètres sphériques équivalents pour une solution à 1% en poids de AH dans du NaC1 aqueux à 0, 15 M, avec une valeur de viscosité limite de 3.562 cc/g.;

FIG.6 est un graphique montrant la viscosité en fonc-

tion de la vitesse de cisaillement pour un produit selon l'invention du type gelée; FIG. 7 est un graphique montrant les résultats d'un test d'oscillation d'un produit selon l'invention du type

gelée, V étant la viscosité, F l'angle de phase, G' le mo-

dule de stockage dynamique et G" le module de perte, et

FIG. 8 est un graphique montrant la courbe de relaxa-

tion pour un produit selon l'invention du type gelée.

Suivant un aspect, la présente invention fournit un

procédé nouveau pour la modification chimique in situ d'aci-

de hyaluronique dans des tissus animaux avant son extraction

à partir de ceux-ci.

Suivant un autre aspect, l'invention fournit un procé- dé nouveau pour la récupération et la purification d'acide

hyaluronique chimiquement modifié à partir de tissus animaux.

Suivant un autre aspect encore l'invention fournit un

acide hyaluronique chimiquement modifié, ultra-pur, ne don-

nant pas de fièvre et non inflammatoire, qui contient d'en-

viron 0,005 % à 0,05 % en poids de groupes aldéhyde de réti-

culation liés de manière covalente aux chaînes polymères

d'acide hyaluronique.

La présente invention est basée sur la découverte que l'acide hyaluronique peut être chimiquement modifié in situ avant qu'il soit extrait des tissus animaux, en traitant les tissus avec une substance qui réagit avec les protéines et l'acide hyaluronique en milieu aqueux. Parmi ces substances

figurent le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal,etc.

On a constaté que cette modification chimique in situ entrai-

ne des modifications substantielles dans la structure primai-

re de la macromolécule d'acide hyaluronique, dans la taille

de la molécule, dans les interactions inter et intramolécu-

laires et dans les propriétés résultantes rhéologiques des solutions fabriquées à partir du produit modifié. Il est par

conséquent justifié de donner à cet acide hyaluronique chimi-

quement modifié un nouveau nom. Il a été choisi de nommer cet-

te matière Hylan (ci-après identifiée en abrégé par HY).Quand

l'acide hyaluronique est extrait d'un tissu animal, une gran-

de quantité de protéines passe habituellement dans la solu-

tion avec lui. La quantité de protéines peut varier sensible-

ment en fonction de la nature du tissu et des paramètres de l'extraction. Dans l'extraction de l'acide hyaluronique à

partir des crêtes-de-coq, le rapport pondéral de l'acide hya-

luronique aux protéines peut varier de 1/0,5 à 1/4 (voir le Brevet américain 4 303 676). Il en résulte que la première difficulté dans la récupération de l'acide hyaluronique pur

à partir d'un tissu animal réside dans l'élimination des pro-

téines. On a constaté que le traitement préliminaire mention-

né ci-dessus du tissu fournit un extrait d'eau de HY conte-

nant sensiblement moins de protéines qu'en l'absence d'un tel traitement. La nature précise des évènements chimiques qui se pro- duisent pendant le traitement du tissu n'est pas totalement

connue et, par conséquent, l'invention ne doit pas être limi-

tée par une quelconque réaction chimique spécifique. Il est estimé que, comme résultat des réactions chimiques entre les protéines du tissu et un réactif présent dans le mélange de

traitement, les protéines deviennent dénaturées et immobili-

sées dans les tissus et, par conséquent, sont insolubles dans

l'extraction aqueuse subséquente.

Toute substance qui réagit avec les protéines dans un milieu contenant de l'eau peut être utilisée dans le but de la présente invention. On a constaté que la substance la plus avantageuse est le formaldéhyde. D'autres aldéhydes, tels que le glutaraldéhyde ou le glyoxal, peuvent être utilisés dans

le procédé selon la présente invention.

Le traitement du tissu peut être effectué dans une solution aqueuse du réactif. Toutefois, si on procède ainsi, il se produira une perte substantielle de HY en raison de sa

bonne solubilité dans l'eau. Pour cette raison, il est pré-

férable d'effectuer le traitement du tissu dans un mélange

d'eau et d'un solvant organique miscible dans l'eau. Le sol-

vant ne doit pas réagir avec le réactif utilisé pour l'immo-

bilisation des protétines. Parmi ces solvants, on citera les cétones inférieures telles que l'acétone et la méthyle éthyle cétone, les alcools tels que l'éthanol ou l'isopropanol, les

solvants aprotiques tels que diméthylformamidcè,diméthylacéta-

mide et diméthylsulfoxide, et autres. Quand un tel solvant est mélangé avec un tissu qui contient une grande quantité d'eau, habituellement 8090 % ou plus en poids, on obtient

un mélange eau- solvantLe rapport eau- solvantdans le mélan-

ge peut être réglé à tout niveau désiré par modification du rapport solvant/tissu ou par addition d'eau au mélange. Le rapport eau/solvant préféré est déterminé par la solubilité de HY, en ce sens que HY ne doit pas être soluble dans le mélange utilisé pour le traitement du tissu. La solubilité de HY dépend du type de solvant utilisé, du rapport eau/

solvant, de la présence et de la concentration de tout élec-

trolyte dans le mélange et du pH du mélange. La solubilité de HY peut être sensiblement réduite en introduisant un élec-

trolyte dans le mélange. On peut utiliser tout type d'élec-

trolyte qui est soluble dans le mélange eau--solvantet qui

fournit le pH désiré du mélange. Par exemple, quand on uti-

lise de l'acétone comme solvant, on peut utiliser de manière

convenable l'acétate de sodium comme électrolyte soluble.

La composition du mélange pour traiter le tissu peut varier sur une large gamme selon la nature du tissu, le type

de solvant utilisé, le type d'électrolyte, etc. Comme men-

tionné ci-dessus, le HY provenant du tissu ne doit pas être soluble dans le mélange de traitement mais ce dernier doit

contenir suffisamment d'eau pour permettre au tissu de gon-

fler, de manière à faciliter la réaction entre le réactif et les polymères du tissu. On a constaté que dans le cas de crêtes-de-coq comme source de HY, la composition du mélange,

en prenant en compte l'eau provenant des crêtes, peut se si-

tuer dans la gamme suivante, en % en poids: eau 10-50, solvant 40-85, électrolyte 0-20, réactif 0,2-10. Plusieurs

solvants différents peuvent être utilisés dans le même mé-

lange de traitement, si on le désire. On a constaté qu'il est avantageux d'utiliser de faibles quantités de solvants non miscibles dans l'eau, tels que le chloroforme, dans le

mélange de traitement. La teneur de cessolvants dans le mé-

lange peut se situer de 0,5 à 10 % en poids.

Le pH du mélange de traitement peut varier selon la

nature des réactifs, la composition du mélange, la tempéra-

ture et la durée du traitement. Dans la récupération de HY à partir des tissus animaux, selon la présente invention, les considérations suivantes sont très importantes. Certains des réactifs, par exemple le formaldéhyde, peuvent réagir

avec les groupes hydroxyle des macromolécules d'acide hyalu-

ronique à un faible pH pour donner un polymère réticulé inso-

luble dans l'eau. Un traitement prolongé dans un milieu pré-

sentant un pH relativement élevé conduit à la dégradation de J/

/ 7

l'acide hyaluronique, et on ne peut récupérer qu'un polymère de faible poids moléculaire. On a constaté que, lorsqu'on

utilise selon l'invention un réactif du type aldéhyde, on ob-

tient les meilleurs résultats avec un pH voisin de 7, par exemple dans la gamme de 4 à 10.

Le rapport du mélange de traitement au tissu peut va-

rier sur une large gamme. La limite inférieure est habituel-

lement déterminée par la condition que le tissu, qui occupe un grand volume dans le cas des crêtes-de-coq, doit au moins

être complètement recouvert par le mélange. La limite supé-

rieure peut être choisie sur la base de considérations écono-

miques. Dans le traitement des crêtes-de-coq selon la présen-

te invention, le rapport du mélange de traitement au tissu,

calculé sur le poids sec du tissu, est habituellement supé-

rieur à 10/1.

La température affecte le rendement du traitement selon

la présente invention. Toutefois, du fait que HY est suscep-

tible d'hydrolyse à haute température, il est préférable d'effectuer le traitement à la température ambiante ou à une

température inférieure pour obtenir un produit de poids molé-

culaire élevé.

La durée nécessaire pour effectuer le traitement dé-

pend de nombreux facteurs, notamment la composition du mélan-

ge, la nature du tissu, la température, etc. On suppose que le facteur de limitation dans le traitement réside dans la diffusion du réactif dans les tranches de tissu. Pour cette

raison, la taille de ces tranches est un paramètre important.

On a constaté que, dans le traitement de crêtes-de-coq décou-

pées en tranches d'épaisseur 1-3mm, la durée du traitement

peut se situer dans la gamme de 4-24 heures.

Le tissu traité comme décrit ci-dessus est ensuite la-

vé avec un solvant ou un mélange solvant/eau pour éliminer du tissu le mélange de traitement en excès. Il est approprié d'utiliser le même solvant que celui qui est utilisé dans le mélange pour le traitement du tissu. On peut procéder à un nombre quelconque de lavages, mais on a constaté qu'un lavage

unique donne des résultats satisfaisants.

Le tissu lavé est ensuite directement extrait avec

l'eau pour la récupération de HY. On a constaté que l'effica-

cité de l'extraction dépend du rapport eau/tissu, du pH du milieu d'extraction, de la température et de la durée. On a également constaté que l'efficacité de l'extraction du tissu traité peut être sensiblement augmentée d'abord en séchant le tissu-traité pour éliminer le solvant qui a été utilisé dans le traitement et les étapes de lavage. On obtient les meilleurs résultats quand le tissu est séché de 1/4 à 1/2

de son poids original.

Le rapport eau/tissu dans la phase d'extraction est choisi sur la base de plusieurs considérations. Tout d'abord,

il doit exister suffisamment de phase liquide pour recou-

vrir le tissu pendant l'extraction. Par ailleurs, la quantité

d'eau ne doit pas être trop importante, de manière qu'on ob-

tienne une concentration de HY dans l'extrait aussi élevée que possible pour réduire la quantité de précipitat dans l'étape suivante du procédé. On a constaté que, dans le cas de crêtes-de-coq, le rapport eau/tissu préféré est de 2 à 5,

sur la base du poids des crêtes non traitées.

Le pH du milieu d'extraction peut être neutre, acide ou basique selon la qualité désirée du produit final. On a constaté que, pour obtenir un produit de poids moléculaire ultra élevé, le pH du milieu d'extraction doit se situer dans

la gamme de 6-8,5. Un pH plus élevé conduit à une augmenta-

tion de la concentration de HY dans l'extrait mais, en même temps, à une diminution du poids moléculaire du produit et à des

modifications dans les autres propriétés des polymères qui se-

ront discutées ci-dessous avec plus de détails. Dans tous les cas, en commandant le pH pendant la phase d'extraction, on peut réguler de manière appropriée les propriétés du produit

final dans une direction désirée.

Il est préférable d'extraire le tissu traité à une tem-

pérature inférieure à 25 C car la dégradation de HY à des tem-

pératures plus élevées peut diminuer sensiblement le poids mo-

léculaire du polymère.

La durée nécessaire pour extraire la quantité maximale

de HY à partir du tissu traité varie sensiblement avec d'au-

tres paramètres de l'extraction, notamment le pH, le rapport liquide/tissu et l'intensité de l'agitation. On a constaté que, dans l'extraction de crêtes-de-coq avec de l'eau, on peut obtenir de bons résultats quand les crêtes traitées

sont extraites sur une durée de 6 heures à plusieurs jours.

Le mélange du tissu traité et du milieu d'extraction peut être agité pendant l'extraction ou au contraire laissé

au repos sans aucune agitation. De manière évidente, l'agi-

tation augmente la vitesse de diffusion des molécules de HY à partir du tissu dans l'extrait. Par contre, une agitation vigoureuse peut conduire à une dégradation de HY et, par conséquent, à une diminution du poids moléculaire. De plus,

on a constaté qu'une agitation vigoureuse provoque une désin-

tégration du tissu qui rend difficile la séparation du tis-

su par rapport à l'extrait. Par conséquent, il est préféra-

ble d'effectuer la phase d'extraction sans agitation ou sous

agitation très lente et douce.

Après l'extraction, le tissu est séparé de l'extrait

en utilisant l'une quelconque de plusieurs méthodes conven-

tionnelles, notamment la filtration, la centrifugation, la décantation et analogue. On a constaté que la manière la plus simple et la plus économique était la filtration. Selon le genre de tissu utilisé comme matière de départ, il peut être

préférable de procéder à une filtration en deux phases. Ain-

si, dans le cas de crêtes-de-coq, de gros morceaux de tissu peuvent être facilement séparés par filtration à travers un tamis en nylon et on peut obtenir une purification fine de

l'extrait par filtration à travers tout milieu filtrant den-

se, par exemple une matière cellulosique.

La concentration de HY dans l'extrait dépend de nom-

breux facteurs, notamment du pH pendant l'extraction, de la

durée, du rapport liquide/tissu, et de l'intensité de l'agi-

tation. D'habitude, la concentration se situe dans la gam-

me de 0,3 à 3,0 mg/ml et, parfois, même au-delà. Dans cer-

tains cas, quand la concentration de HY dans l'extrait se situe dans les valeurs faibles, on a constaté qu'il était souhaitable de procéder à une seconde extraction du tissu.On

a également constaté que le produit précipité à partir du se-

conq extrait présente habituellement un poids moléculaire plus élevé par rapport à celui de HY provenant du premier

extrait. Cela peut être expliqué par le fait que les frac -

tions de HY qui présentent un poids moléculaire faible diffu-

sent plus facilement du tissu dans l'extrait et par le fait que le produit précipité à partir du premier extrait est en-

richi avec ces fractions.

On peut utiliser plus de deux extractions pour obtenir un rendement aussi élevé que possible, mais la concentration

de HY dans un extrait décroît avec chaque extraction consécu-

tive.

On peut récupérer le HY à partir des filtrats par tout procédé connu de l'art antérieur. Le procédé le plus approprié est la précipitation avec un solvant miscible dans l'eau,par exemple de l'acétone, de l'éthanol, de l'isopropanol, etc.

La précipitation peut être faite en présence d'un acide, no-

tamment hydrochlorique, sulfurique, phosphorique, etc, ou en présence d'électrolytes neutres, notamment l'acétate de sodium,

le chlorure de sodium et leurs sels. Le HY et ses sels sont ha-

bituellement précipités sous la forme d'une matière blanche en fibres ou sous la forme d'une poudre. Le précipitat peut être lavé avec le même solvant que celui qui est utilisé pour la précipitation, ou avec un quelconque autre mélange de solvants

qui ne dissout pas le produit, par exemple de l'éther. Le pro-

duit lavé peut être séché par tout moyen approprié ou il peut

être stocké sous une couche d'un solvant, notamment de l'acé-

tone, de l'éthanol, etc. En variante, le filtrat peut être

séché et congelé.

Il est clair que toutes phases additionnelles de l'art

antérieur et utilisées dans la purification de l'acide hyalu-

ronique peuvent être introduites dans le procédé selon la pré-

sente invention sans sortir de son cadre. Par exemple, pour éliminer les agents créateurs de fièvre ou inflammatoires, on peut utiliser une extraction par des solvants bien connus,par exemple le chloroforme, dans lesquels le HY est insoluble mais

dans lesquels les lipoprotéines, les glycolipides ou les gly-

colipoprotéines sont solubles ou séparées.

Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir des produits à base de HY dont les propriétés varient sur une

large gamme. On a évalué les propriétés suivantes. Les pro-

cédés cités ont été utilisés pour caractériser les produits

obtenus selon la présente invention.

La concentration de HY dans les solutions a été déter-

* minée par des essais à l'acide hexuronique en utilisant le procédé automatisé au carbazole (E.A. Balazs, K.0 Berntsen,

J.Karossa et D.A. Swann, Analyt. Biochem. 12, 547-558 (1965)).

La teneur en hexosamine a été déterminée par la méthode auto-

matisée colorimétrique (D.A. Swan et E.A Balazs, Biochem. Biophys. Acta 130, 112-129 (1966)). La teneur en protéines des solutions de HY a été déterminée par le procédé au

réactif phénol (Lowry et al. J. Biol.Chem 193, 265-275(1951)).

La teneur du produit en formaldéhyde a été déterminée par l'hydrolyse d'environ 0,1 g de l'échantillon dans 10 ml d'une solution aqueuse d'acide sulfurique à 10 % pendant 2

heures avec ébullition, suivie par une distillation à la va-

peut du formaldéhyde libre hors de la solution obtenue et la détermination du formaldéhyde dans le distillat en utilisant une méthode colorimétrique à l'acide chromotropique (M.J.Boyd

et M.A. Logan, J. Biol. Chem.,146, 279 (1942)).

La valeur de viscosité limite (viscosité intrinsèque) est définie par la limite de ( n/no - 1)/c, n et no étant les viscosités respectivement de la solution et du solvant et c étant la concentration de HY en g/cc. Les mesures ont été effectuées dans des solutions aqueuses de NaCl à 0,20 M dans

un viscosimètre Ubbelohde de dilution du type à capillarité.

Le poids moléculaire à viscosité moyenne est calculé par l'é-

quation[n] = 0,0228 M 0,81 (R.C Cleland et J.L. Wang, Biopo-

lymers 9,799 (1970)).

Le poids moléculaire à poids moyen est déterminé par la

méthode de diffusion de lumière laser à angle faible en uti-

lisant un instrument Chromatix KMX-6 équippé d'un ensemble laser héliumnéon à 632,8 nm. Le poids moléculaire à poids

moyen est également calculé à partir des constantes de sédi-

mentation et de diffusion déterminées dans une ultra-centri-

fugation analytique.

Le procédé dynamique de diffusion de la lumière est

utilisé pour évaluer l'agrégation des molécules dans des so-

lutions de HY relativement concentrées. Ce procédé donne la distribution des diamètres sphériques équivalents ( DSE)

dans la solution.

Les propriétés rhéologiques ont été évaluées avec le système de rhéomètre Bohlin qui est un rhéomètre à commande par ordinateur pouvant fonctionner sur trois modes: visco- métrie, oscillation et relaxation. Les paramètres suivants ont été mesurés pour la solution de HY: viscosité pour la large gamme de taux de cisaillement, viscosité dynamique, module de stockage dynamique et module de perte dynamique pour diverses fréquences d'oscillation et divers temps de relaxation.

Comme mentionné ci-dessus, le produit selon la présen-

te invention (HY) est un nouveau polymère qui est obtenu par réaction chimique in situ entre l'acide hyaluronique et un

agent de réticulation, par exemple le formaldehyde. On a cons-

taté, par analyse chimique de HY, que la teneur du formaldé-

hyde combiné dans des produits obtenus à partir des crêtes-de-

coq traitées avec un mélange contenant du formaldehyde, se situait dans la gamme de 0,005 à 0,02 % en poids, sur la base

du poids du polymère, selon les divers paramètres du traite-

ment. La présence du formaldehyde combiné dans le produit a

également été trouvée par une expérience dans laquelle le trai-

tement a été effectué avec du formaldéhyde radioactive

14CH20 (voir l'exemple 12 ci-dessous). Les résultats de l'ex-

périence ont montré que le produit obtenu selon l'invention contenait du formaldéhyde combiné qui n'a pas pu être éliminé par des précipitations répétées ou par une dialyse exhaustive

des solutions du polymère. Cela constitue une preuve très for-

te pour la démonstration de la liaison covalente du formal-

déhyde avec les molécules polymères du produit. Pour détermi-

ner si le formaldehyde est spécifiquement combiné avec l'acide hyaluronique, ce dernier a été traité avec des hyaluronidases bactérielles ou de sangsue, enzymes dégradant spécifiquement l'acide hyaluronique. Les résultats de ce traitement ont mon-

tré qu'une quantité appréciable de formaldéhyde était liée de

manière covalente directement aux macromolécules de HY.

La teneur en protéines du produit obtenu selon la pré-

sente invention n'est habituellement pas supérieure à 0,5 %, sur la base du polymère sec, et elle peut atteindre 0,1 % et

même moins.

La modification chimique de l'acide hyaluronique par liaison covalente d'un agent de réticulation à ses macro-

molécules, en d'autres termes les modifications dans la struc-

ture primaire du polymère, affectent sensiblement ses paramè-

tres physico-chimiques0 par exemple le poids moléculaire et la taille des molécules, l'interaction intermoléculaire et

les propriétés rhéologiques des solutions du polymère.

Le HY obtenu selon la présente invention peut avoir un pcids moléculaire très élevé. Ainsi, la valeur de viscosité limite peut être supérieure à 7. 000 cc/g, ce qui correspond

à un poids moléculaire à viscosité moyenne d'environ 6 X 106.

Le poids moléculaire à poids moyen, à partir des données de diffusion de la lumière0 peut atteindre une valeur de 13 X 106

On a constaté que cette discordance entre les poids moléculai-

res à poids moyen et à viscosité moyenne est très significati-

ve, comme discuté ci-dessous. Il doit être compris qu'un poly-

mère présentant un poids moléculaire sensiblement inférieur, par exemple 1 X 106 ou moins, peut facilement être obtenu avec le-procédé selon la présente invention, si on le désire. De

manière similaire, un polymère présentant tout poids molécu-

laire désiré peut être obtenu si le HY, à un quelconque stade de sa récupération et de sa purification, est exposé à des agents qui sont connus pour rompre la liaison glucosidique de la chaîne polysaccharide. De tels agents bien connus sont des enzymes spécifiques, par exemple hyaluronidase, les systèmes de génération de radicaux libres, les forces de cisaillement, la chaleur, les bases et les acides forts, etc.

Le volume partiel spécifique (vps) de HY dans la solu-

tion dépend de la force ionique de la solution. Il a été dé-

terminé par densitométrie pour une solution de HY dans l'eau contenant 0, 15 M de NaCl dans la gamme de concentration de

zéro à 0,5 mg/ml, et on a trouvé 0,627 cc/g.

La distribution de DSE pour un échantillon de HY dis-

sout dans une solution à 0,15 M de NaCl dans une solution à

1 % est présentée à la FIG. 4. Il apparaît, à partir des don-

nées présentées, que HY existe sous une forme très hautement

agrégée, bien que ces agrégats soient stables et ne sédimen-

tent pas.

Les propriétés rhéologiques d'un produit typique de poids moléculaire ultra élevé, préparé selon la présente invention, sont présentées dans les FIGS. 1-3. On a constaté

que ce produit forme des solutions (à 0,5 % en poids et au-

delà) avec des propriétés viscoélastiques remarquables.

Les paramètres suivants caractérisent les propriétés élastiques des solutions du polymère de la meilleure manière: module de stockage dynamique (G'), la fréquence du "point de croisement" ( point auquel le module G' de stockage dynamique devient supérieur au module G" de perte dynamique), l'angle

de phase et le temps de relaxation.

HY forme des solutions très visqueuses dans l'eau ou dans une solution aqueuse d'électrolytes. La viscosité de la solution dépend de la concentration du polymère, de la teneur en électrolyte, de la température, et elle décroît avec la vitesse de cisaillement, c'est-à-dire que les solutions de

HY présentent une pseudo plasticité importante.

Si on considère les propriétés rhéologiques des solu-

tions de HY, on peut comprendre que ces propriétés dépendent grandement du poids moléculaire du produit, comme dans le cas de tout autre polymère. On a mentionné ci-dessus qu' on peut obtenir le HY présentant un poids moléculaire qui varie sur une large gamme et dont les propriétés rhéologiques varient de manière correspondante. Ainsi, on a constaté que, pour un produit de poids moléculaire ultra élevé (valeur de viscosité limite supérieure à 4500 cc/g),la viscosité d'une solution à 1 % en poids dans une solution aqueuse contenant 0,15 M de NaCl atteint 1000 Pa.s et même plus pour une vitesse de cisaillement de 0,055, alors qu'elle n'est que de 2 Pa.s pour une solution du polymère à 1 % en poids avec une valeur de viscosité limite d'environ 1000 cc/g. On a constaté que

les propriétés élastiques des solutions de HY dépendent éga-

lement du poids moléculaire du polymère. Ainsi, le module G' de stockage dynamique pour une solution à 1 % en poids de HY d'un poids moléculaire ultra élevé dans une solution contenant 0,15 M de NaCl est d'environ 40 Pa à une fréquence de 0,01 Hz, tandis qu'il n'est que d'environ 0,2 Pa pour une solution de HY avec une valeur de viscosité limite d'environ

1000 cc/g. La fréquence du "point de croisement", qui ca-

ractérise de très bonne manière le rapport entre les proprié- tés élastiques et visqueuses des solutions du polymère, est habituellement inférieure à 0,025 Hz pour des solutions de HY à 1 % en poids dans des solutions contenant 0,15 M de

NaCl, à 25 C, quand le poids moléculaire du polymère se si-

tue dans la gamme d'environ 1,5 X 106 à 8 X 106 et au-delà.

Les propriétés physico-chimiques et rhéologiques d'un échantillon de HY et de sa solution ont été comparées avec les mêmes propriétés d'un produit à base d'acide hyaluronique obtenu selon un procédé bien connu, et elles sont présentées

dans le tableau I et montrées dans les FIGS. 4 et 5. Le pro-

duit utilisé pour la comparaison est de l'acide hyaluronique récupéré à partir de crêtes-de-coq par extraction aqueuse suivie d'une déprotéinisation avec la méthode dite Sevag,qui comporte plusieurs extractions au chloroforme (G.Blix,

O.Shellman, Arkiv for Kemi, Mineral Geol. 19A,1 (1945)).

TABLEAU 1

DONNEES PHYSICO-CHIMIQUES ET RHEOLOGIQUES

COMPAREES POUR DES ECHANTILLONS DE HY ET

D'ACIDE HYALURONIQUE

Paramètres HY ACIDE

HYALURONIQUE

Valeur de viscosité limite(cc/g) 4.729 3.562 Poids moléculaire à partir des données de viscométrie (X 106) 3,28 2,30 Poids moléculaire à partir des données de diffusion de la lumière (X 106) 13,30 2,86 Poids moléculaire à partir des données de sédimentation de diffusion (X010 PSU) 13,60 2,14 Volume spécifique partiel (cc/g) 0,627 0,570 Propriétés rhéologiques d'une solution à 1% dans une solution

contenant 0,15 M de NaCl: Visco-

sité de cisaillement à une vitesse de cisaillement de 0,055-1,(Pa.s) 969 305 Module de stockage dynamique (G') à une fréquence de 0,01 Hz (Pa) 39, 8 10,1

Fréquence au "point de croise-

ment" (Hz) 0,0056 0,035 Temps de relaxation pour réduire de moitié le module 58 19 Angle de phase (o) à la fréquence de 0,002 Hz 58,7 76 à la fréquence de 10 Hz 8,5 12 Les données présentées dans le Tableau 1 et dans la FIG 4 montrent des différences notables entre HY et l'acide hyaluronique. Tout d'abord, le poids moléculaire à viscosité

moyenne et le poids moléculaire à poids moyen pour le pro-

duit connu étaient sensiblement les mêmes (le poids molécu-

laire à poids moyen est légèrement inférieur), tandis que,

pour le produit selon la présente invention, le poids molé-

culaire à poids moyen est environ quatre fois supérieur au poids moléculaire à viscosité moyenne. En second lieu, la

valeur supérieure de vsp pour la solution de HY, par compa-

raison avec la solution d'acide hyaluronique, prouve que les macromolécules de HY présentent une plus grande taille. En troisième lieu, l'agrégation des macromolécules de HY dans la solution donne naissance à des agrégats sensiblement plus importants que ceux des solutions d'acide hyaluronique, ce qui suggère non seulement une plus grande taille pour les

macromolécules de HY, mais également une interaction inter-

moléculaire beaucoup plus forte. Enfin, les solutions de HY

sont sensiblement plus visqueuses et élastiques que les solu-

tions équiconcentrées d'acide hyaluronique. Bien que la vis-

cosité accrue puisse être attribuée à un poids moléculaire

plus important à viscosité moyenne, la forte augmentation ob-

servée de l'élasticité peut difficilement être expliquée par

la même raison.

Toutes ces observations conduisent à la conclusion que la modification chimique de l'acide hyaluronique in situ avant son extraction du tissu, bien qu'elle provoque seulement

des variations mineures dans la composition chimique du poly-

mère, entraine en même temps des modifications très importan-

tes des paramètres physico-chimiques et des propriétés rhéo-

logiques. Cela ne peut se produire que lorsque la modifica-

tion dans la composition chimique correspond à des modifica-

tions majeures dans la structure macromoléculaire.

La forme et la conformation des macromolécules d'acide

hyaluronique en solution ont été étudiées par diverses métho-

des, et il existe une littérature abondante à ce sujet. Ces

études indiquent que les macromolécules présentent une confi-

guration aléatoire augmentée en colimaçon et s'enchevêtrent les unes avec les autres pour une concentration relativement faible (par exemple 0,1 %) du polymère dans la solution.Pour des concentrations plus importantes, on pense que la solution

contient un réseau continu tridimensionnel de chaînes polymè-

res. On a trouvé que les liaisons glucosidiques dans les ma-

cromolécules d'acide hyaluronique possèdent une force consi-

dérable. On a proposé plusieurs mécanismes, par exemple l'in-

teraction solvant-soluté, l'interaction avec de faibles quan-

tités de protéines présentes dans de nombreuses préparations d'acide hyaluronique, et les interactions inter-chatnes, pour expliquer ces phénomènes (voir par exemple E.A.Balazs, Physical Chemistry of Hyaluronic Acid, Fed. Proceed., 17, 1086-1093 (1958)). Certains auteurs ont proposé une double

structure hélicoidale pour les macromolécules d'acide hyalu-

ronique et ont suggéré que les doubles segments hélicoidaux pouvaient jouer le rôle d'agents de réticulation fournissant

les propriétés rhéologiques inhabituelles des solutions d'a-

cide hyaluronique (C.M. Dea, R. Moorhous, D.D.Rees, S. Arhott, J.M. Guss et E.A. Balazs, Science, 179, 560-562 (1972); S. Arnott, A.R. Mitra et S. Raghunatan, J. Mol.

Biol. 169, 861-872 (1983)).

En prenant en considération ces études et ces obser-

vations, on est parvenu à l'hypothèse que le produit HY se-

lon la présente invention peut contenir un nombre addition-

nel de liaisons de réticulation introduites pendant le trai-

tement du tissu avec un agent d'immobilisation de réticula-

tion des protéines. Les agents utilisés selon la présente invention, par exemple le formaldéhyde, sont très actifs à

l'égard de divers groupes chimiques, leur réactivité dépen-

dant sensiblement des conditions de réaction telles que le

pH, la température, la concentration, etc. Les groupes hy-

droxyles de l'acide hyaluronique ne réagissent à l'évidence pas avec ces agents dans les conditions de traitement car le produit obtenu après le traitement est toujours soluble dans

l'eau et, par conséquent, ne présente pas un degré substan-

tiel de polymère réticulé. La quantité de liaisons addition-

nelles de réticulation introduites dans le polymère pendant

le traitement est probablement assez faible pour ne pas pro-

voquer l'insolubilité du polymère, mais suffisamment impor-

tante pour augmenter de manière notable l'interaction entre

les macromolécules, et par conséquent l'élasticité de la so-

lution du polymère. Plusieurs candidats pour une telle réac-

tion avec l'agent de traitement sont des groupes acétamido de l'acide hyaluronique, les groupes amino nonacétylés qui

peuvent être présents en faibles quantités dans l'acide hya-

luronique, et les groupes amido et amino, et les autres grou-

pes réactifs, de protéines qui sont présents dans la matrice intercellulaire du tissu pendant le traitement. Il est peu probable que les groupes acétamido de l'acide hyaluronique

eux-mêmes puissent fournir une réticulation intermoléculai-

re. Dans les études de la réaction de protéines avec le for-

maldéhyde (voir par exemple J.F. Walker, Formaldehyde,Rein-

hold Publ.Corp., NY, 1953, pp 312-317), on a constaté que les groupes amide d'une protéine ne pouvaient pas eux-mêmes

fournir la réticulation, et l'une des réactions les plus pro-

bables dans la formation des liaisons de réticulation est

la réaction du formaldehyde avec les groupes amino qui don-

ne les groupes N-méthylol amino, lesquels réagissent à leur

tour avec les groupes amide.

Par suite, deux mécanismes sont possibles pour intro-

duire un nombre limité de liaisons de réticulation dans les macromolécules d'acide hyaluronique. Le premier mécanisme comporte la réaction entre un agent de réticulation, par

exemple le formaldehyde, et les groupes acétamido et non-

amino d'acide hyaluronique, dont l'existence est très proba-

ble dans l'acide hyaluronique (E.A. Balazs, Fed. Proceed.

, 1817-1822 (1966)).

Le second mécanisme possible suggère la participation

des protéines ou des polypeptides dans la réaction de réticu-

lation. On maintient dans la littérature que les protéines

ou les polypeptides sont liées de manière covalente à la mo-

lécule d'acide hyaluronique ( Yuko Mikum-Takagaki et B.P.

Toole, J.Biol.Chem. 256 (16), 8463-8469 (1981)) ou qu'elles

peuvent être associées d'une autre manière avec les moléeu-

les d'acide hyaluronique. Dans ce cas, des liaisons de réti-

culation peuvent se former entre une macromolécule d'acide

hyaluronique et une partie des protéines et une autre macro-

molécule d'acide hyaluronique, ou entre une protéine liée

de manière covalente à deux macromolécules d'acide hyaluro-

nique. Aucun de ces mécanismes ne doit être considéré comme limitatif de la présente invention. Il doit être compris que d'autres mécanismes pour l'introduction de faibles quantités de liaisons covalentes de réticulation dans le produit selon

la présente invention sont possibles.

Dans tous les cas, la caractéristique essentielle de la présente invention réside dans la modification chimique de l'acide hyaluronique dans le tissu pendant son processus de récupération, probablement par l'introduction d'un faible nombre de liaisons de réticulation dans les macromolécules

d'acide hyaluronique, le degré de modification étant suffi-

sant pour augmenter sensiblement les caractéristiques élas-

tiques des solutions du polymère sans aucun effet néfaste

sur les propriétés bénéfiques de l'acide hyaluronique, no-

tamment quant à sa capacité de donner des solutions hautement visqueuses dans un milieu aqueux, sa biocompatibilité, etc.

L'acide hyaluronique chimiquement modifié (HY), prépa-

ré selon la présente invention, peut être utilisé avec succès pour de nombreuses applications dans le domaine biomédical

et dans le domaine des cosmétiques, par exemple comme un ou-

til en viscochirurgie, pour des revêtements améliorant la biocompatibilité de diverses matières,comme constituant de

diverses préparations pharmaceutiques,dans des produits de.

soin de la peau,etc.Les propriétés améliorées de ce polymère,

par exemple une élasticité accrue, donnent des avantages si-

gnificatifs quand on utilise HY.

HY peut également être utilisé comme matière de départ pour de nouveaux produits obtenus par modification chimique additionnelle, par exemple la réticulation avec des agents

conventionnels de réticulation. On a constaté que les proprié-

tés spéciales de l'acide hyaluronique chimiquement modifié

selon la présente invention et ses solutions donnent une occa-

sion d'obtenir les produits ci-dessus modifiés de manière ad-

ditionnelle, lesquels possèdent également certaines pro-

priétés non habituelles. Ainsi, on a constaté qu'on peut ob-

tenir, à partir du produit selon l'invention, une matière insoluble dans l'eau et du type gelée, par réticulation avec du sulfone de divinyle dans une solution alcaline. Cette

matière est un gel hautement gonflé. La concentration du po-

lymère dans le gel dépend de la composition de la phase li-

quide qui peut être de l'eau ou des solutions aqueuses de di-

verses substances de faible poids moléculaire, par exemple

les électrolytes. Dans le cas d'une solution de sel physiolo-

gique (0,15 M de NaCl dans l'eau), la concentration du poly-

mère peut se situer dans la gamme de O,15 à 0,40 % en poids.

Cette matière possède des propriétés rhéologiques très inté-

ressantes (FIGS. 5,6 et 7). Ainsi, la composante élastique du module dynamique complexe (G') est supérieure au module de perte (G") pour toutes les fréquences essayées. En même temps, la matière se comporte comme un corps pseudo-plastique à des faibles vitesses de cisaillement, c'est-à-dire qu'elle

présente une viscosité substantielle qui diminue avec la vi-

tesse de cisaillement. Cette matière est également caractéri-

sée par un temps très long de relaxation. On croit fermement que cela constitue une structure unique des solutions de HY obtenues selon la présente invention, ce qui rend possible l'obtention du produit ci-dessus du type gelée présentant ces propriétés rhéologiques spéciales. En d'autres termes,les modifications chimiques dans l'acide hyaluronique, qui se

produisent pendant le procédé de récupération selon la pré-

sente invention, affectent non seulement la structure et les propriétés de HY, mais également les propriétés des produits obtenus à partir de celui-ci. Par suite, on a constaté que,

lorsque l'acide hyaluronique obtenu selon les méthodes con-

nues de l'art antérieur, c'est-à-dire par l'élimination des

protéines au moyen d'extractions au chloroforme, était utili-

sé comme matière de départ pour la réticulation avec du sul-

fone de divinyle, on obtenait une matière insoluble qui pré-

sentait des propriétés rhéologiques sensiblement moins bonnes

que celles du produit selon la présente invention.

Bien entendu, de nombreuses autres matières modifiées

peuvent être obtenues par modification additionnelle du pro-

duit obtenu selon la présente invention, par exemple des gels

fortement réticulés, des pellicules insolubles, des revête-

ments, etc. Les exemples suivants illustrent des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, sans en constituer pour

autant une limitation.

EXEMPLE 1

On a lavé de manière intensive des crêtes-de-coq

avec une solution aqueuse à 1 % de chlorure de cétylpyridi-

nium, puis avec de l'eau déionisée et, finalement, on les

a congelées. Les crêtes congelées ont été découpées en tran-

ches d'environ 1-2 mm d'épaisseur. On a préparé un mélange contenant 1000 g d'acétone, lOOg de formaline à 37% et 50g d'a-

cétate de sodium,et on a ajouté 1000lg des crêtes au mélange.

Le mélange des crêtes et du liquide de traitement(pH6,7)a été maintenu pendant 24 heures à une température d'environ 20 C sous faible agitation. Le liquide a ensuite été séparé des crêtes par filtration à travers un tamis en nylon. Les crêtes

* traitées ont ensuite été lavées avec 500 g d'acétone et sé-

chées à l'air pour donner un poids final de 500 g.Les crêtes

séchées ont été mélangées avec 2,5 1 d'eau déionisée et l'ex-

traction a été effectuée pendant 72 heures à une température

d'environ 20 C sous faible agitation. Les crêtes ont été sé-

parées de l'extrait par filtration à travers un tamis en tis-

su de nylon, et l'extrait a été encore filtré à travers une matière filtrante du type cellulosique ("Micro-media" R, M70, Ertel Engineering Co.). La concentration d'acide hyaluronique dans ce premier extrait a été de 0,92 mg/ml. On a mélangé

2 1 de l'extrait avec 4 1 d'acétone et 20 g d'acétate de so-

dium. Il s'est formé un précipitat fibreux blanc qui a été collecté, lavé avec de l'acétone et séché dans un four à vide à-35 C. On a obtenu 1,75 g de produit. Le rapport hexosamine/ acide hexuronique pour le produit a été de 1 + 0,05. La teneur en formaldehyde dans le produit a été de 0, 0150 %. Ainsi, le produit a été identifié comme Hylan. La teneur en protéines dans le produit a été de 0,35 % et la valeur de viscosité

limite a été de 4,320 cc/g.

Après la première extraction, les crêtes ont été mélan-

gées avec 2,5 1 d'eau déionisée, et l'extraction a été effec-

tuée pendant 48 heures à la température ambiante. Les crêtes

ont été séparées et l'extrait a été filtré comme indiqué ci-

dessus. La concentration d'acide hyaluronique dans le second extrait a été de 0,65 mg/ml. On a récupéré 1,26 g du produit

à partir de l'extrait par précipitation, comme décrit ci-des-

sus. Cette fraction se caractérisait également comme un hyalu-

ronate de sodium chimiquement modifié avec une teneur en for-

maldéhyde de 0,014 %. La teneur en protéines a été de 0,27% et la valeur de viscosité limite a été de 4.729 cc/g. Les propriétés réhologiques d'une solution à i % en poids dans une solution aqueuse contenant 0,15 M de NaCl dans l'eau ont été évaluées. Ces données sont données dans le Tableau 1.

On a également effectué une troisième extraction aqueu-

se des crêtes, comme indiqué ci-dessus. La concentration en acide hyaluronique dans le troisième extrait a été de 0,33mg/ ml, et on a récupéré 0,60 g d'acide hyaluronique à partir de

cet extrait, avec une teneur en protéines de 0,20 %, une va-

leur de viscosité limite de 4.830 cc/g et une teneur en for-

maldéhyde de 0,0115 %.

Ainsi, on a récupéré à partir de 1 kg de crêtes-de-coq

3,61 g de hyaluronate de sodium chimiquement modifié.

EXEMPLE 2

On a mélangé 1 kg de crêtes-de-coq en tranches, prépa-

rées comme dans l'Exemple 1, avec un mélange de 1 kg d'acéto-

ne et de 150 g d'une solution à 40 % en poids de glutaraldé-

hyde dans l'eau. Le pH de ce mélange était de 6,9. Le mélan-

ge a été maintenu pendant 16 heures à la température ambian-

te, à environ 20 C sous faible agitation (environ 1 tour/

minute). Ensuite, les crêtes ont été séparées du liquide,la-

vées à l'acétone et séchées à l'air pour donner la moitié de leur poids original. Les crêtes séchées ont été extraites avec 3 1 d'eau déionisée pendant 96 heures à une température d'environ 20 C. L'extrait a été séparé des crêtes et filtré

comme décrit dans l'Exemple 1. La teneur en acide hyaluroni-

que dans l'extrait a été de 1,4 mg/ml. Le produit, après pré-

cipitation avec l'acétone conformément à l'Exemple 1, a pré-

senté une teneur en protéines de 0,42 % et une valeur de vis-

cosité limite de 3.700 cc/g.

EXEMPLE 3

On a répété le processus décrit à l'Exemple 2, à la différence que la même quantité d'une solution à 40 % en poids de glyoxal dans l'eau a été utilisée au lieu d'une solution de glutaraldéhyde. La concentration d'acide hyaluronique dans l'extrait a été de 0,92 mg/ml. La teneur en protéines dans le produit a été de 0,5 % et la valeur de viscosité limite

a été de 3.930 cc/g.

EXEMPLE 4

Des crêtes-de-coq ont été lavées, congelées, tranchées

et traitées avec le mélange acétone-formaldéhyde conformé -

ment à l'Exemple 1. Les crêtes, après avoir été séchées pour donner la moitié de leur poids original, ont été extraites avec 2,5 1 d'une solution aqueuse à 0,05 M d'hydroxyde de

sodium (pH supérieur à 11) pendant 120 heures à une tempéra-

ture d'environ 20 C. L'extrait a été séparé et filtré comme

décrit dans l'Exemple 1. La concentration d'acide hyaluroni-

que dans l'extrait a été de 3,6 mg/ml. Un produit blanc a

été précipité avec un mélange acétone-acétate de sodium, la-

vé avec de l'acétone et séché. On a obtenu 7,5 g d'un produit présentant une teneur en protéines de 0,2 % et une valeur

de viscosité limite de 1.310 cc/g.

EXEMPLE 5

Des crêtes-de-coq ont été lavées, congelées et tran-

chées, et 1 kg de crêtes ont été mélangées avec un mélange contenant 1 kg d'isopropanol, 100 g de formaline à 37 %,

50 g d'acétate de sodium et 100 g de chloroforme. Le traite-

ment a été effectué sous faible agitation pendant 16 heures

à une température d'environ 20 C. L'extraction et la préci-

pitation ont été effectuées comme décrit dans l'Exemple 1.La concentration de l'extrait en acide hyaluronique a été de 0,68 mg/ml. La teneur du produit en protéines a été de 0,46%

et la valeur de viscosité limite de 4.900 cc/g.

EXEMPLE 6

Des crêtes-de-coq ont été lavées, congelées, tran-

chées, traitées avec un mélange acétone-formaldéhyde, lavées à l'acétone, séchées et extraites avec de l'eau, comme décrit dans l'Exemple 1. L'extrait a été mélangé avec un mélange de 2 1 d'acétone et de 1 f de chloroforme. On a obtenu 1,9 g

d'un produit blanc en fibres présentant une teneur en protéi-

nes de 0,05 % et une valeur de viscosité limite de 4.400 cc/

g.

EXEMPLE 7

On a traité 1 kg de crêtes en tranches préparées comme décrit dans l'Exemple 1 avec un mélange contenant 1 kg d'acétone, 50 g de formaline à 37 % et 50 g d'acétate de sodium pendant 24 heures à une température d'environ 200csous

faible agitation. L'extrait a été séparé et filtré et le pro-

duit a été précipité comme décrit dans l'Exemple 1. On a ob-

tenu 1,6 g de produit blanc présentant une-teneur en protéi- nes de 0,45 %, une valeur de viscosité limite de 5.300 cc/g

et une teneur combinée en formaldéhyde de 0,008 %.

EXEMPLE 8

Le processus décrit dans l'Exemple 1 a été répété à

la différence que, après le traitement à l'acétone-formaldé-

hyde, les crêtes ont été séchées pour donner un tiers de leur

poids original, et la première extraction à l'eau a été ef-

fectuée pendant 96 heures.

La concentration en acide hyaluronique dans le premier extrait a été de 1, 05 mg/ml. Le produit précipité à partir de l'extrait présentait une teneur en protéines de 0,25 % et

une valeur de viscosité limite de 4.930 cc/g. Un test d'os-

cillation d'une solution à 1 % en poids de ce produit dans une solution aqueuse contenant 0,15 M de NaCl a donné un

"point de croisement" à une fréquence de 0,020 Hz.

La concentration en acide hyaluronique dans le second extrait a été de 0,58 mg/ml. La fraction obtenue à partir de cet extrait a présenté une teneur en protéines de 0,19 % et une valeur de viscosité limite de 7.300 cc/g. La teneur combinée en formaldéhyde a été de 0,01 %. La fréquence du "point de croisement" dans le test d'oscillation a été de

0,0005 Hz.

Au total, on a récupéré avec les trois extractions

consécutives 3,5 g d'acide hyaluronique chimiquement modifié.

EXEMPLE 9

Des crêtes-de-coq ont été lavées, congelées et tran-

chées, et 1 kg de tranches a été mélangé avec 1 kg d'acétone, g de formaline à 37 % et 100 g de chloroforme. Le pH du mélange a été réglé à 4,0 avec de l'acide hydrochlorique.La concentration en acide hyaluronique dans le premier extrait a été de 0,58 mg/ml. Le produit a été récupéré à partir du premier extrait par précipitation avec de l'acétone et de l'acétate de sodium conformément à l'Exemple 1. La teneur en protéines dans le produit a été de 0,12 % et la valeur de viscosité limite a été de 4.025 cc/g. La teneur combinée

en formaldéhyde dans le produit a été de 0,02 %. La fréquen-

ce du "point de croisement" dans leatest d'oscillation pour une solution à 1 % en poids du produit dans une solution

aqueuse contenant 0,15 M de NaCl a été de 0,006 Hz.

EXEMPLE 10

Des crêtes-de-coq ont été lavées, congelées et tran-

chées, et 1 kg de tranches a été traité avec un mélange acé-

tone-formaldéhyde comme décrit dans l'Exemple 1, à la diffé-

rence que le pH du mélange a été réglé à 11,0 avec de l'hy-

droxyde de sodium. Les crêtes ont été séchées et extraites à l'eau conformément à l'Exemple 1. La concentration d'acide hyaluronique dans l'extrait a été de 0,69 mg/ml. Le produit

a été précipité à partir de l'extrait conformément à l'Exem-

ple 1, à la différence qu'on a utilisé de l'isopropanol à la place de l'acétone. On a obtenu 1,3 g de matières fibreuses blanches présentant une teneur en protéines de 0,45 %, une valeur de viscosité limite de 5. 050 cc/g et une teneur en formaldéhyde de 0,012 %. La fréquence du "point de croisement"

dans le test d'oscillation pour une solution à 1 % du pro -

duit dans une solution aqueuse contenant 0,15 M de NaCl a été

de 0,012 Hz.

EXEMPLE 11 -

Cet Exemple illustre l'obtention d'une matière du type

gelée à partir de HY. On a mélangé 0,88 g du produit préci-

pité à partir du second extrait de l'Exemple 1 avec 28,3 g

d'une solution aqueuse contenant 0,05 N de NaOH, et le mélan-

ge a été agité pendant 60 minutes à la température ambiante.

On a ajouté à la solution visqueuse qui a été obtenue un mé-

lange de 0,26 g de sulfone de divinyle et 1,0 g d'une solu-

tion aqueuse contenant 0,5 n de NaOH. Le mélange résultant a été agité pendant 10 minutes puis laissé au repos pendant minutes à la température ambiante. On a obtenu un gel élastique, incolore et clair. Le gel a été placé dans 0,5 1 d'une solution saline à 0,15 M et laissé au repos toute la

nuit. Ensuite, le liquide en excès a été éliminé du gel hau-

tement gonflé et on a ajouté au gel 0,5 1 de solution saline fraiche,puis le mélange a été agité pendant 24 heures. Le

liquide en excès a été décanté à partir de la matière gon-

flée insoluble. On a obtenu une matière claire du type gelée.

On a déterminé la concentration de l'acide hyaluronique dans le produit à 0,275 % en poids. Les propriétés rhéologiques

de la matière sont illustrées aux FIGS. 5,6 et 7.

EXEMPLE 12

Traitement de crêtes-de-co avec 1CH2 0 Du paraformaldéhyde radioactive (14CH20), présentant une activité spécifique de 500 m Ci/g (produits chimiques

radioactifs I2CN) a été mélangé dans une quantité correspon-

dant à 5,0 mCi avec 1,0 ml d'une solution à 37 % en poids de formaldehyde dans l'eau, puis on a ajouté 0,1 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium 1 N. Le mélange a été placé dans un récipient hermétiquement fermé et chauffé à 60 C pour dissoudre le paraformaldéhyde. Ensuite, le mélange a été refroidi à 0 C et neutralisé avec 0,1 ml d'une solution

aqueuse d'acide acétique à 1 N. La radioactivité de la solu-

tion obtenue a été mesurée dans 10 ml d'un milieu liquide

HydrofluorR de comptage de scintillation (National Diagnos-

tic) en utilisant un compteur Searle Isocap 300 de scintilla-

tion du liquide, avec une correction d'efficacité par ordina-

teur, sur la base d'une méthode externe standard. La concen-

tration en formaldehyde a été déterminée par une méthode

colorimétrique en utilisant de l'acide chromotropique. L'ac-

tivité spécifique mesurée de la solution obtenue a été de 0,555 mCi/mmole de CH20. La solution de formaldehyde a été mélangée avec 7,5 g d'acétone, 1 g de chloroforme et 0,5 g d'acétate de sodium. On a mélangé 7,5 g de crêtes-de-coq en tranches avec la solution, et le traitement a été effectué

pendant 18 heures à une température d'environ 200 C. Les crê-

tes ont été séparées du liquide, lavées plusieurs fois à l'a-

cétone et séchées à l'air pour donner la moitié de leur poids d'origine. On a ajouté 15 ml d'eau distillée deux fois aux crêtes, et l'extraction a été effectuée pendant 96 heures à une température d'environ 20 C. L'extrait a été séparé des crêtes et filtré à travers plusieurs couches de papier filtre

(Whatman R numéro 1). Le même processus a été répété pour ob-

tenir un second extrait des crêtes. Le HY a été précipité à partir des extraits sous la forme d'une matière blanche

en fibres par addition aux extraits de CH300Na dans une quan-

tité donnant une solution à 1 % en poids et 4 volumes d'étha-

nol à 95 %. La matière en fibres a été séparée, lavée inten- sivement à l'acétone, séchée puis redissoute dans l'eau pour

donner une solution présentant une concentration en HY d'en-

viron 1 mg/ml. Le HY a été reprécipité à partir de cette so-

lution, comme décrit ci-dessus, et à nouveau lavé intensive-

ment à l'acétone puis séché. La matière sèche a de nouveau

été redissoute dans de l'eau distillée pour donner une solu-

tion contenant 0,84 mg/ml de HY. L'activité spécifique de cette solution a été mesurée comme donnant 194 dpm/pg d'acide hyaluronique. Une dialyse exhaustive de cette solution contre un tampon de phosphate à 0,05 M, pH 7, 5, contenant 0,15 M de

NaCl, a réduit la radioactivité à 103 dpm/Vg de HY. Une dia-

lyse exhaustive de cette solution contre de l'hydrochlorure de guanidium à 4 M a réduit l'activité à 101 dpm/pg de HY, ce qui indique que du formaldéhyde est resté dans le produit même après le traitement de la solution dans les conditions

de dissociation des protéines. Sur la base de cette radioac-

tivité mesurée du produit et de l'activité spécifique de la

solution de formaldehyde de départ, la teneur en formaldehy-

de par rapport à HY a été calculée à environ 0,2 % en poids.

Pour évaluer dans quelle mesure le formaldéhyde radioactive

s'est associé avec le HY susceptible d'une dégradation enzy-

matique avec un hyaluronidase Streptomyces, on a préparé une autre solution du produit qui contenait 0,8 mg/ml de HY et présentait une activité de 1,250 dpm/10 p1 de solution. On a

ajouté à 2 ml de cette solution 0,1 ml d'un tampon citrate-

phosphate (pH 5,6) contenant 33 TRU de hyaluronidase Strepto-

myces (Miles Laboratories, Inc., activité spécifique 2.000

TRU/mg d'acide hyaluronique, activité protéolytique inférieu-

re à 5 X 1014 unités par TRU). On a ajouté à une autre frac-

tion de 2 ml de la même solution 0,1 ml du tampon sans l'en-

zyme. Les deux parties ont été dialysées pendant 24 heures contre 1000 volumes du tampon citrate-phosphate. Les volumes

des deux échantillons ont été les mêmes après dialyse. L'é-

chantillon non traité à l'enzyme a présenté une concentra-

tion en HY de 0,76 mg/ml et une radioactivité de 552 dpm/10

pi. La concentration en HY dans l'échantillon traité à l'en-

zyme se situait sous un niveau détectable (10 pg/ml) et la radioactivité a été de 414dpm /10 pl de solution. Ainsi, le hyaluronidase susceptible de radioactivité correspondait à dpm/pg de HY, ce qui correspond à 0,049 % en poids de

formaldéhyde associé avec le HY digestible de manière enzy-

matique. De tels échantillons du produit ont encore été ana-

lysés par chromatographie à pénétration de gel sur une colon-

ne en verre de 1,6 X 90 cm garnie de clycéryle CPG 3000, taille des pores 2869 + 8,3 % (Electronucleonics, Inc.). Un tampon de borate à 0,02 M dégazé (pH 7,5), contenant 0,15 M de NaCl, a été utilisé pour l'élution. Le volume exclu de la colonne (Vo) a été déterminé avec un échantillon de HY de poids moléculaire 4 X 106, et le volume total de la colonne

(Vt) a été déterminé avec du sucrose. L'élution a été effec-

tuée à un faible débit de 10 ml/h à 6 C. On a recueilli des fractions de 5 ml et on les a analysées pour la concentration et la radioactivité de HY. On a constaté que la radioactivité coélue avec le HY dans le volume vide, et que la digestion enzymatique élimine des fractions de volume vide à la fois le HY et la radioactivité. Le calcul a montré que l'activité spécifique associée au HY de volume vide a été de 14,6 dpm/

pg de HY, ce qui correspond à 0,036 % en poids de formaldé-

hyde dans le polymère. Cette valeur est une confirmation de celle qui a été obtenue dans l'expérience de dialyse. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation, non plus qu'au mode d'application, qui ont été décrits; on pourrait au contraire concevoir diverses variantes sans sortir

pour autant de son cadre.

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention d'une préparation d'acide hyaluronique chimiquement modifiée, caractérisé par le fait qu'il comporte les étapes consistant à:

(a) traiter un tissu animal contenant de l'acide hya-

luronique avec un mélange aqueux de traitement contenant une

substance réagissant avec les protéines et l'acide hyaluroni-

que pour effectuer in situ une modification chimique de l'a-

cide hyaluronique contenu dans le tissu,

(b) enlever le mélange de traitement en excès du mé-

lange de réaction, (c) extraire à l'eau l'acide hyaluronique chimiquement modifié du tissu animal traité, (d) séparer l'extrait contenant l'acide hyaluronique modifié du tissu animal traité, et

(e) récupérer de l'extrait l'acide hyaluronique chimi-

quement modifié.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la substance réagissant avec les protéines et

l'acide hyaluronique contenu dans le mélange aqueux de trai-

tement est un aldéhyde, par exemple du formaldéhyde, du glu-

taraldéhyde ou du glyoxal.-

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par

le fait que le mélange aqueux de traitement contient un sol-

vant, par exemple une cétone inférieure, un alcool inférieur

ou un solvant aprotique tels que l'acétone, la cétone méthy-

le-éthyle, l'éthanol, l'isopropanol, le diméthyle formamide,

le diméthyle acétamide ou le diméthyle sulfoxide, qui ne ré-

agit pas avec l'aldéhyde.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3,ca-

ractérisé par le fait que le mélange aqueux de traitement

peut comporter un électrolyte, notamment de l'acétate de so-

dium, et un solvant organique insoluble dans l'eau, par exem-

ple du chloroforme.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé

par le fait que le rapport pondéral de l'eau au solvant mis-

cible dans l'eau dans le mélange de traitement est de 1-5/ 4-8,5, et que le rapport pondéral de l'eau à l'aldéhyde est

de 1-5/0,02-1.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, ca-

ractérisé par le fait que le mélange de traitement comporte, en parties, en poids: eau 10-50 solvant miscible dans l'eau 40-85 aldéhyde 0,2-10 solvant insoluble dans l'eau 0,5-10 électrolyte 0-20

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, ca-

ractérisé par le fait que le mélange de traitement présente un pH de 4-10, le rapport pondéral du mélange de traitement au tissu à traiter est d'au moins 10/1, et en ce que le

traitement est effectué pendant environ 4-24 heures à la tem-

pérature ambiante ou à une température inférieure.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, carac-

térisé par le fait que le tissu animal est constitué par des

crêtes-de-coq et que les crêtes sont coupées en tranches d'en-

viron 1-3 mm d'épaisseur.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, ca-

ractérisé par le fait que le mélange de traitement est élimi-

né du mélange de réaction par lavage du tissu traité avec un solvant ou un mélange solvant/eau, le solvant utilisé pour le lavage pouvant être le même que celui qui est utilisé dans le

mélange de traitement.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, carac-

térisé par le fait que l'extraction de l'acide hyaluronique

chimiquement modifié est effectuée à une température inférieu-

re à 25 C pendant environ 6 heures à plusieurs jours, le rap-

port pondéral de l'eau au tissu traité étant d'environ 2-5/1,

sur la base du poids du tissu non traité.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que le tissu traité est séché à environ 25-50 % de

son poids traité avant la phase d'extraction.

12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, ca-

ractérisé par le fait que l'extrait est séparé du tissu ani-

mal par filtration, par centrifugation ou par décantation.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que la filtration est effectuée en deux phases, à savoir une première filtration grossière à travers un tamis

large pour éliminer les morceaux de tissu animal et une se-

conde filtration fine à travers une matière cellulosique.

14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, ca-

ractérisé par le fait que l'acide hyaluronique chimiquement modifié est récupéré à partir de l'extrait par précipitation avec un solvant, par exemple de l'acétone, de l'éthanol ou de l'isopropanol, suivie par lavage et séchage de l'acide hyaluronique chimiquement modifié précipité résultant, un

acide minéral, par exemple HC1, H2S04 ou H3P04 ou un élec-

trolyte, par exemple de l'acétate de sodium ou du NaCl,pou-

vant être ajouté pendant la phase de précipitation.

15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14,ca-

ractérisé par le fait que l'acide hyaluronique chimiquement

modifié est retiré de l'extrait par lyophilisation.

16. Procédé de réticulation de l'acide hyaluronique chimiquement modifié obtenu selon le procédé de l'une des

revendications 1 à 15, caractérisé par le fait qu'il consis-

te à soumettre l'acide hyaluronique chimiquement modifié à une réaction de réticulation avec du sulfone de divinyle

dans des conditions alcalines à la température ambiante pen-

dant environ 1 heure.

17. Préparation d'acide hyaluronique chimiquement mo-

difié, caractérisée par la présence d'environ 0,005 % à 0,05 % en poids de groupes aldéhyde de réticulation liés de

manière covalente aux chaînes polymères d'acide hyaluronique.