JPH01198602A - 化学的に修飾したヒアルロン酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な化学的、物理化学的、レオロジー的性
質によって特徴づけられる化学的に修飾されたヒアルロ
ン酸製剤及び該製剤の新規な製造法に関する。

（従来技術） ヒアルロン酸（以下ＨＡと略称する）は天然に存在する
高分子量グリコサミノグリカンであって、Ｄ−グルクロ
ン酸とＮ−アセチルゲルコサミノ−２−アートアミド−
２−デンキシーＤ−グルコースとがβ１→３グルコシド
結合で結合した二糖類を繰返単位としている。これらの
二糖類はβ１→４グルコシド結合によって結合し、非分
枝、非架橋の多糖類鎖を形成している。

ＨＡは膀帯、目の硝子液、ｉ液、雄鶏のとさか。

皮膚などの動物組織中に見出される。精製ＨＡの分子量
はその原料９分離法１分子量の測定法などで異るが５万
乃至８００万の範囲であることが文献に報告されている
〔バラズ・イー・エイ（Ｂａｌａｚｓ、　Ｅ、　Ａ、）
、フェト、プロシード、（Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃｅｅｄ、）、１７．１０８６−１０９８（１９
５８））。

動物組織及び細菌培養物からのＨＡの回収、精製につい
ていくつかの方法が提案されている。これらの方法とし
ては次のものがある。蛋白質の酵素的消化法〔イー・デ
イ・ティ・アドキンス（Ｅ。

Ｊ）、Ｔ、　Ａｔｋｉｎｓ）　、シイ・エフ・フエルプ
ス（０，Ｆ。

Ｐｈｅｌｐｓ）　　及びジェイ・ケイ・シーハン（Ｊ、
Ｋ。

５ｈｅｅｈａｎ）、バイオケミカＪＬｔ−ジャーナル（
Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、）、１．２８．１２５５−１２６（、（１９７２）
；アール慟バー？（Ｒ，Ｖａｒｍａ）、　７−ルー　ｘ
ス、バー？　（Ｒ，８，Ｖａｒｍａ）　＃　タフ！Ｊユ
・ニス・アルテン（Ｗ、　Ｓ、　Ａｌ　ｔｅｎ）　、　
：Ｘ、イ・エイチ・ワルデイー（Ａ、Ｈ，Ｗａｒｄｉ）
　、カーボハイド　し・−ト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒ、Ｒｅｓ、）　、　８２．８８６−８９６　。

（１９７４））、イオン交換樹脂での処理法〔テ・ｆ・
シイ・ラウレント（Ｔ、Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、）　、　２１６　、２６３−２７
１　（１９５５）；イー・アール・ベルマン（Ｅ、　Ｒ
，Ｂｅｒｍａｎ）　、バイオキミカ・工・バイオフイジ
カ、アクタ（Ｂｉｏ−ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ）　５８　、１２０−１２２（１９６２））、カ
チオン界面活性剤による沈降法〔ティ・シイ・ラウレン
ト（Ｔ、　Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ）、。

エム、ライアン（Ｍ、　Ｒｙａｎ　）　、エイ、ピエト
ルスキーヴイチ（Ａ、　Ｐｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃ
ｚ　）　、　　バイオキミカ、バイオフィジカ・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ−Ａｃｔ＠）　、　４２　、４７６＝４
８５　（１９６０）１三クロロ酢酸による処理法〔エイ
チ、ホフマンス。

オー・シュムット、エイチ・ステルクおよびエイチ・ク
ープ（、Ｈ，Ｈｏｆｍａｎｓ　、　Ｑ、　Ｓｃｈｍｕｔ
　、　Ｔ１．Ｂ　ｔｅｒｋａｎｄ　Ｈ，ＫＯＯＩ））　
ｌナチュールフオルシ−Ｌ　、　（Ｎａｔｕ−ｒｆｏｒ
ｓｃｈ、）３４ｃ　、５０８−５１１（１９７９）：ｌ
。

〔デイ、シュムットおよびエイチ、ホフマンス（Ｄ、８
ｃｈｍｕｔ、ａｎｄＨ，Ｈｏｆｍａｎｓ）　　＊バイオ
キミカ、バイオフイジカ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

ＢｊｏｐＨｙｓ、ＡｃＬａ）　６７８　　、１９２−１
９６（１９８１）：ｌ、分離用密度勾配沈降法〔ビイ・
シルパナタ、ジエイ・アール・ダンストン、エイ・シイ
・オグストン（Ｐ、　５ｉｌｐａｎａｔａ　、　Ｊ、Ｒ
。

Ｄｕｎｓｔｏｎｅ　、　Ａ、　Ｇ、　０ｇ５ｔｏｎ）　
、バイオケミカＪＬｔ−ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｊ
、）　　１０９　、４８−５０（１９６８）〕及び電着
法〔ニス・ローズマン、デイ・アール・ワトンン、ジエ
イ・エフ・ダフおよびダブリュ・アール・ロビンソン（
Ｓ。

几ｏｓｅｍａｎ　、Ｄ、Ｒ，Ｗａｔｓｏｎ　、Ｊ、Ｆ、
Ｄｕｆｆ　　ａｎｄ　Ｗ。

Ｄ、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　、アナルス　リューマチッ
ク　デイジージズ（Ａｎｎａｌｓ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ
　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）　。

１５　、６７−６　ｇ　（１９５５））である。　また
数種の異った処理法例えば酵素的消化法とセチルピリジ
ニウムクロライドによる沈降法〔ジエイ・イー・スコツ
ト（Ｊ、　Ｅ、　５ｃｏｔｔ）　、　　バイオケミカル
・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）　＋　６２　
、３１（１９５６））とを使用した方法を用いることが
できる。

ＨＡを生物的原料から回収する場合に起る基本的な問題
はＨＡと共に動物組織から抽出される蛋白質及びその他
の生物的高分子物から高分子物のＨＡを分離するさいに
起こる。原料によっては好ましくない高分子物の量が非
常に多（、ＨＡ量の何倍をも超える場合がある。上述の
ＨＡ回収法はすべて実験室で用いられるが、これらの方
法には夫々固有の種々の欠点があるので大規模製造には
ほとんど用いることができない。

工業的規模での最も進歩したＨＡの回収、精製法はＥ、
　Ａ、バラズ（Ｅ、　Ａ、　Ｂａ１ａｚｓ　）の米国特
許第４，１４１，９７１号に記載されている。　この方
法によると蛋白質の含有量が０．５重量％以下で分子量
が１２０万の超純品のＨＡが雄鶏のとさか或いはヒＨ７
Ｗ帯からの水による抽出で得られる。蛋白質類及び他の
物質はｐＨ値を変えて数回クロロホルムで抽出すること
によって除かれる。水抽出物のクロロホルム抽出に於い
ては変性蛋白質及び他の物質が集まる界面層が形成され
る。或種の物質例えば脂肪は多分クロロホルム相に溶解
されている。この方法は又蛋白質分解酵素例えばプロナ
ーゼによる処理法を併用してもよい。数種の正に苦心の
作とも言える処理法の組合せによって発熱性物質を含ま
ず非炎症性のＨＡフラクションが得られる方法が開発さ
れた。この生成物は［ヒアロンＱＩｅａｌｏｎ）Ｊなる
登録商標で１％溶液として現在市販されており、ビスコ
外科手術（ｖｉｓｃｏｓｕｒ−ｇｅｒｙ）　　に用いら
れ組織の機械的損傷を防止し、スペース（５ｐａｃｅ）
を提供し外科手術中に於ける組織への触診を許容してい
る〔イー・エイ・バラズ（Ｅ、　Ａ、　Ｂａ１ａｚｓ　
）　、　　ヒアロン（Ｈｅａｌｏｎ）　＋　ジエイ・ウ
ィリー・アンド・サン（Ｊ　、　Ｗｉ　１　ｅｙ　ａｎ
ｄＳｏｎ）、＝ニーＥｌ−り、１９８Ｂ、ｐｐ５−２８
）。

（発明の構成） 本発明は抽出に先立って動物組織中のＨＡをその場で化
学的に修飾するための新規な方法を提供するものであり
、化学的に修飾されたＨＡを動物組織から回収、精製す
る新規な方法を提供するものであり、更に新規で超純粋
で発熱性物質を含まず、且つ非炎症性の化学的に修飾さ
れ、ＨＡポリマー鎖に共有結合で結合したアルデヒド４
Ｆ　ａ基を約０．００５乃至０．０５重量９ｄ含んでい
るＨＡを提供するものである。

本発明は、ＨＡを、水性媒体中で蛋白質やＨＡと反応す
る物質で動物組織を処理することによりＭ織から抽出す
る前に、その場で化学的に修飾できるという発見に基づ
くものである。これらの物質にはホルムアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド。

グリオキサール等が含まれる。このその場での化学的修
飾はＨＡ高分子の最初の構造２分子の大きさ１分子間及
び分子内相互作用を、ひいては修飾された生成物から作
られた溶液のレオロジー的性質を実質的に変えてしまう
事が判った。それ故にこの化学的修飾されたＨＡは新し
い名称で呼ばれるのが相当である。本願発明の発明者ら
はこの物質を［ハイラン（Ｈｙｌａｎ）　Ｊと呼ぶこと
にした（以下ＨＹと呼称する）。ＨＡが動物脂？Ｔｚ、
から抽出される際、通常は−Ｍ１こ大量の蛋白質が溶出
して来る。この蛋白質の量は動物組織の性質や抽出法の
パラメータに実質上依存して変り得る。雄鶏のとさかか
らＨＡを抽出する場合、ＨＡ対対口白質重量比は１：０
．５から１：４まで変り得る（イー・エイ・バラズの米
国特許第４．ＳＯ８，６７６号）。

結局動物組織からの純１１１１Ａの回収における第一の
問題は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動物
組織の前記予備処理によって、その処理を行わない場合
よりも実質的に低い蛋白質含量のＨＹの水抽出物が得ら
れることを見出したのである。

この組織の処理の間に起る化学的な現象の正確な処は充
分には判らないので、本発明は特定の化学反応によって
限定されてはならない。組織中の蛋白質と処理混合物中
の試薬との間の化学反応の結果として、蛋白質は変性さ
れ、組織中に固定され、それ放火の水抽出操作に於いて
不溶性になるものと考えられる。

本発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質と反応する
いずれの物質も用いることができる。その最も有利な物
質はホルムアルデヒドであることが判った。その他のア
ルデヒド例えばグルタルアルデヒド又はグリオキザール
も本発明の方法に使用できる。

組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができる。しか
しこれを行った場合は「ハイラン」が水に良く溶けるた
めに実質的にロスが起る。そのため組織の処理は水と水
溶性有機溶媒との混合物中で行うのが良い。その溶媒は
蛋白質固定化に用いる試薬と反応するものであってはな
らない。これらの溶媒の例としてはアセトン或いはメチ
ルエチルケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイ
ンプロパツールの如き低級アルコール、ジメチルホルム
アミド、ジメチルアセトアミド、或いはジメチルスルホ
オキシドの如き非プロトン性溶媒などがある。そのよう
な溶媒は通常８０〜９０］ｉｆ％以上の大量の水を含ん
でいる組織と混合すると水−溶媒混合物が形成される。

゛その混合物中の水−溶媒の比は溶媒／組織の比を変え
或いはその混合物に水を加えることによって所望のレベ
ルに調節できる。好ましい水／溶媒比はＨＹが組織の処
理に用いる該混合物に溶解してはならないという意味に
於いてＨＹの溶解性によって決められる。

ＨＹの溶解性は用いる溶媒の種類、水／溶媒比、混合物
中の電解質の存在及び濃度、及び混合物のｐＨに依存す
る。ＨＹの溶解性は混合物中に電解質を加えると実質的
に減少することがある。水−溶媒混合物に可溶で、混合
物に所望のＩ）Ｈを与えるいずれの電解質も使用できる
。例えばアセトンを溶媒に使用した際には酢酸ナト・リ
ウムを可必性電解質として好都合に使うことができる。

組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用する溶媒の
種類、電解質の種類などによって広範囲に変えることが
できる。上述の如く、組織からのＥＴ　Ｙは処理用混合
物に溶解してはならないが、処理混合物は試薬と組織高
分子物との反応を容易ならしめるため組織を膨潤させる
のに充分な水を含有していなければならない。この発明
の発明者らはＨＹの原料として雄鶏のとさかを用いた場
合、処理混合物のね成は鶏冠からの水を考慮に入れて下
記の範囲の重量％でよいことを見出した。すなわち水：
１０〜５０．溶媒４０〜８５、電解質０〜２０、試薬０
，２〜１０である。所望によりいくつかの異なる溶剤を
同じ処理混合物に使用できる。

この発明の発明者らは処理混合物中にクロロホルムの如
き水と不混和性の溶媒の少量を使用するのが有利である
ことを見出した。前記混合物のこのような溶媒の含有量
は０．５〜１０重量９６であってもよい。

処理混合物のＩ）Ｈは試薬の性状、該混合物の組成、処
理温度及び時間によって変えることができる。本発明に
よる動物組織からのＨＹを回収する際、次の事を考慮す
ることが非常に重要である。

いくつかの試薬、例えばホルムアルデヒドはｆ（Ａ高分
子物のヒドロキシ基と低いｐＨて反応して水不溶性の架
橋したポリマーを生成することができる。比較的高いｐ
Ｈの媒体中で長時間処理するとＨＹの分解を招き、低分
子量のポリマーしか回収できないことがある。本発明に
於いてアルデヒド型の試薬を使う際、ｐＨは中性附近例
えば４〜１０の範囲で行うのが最も良い結果が得られる
。

処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変えること
ができる。通常下限は、組織が、−雄鶏のとさかの場合
著しくかさだかであるが一処理混合物で少なくとも充分
に覆われねばならないということを条件にして決められ
る。上限は経済的観点から選ばれる。本発明による雄鶏
のとさかの処理に於いては処理混合物と組織の比は組織
の乾燥重量基準で通常１０：１以上である。

温度は本発明による処理の効率に影響する。しかし、Ｈ
Ｙは高温で加水分解しやすいため、高分子量の生成物を
得るためには室温又はそれ以下で処理するのが好ましい
。

処理を完了するために必要な時間は処理混合物の組成、
組織の性状、温度など多くの因子に依存する。処理の制
限要因は組織の薄片中への試薬の拡散であろうと思われ
る。その故に組織薄片の大きさは一つの重要なパラメー
タである。この発明の発明者らは１〜３門厚の小片にス
ライスされた雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時間は
４〜２４時間は４〜２４時間にできることを見出した。

以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒／水混合物
で洗滌し、組織から過剰の処理混合物を除去する。組織
処理用の混合物中で使われたのと同じ溶媒を使用するの
が便利であるｃ洗滌回数は任意であるが、１回の？Ｘａ
で満足な結果が得られた。

次いで洗滌した組織は直接水で抽出してＨＹを回収する
。抽出の効率は水／組織比、抽出媒体のｐＨ，温度及び
時間に依存することを見出した。

又処理済組織の抽出効率は、最初に処理組織を乾燥させ
て処理及び洗滌工程で使われた溶媒を除去することによ
って実質的に増加させることができることも見出された
。組織を元の重量の１／４から１７２まで乾燥させると
最高の結果が得られる。

抽出工程での水７組１ｗＬの比はいくつかの考慮を行っ
て選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆うに充分な
液相が存在すべきである。一方永め量は、次の工程での
沈澱剤の量を減らせるよう抽出液中のＨＹの濃度を出来
るだけ高く維持するために、あまり多くてはならない。

雄鶏のとさかの場合について、水の組織に対する比率は
未処理とさかの重量基準で２〜５であるのが好ましい事
を見出した。

抽出媒体のｐＨは最終生成物の希望品質によって中性、
酸性、塩基性のいずれかに保つことができる。超高分子
量の生成物を得るためには抽出媒体のＩ）　Ｈは６〜８
．５の範囲にすべきであることが見出された。高いＩ）
　Ｈにすれば抽出液中のＨＹ儂度は増大するが同時に生
成物の分子量を低下させ、且後に詳述する如くポリマー
の他の性質を変化させることになる。いずれにしても、
抽出工程中でｐＨを調節することによって最終生成物の
性質を希望する方向へ都合よく規制することができる。

ＨＹの高温での分解がポリマーの分子量を実質的に低下
させるので、２５℃以下の温度で処理済組織の抽出を行
うのが好ましい。

処理済組織からＨＹを最大限に抽出するに必要な時間は
ｐＨ９液／組織比、撹拌強度の如き他の抽出パラメータ
によって実質的に変化する。雄鶏のとさかからの水によ
る抽出に於いて処理済とさかを６時間から数日間までの
間で抽出する時に良い結果が得られることを見出した。

処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹拌するこ
とが出来るし或いは何らの撹拌もせずに放置することも
できる。撹拌は明らかにＨＹ分子が組織から抽出液へ拡
散するのを増大させる。他方激しい撹拌はＨＹの分解と
それによる分子量の低下を招来する。加うるに激しい撹
拌は組織の崩壊を招き抽出液から組織を分離するのを困
難ならしめることが明らかになった。従って抽出工程は
撹拌しないか、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で行うの
が好ましい。

抽出後組織は濾過、遠心分難、傾国等を含む各種の通常
の方法によって抽出液から分難される。

最も簡単で経済的な方法は濾過であることが分かった。

出発物質として用いた組織の種類によっては二段濾過を
用いるのが好ましい場合がある。従って雄鶏のとさかの
場合、組織の大きな切片はナイロンメツシュで容易に濾
過分離でき、例えばセルロース質の緻密な濾過材で濾過
すれば抽出液の良好な精製ができる。

抽出液中の■１１度は抽出中のｐＨ，時間、液／組織化
、撹拌の強さといった多くの因子に依存しているが、通
常０．３〜Ｂ、　Ｏｍｌ／ｍｌの範囲であるが時には更
に高くなる。ある場合には、抽出液中のＨＹ濃度が低い
ときに、第二回目の組織の抽出を行うのが望ましいこと
が分かった。又第二回目の抽出液から沈澱した生成物は
通常第一回目の抽出液からのＨＹに比して高分子量であ
ることも判明した。これは、ＨＹの低分子量画分は組織
から抽出液に拡散し易く、第一回目の抽出液から沈澱さ
せた生成物には、これらの低分子量画分を多く含んでい
るという事実で説明できる。

出来る限り高い収率を得るために二回以上の抽出を行う
ことができるが、抽出を繰返す毎に抽出液中のＨＹ濃度
は低下する。

ＨＹは前記Ｆ液から公知の方法で回収できる。

最も都合の良い方法は水混和性溶媒例えばアセトン、エ
タノール、インプロパツール等を加えて沈澱さす方法で
ある。この沈澱法は酸例えば塩酸。

硫酸１ｇ！＃酸などの存在下か或いは中性電解質例えば
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びこれらの塩類の存
在下で行うことができる。ＨＹ及びその塩類は通常白色
の繊維状又は粉状の物質として沈澱する。この？′？、
澱物は沈澱に使用したのと同じ溶媒又は生成物を溶解し
ない他の溶媒混合物、例えばエーテルで洗滌できる。洗
滌法生成物は通常の手段で乾燥でき、或いは溶媒例えば
アセトン、エタノールなどの層中で貯蔵することができ
る。又ｐ液を凍結乾・買することもできる。

従来技術として知られＨＡ精製に用いられている工程が
本発明方法にその範囲を限定することなく附加されても
よいことは明らかである。例えば発熱性物質、炎症性物
質を除去するために、ＨＹは溶解せず脂肪蛋白質、糖脂
質もしくは糖脂肪蛋白質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）が可溶か或は分離出来る良く知られた溶媒例え
ばクロロホルムによる抽出法を用いることができる。

本発明による方法によれば広範囲に変化した性質をもっ
たＨＹ生成物が得られる。後述の性質が測定された。引
用した方法は本発明によって得られた生成物の特性を特
徴づけるのに使用された。

溶液中のＨＹ濃度は自動化されたカルバゾール法を用い
たヘキスロン酸検定法〔イー・エイ・バラズ、ケイ・オ
ー働ベルンツエン、ジエイ・カロツサおよびデイ・エイ
・スワン（Ｅ、　Ａ、　Ｂａ１ａｚｓ。

Ｋ、Ｏ，Ｂｅｒｎｔｓｅｎ　、　Ｊ、　Ｋａｒｏｓｓａ
　ａｎｄ　Ｊ）、Ａ、　８ｗａｎｎ）、アナリテイカル
、バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１２，５４７−５５８（１９６５
））で測定した。ヘキンサミン含量は自動化比色定量法
〔デイ・エイ・スワンおよびイー・エイ・バラズ（Ｄ、
Ａ、Ｓｗａｎ　　ａｎｄＥ、Ａ、Ｂａ１ａｚｓ）、　　
バイオケミカ、バイオフイジカ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、　１３０．１１２−１２
９（１９６６））で測定した。ＨＡ浴溶液蛋白質含量は
フェノール試薬法〔ロウリーラ（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔａり
、レジャール・オブ・バイオロジカル・　ケミストリイ
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、　１９８　、　
２６５−２７５　、（１９５１）］て測定した。

生成物中のホルムアルデヒド含量は約０．ＩＩの試料を
１０％硫酸水溶液１０ｍ１！中で２時間煮沸し、次いで
得られた溶液を水蒸気蒸溜して遊離のホルムアルデヒド
を除去し、溜出物中のホルムアルデヒドをクロモトロブ
酸を用いた比色定量法で測定シた〔ニス・ジエイ・ボイ
ドおよびエム・エイ、ローガン、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリイ、１４６，２７９（１９４
２）ＣＭ、　Ｊ、　Ｂｏｙｄ　ａｎｄ　Ｍ、Ａ、　Ｌｏ
ｇａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、）］。

ｔ１Ｍ限粘度ｌ＆　（ｍ限粘度）は１　ｉｍ　（ｎ／ｎ
□　−１）／Ｃで定義される。但しｎ及びｎｏは夫々溶
液及び溶媒の粘度であり、Ｃはｇ／ｃｃで表わしたＨＹ
の濃度である。測定は０．２０モル濃度食塩水溶液中で
ウベロード毛管型稀薄溶液粘度計で行った。粘度平均分
子量は式［ｎ］＝ｏ、０２２８Ｍ　　　で計算する〔ア
ール・シイ、クリ−ランド、ジエイ・エル・、ワング、
パイオポリマース　９．７９９（１９７０）（Ｒ，Ｏ，
Ｃ１ｅｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｊ、Ｌ、Ｗａｎｇ、　Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ）１）重量平均分子量は６８２．８ｎ
ｍにセットされたヘリュウムーネオンレーザーを備えた
［クロマティックｘ　（Ｑｈｒｏｍａｔｉｘ）　ＫＭＸ
　−６Ｊ装置を用いて小角レーザー光散乱法（ｌｏｗ　
ａｎｇｌｅ　ｌａｓｅｒｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉ
ｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）により測定される。

重量平均分子量はその外にも分析的超遠心法によって測
定される沈降常数及び拡散常数からも計算できる。

動的光散乱法は比較的高濃度のＨＹ溶液中での分子の凝
集度を測定するのに使われる。この方法によって、溶液
中の相当球面径（ＥＮＤ）の分布が判る。

レオロジー的性質はボーリン　レオメータ−システム（
Ｂｏｈｌｉｎ　Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）　
　で測定される。同システムはコンピューター化された
レオメータ−であって粘度、振動、緩和の３つのモード
で動作できる。ＨＹ浴溶液ついて次のパラメータ、すな
わち広範囲の剪断速度下の粘度、並びに種々の振動周波
数及び緩和時間に於ける動的粘度、動的貯蔵弾性率及び
動的損失弾性率が測定される。

上述の如く本発明の生成物（ＨＹ）はＨ人とホルムアル
デヒドの如き架橋剤とのその場での化学反応の結果得ら
れた新規な高分子物である。ＨＹの化学分析の結果、ホ
ルムアルデヒド含有混合物で処理した雄鶏のとさかから
得られる生成物中の結合ホルムアルデヒドの含有量は処
理の各種のパラメータに依存するがＨＹポリマーの重量
基準でＱ、００５〜０．０２重量％の範囲内であること
が明らかになった。

生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射性同位元
表でラベルされたホルムアルデヒド（”０Ｈ２０）　　
を使用した処理の実験によっても証明された（後記実施
例１２を参照）。実験の結果は本発明によって得られた
生成物が繰返し沈澱をしても、もしくはポリマー溶液の
徹底的透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｎｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ
）　　（Ｃよっても除去し得ない結合ホルムアルデヒド
を含んでいることを示している。これは生成物のポリマ
ー分子にホルムアルデヒドが、共有結合で結合している
ことを証明する強力な証拠である。ホルムアルデヒドが
明確にＨＡと結合しているか否かを知るために、ＨＡを
、細菌もしくはリーチ（ｌｅｅｃｈ）のヒアルロニダー
ゼ、特にＨＡを分解する酵素類で処理した。

この処理の結果はホルムアルデヒドの顕著な量がＨＹ高
分子物に直接共有結合で結合していることを示した。

本発明によって得られる生成物中の蛋白質含量は乾燥ポ
リマーの重量基準で通常０．５％を超えることはな（，
０，１％程度に少な（したりさらに少なくすることがで
きる。

ＨＡ高分子に架橋剤を共有結合的に結合させることによ
るＨＡの化学的修飾、換言すれば該ポリマーの元々の構
造の変化は、分子量や分子の大きさのごとき物理化学的
パラメータ、その上分子間相互作用およびポリマー溶液
のレオロジー的性質に実質的に影響を与える′。

本発明によりＨＹの極めて高い分子量のものが得られる
。従って極限粘度数は７．０００　ｃｃ／ｊ７以上すな
わち粘度平均分子量にして約６Ｘ１０６に達する。光散
乱法による重量平均分子量は１３×１♂にも達する。こ
の重量平均分子量と粘度平均分子量との不一致は後述す
る如く極めて大きな意味をもっていることが明らかにな
った。例えばｉ　ｘ　ｉｏ６或いはそれ以下の如き実質
的に低い分子量のポリマーも所望により本発明の方法に
よって容易に作ることができると理解されるべきである
。同様にＨＹを、回収、精製の任意の工程でそのポリサ
ッカライド鎖のグルコシド結合を切断することが知られ
ている試薬に曝露させれば、いずれの所望の分子量のポ
リマーも得ることができる。上記公知の切断剤とはヒア
ルロニダーゼの如き特定の酵素、フリーラジカル発生系
、剪断力、熱１強アルカリ。

強酸などである。

ＨＹの溶液中での部分比容積（ｐ　ｓ　ｖ）　（ｐａｒ
−ｔｉａｌ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｖｏｌｕｍｅ）は溶液
のイオン強度に依存する。それは０．１５モル食塩含有
の水によるＨＹ浴溶液濃度０から０．５　ｍｌ／ｍｌ　
）のデンシトメトリイ（ｄｅｎｓｉＬｏｍｅｔｒｙ）で
測定され、０、６２７　ｃｃ／１であることが判った。

０．１５モル食塩水に溶解したＨＹの１％溶液の試料に
ついての相当球面径の分布を第４図に示した。そのデー
タによると、ＨＹは極めて高度に凝集した形態で存在し
、しかもこの凝集体は安定で沈降することはないことは
明らかである。

本発明により作られた典型的な超高分子量生成物のレオ
ロジー的性質は第１〜８図に示しである。

この生成物は顕著な粘弾性的性質を有する溶液（０，５
重量％及びそれ以上）を作ることが分かった。

下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性質を最も
良く表わす。すなわち動的貯蔵弾性率（Ｇ′）、クロス
オーバー点（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ　ｐｏｉｎｔ）（動
的貯蔵弾性率ｄが動的損失弾性率Ｇより大きくなる点）
の周波数位相角、緩和時間である。

ＨＹは極め粘稠な水もしくは電解質水溶液による溶液を
作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電解質濃度、温度
に依存し、剪断速度によって減少する、すなわちＨＹ浴
溶液実質的に擬似可塑性（ｐｓｅｕｄｏｐｌａｓｔｉｃ
ｉｔｙ）をもっている。

ＨＹ浴溶液レオロジー的性質を考える場合、これらの性
質が他のポリマーの場合と同様生成物の分子量に大きく
依存することを理解しておくべきである。上述の如（Ｈ
Ｙは広範囲の分子量のものが得られ、レオロジー的性質
もそれに従って変る。

か（して超高分子量生成物（極限粘度数４５００ＣＣ／
ｊｉ以上）については０．１５モル食塩水による１重量
％溶液の粘度は剪断速度０．０５５　　で１０００Ｐａ
、ｓ　以上に達するが、一方極限粘度数が約１０００ｃ
ｃ、係のポリマーの１重量％溶液は約２　Ｐａ、ｓ、に
すぎないことが分かった。ＨＡ浴溶液弾性的性質もポリ
マーの分子量に依存することが分かった。その故に超高
分子量ＨＹの０．１５モル食塩水の１重量％溶液の動的
貯蔵弾性率Ｇは周波数０．Ｏｌヘルツで約４０　Ｐａで
あるが、一方極限粘度数が約１０００　ｃｃ７ＪのＨＹ
浴溶液は約０．２Ｐａである。ポリマー溶液の弾性的性
質と粘性的性質との比を極めてうまく特徴づけるクロス
オーバー点の周波数は、ポリマーの分子量がほぼ１．５
×１０　から８×１０　の範囲及びそれ以上の場合、Ｈ
Ａの０．１５モル食塩水による１重量％溶液について２
５℃で通常０．０２５ヘルツ以下である。

ＨＹ試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性質を公知
の方法で得られたＨＡ生成物の同じ性質と比較して第１
表及び第４図と５図に示した。比較に用いた生成物は雄
鶏のとさかから水抽出し、数回のクロロホルム抽出を行
う所謂セバグ（ｓｅｖａｇ）法〔シイ・ブリックス、オ
オ・シェルマン、アルキ７・フォア・ケミ、ミネラル　
ゼオル、（Ｇ。

Ｂｌ　ｉｘ　、　０．　Ｓｈｅｌｌｍａｎ　、　Ａｒｋ
ｉｖ　ｆｏｒ　［ｅｍｉ　。

Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｇｅｏｌ、）、　１９Ａ　、　１　（
１９４５）］で脱蛋白質して回収したＨＡである。

（以下余白、次頁に続く。） 第１表　ＨＹとＨＡ試料の物理化学的及びレオロジー的
データの比較 パラメータ　　　　　　　　　　　　　ＨＹ　　　　Ｈ
Ａ極限粘度数ｃ　ｃ／ｊｊ　　　　　　　　　　　４　
ｒ　７２９　　８　＋　５６２粘度法分子量データＸＩ
Ｏ’　　　　　　　　　８．２８　　　２．８０光散乱
法分子量データＸＩＯ’　　　　　　　　１３．３０　
　　２．８６沈降、拡散法分子量データ刈０６（Ｐ８Ｕ
）　　　　　１Ｂ、６０　　　２．１４剪断粘度（剪断
速度０．０５５−１）Ｐａ、ｓ　　９６９　　　３０５
クロスオ一バー点周波数　　ヘルツ　　０．００５６　
　０．０３５緩和時間（弾性率半減）　　　　　　　　
５８　　　１９位相角　　　　　　　　　　度 周波数０．００２ヘルツ　　　　　　　　５８．７　　
　７６〃　　１０　ヘルツ　　　　　　　　　　８．５
　　　１２第１表及び第４図のデータはＨＹとＨＡとの
明瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物では
粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆んど同じ値であ
るが、重量平均分子量の方がわずかに低い）、本発明の
生成物は重量平均分子量が粘度平均分子量の約４倍と大
きい。第二に、ＨＹ浴溶液部分比容債（ＰＳＶ）の値が
ＨＡと比べて大きいということは、ＨＹポリマーの方が
より大きな大きさを有することを証明している。第三に
ＨＹポリマーは溶液中で凝集してＨＡ浴溶液比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはＨＹ高分子
がより大きな大きさを有するだけでなく、より強い分子
間相互作用を有することを示している。最後にＨＹ浴溶
液実質的に、ＨＡの同濃度溶液より粘稠で弾力的である
。その大きな粘度は高い粘度平均分子量によるとしても
、測定された劇的ともいえる弾力性の増加は同じ理由で
説明するのが困難である。

これらの観察の結果組織からの抽出に先立ってその場で
のヒアルロン酸の化学的修飾はポリマーの化学的組成を
ほんの僅かに変えるだけであるが、同時に物理化学的パ
ラメータ及びレオロジー的性質にいくつかの劇的変化を
与えるという結論が得られた。この変化は化学的組成の
変化が高分子構造の何らかの重要な変化に相当する際に
起るだけである。

溶液中のＨＡ高分子の形態は種々の方法で研究されてお
り、この問題についての文献も多数にのぼる。これらの
研究は溶液中のポリマー濃度が比較的低い（例えば０．
１９６）場合ポリマー分子は伸びたランダムコイル形態
で相互に絡み合っていることを示している。高濃度では
溶液は高分子鎖の三次元連続網状構造を含んでいると信
じられる。

ＨＡ高分子中のグルコシド結合は相当の硬さをもってい
ることが見出された。溶媒と溶質との相互作用、多くの
）ＩＡ製剤中に存在する少量の蛋白質との相互作用及び
分子内相互作用の如き各種の機構がこれらの現象を説明
するのに提案されている〔例えばイイ・エイ・バラズ、
ヒアルロン酸の物理化学、フェト、プロシード０．１７
．１０８６〜ｌ　０９３　（１９５８）（Ｅ、Ａ、Ｂａ
１ａｚｓ、Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃｅｅｄ、　）参照〕。役人かの著者はＨＡ高分
子に二重らせん構造を提唱し、二重らせんセグメントが
ＨＡ浴溶液異常なレオロジー的性質を与える架橋結合の
役割を演することができると示唆した〔シイ・エム・デ
ィア、アール・ムアーハウス。

デイ・デイ、リース、ニス、アルノット、ジエイ・エム
・ガスおよびイイ・エイ、バラズ、サイエンス、１７９
．５６０−５６２（１９７２）（Ｃ，Ｍ。

Ｄｅａ、　Ｒ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓ、　Ｄ、Ｄ、　Ｒｅｅ
ｓ、Ｓ、Ａｒｎｏｊｔ。

Ｊｉｌ、　Ｇｕｓｓ　ａｎｄ　Ｅ、　Ａ、　Ｂａ１ａｚ
ｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ）　；ニス・アルノット、エイ・
アール・ミトラおよびニス・ラグナタン、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジイ、１６９，８６１〜
８７２゜（１９８３）　（Ｓ、Ａｒｎｏｔｔ、　Ａ、Ｒ
ＯＭ１ｔｒａ　ａｎｄ　　Ｓ。

ＩｔａｇｈｕｎａＬａｎ　、　Ｊ　、　Ｍｏｌ　、　Ｂ
ｉｏｌ　、　）　〕。

これらの研究及び考察について考えてみて、この発明の
発明者らは本発明による生成物（ＨＹ）は、蛋白質架橋
固定化剤で組織を処理する間に導入された追加の架橋結
合を含有できるという仮説に到達した。本発明で使用す
る反応剤例えばホルムアルデヒドは種々の化学基に対し
て著しく反応性であり、その反応性はｐＨ１温度、濃度
などの反応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒ
ドロキシ基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明らか
に反応しない。何故ならば処理して得られた生成物；丈
常に水溶性であり、それ故かなりの架橋度のポリマーを
含んでいないからである。処理中に、ポリマーに導入さ
れる追加の架橋結合の量は多分、ポリマーを不溶化する
のには不充分な少ない量であるが、高分子間の相互作用
とそれによって起るポリマー溶液の弾性を顕著に増加さ
せるに充分なものである。処理剤とのかかる反応の候補
はヒアルロン酸のアセタミド基、ＨＡ中に少量存在し得
るアセチル化されていないアミン基、並びに処理中の組
織の細胞間マトリックス中に存在する蛋白質のアミド基
、アミノ基および他の活性基である。ＨＡのアセタミド
基自身が分子間架橋を形成するということはほとんど考
えられない。

蛋白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて〔例
えばジエイ・エフ・ウォーカー（Ｊ、Ｆ。

Ｗａｌｋｅｒ）、　　ホルムアルデヒド、ラインホルト
出版社、ニューヨーク、１９ｆｌｐｐ８１２−３１７を
参照〕、蛋白質のアミド基自身は架橋を形成できず、架
橋形成の可能性の最も高い反応の一つはホルムアルデヒ
ドとアミノ基とが反応してＮ−メチロールアミノ基を与
え、これが次いでアミド基と反応する反応であることが
見出された。

ノ基との反応が含まれる　〔イイ・エイ・バラズ。

フェト、プロシード、１１１８１７−１８２≧（１９６
６）　（Ｅ、Ａ、　Ｂａ１ａｚｓ、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏ
ｃｅｅｄ、）〕。

第二の予想される機構は、架橋反応への蛋白質又はポリ
ペプチドの関与を示唆している。文献には、蛋白質又は
ポリペプチドはＨＡ高分子共有結合で結合している〔ユ
ーコ、ミクムータ力ガキおよびビイ・ビイ・ツール、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストシイ、２５
６．（，１Ｇ）。

８４６Ｂ−８４６９（１９８１）（ＹｕｋｏＭｉｋｕｍ
−Ｔａｋａｇａｋｉ　ａｎｄ　Ｂ、Ｐ、　Ｔｏｏｌｅ、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）］とか、或いは別のしか
たでＩ（高分子と会合することができるという報告が続
いている。この場合、架橋結合は一つのＨＡ高分子とひ
とつの蛋白質成分と別のＨＡ高分子との間に形成される
か、或いは２つのＨＡ高分子に共有結合で結合した蛋白
質問に形成することができる。

これらの機構のいずれも本発明を限定するとみなさるべ
きではない。本発明の生成物中に共有結合による架橋結
合を少量導入する他の機構があり得ることは理解さるべ
きである。

いずれにせよ、本発明の本質的な特徴は、村らく、ＨＡ
高分子中に少数の架橋結合を導入することによって、Ｈ
Ａ回収工程中に、組織内のＨＡを化学的に修飾すること
であり、その化学的修飾の程度は、ＨＡの有利な性質例
えば水性媒体中で高粘度の溶液を与える性能、生物的適
合性などに悪影響を与えることなくポリマー溶液の弾性
的特性を実質的に増大させるに充分なものである。

本発明により製造される化学的に修飾されたヒアルロン
酸すなわちＨＹは医学の分野や化粧品の多くの用途、例
えばビスコ外科の道具、各種の素材の生物的適合性を改
善するための被覆剤、各種医薬製剤の一成分、肌の手入
れ用製品などに利用できる。このポリマーの改良された
性質例えば増大された弾力性はＨＹの使用時に大きな利
益をもたらす。

又、ＨＹは、慣用的な架橋剤による架橋反応の如き化学
的修飾法を更に附加することによって得られる新規生成
物用の出発物質としても使用できる。本発明による化学
的に修飾されたＨＡおよびその溶液の特別な性質はいく
つかの珍らしい性質を持った上記の附加的に化学的修飾
された生成物を得る機会を与えてくれることが判った。

かくして本発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニ
ルスルホンで架橋することによって水不溶性のゼリー状
物質が得られることが判った。この物質は高度に膨潤し
たゲルである。このゲル中のポリマーの濃度は水或いは
電解質の如き種々の低分子量物質の水溶液であってもよ
い液相の組成に依存する。生理食塩水（０，１５モル食
塩水溶液）の場合、ポリマー濃度は０．１５〜０．４０
重量％にできる。

この物質は第５．６および７図に示す非常に興味あるレ
オロジー的性質をもっている。すなわち全試験周波数に
ついて、複素動的弾性率（Ｇ′）の弾性成分は損失弾性
率（ｄ′）より大きい。同時にこの物質は低い剪断速度
下で梁似可塑物の如き挙動を示す。すなわち粘度は剪断
速度によってかなり低下する。またこの物質は緩和時間
が著しく永いという特徴を有する。この事は本発明によ
り得られたＨＹの溶液の特異な構造であって、それが特
別のレオロジー的性質をもった上記のゼリー状生成物を
得ることを可能にしたものと確信している。換言すれば
、本発明の回収法で起こるＨＡの化学的変化がＨＹの構
造及び性質に影響するばかりか、それから得られる生成
物の性質にまでも影響を及ぼすのである。従って、その
技術分野で知られている方法すなわちクロロホルム抽出
で蛋白質を除去することによって得られたＩＩＡをジビ
ニルスルホンでの架橋の出発物質として使った場合、本
発明の生成物より実質的に劣るレオロジー的性質をもつ
不溶性物質が得られた。

本発明によって得られた生成物の附加的修飾によって多
くの他の変性物質例えば強架橋ゲル、不溶性フィルム、
被覆物などが得られるということは理解されるべきであ
る。

（実施例） 以下の実施例は本発明の好ましい具体例を説明するもの
であって、本発明はこれらに限定さるべきものではない
。

実施例１ 雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライドの１％水
溶液で良く洗い、次いで脱イオン水で洗って最後に冷凍
した。冷凍とさかを約１〜２ｍｍの厚みにスライサーで
薄切りした。アセトン１０００．９，３７％ホルマリン
１００ｙおよび酢酸ナトリウム５０！ｉの混合物を作り
、薄切りとさか１０００！ｉを加えた。とさかと処理液
との混合物（ｐＨ６，７）をゆ・るく攪拌しつつ約２０
℃で２４時間保持した。

ナイロン網で濾過して液をとさかから分離した。

次いでこの処理済とさかをアセトン５００Ｉで洗滌し、
最終５００！ｉになるまで空気中で乾燥した。

乾燥とさかを脱イオン水２．５１！と混合し、ゆるい撹
拌下約２０℃で７２時間抽出を行った。ナイロン網布て
濾過して抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維
素系Ｐ材〔［ミクロ−メディア（Ｍｉｃｒｏ　−ｍｅｄ
ｉａｏ）　Ｍ７０　Ｊエルテル　エンジニャリング社（
Ｅｒｔｅｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏ、）　）　
　で濾過した。この第１抽出液中のＨＡ濃度は０．９２
ｍ１／／ｍＩ！であった。　２１の抽出液をアセトン４
１および酢酸ナトリウム２０Ｉｉと混合した。白色繊維
状沈澱が得られ、これを集めアセトンで洗滌し、８５℃
の真空乾燥機中で乾燥し、１．７５９の生成物を得た。

生成物のへ中ソサミン／ヘキスロン酸比は１±０．０５
であった。生成物中のホルムアルデヒド含量は０．０１
５０％であることが判った。生成物はハイランと同定さ
れた。生成物中の蛋白質含量は０．３５％で極限粘度数
は４，８２０ｃｃ、々てあった。

第１抽出後のとさかを脱イオン水２．５１と混合し常温
で４８時間抽出を行った。上述の如くとさかを抽出液か
ら分離した。第２抽出液中のＨＡ濃度は０．６５　ｍｊ
ｉ／ｍｌであった。上述の沈澱法で抽出液から回収した
生成物は１．２６．ｐであった。この画分は又ホルムア
ルデヒド含量０．０１４％の化学的に修飾されたヒアル
ロン酸ナトリウムとして特徴づけられるものであった。

その蛋白質含量は０．２７％、極限粘度数は４，７２９
　ＣＣ／１であった。

０．１５モル食塩水中の１重量％溶液のロオロジー的性
質を測定し第１表に示した。

このとさかの第３回目の水抽出を上と同様に行った。第
３抽出液中のＨＡ濃度はＯ，ｆ３　Ｂ　ｍｌ／ｍｌで、
この抽出液から０．６０１のＨＡを回収した。

蛋白質含量は０．２０％、極限粘度数は４，８３０ＣＣ
Ｘ八　　ホルムアルデヒド含量は０．０１１５％であっ
た。

ｌ　Ｋ９の雄鶏のとさかから化学的に修飾したＨＡナト
リウムを合計３．６１．９得た。

実施例２ 実施例１と同様にして薄切りした雄鶏のとさか１〜を、
アセトンｌ　Ｋｙとグルタルアルデヒドの４０％水溶液
１５０．９との混合物に混合した。該混合物のｐＨは６
．９であった。該混合物をゆるく撹拌しつつ（約１ｒｐ
ｍ）常温（約２０℃）で１６時間放置した。とさかを液
から分離し、アセトンで洗滌し、元の重量の半分になる
まで風乾した。

乾燥とさかを脱イオン水３１にて約２０℃で９６時間抽
出した。抽出液を実施例１と同様にしてとさかから分離
して濾過した。抽出液中のＨＡ含量は１．４ｍｌ／ｍｌ
であった。実施例１と同様にしてアセトンで沈澱した生
成物は蛋白質含量が０．４２％、極限粘度数が８．ＴＯ
Ｏｃｃ／ｐであった。

実施例８ グルタルアルデヒド溶液の代りに同量のグリオキサール
４０重量％水溶液を用いた以外は実施例２と同様にした
。抽出液中のＨＡ含量は０．９２ｍ、！９／ｍｌであっ
た。生成物の蛋白質含量は０．５％、極限粘度数は３，
９８０ｃｃ／Ｉであった。

実施例４ 実施例１と同様にして雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理
した。とさかを元の重量の半分になるまで乾燥した後、
０．０５モル水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨは１１以上
）２．５１！で約２０℃。

１２０時間抽出した。抽出液は実施例１と同様にして分
離し、濾過した。抽出液中のＨＡ濃度は８、６　ｍｌ／
／ｍｅであった。アセトンと酢酸ナトリウムとの混合物
で沈澱して白色の生成物を得、アセトンで洗滌し乾燥し
た。蛋白質含量０．２％、極限粘度数１，３１０　ｃｃ
／ｊｉの生成物７．５１を回収した。

実施例５ 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、とさカｌ　Ｋ
９をインプロパツールＩＫｇ、８７％ホルマリン１００
，９．酢酸ナトリウム５０Ｉｉおよびクロロホルム１０
０ｙの混合物と混合した。処理はゆっくり撹拌しつつ約
２０℃で１６時間行った。実施例１と同様に抽出、沈澱
を行った。抽出液中のＨＡ濃度は０．６８　ｍｌ／ｍｅ
であった。生成物中の蛋白質含量は０．４６％、極限粘
度数は４．９００ｃｃ／Ｉであった。

実施例６ 雄鶏のとさかを実施例１同様洗滌し、冷凍し、スライス
し、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し、アセ
トンで６１し、乾燥し、水で抽出した。抽出液をアセト
ン２１！とクロロホルム１１！との混合物と混合した。

蛋白質含量０．０５％、極限粘度数４．４００ｃｃ／、
！ｉ＋の白色繊維状生成物１．９１を得た。

実施例７ 実施例１と同様にして作られた薄切りとさかＩＫＳＩ　
ヲ、アセトンＩ　Ｋ９と３７％ホルマリン５０ｊｉと酢
酸ナトリウム５０Ｉとの混合物でゆるく撹拌しつつ約２
０℃で２４時間処理した。抽出液を実施例１と同様に分
離し、濾過し、生成物を沈澱した。

蛋白質含量０．４５％、極限粘度数５，８００　ＣＣ／
ｌ　ｓ結合ホルムアルデヒドｏ、ｏｏｓ％の白色生成物
１．６Ｉを得た。

実施例８ アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを元の重量
の１７３まで乾燥し、水による第１回抽出を９６時間行
う以外は実施例１と同様の操作を行った。

第１回抽出液中のＨＡ濃度は１．０５　ｍ１Ｉｎ司であ
った。この抽出液からの？ｊ：、Ｐ、生成物は蛋白賃金
ｉ０．２５％、極限粘度数４，９８０ｃｃ／、９であっ
た。

この生成物の０．１５モル食塩水による１重量％溶液の
振動試験では０．０２０ヘルツの周波数の「クロスオー
バー点」を有していた。

第２回抽出液中のＨＡ濃度は（１，５８ｍ１／ｍｌであ
った。この抽出液からの両分（フラクション）は蛋白賃
金ｆｉ０．１９％、極限粘度数７，８００ｃｃ／１であ
った。結合ホルムアルデヒド含量は０．０１％であった
。振動試験による「クロスオーバー点」周波数は０．０
０５ヘルツであった。

一連の３回抽出で回収された化学的に咋飾されたＨＡの
合計は３．５ｙであった。

実施例９ 雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、スライス
したものｌ　Ｋ９をアセトンＩＫＳＩ、８７％ホルマリ
ン２００Ｉｉおよびクロロホルム１００Ｊ９と混合した
。混合物のｐＨは塩酸を加えて４．０に調整した。第１
回抽出液のＨＡ濃度は０．５８　ｍＩｉ／ｍｌ！であっ
た。抽出液から実施例１と同様にアセトン−酢酸ナトリ
ウムで沈澱させて生成物を回収した。

生成物の蛋白質含量は０．１２％で極限粘度数は４．０
２５　ＣＣ／ｌであった。生成物中の結合ホルムアルデ
ヒド含量は０．０２％であった。０．１５モル食塩水に
よる生成物１重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオ
ーバー点」周波数は０．００６ヘルツであった。

実施例１０ 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、スライスした
ものｌ　Ｋｙを、混合物のｐＨを水酸化ナトリウムで１
１．０に調整した以外は実施例１と同様にしてアセトン
−ホルムアルデヒド混合物、て処理した。とさかを実施
例１と同様に乾燥し、水で抽出した。抽出液のＥＩＡ濃
度は０．６９ｍｌ／ｍｌであった。アセトンの代りにイ
ンプロパツールを使用した以外は実施例１と同様にして
抽出液から生成物を沈澱させた。蛋白質含量０．４５％
、極限粘度数５，０５０　ｃｃ／ｇ、ホルムアルデヒド
含量０．０１２９６の白色繊維状物１．８．９を得た。

この生成物の０．１５モル食塩水中１重量％溶液の振動
試験に於ける「クロスオーバー点」周波数は０．０１２
ヘルツであった。

実施例１１ 本実施例は「ハイラン」からのゼリー状物質の製造を示
す。実施例１の第２回抽出液から得た沈澱生成物０．８
８．９を０．０５規定水酸化す）　ＩＪウム水溶液２８
．１．９と混合し、混合物を室温で６０分間撹拌した。

得られた粘稠溶液にジビニルスルホン０．２６ｇと０．
５規定水酸化ナトリウム水溶液ｔ、ｏｇとを加えた。得
られた混合物を１０分間撹拌し次いで室温で５０分間放
置した。弾力性のある無色透明のゲルを得た。ゲルを０
．５１！の０．１５モル食塩水中に入れ一夜放置した。

次いで高度に膨潤したゲルから過料の液体を除去し、新
しい食塩水０．５ｅをゲルに加え振の機上で２４時間放
置した。膨潤した不溶性物質から週刊の液体を除いてゼ
リー状の透明物質を得た。この生成物中のＨＡ濃度は０
．２７５重量％と測定された。この物質のレオロジー的
性質は第５．６及び７図に示した。

実施例１２　　（”ＣＨ２Ｏによる雄鶏とさかの処理）
放射性同位元素で標識されたパラホルムアルデヒド（１
４ＣＨ２０）（比放射能５００ｍＣ１／、９（Ｉ２ＣＮ
レイデイオケミカルズ、Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
））を、１規定水酸化ナトリウム水溶液１．０　ｍｌ！
を加えた８７重量％ホルムアルデヒド水溶液１．０　ｍ
ｌに５．Ｑｍｃｉに相当する量加えた。混合物をきっち
りと栓をした容器に入れ６０℃に加温しパラホルムアル
デヒドを溶解した。次いで混合物を０℃に冷却し１規定
の酢酸水溶液０．１　ｍＪで中和した。

得られた溶液の放射能は、１０ｍｒの［ハイドロツルア
−（Ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒ　）　Ｊ液状シンチレーショ
ン計数媒体（１ｉｑｕｉｄ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏ
ｎ　ｃｏｕｎｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）　（ナショナル嗜
ダイアノスチック）（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃ　）中で、外部標準法に基づく効率の補正をコ
ンピューターで行うリール・アイソキャップ３００液体
シンチレイション・カウンター（Ｓｅａｒｌｅ　ｌ５ｏ
ｃａｐ　３００　ＬｉｑｕｉｄＳｃｉｎｔｉｌａｔｉｏ
ｎ　Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて測定した。

ホルムアルデヒド濃度はクロモトロープ酸による比色法
で測定した。得られた溶液の比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は０．５５５　ｍＣｉ／　（ミ
リモ／Ｉ／　ＣＨ２０）であった。この標識されたホル
ムアルデヒド溶液をアセトン７．５，９．クロロホルム
Ｉ１１酢酸ナトリウム０．５Ｉと混合した。薄切りした
ｔｎ、鶏のとさか７．５．９をこの溶液と混合し約２０
℃で１８時間処理した。とさかを液から分離し、数回ア
セトンで洗滌し元の重量の１７２になるまで風乾した。

２回反復蒸溜水１５ｍＪをとさかに加え約２０℃で９６
時抽出を進めた。抽出液はとさかから分離し２紙〔ホワ
ットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）ト１α１〕を数枚重ねて
濾過した。同じ操作を繰返してとさかの第２抽出液を得
た。ＨＹは抽出液に酢酸ナトリウムを１！ｉ％溶液にな
る量と、９５％エタノールを４倍量加えて白色繊維状物
として沈澱した。繊維状物を分離し、アセトンで丁寧に
洗い、乾燥し再びＨＹ濃度が約１ｍｌ／ｍｌになるよう
水に再溶解した。ＭＹをその溶液から上記と同様にして
再沈澱し、再度アセトンで徹底的に洗い乾燥した。乾燥
物質を今−度蒸溜水に溶解してＨＹを０．８４ｍ１／ｍ
ｌ含有する溶液を得た。この溶液の比放射能を測定した
処１９４　ｄｐｍ／μ！ｉＨＹであった。この溶液の放
射能は、０．１５モルの食塩を含みｐ　Ｈ７，５の０．
０５モルリン酸Ｂ衝液への完全透析（ｅｘｈａｕｓｔｉ
ｖｅ　ｄｉａｌｙｓｉｓ）によって１０８　ｄｐｍ／（
μ、９　ＨＹ）に減少した。この溶液の放射能は４モル
濃度グアニジン塩酸塩に対する完全透析によって１０１
　ｄｐｍ／（μｙ　ＨＹ）にまで減少した。このことは
蛋白質が解離する条件下での溶液の処理後でもホルムア
ルデヒドは生成物中に残留していることを示している。

生成物について測定された放射能並びに出発物質のホル
ムアルデヒド溶液の比放射能に基づき、ＨＹに関係する
ホルムアルデヒド含有量は約０．２重量％と算出された
。放射性同位元素で標識されストレプトマイセスヒアル
ロニダーゼによる酵素的分解を受は易いＨＹと結合した
ホルムアルデヒドがどれくらいかを評価するため、ＨＹ
　Ｏ，８ｒＵ／ｍｌを含み１　、２５０ｄｐｍ／（１０
μｌ溶液）の放射能を持つ卵の溶液を作った。この溶液
２ｍｌ！にストレプトマイセス・ヒアルロニダーゼ、１
３８ＴＲＵ（マイルス　ラボラトリ−社（Ｍｉｌｅｓ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　、比活性度２
　、０００　ＴＲＵ／（ＩｎｇＨＡ　）、蛋白質加水分
解活性度が５×１０　単位／ＴＲＵ以下〕含んだクエン
酸−りん酸緩衝液（ｐＨ５，６）　０．１ｍｌ！を加え
た。同じ溶液の別の２ｍｌに酵素を含まない前記緩衝液
を０．１　ｍｌ！加えた。両方共２０時間かけて１．０
００倍量のクエン酸−りん酸緩衝液へ透析した。透析後
の上記２試料の容積は同じであった。

酵素処理しなかった試料はＨＹ濃度が０．７６ｍｌ１／
ｍｌ！　で放射能は５５２　ｄｐｍ／１０μｒ　Ｔ：あ
ツタ。

酵素処理した試料のＥ［Ａ濃度は検出レベル（１０ｔｔ
ｊｉ／ｍｌ）以下で放射能は４１４　ｄｐｍ／（１０μ
Ｊ溶液）であった。ヒアルロニダーゼに敏感な放射能は
２０ｄｐｍ／（μ、ｐＨｙ）でこれは面素的に消化し得
るＨ　Ｙに結合したホルムアルデヒド０．０４９重量％
に相当する。生成物のそのように標識された試料をゲル
　パーミェーション　クロマトクラフィーで分析した。

このクロマトグラフィはグリセリール−〇ＰＧ：（００
０（孔の大きさ２８６９±８．３％）（エレクトロヌク
レオニックス社（Ｅ！ｅ−ｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃ
ｓ、　Ｉｎｃ、）を充填した１、６×９０ｃｍのガラス
カラムを使用した。０．１５モル食塩を含む脱気した０
、０２モルはう酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）を溶ａ　（ｅ
ｌｕｔｉｏｎ）に使用した。カラムの排除容積（ｅｘｃ
ｌｕｄｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）（Ｖｏ）を分子［４×１０
　のＨＹ試料で測定し、カラムの全容積（Ｖｔ）をスク
ロースで測定した。溶離は６℃で１０ｍ１／時間　の流
速で行った。５ｍＪずつの分ｕｔｅ）及び酵素的消化か
、ＨＹとその放射能との両方を気孔容積の両分から除去
することが明らかになった。計算すると、気孔容積のＨ
Ｙと結合した比放射能は１４．６ｄｐｍ／（μ、ＦＨＹ
）で、これはポリマー中のホルムアルデヒド０．０３６
ｆｆｉ　ｆｆｉ％に対応することを示した。この数字は
透析実験で得た数値とよく一致する。

勿論本発明の思想及び範囲をいつ脱することなしに変形
、修飾することは可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はハイラン（ＨＹ）の０．１５モル濃度食塩水溶
液（１重量％）の粘度対剪断速度依存性を示すグラフ（
Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図はＨＹの０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の振動試験の結果を示す
グラフ（■は粘度、Ｆは位相角（ｐｈａｓｅ　ａｎｇｌ
ｅ　）　、　Ｇ’　は動的貯蔵弾性率（ｄｙｎａｍｉｃ
　ｓｔｏｒａｇｅ　ｍｏｄｕｌｉ）　、Ｇ”は損失弾性
率（１ｏｓｓ　ｍｏｄｕ’ｌｉ　）　）　、第３図はＨ
Ｙの０．１５モル濃度食塩水溶液（１ｍ８％）の緩和曲
線を示すグラフ、第４図はＨＹ（極限粘度数４，３００
ｃｃ　１０　）の０．１５モル濃度食塩水溶液（１重量
％）の相当球直径の分布を示すグラフ、第５図は）−Ｉ
Ａ（極限粘度数３，５６２ｃｃ　１０　）の０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分布を示
すグラフ、第６図は本発明によるゼリー状生成物の粘度
対剪断速度依存性を示すグラフ、第７図は本発明による
ゼリー状生成物の振動試験の結果を示すグラフ（■は粘
度、Ｆは位相角、Ｇ′は動的貯蔵弾性率、Ｇ　Ｉｔは損
失弾性率）、第８図は本発明によるゼリー状生成物の緩
和曲線を示すグラフである。 殉　　　（Ｘ）　　　　　屯　　　　％　　　　　Ｎ　
　　　ｂ５　　　　　　℃　　　　　　ゝ１　　　　　
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒアルロン酸ポリマー鎖に共有結合したアルデヒド
   架橋基が約０．００５〜０．０５重量％存在し、さらに
   ジビニルスルホンで架橋されていることを特徴とする化
   学的に修飾したヒアルロン酸。 ２、ヒアルロン酸ポリマー鎖に共有結合したアルデヒド
   架橋基が約０．００５〜０．０５重量％存在するヒアル
   ロン酸をアルカリ性条件下でジビニルスルホンでの架橋
   反応に付すことからなる化学的に修飾したヒアルロン酸
   の製法。 ３、架橋反応が室温で行われる特許請求の範囲第２項に
   記載の方法。