NL8600644A - Chemisch gemodificeerd hyaluronzuurpreparaat en werkwijze voor het winnen daarvan uit dierlijke weefsels. - Google Patents

Description

VO 7537

Chemisch gemodificeerd hyaluronzuurpreparaat en werkwijze voor het winnen daarvan uit dierlijke weefsels._

De uitvinding heeft betrekking op een chemisch gemodificeerd hyaluronzuurpreparaat, dat gekarakteriseerd wordt door nieuwe chemische, fysisch-chemische en Theologische eigenschappen, en een nieuwe werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijk preparaat.

5 Hyaluronzuur (verder aangeduid als HA) is een in de natuur voor komend glycosaminoglycan met hoog-molecuulgewicht, dat een repeterende disaccharide eenheid van D-glucuronzuur en N-acetylglucosamino-2-acet-amido-2-desoxy-D-glucose heeft, die verbonden zijn via een β 1-* 3 gluco-sidische binding. De disacchariden zijn met elkaar verbonden onder vor-10 ming van een niet-vertakte, niet-verknoopte polysaccharideketen door middel van Sl->- 4 glucosidische bindingen.

HA wordt aangetroffen in dierlijke weefsels zoals navelstrengen, vitreus vocht, gewrichtsvocht, hanekammen, huid, enz. Het molecuulge-wicht van gezuiverd HA is in de literatuur aangegeven in het bereik van 15 50.000 tot 8.000.000 afhankelijk van de bron, isolatiemethode en methode voor het bepalen van het molecuulgewicht [Balazs, E.A., Fed. Proceed.

17, 1086 - 1093 (1958)].

Er zijn verscheidene methoden voorgesteld voor het winnen en zuiveren van HA uit dierlijke weefsels en bacteriekweken. Daartoe be-20 horen enzymatische digestie van eiwitten [E.D.T. Atkins, C.F. Phelps en J.K. Sheehan, Biochem. J. 128, 1255 - 1263, (1972); R. Varma, R.S.

Varma, W.S. Alten en A.H. Wardi, Carbohydr. Res. 32, 386 - 395, (1974)]; behandeling met ionenuitwisselingsharsen [T.C. Laurent, J. Biol. Chem.

216, 263 - 271, (1955); E.R. Berman, Biochim. Biophys. Acta 58, 120 -25 122 (1962)]? precipitatie met kationogene surfactants [T.C. Laurent, M.

Ryan, en A. Pietruszkiewicz, Biochem. Biophys. Acta 42, 476 - 485 (I960)]; behandeling met trichloroazijnzuur [H. Hofmans, 0. Schmut, H. Sterk, en H. Koop, Naturforsch. 34c, 508 - 511 (1979); D. Schmut, en H. Hofmans, Biochim.Biophys.Acta 673, 192 - 196 (1981)]; preparatieve 30 dichtheidsgradiënt sedimentatie [P. Silpanata, J.R. Dunstone, A.G. Ogston, Biochem. J. 109, 43 - 50 (1968)];en elektrodepositie [S. Roseman, D.R.

Watson, J.F. Duff, en W.D. Robinson, Annals Rheumatic Diseases, 15, 67 - 68 (1955)]. Ook kan men een methode gebruiken die meerdere verschillende behandelingen omvat, bijvoorbeeld enzymatische digestie 35 en precipitatie met cetylpyridiniumchloride [J.E. Scott, Biochem. J., 62, 31 (1956)].

Ή .' ' - - 3 - 3 ♦ ---------- - ^ * » » 4 -2-

Het belangrijkste probleem dat men bij het winnen van HA uit biologische bronnen tegenkomt, betreft de afscheiding van het polymeer (HA) van eiwitten en andere biologische polymeren die samen met het HA uit het weefsel worden geëxtraheerd. Afhankelijk van het uitgangs-5 materiaal, kan de hoeveelheid ongewenste polymeren zeer groot zijn, waarbij deze de hoeveelheid HA meerdere malen overtreft. De bovenstaand vermelde methoden voor het winnen van HA worden alle voor de bereiding van HA in laboratoria gebruikt, maar kunnen nauwelijks voor produktie op grote schaal van HA worden toegepast vanwege de aan elk van die 10 methoden inherente, verschillende nadelen.

*

De meest geavanceerde methode voor het winnen van HA en zuiveren daarvan op industriële schaal wordt beschreven in het Amerikaanse oc-trooischrift 4.141.973 (E.A. Balazs). Volgens deze methode wordt een ultra-zuiver HA met een eiwitgehalte van minder dan 0,5 gew.% èn een 15 molecuulgewicht van meer dan 1.200.000 verkregen door extractie met water uit hanekammen of humane navelstrengen. Eiwitten en andere stoffen worden verwijderd door meerdere chloroformextracties bij variërende pH-waarden. In een chloroform extractie van het waterextract wordt een grensvlaklaag gevormd waarin gedenatureerde eiwitten en andere stoffen 20 worden verzameld. Sommige stoffen, bijvoorbeeld vetten, worden oplosbaar, waarschijnlijk in de chloroformfase. De werkwijze kan ook een behandeling omvatten met een proteolytisch enzym, bijvoorbeeld pronase.

Door verschillende zeer omslachtige behandelingen te combineren, is een werkwijze ontwikkeld waarmee men een pyrogeen-vrije, niet-inflam-25 matore fractie van HA kan verkrijgen. Dit produkt is momenteel in de £ handel verkrijgbaar als een 1 %-ige oplossing onder het merk Healon en wordt in visco-chirurgie toegepast, waar het weefsels beschermt tegen mechanische beschadiging, ruimte geeft en hantering van weefsels tijdens chirurgie mogelijk maakt (E.A. Balazs, Healon, J. Wiley and Son, 30 NY, 1983, biz. 5 - 28) .

Fig. 1 is een grafiek die de viscositeit versus afschuifsnelheid afhankelijkheid voor een 1 %-ige (betrokken op het gewicht) oplossing van HY in waterig 0,15 M NaCl toont (V = viscositeit? S = afschuif-spanning); 35 Fig. 2 is een grafiek die de resultaten toont van een oscillatie- test voor een 1 %-ige (betrokken op het gewicht) oplossing van HY in r. \ t f % * -3- waterig 0,15 M NaCl (V = viscositeit; F = fasehoek; G' = dynamische opslagmoduli; G" = verliesmoduli);

Fig. 3 is een. grafiek die de relaxatiekromme toont voor een 1 %-ige (betrokken op het gewicht) oplossing van HY in waterig 0,15 M 5 NaCl;

Fig. 4 is een grafiek die de verdeling van ESD toont voor een 1 gew.%-ige oplossing van HY (beperkend viscositeitsgetal 4.300 cc/g) in waterig 0,15 M NaCl;

Fig. 5 is een grafiek die de verdeling van ESD toont voor een 10 1 gew.%-ige oplossing van HA (beperkend viscositeitsgetal 3.562 cc/g) in waterig 0,15 M NaCl;

Fig. 6 is een grafiek die de viscositeit versus afschuifsnelheid afhankelijkheid toont voor een geltype produkt volgens de uitvinding;

Fig. 7 is een grafiek die de resultaten toont van een oscillatie-15 test voor een geltype produkt volgens de uitvinding (V = viscositeit; F = fasehoek; G' = dynamische opslagmoduli; G" = verliesmoduli);en

Fig. 8 is een grafiek waarin de relaxatiekromme voor een geltype produkt volgens de uitvinding wordt getoond.

In één aspect verschaft de onderhavige uitvinding een nieuwe 20 werkwijze voor de chemische modificatie in situ van HA in dierlijke weefsels voordat het daaruit wordt geëxtraheerd.

In een ander aspect verschaft de uitvinding een nieuwe werkwijze voor het winnen en zuiveren van het chemisch gemodificeerde HA uit dierlijke weefsels.

25 In weer een ander aspect verschaft de uitvinding een nieuw ultra- zuiver, pyrogeenvrij, niet-inflammator chemisch gemodificeerd HA dat ongeveer 0,005 tot 0,05 gew.% aldehyde verknopingsgroepen bevat, die covalent met de hyaluronzuur polymeerketens zijn verbonden.

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de vondst dat HA 30 chemisch in situ kan worden gemodificeerd voordat het uit dierlijke weefsels wordt geëxtraheerd door behandeling van het weefsel met een stof die met eiwittten en HA in waterige media reageert. Tot deze stoffen behoren formaldehyde, glutaaraldehyde, glyoxal, enz. Gevonden is dat deze chemische modificatie in situ sterke wijzigingen veroorzaakt 35 in de primaire structuur van het HA macromolecuul, in molecuulgrootte, inter- en intramoleculaire interacties en in de resulterende rheologi- * i i -4- sche eigenschappen van oplossingen die van het gemodificeerde produkt zijn bereid. Het is daarom gerechtvaardigd dat aan dit chemisch gemodificeerde HA een nieuwe naam wordt gegeven. De uitvinders hebben er voor gekozen om dit materiaal Hylan te noemen (verder aangeduid als HY). Wan-5 neer HA uit een dierlijk weefsel wordt geëxtraheerd, gaat gewoonlijk -een grote hoeveelheid eiwitten daarmee samen in oplossing. De hoeveelheid eiwit kan aanzienlijk variëren afhankelijk van de aard van het weefsel en de extractieparameters. In extractie van HA uit hanekammen kan de gewichtsverhouding van HA tot eiwitten variëren van 1 : 0,5 tot aan 10 1:4 (Amerikaans octrooischrift 4.303.676, Ξ.Α. Balazs). Het eerste probleem voor het winnen van zuiver HA uit dierlijk weefsel is derhalve de verwijdering van eiwitten. Gevonden is dat de bovenstaand vermelde voorafgaande behandeling van het weefsel een waterextract van HY geeft met een aanzienlijk lager eiwitgehalte dan bij afwezigheid van een derge-15 lijke behandeling.

De preciese aard van de chemische gebeurtenissen die bij de behandeling van het weefsel optreden, wordt niet volledig begrepen en daarom dient de uitvinding niet tot een specifieke chemische reactie beperkt te zijn. Gemeend wordt dat de eiwitten als gevolg van chemische 20 reacties tussen eiwitten in het weefsel en een reagens in het behande-lingsmengsel gedenatureerd worden en in de weefsels geïmmobiliseerd worden en daardoor in de daarop volgende waterige extractie onoplosbaar zijn.

Elke stof die met eiwitten in een waterig bevattend medium rea-25 geert kan voor het doel van de onderhavige uitvinding worden gebruikt. Gevonden is dat de meest gunstige stof formaldehyde is. Andere aldehyden zoals glutaar-aldehyde of glyoxal kunnen eveneens in de methode volgens de onderhavige uitvinding worden toegepast,

De behandeling van het weefsel kan worden uitgevoerd in een op-30 lossing van het reagens in water. Wanneer dit échter wordt gedaan, zal er een aanzienlijk verlies van HY plaatsvinden vanwege zijn goede oplosbaarheid in water. Om deze reden heeft het de voorkeur dat de behandeling van het weefsel wordt uitgevoerd in een mengsel van water en een met water mengbaar organisch oplosmiddel. Het oplosmiddel dient niet te 35 reageren met het voor de immobilisatie van het eiwit toegepaste reagens. Tot deze oplosmiddelen behoren lage ketonen zoals aceton of methylethyl-keton, alcoholen zoals ethanol of isopropanol, aprotische oplosmiddelen : / ' a 4 * ♦ -5- zoals dimethylformamide, dimethylacetamide of dimethylsulfoxyde en anderen. Wanneer een dergelijk oplosmiddel wordt gemengd met een weefsel dat een grote hoeveelheid water bevat, gewoonlijk 80 - 90 % of meer, betrokken op het gewicht, werd een water-oplosmiddelmengsel gevormd, 5 De water-oplosmiddelverhouding in het mengsel kan op elke gewenste waarde worden ingesteld door de oplosmiddel/weefselverhouding te veranderen of door aan het mengsel water toe te voegen. De geprefereerde water/oplosmiddelverhouding wordt bepaald door de oplosbaarheid van HY in die zin dat het HY niet oplosbaar moet zijn in het mengsel dat voor 10 de behandeling van het weefsel wordt gebruikt. De oplosbaarheid van HY hangt af van het gebruikte type oplosmiddel, de water/oplosmiddelverhouding, de aanwezigheid en concentratie van eventueel elektrolyt in het mengsel en de pH van het mengsel. De oplosbaarheid van HY kan aanzienlijk worden verkleind door een elektrolyt in het mengsel te brengen. Elk 15 type elektrolyt kan worden gebruikt dat in het water-oplosmiddelmengsel oplosbaar is en dat de gewenste pH van het mengsel geeft. Wanneer bijvoorbeeld aceton als oplosmiddel wordt gebruikt kan natriumacetaat geschikt als oplosbare elektrolyt worden toegepast.

De samenstelling van het mengsel voor het behandelen van het 20 weefsel kan over een breed bereik variëren afhankelijk van de aard van het weefsel, het gebruikte type oplosmiddel, het type elektrolyt enz.

Zoals bovenstaan vermeld dient HY uit het weefsel niet in het behandelingsmengsel oplosbaar te zijn, maar het laatstgenoemde mengsel dient voldoende water te bevatten opdat het weefsel kan zwellen waardoor de 25 reactie tussen het reagens en de weefselpolymeren wordt bevorderd. Gevonden is dat in het geval van hanekammen als bron van HY, de samenstelling van het mengsel, rekening houdend met het uit de hanekammen afkomstige water, in het volgende bereik kan liggen, uitgedrukt in gewichts-procenten: water 10 - 50, oplosmiddel 40 - 85, elektrolyt 0-20, 30 reagens 0,2 - 10. Meerdere verschillende oplosmiddelen kunnen in hetzelfde behandelingsmengsel worden toegepast, indien dat gewenst is.

Het is gunstig gebleken om in het behandelingsmengsel kleine hoeveelheden van niet met water mengbare oplosmiddelen zoals chloroform te gebruiken. Het gehalte van deze oplosmiddelen in het mengsel kan 0,5 tot 35 10 gew.% bedragen.

De pH van het behandelingsmengsel kan worden gevarieerd afhankelijk van de aard van de reagens, de samenstelling van het mengsel, de • · * - · — j * i ï -6- temperatuur en de tijdsduur van de behandeling. Bij het winnen van HY uit dierlijke weefsels volgens de onderhavige uitvinding, zijn de volgende overwegingen van groot belang. Sommige van de reagentia, formaldehyde bijvoorbeeld, kunnen reageren met hydroxylgroepen van HA 5 macromoleculen bij lage pH onder vorming van een verknoopt polymeer dat in water onoplosbaar is. Een langdurige behandeling in een medium met een betrekkelijk hoge pH leidt tot de afbraak van HA waardoor slechts een polymeer met laag molecuulgewicht kan worden gewonnen. Gevonden is dat wanneer een aldehyde type reagens wordt gebruikt volgens 10 de onderhavige uitvinding, de beste resultaten worden verkregen met een pH die dichtbij het neutrale punt ligt, bijvoorbeeld in het bereik van 4 tot 10.

De verhouding van het behandelingmengsel tot het weefsel kan over brede bereiken variëren. De ondergrens wordt gewoonlijk bepaald door de 15 bedoeling dat het weefsel, dat in het geval van hanekammen nog al omvangrijk is, ten minste volledig door het mengsel wordt bedekt. De bovengrens kan worden gekozen op basis van economische overwegingen.

Bij de behandeling van hanekammen volgens de onderhavige uitvinding, is de verhouding van het behandelingsmengsel tot het weefsel (berekend 20 op het droge gewicht van het weefsel) gewoonlijk meer dan 10 : 1.

De temperatuur heeft invloed op de efficiëntie van de behandeling volgens de onderhavige uitvinding. Omdat HY echter bij verhoogde temperatuur gevoelig is voor hydrolyse, heeft het de voorkeur dat de behandeling wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur of lager om een produkt met 25 hoog molecuulgewicht te verkrijgen.

De tijdsduur die nodig is om de behandeling uit te voeren hangt van vele factoren af, met inbegrip van de samenstelling van het mengsel, de aard van het weefsel, de temperatuur, enz. Aangenomen wordt dat de beperkende factor in de behandeling de diffusie van het reagens in de 30 weefselstukjes is. Om deze reden is de grootte van deze weefselstukjes een belangrijke parameter. Gevonden is dat bij de behandeling van hanekammen, die tot schijfjes met een dikte van 1-3 mm zijn gesneden, de behandelingsduur in het bereik van 4-24 uur kan liggen.

Het als bovenstaand beschreven behandelde weefsel wordt daarna 35 gewassen met een oplosmiddel of een oplosmiddel/watermengsel om de overmaat van het behandelingsmengsel van het weefsel te verwijderen. Hiervoor kan geschikt hetzelfde oplosmiddel worden gebruikt als in het mengsel voor de behandeling van het weefsel. Elk aantal wasbehande- i 3 -7- lingen kan worden toegepast, maar gevonden is dat één wasbehandeling bevredigende resultaten geeft.

Het gewassen weefsel wordt daarna direct geëxtraheerd met water om het HY te winnen. Gevonden is dat de efficiëntie van de extractie 5 afhangt van de water/weefselverhouding, de pH van de extractiemedia, de temperatuur en de tijdsduur. Ook is gevonden dat de efficiëntie van de extractie van het behandelde weefsel aanzienlijk kan worden vergroot door het behandelde weefsel eerst te drogen om het oplosmiddel te verwijderen dat in de behandeling en in de wasstappen was gebruikt.

10 De beste resultaten worden verkregen wanneer het weefsel tot een kwart tot een half van zijn oorspronkelijke gewicht wordt gedroogd.

De water/weefselverhouding in de extractiestap wordt gekozen op basis van verscheidene overwegingen. Op de eerste plaats dient er voldoende vloeibare fase te zijn om het weefsel tijdens de extractie te 15 bedekken. Anderzijds dient de hoeveelheid water niet te groot te zijn zodat men een zo hoog mogelijke concentratie van HY in het extract kan bereiken waardoor de hoeveelheid precipitatiemiddel in de volgende stap van de werkwijze wordt verminderd. Gevonden is dat in het geval van hanekammen de geprefereerde verhouding van water tot weefsel 2-5 be-20 draagt, gebaseerd op het gewicht van de niet-behandelde hanekammen.

De pH van de extractiemedia kan neutraal, zuur of basisch worden gehouden afhankelijk van de gewenste kwaliteit van het eindprodukt. Gevonden is, dat voor het verkrijgen van een produkt met ultra hoog molecuulgewicht, de pH van de extractiemedia in het bereik van 6-8,5 25 dient te liggen. Een hogere pH leidt tot een toename van de HY concentratie in het extract maar tegelijkertijd tot een afname van het mole-cuulgewicht van het produkt en tot veranderingen van andere polymeer-eigenschappen die onderstaand in groter detail zullen worden besproken.

In elk geval kan men door regeling vein de pH tijdens de extractiestap 30 de eigenschappen van het eindprodukt gemakkelijk regelen in een gewenste richting.

Het heeft de voorkeur dat het behandelde weefsel wordt geëxtraheerd bij een temperatuur beneden 25°C omdat de afbraak van HY bij hogere temperaturen tot een aanzienlijke daling van het molecuulgewicht 35 van het polymeer kan leiden.

De tijdsduur die nodig is voor het extraheren van de maximale

V V

-8- hoeveelheid ΗΥ uit het behandelde weefsel varieert aanzienlijk met andere extractieparameters zoals pH, vloeistof/weefselverhouding en roer-intensiteit. Gevonden is dat in de extractie van hanekammen met water, goede resultaten kunnen worden verkregen wanneer de behandelde hane-5 kammen gedurende 6 uur tot verschillende dagen worden geëxtraheerd.

Het mengsel van behandeld weefsel en extractiemedia kan tijdens de extractie worden geroerd of zonder roeren met rust worden gelaten.

Het zal duidelijk zijn dat door roeren de diffusiesnelheid van HY. mole-. culen vanuit het weefsel naar het extract zal worden vergroot. Ander-10 zijds kan heftig roeren leiden tot afbraak van HY en derhalve tot een afname van het molecuulgewicht. Bovendien is gevonden dat heftig roeren desintegratie van het weefsel veroorzaakt waardoor het lastig wordt om het weefsel van het extract af te scheiden. Het heeft daarom de voorkeur dat de extractiestap wordt uitgevoerd zonder dat geroerd wordt of 15 met slechts zeer langzaam en zacht roeren.

Na extractie wordt het weefsel van het extract afgescheiden met behulp van een willekeurige conventionele methode zoals filtratie, cen-trifugatie, decantatie en dergelijke. Gevonden is dat de meest eenvoudige en economische wijze van afscheiding filtratie is. Afhankelijk van 20 de als uitgangsmateriaal toegepaste soort weefsel, het de voorkeur kan hebben om een tweetraps filtratie toe te passen. In het geval van hanekammen kunnen aldus gemakkelijk grote stukken weefsel door filtratie worden afgescheiden door een nylon gaas en kan een fijne zuivering van het extract worden gerealiseerd door filtratie door een willekeurig 25 dicht filtermedium, bijvoorbeeld een cellulosemateriaal.

De HY concentratie in het extract hangt af van vele factoren met inbegrip van de pH tijdens de extractie, de tijdsduur, de vloeistof/ weefselverhouding, en de roerintensiteit. Gewoonlijk ligt hij in een bereik van 0,3 - 3,0 mg/ml en soms zelfs nog hoger. In sommige gevallen, 30 wanneer de HY concentratie in het extract aan de lage kant is, is het wenselijk gebleken om een tweede extractie van het weefsel uit te voeren. Ook is gevonden dat het uit het tweede extract neergeslagen produkt gewoonlijk een hoger molecuulgewicht heeft dan het uit het eerste extract verkregen HY. Dit kan worden verklaard door het feit dat HY fracties 35 met laag molecuulgewicht gemakkelijker uit het weefsel in het extract diffunderen en dat het uit het eerste extract neergeslagen produkt aan j 5 Λ -9- deze fracties verrijkt is.

Men kan meer dan twee extracties toepassen om een zo hoog mogelijke opbrengst te realiseren, maar de concentratie van HY in een extract neemt met elke volgende extractie af.

5 HY kan uit de filtraten worden gewonnen volgens elke op zichzelf bekende methode. De meest geschikte methode is precipitatie met een met water mengbaar oplosmiddel zoals aceton, ethanol, isopropanol enz.

De precipitatie kan worden uitgevoerd in aanwezigheid van een zuur zoals waterstofchloride, zwavelzuur, fosforzuur, enz,, of in tegenwoordigheid 10 van neutrale elektrolyten zoals natriumacetaat, natriumchloride en hun zouten. HY en zijn zouten worden gewoonlijk neergeslagen als een wit vezelachtig materiaal of als een poeder. Het precipitaat kan met hetzelfde oplosmiddel worden gewassen dat voor de precipitatie is gebruikt, of met elk ander oplosmiddelmengsel waarin het produkt niet oplost, bij-15 voorbeeld ether. Het gewassen produkt kan worden gedroogd met elk conventioneel middel of kan onder een laag oplosmiddel zoals aceton, ethanol, enz. worden bewaard. Ook kan het filtraat worden gevriesdroogd.

Het is duidelijk dat eventuele additionele stappen die op zichzelf bekend zijn en in de HA-zuivering worden gebruikt, in de werkwijze 20 volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden opgenomen zonder dat daardoor de omvang van de uitvinding wordt beperkt. Voor het verwijderen van pyrogene of inflammatore middelen bijvoorbeeld, kan een extractie worden gebruikt met op zichzelf bekende oplosmiddelen zoals chloroform, waarin HY onoplosbaar is maar lipoproteinen, glycolipiden of glycolipo-25 proteïnen oplosbaar zijn of worden afgescheiden.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding maakt het mogelijk dat HY-produkten worden verkregen met eigenschappen die over een breed bereik variëren. De volgende eigenschappen werden onderzocht. De geciteerde methoden werden gebruikt om de volgens de onderhavige uitvinding 30 verkregen produkten te karakteriseren.

De HY-concentratie in oplossingen werd bepaald door hexuronzuur-analyse volgens de geautomatiseerde carbazoolmethode [E.A. Balazs, K.O. Bemtsen, J. Karossa en D.A. Swann, Analyt. Biochem. _12, 547 - 558(1965)]

Het hexosaminegehalte werd bepaald met de geautomatiseerde colorimetri-35 sche methode [D.A. Swann en E.A. Balazs, Biochem. Biophys. Acta 130, 112 - 129 (1966)]. Het eiwitgehalte van HY-oplossingen werd bepaald met t t -10- de fenolreagensmethode [Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 - 275)].

Het formaldehydegehalte in het produkt werd bepaald door hydrolyse van ongeveer 0,1 g van het monster in 10 ml 10 %-ig waterig zwavelzuur gedurende 2 uur onder koken, gevolgd door stoomdestillatie om vrij 5 formaldehyde uit de verkregen oplossing te verwijderen, en bepaling van formaldehyde in het destillaat met behulp van een colorimetrische methode met chromotropinezuur [M.J. Boyd en M.A. Logan, J. Biol. Chem-, 146, 279 (1942)].

Het beperkend viscositeitsgetal (intrinsieke viscositeit) gedefi-10 nieerd als lim (n/no - l)/c waarin n en no de viscositeiten van de oplossing respectievelijk het oplosmiddel voorstellen en c de concentratie van HY in g/cm3voorstelt. De metingen werden uitgevoerd in waterige 0,20 M NaCl-oplossingen in een Ubbelohde capillair type verdunnings- viscosimeter. Het viscositeitsgemiddelde molecuulgewicht wordt berekend 0 81 15 door de vergelijking [n] = 0,0228 M ' [R.C. Cleland en J.L. Wang,

Biopolymers 9_, 799 (1970)].

Het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht wordt bepaald door de lage hoek laserlicht-verstrooiingsmethode onder toepassing van een Chromatix KMX-6 instrument, uitgerust met een helium-neon laser inge-20 steld op 632,8 nm. Het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht wordt ook berekend uit de sedimentatie- en diffusieconstanten, die bepaald zijn in een analytische ultra-centrifuge.

De dynamische lichtverstrooiingsmethode wordt gebruikt om de aggregatie van de moleculen in relatief geconcentreerde oplossingen van 25 HY te onderzoeken. Deze methode geeft de verdeling van equivalente sferische diameters (ESD) in oplossing.

Fheologische eigenschappen werden onderzocht met het Bohlin rheometersysteem dat een computer-gestuurde rheometer is die op drie manieren kan werken: viscometrie, oscillatie en relaxatie. De volgende 30 parameters worden voor de HY-oplossing gemeten: viscositeit voor het brede bereik van afschuifsnelheden, dynamische viscositeit, dynamische opslagmoduli en dynamische verliesmoduli voor verschillende oscillatie-frequenties en relaxatietijd.

Zoals bovenstaand vermeld is het produkt volgens de onderhavige 35 uitvinding (HY) een nieuw polymeer, verkregen als gevolg van een in situ chemische reactie tussen HA en een verknopingsmiddel zoals form- 2 -i -11- aldehyde . Door chemische analyse van HY is gevonden dat het gehalte van het gecombineerde formaldehyde in produkten verkregen uit de met een formaldehyde-bevattend mengsel behandelde hanekammen/ in het bereik van 0,005 - 0,02 gew.% lag, berekend op het gewicht van het polymeer, af- 5 hankelijk van de verschillende behandelingsparameters.

De aanwezigheid van gecombineerd formaldehyde in het produkt werd ook vastgesteld door een experiment waarin de behandeling werd uitgevoerd 14 met radio-isotoop gelabeld formaldehyde CH^O (zie onderstaand voorbeeld XII). De resultaten van het experiment laten zien dat het volgens de uit-10 vinding verkregen produkt gecombineerd formaldehyde bevatte dat door herhaalde precipitaties of door uitputtende dialyse van de polymeeroplossin-gen niet kon worden 'verwijderd. Dit is een sterk bewijs voor de aanwezigheid van een covalente binding van formaldehyde aan de polymere moleculen van het produkt. Teneinde te onderzoeken of formaldehyde specifiek 15 met HA wordt gecombineerd, werd laatstgenoemde behandeld met bacteriële of bloedzuigerhyaluronidases, enzymen die specifiek HA afbreken. De resultaten van deze behandeling lieten zien dat een aanmerkelijke hoeveelheid formaldehyde covalent direct met de HY - macromoleculen was verbonden.

20 Het eiwitgehalte in het volgens de onderhavige uitvinding ver kregen produkt is gewoonlijk niet meer dan 0,5 %, berekend op het gewicht van een droog polymeer, en kan slechts 0,1 % of zelfs nog minder zijn.

De chemische modificatie van hyaluronzuur door covalente bevesti-25 ging van een verknopingsmiddel aan zijn macromoleculen, met andere woorden de veranderingen in de primaire structuur van het polymeer, hebben een grote invloed op zijn fysisch-chemische parameters, zoals molecuul-gewicht en molecuulgrootte, intermoleculaire interactie, alsook op de rheologische eigenschappen van polymeeroplossingen.

30 Volgens de onderhavige uitvinding verkregen HY kam een zeer hoog molecuulgewicht bezitten. Het beperkende viscositeitsgetal kan hoger dan 7000 cm3/g zijn, hetgeen correspondeert met een viscositeits- 6 gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 6x10 . Het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht uit de licht-verstrooiingsgegevens kan een waarde van g 35 13 x 10 bereiken. Gevonden is dat dit verschil tussen het gewichts- geraiddelde en het viscositeitsgemiddelde molecuulgewicht zeer betekenis -12- 7 ΐ vol is zoals onderstaand zal worden besproken. Qpgemerkt wordt dat een g polymeer met aanzienlijk lager molecuulgewicht, bijvoorbeeld 1 x 10 of lager, gemakkelijk met de methode volgens de onderhavige uitvinding kan worden bereikt, indien men dat wenst. Ook kan een polymeer met elk 5 gewenst molecuulgewicht worden verkregen wanneer HY, op enig moment bij zijn winning en zuivering, wordt blootgesteld aan middelen waarvan bekend is dat ze de glucosidische binding van de polysaccharideketen verbreken. Dergelijke op zichzelf bekende middelen zijn specifieke enzymen, bijvoorbeeld hyaluronidase, systemen die vrij radicalen genereren, af-10 schuifkrachten, warmte, sterke basen en zuren, enz.

Het partiële specifieke volume (psv) van HY in oplossing hangt af van de ionsterkte van de oplossing. Door densitometrie werd voor een HY-oplossing in water die 0,15 M NaCl bevatte in het concentratiebereik van 0 tot 0,5 mg/ml werd deze bepaald en bleek 0,627 cm3/g te zijn.

15 De verdeling van ESD voor een monster van HY, opgelost in 0,15 M NaCl-oplossing in 1 %-ige oplossing, wordt in fig. 4 getoond. Uit de getoonde gegevens is duidelijk dat HY in een zeer sterk geaggregeerde vorm bestaat, hoewel deze aggregaten stabiel zijn en niet sedimenteren.

De rheologische eigenschappen van een typisch produkt met ultra-20 hoog molecuulgewicht, bereid volgens de onderhavige uitvinding, worden in de figuren 1-3 getoond. Gevonden is dat dit produkt oplossingen (0,5 gew.% en hoger) vormt met opmerkelijke visco-elastische eigenschappen .

De volgende parameters karakteriseren de elastische eigenschap-25 pen van de polymeeroplossingen op de beste wijze: dynamische opslag-moduli (G1), de frequentie van "cross-over point" (een punt waarbij de dynamische opslagmodulus G' groter wordt dan de dynamische verlies-moduli G"), fasehoek en relaxatietijd.

HY vormt zeer visceuze oplossingen in water of oplossingen van 30 elektrolyten in water. De viscositeit van de oplossing hangt af van de polymeerconcentratie, het elektrolytgehalte, de temperatuur en neemt af met de afschuifsnelheid, dat wil zeggen de HY-oplossingen hebben een aanzienlijke pseudoplasticiteit.

Wanneer de rheologische eigenschappen van HY-oplossingen worden 35 bezien, dient men te begrijpen dat deze eigenschappen in hoge mate afhankelijk zijn van het molecuulgewicht van het produkt, zoals ook het a 2 -13- geval is bij andere polymeren. Bovenstaand werd aangegeven dat HY kan worden verkregen met een molecuulgewicht dat over een breed bereik varieert en dat de rheologische eigenschappen dienovereenkomstig zullen variëren. Gevonden is dat voor het produkt met ultra-hoog molecuulgewicht 5 (beperkend viscositeitsgetal groter dan 4500 cm3/g) de viscositeit van een 1 gew.%-ige oplossing in 0,15 M NaCl-oplossing in water tot 1000 Pa.s is en zelfs hoger is bij een afschuifsnelheid van 0,055, terwijl hij slechts ongeveer 2 Pa.s bedraagt voor een 1 gew.%-ige oplossing van polymeer met een beperkend viscositeitsgetal van ongeveer 1000 cm3/g.

10 Gevonden is dat de elastische eigenschappen van HY-oplossingen ook afhankelijk zijn van het molecuulgewicht van het polymeer. De dynamische opslagmodulus G' voor een 1 gew.%-ige oplossing van HY met ultra-hoog molecuulgewicht in 0,15 M NaCl bedraagt ongeveer 40 Pa bij een frequentie van 0,01 Hz, terwijl hij slechts ongeveer 0,2 Pa is voor een oplos-15 sing van HY met een beperkend viscositeitsgetal van ongeveer 1000 cm3/g.

De frequentie van het "cross-over point" dat op een zeer goede wijze ie verhouding karakteriseert tussen elastische en visceuze eigenschappen van polymeeroplossingen, is gewoonlijk minder dan 0,025 Hz voor 1 gew.

%-ige HY-oplossingen in 0,15 M NaCl bij 25 °C wanneer het molecuul- 6 20 gewicht van het polymeer in het bereik van ongeveer 1,5 x 10 tot 8 x g 10 en hoger ligt.

De fysisch-chemische en rheologische eigenschappen van een HY-monster en zijn oplossing, werden vergeleken met dezelfde eigenschappen van een HA-produkt, verkregen volgens een welbekende methode, en worden 25 in tabel A en de figuren 4 en 5 getoond. Het ter vergelijking toegepaste produkt is HA,gewonnen uit hanekammen door extractie met water, gevolgd door deprotexnisatie met de zogenaamde Sevag procedure, die verschillende chloroformextracties omvat iG. Blix, 0. Shellman, Arkiv for Kemi,

Mineral Geol. 19A, 1 (1945)].

-14- TABEL A.

vergelijkende fysisch-chemische en rheologische gegevens _voor HY en HA monsters.__ 5

Parameter HY HA

beperkend viscositeitsgetal, cm3/g 4729 3562 molecuulgewicht uit viscosimetrie- data, x 10δ 3,28 2,30 10 molecuulgewicht uit lichtverstrooiings- data, x 10δ 13,30 2,86 molecuulgewicht uit sedimentatie- diffusie-data, x 10δ (PSU) 13,60 2,14 partieel specifiek volume, cm3/g 0,627 0,570 15 rheologische eigenschappen van 1 gew.% oplossing in 0,15 M waterig NaCl: afschuifviscositeit bij afschuifsnelheid 0,055-1, Pa.s. 969 305 dynamische opslagmoduli (G') bij frequentie 20 0,01 Hz, Pa 39,8 10,1 frequentie bij "cross-over point", Hz 0,0056 0,035

Relaxatietijd voor halvering van de moduli 58 19 fasehoek, graden bij frequentie 0,002 Hz 58,7 76 25 bij frequentie 10 Hz 8,5 12

De in tabel A en in fig. 4 getoonde data laten duidelijke verschillen tussen HY en HA zien. Op de eerste plaats hebben het viscosi-teitsgemiddelde molecuulgewicht en gewichtsgemiddelde molecuulgewicht 30 voor het bekende produkt nagenoeg dezelfde waarden (het gewichtsgemid-delde molecuulgewicht is een klein beetje lager) , terwijl voor het produkt volgens de uitvinding het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht ongeveer 4 x zo groot is als het viscositeitsgemiddelde molecuulgewicht. Op de tweede plaats bewijst de grotere waarde voor psv van de HY-oplossing 35 vergeleken met HA dat HY-macromoleculen een grotere afmeting hebben.

Op de derde plaats leidt de aggregatie van HY-macromoleculen in oplos- m β -15- sing tot aanzienlijk grotere aggregaten in vergelijking tot HA-oplos-singen, waardoor niet alleen grotere afmetingen van HY-macromoleculen worden gesuggereerd, maar ook veel sterkere intermoleculaire interactie. Tenslotte zijn HY-oplossingen aanzienlijk visceuzer en elas-5 tischer dan even sterk geconcentreerde oplossingen van HA. Hoewel de grotere viscositeit kan worden toegeschreven aan een groter viscosi-teitsgemiddeld molecuulgewicht, kan de waargenomen dramatische toename van de elasticiteit nauwelijks door dezelfde factor worden verklaard.

Al deze waarnemingen hebben de uitvinders doen concluderen dat 10 de chemische modificatie van hyaluronzuur in situ voorafgaande aan zijn extractie uit het weefsel, hoewel resulterende in slechts ondergeschikte wijzigingen van de chemische samenstelling van het polymeer, tegelijkertijd enkele dramatische wijzigingen teweegbrengt in de fysisch-chemische parameters en rheologische eigenschappen. Dit kan alleen optreden wan-15 neer de verandering van chemische samenstelling correspondeert met enkele belangrijke veranderingen in de macromoleculaire structuur.

De gedaante en conformatie van HA-macromoleculen in oplossing is met verschillende methoden bestudeerd en er bestaat een grote hoeveelheid literatuur over dit onderwerp. Deze onderzoeken laten zien dat de 20 macromoleculen een uitgestrekte random spiraalconfiguratie hebben en met elkaar een relatief kleine (bijvoorbeeld 0,1 %) concentratie van het polymeer in de oplossing verwarren. Bij hogere concentratie wordt gemeend dat de oplossing een continu drie-dimensionaal netwerk van poly-meerketens bevat. De glucosidische bindingen in de HA-macromoleculen 25 bleken een aanzienlijke stijfheid, te bezitten. Verschillende mechanismen zoals oplosmiddel-opgeloste stof interactie, interactie met kleine hoeveelheden eiwitten die in vele HA-preparaten aanwezig zijn, en interacties tussen de ketens, zijn voorgesteld om deze verschijnselen te verklaren (Zie bijvoorbeeld E.A. Balasz, Physical Chemistry of Hyaluronic 30 Acid, Fed. Proceed., _T7, 1086 - 1093 (1958)]. sommige schrijvers hebben een dubbele helix structuur voor HA-macromoleculen voorgesteld en gesuggereerd dat dubbele helische segmenten de rol van verknopingen zouden kunnen spelen die de ongewone rheologische eigenschappen van HA-oplos-singen verschaffen [C.M. Dea, R. Moorhous, D.D. Rees, S. Arhott, j.M.

35 Guss en E.A. Valazs, Sciense, 179, 560 - 562 (1972) ; S. Amott, A.R.

Mitra en S. Raghunatan, J. Mol. Biol. 169, 861 - 872(1983)].

-16-

Deze onderzoeken en waarnemingen in aanmerking nemend, zijn de onderhavige uitvinders gekomen tot een hypothese dat het produkt volgens de onderhavige uitvinding (HY) een extra aantal verknopingen kan bevatten, die tijdens de behandeling van het weefsel met een eiwit-verknopend 5 immobilisatiemiddel zijn geïntroduceerd. De volgens de onderhavige uitvinding toegepaste middelen zoals formaldehyde, zijn zeer reactief ten opzichte van verschillende chemische groepen, waarbij hun reactiviteit in hoofdzaak afhangt van reactieconditi.es zoals pH, temperatuur, concentratie enz. De hydroxyIgroepen van hyaluronzuur reageren duidelijk niet 10 met deze middelen onder de behandelingscondities omdat het na de behandeling verkregen produkt steeds in water oplosbaar is en derhalve geen aanzienlijke mate van verknoop: polymeer bevat. De hoeveelheid extra verknopingen die in het polymeer is geïntroduceerd tijdens de behandeling, is waarschijnlijk voldoende klein opdat geen onoplosbaarheid van poly-15 meer wordt veroorzaakt, maar voldoende significant om een aanzienlijke vergroting van de interactie tussen macromoleculen te geven en dienovereenkomstig de elasticiteit van de polymeeroplossing te verklaren. Verschillende candidaten voor een dergelijke reactie met een behande-lingsmiddel zijn de acetamidogroepen van hyaluronzuur, niet-geacetyleer-20 de aminogroepen die in kleine hoeveelheden in hyaluronzuur aanwezig kunnen zijn, een amido, amino en andere reactieve groepen van eiwitten die in de intercellulaire matrix van het weefsel tijdens de behandeling aanwezig zijn. Het is niet erg waarschijnlijk dat de acetamidogroepen van HA zelf intermoleculaire verknoping kunnen geven. In de onderzoeken van 25 de reactie van eiwitten met formaldehyde (zie bijvoorbeeld J.P. Walker, Formaldehyde, Reinhold Publ. Corp., NY, 1953, blz. 312 - 317) werd gevonden dat amidegroepen van een eiwit zelf geen verknoping konden geven en één van de meest waarschijnlijke reacties in de verknopingsvorming is een reactie van formaldehyde met aminogroepen waarbij N-methylol-30 aminogroepen worden verkregen die op hun beurt met amidegroepen reageren.

Derhalve zijn twee mechanismen mogelijk voor het introduceren van een beperkt aantal verknopingen in HA-macromoleculen. Het eerste mechanisme omvat een reactie tussen een verknopingsmiddel zoals form-• aldehyde en acetamido en vrije aminogroepen van HA, het bestaan waar- 35 van in HA zeer waarschijnlijk is [E.A. Balazs, Fed. Proceed. 25, 1817 - 1822 (1966)].

-17-

Het tweede mogelijke mechanisme suggereert de deelneming van eiwitten of polypeptiden in de verknopingsreactie. In literatuurrapporten wordt volgehouden dat eiwitten of polypeptiden covalent aan het HA-mole-cuul zijn gebonden [Yuko Mikum-Takagaki en B.P. Toole, J. Biol. Chem.

5 256 (16), 8463 - 8469 (1981)] of op een andere wijze met HA-moleculen kunnen zijn verbonden. In dit geval kunnen verknopingen worden gevormd tussen één HA-macroraolecuul en een eiwitgroep en een ander HA-macro-molecuul, of tussen een covalent met twee HA-macromoleculen verbonden eiwit.

1Ó Geen van deze mechanismen moet worden geacht de onderhavige uit vinding te beperken. Andere mechanismen voor het introduceren van kleine hoeveelheden covalente verknopingen in het produkt volgens de onderhavige uitvinding zijn mogelijk.

In elk geval is het essentiële kenmerk van de onderhavige uitvin-15 ding de chemische modificatie van HA in het weefsel tijdens het proces van zijn winning, vermoedelijk door het introduceren van kleine hoeveelheden verknopingen in de HA-macromoleculen, waarbij de mate van modificatie voldoende is om de elastische eigenschappen van de polymeeroplos-singen sterk te vergroten zonder dat enige nadelige invloed wordt uit-20 geoefend op de gunstige eigenschappen van HA, zoals zijn vermogen om zeer visceuze oplossingen in waterig medium te geven, biocompatibili-teit, enz.

Het chemisch gemodificeerde hyaluronzuur, HY, bereid volgens de onderhavige uitvinding, kan met succes worden gebruikt voor vele toepas-25 singen in het biomedische gebied en in cosmetica, bijvoorbeeld als een middel in viscochirurgie, voor bekledingen om de biocompatibiliteit van verschillende materialen te verbeteren, als een component van verschillende farmaceutische preparaten, in huidverzorgingsprodukten, enz.

De verbeterde eigenschappen van dit polymeer zoals een vergrote e-lasti-30 citeit, betekenen aanzienlijke voordelen wanneer HY wordt gebruikt.

HY kan ook worden gebruikt als een uitgangsmateriaal voor nieuwe produkten, die verkregen worden door extra chemische modificatie, zoals verknoping met conventionele verknopingsmiddelen. Gevonden is dat de speciale eigenschappen van chemisch-gemodificeerd HA volgens de onder-35 havige uitvinding en zijn oplossingen een gelegenheid bieden om de bovenstaand vermelde extra gemodificeerde produkten te verkrijgen die -18- eveneens enkele ongebruikelijke eigenschappen bezitten. Aldus is gevonden dat een in water-onoplosbaar gelachtig materiaal kan worden verkregen uit het produkt volgens de uitvinding door verknoping met di-vinylsulfon in basische, oplossing. Dit materiaal is een sterk gezwollen 5 gel. De concentratie van het polymeer in de gel hangt af van de samenstelling van de vloeibare fase die water kan zijn of kan bestaan uit waterige oplossingen van verschillende stoffen met laag molecuulgewicht, zoals elektrolyten. In het geval van fysiologische zoutoplossing <0,15 M NaCl in water), kan de polymeerconcentratie in het bereik van 10 0,15 tot 0,40 gew.% zijn. Dit materiaal bezit zeer interessante rheolo gische eigenschappen (figuren 5, 6 en 7). De elastische component van de complexe dynamische moduli (G') is hoger dan de verliesmoduli (G") voor alle onderzochte frequenties. Tegelijkertijd gedraagt het materiaal zich als een pseudo-plastisch lichaam bij lage afschuifsnelheden, dat 15 wil zeggen,het heeft een aanzienlijke viscositeit die met de afschuif-snelheid afneemt. Dit materiaal wordt ook gekarakteriseerd door een zeer lange relaxatietijd. De uitvinders zijn sterk van mening dat dit een unieke structuur van oplossingen van HY, verkregen volgens de onderhavige uitvinding, is, waardoor het mogelijk wordt gemaakt om het boven-20 staand beschreven gel-type produkt met deze speciale rheologische eigenschappen te verkrijgen. Met andere woorden hebben de chemische veranderingen in HA, die in het winningsproces volgens de onderhavige uitvinding optreden, niet alleen invloed op de structuur en eigenschappen van HY, maar ook op de eigenschappen van daaruit verkregen produkten. Dien-25 overeenkomstig is gevonden, dat wanneer HA, verkregen volgens de op zichzelf bekende methoden, namelijk door eiwitverwijdering met chloro-formextracties, als uitgangsmateriaal werd gebruikt voor verknoping met divinylsulfon, een onoplosbaar materiaal werd verkregen met rheologische eigenschappen die veel slechter waren dan die van de onderhavige uit-30 vinding.

Opgemerkt wordt dat vele andere gemodificeerde materialen kunnen worden verkregen door extra modificatie van het volgens de onderhavige uitvinding verkregen produkt, zoals sterk verknoopte gels, onoplosbare films, bekledingen, enz.

35 De uitvinding wordt aan de hand van de hierna volgende voor beelden van voorkeursuitvoeringsvormen nader toegelicht, zonder door de voorbeelden te worden beperkt.

f; f' r ; ? /, -19-

Voorbeeld I.

Hanekammen werden, uitgebreid gewassen met een 1 %-ige oplossing in water van cetylpyridiniumchloride, daarna met gedeioniseerd water en werden tenslotte ingevroren. De ingevroren hanekammen werden met een 5 snijmachine gesneden tot stukjes met een dikte van ongeveer 1-2 mm. Een mengsel dat 1000 g aceton, 100 g 37 %-ig formaline en 50 g natrium-acetaat bevatte, werd bereid en daaraan werd 1000 g van de gesneden hanekammen toegevoegd. Het mengsel van hanekammen en de behandelings-vloeistof CpH 6,7) werd gedurende 24 uur onder langzaam roeren op een 10 temperatuur van ongeveer 20°C gehouden. De vloeistof werd daarna van de hanekammen afgescheiden door filtratie door een nylonzeef. De behandelde hanekammen werden daarna met 500 g aceton gewassen en aan de lucht gedroogd tot een uiteindelijk gewicht van 500 g. De gedroogde.hanekammen werden gemengd met 2,5 1 gedeioniseerd water en de extractie werd ge-15 durende 72 uur onder langzaam roeren bij een temperatuur van ongeveer 20°C uitgevoerd. De hanekammen werden van het extract afgescheiden door filtratie door een weefsel van nylongaas en het extract werd bovendien gefiltreerd door een cellulose type filtermateriaal("Micro-media" , M70, Ertel Engineering Co.). De HA-concentratie in dit eerste extract 20 bedroeg 0,92 mg/ml. 2 1 van het extract werd met 4 1 aceton en 20 g natriumacetaat gemengd. Er vormde zich een wit vezelig neerslag dat verzameld werd, gewassen werd met aceton en in een vacuümoven bij 35°C werd gedroogd. Men verkreeg 1,75 g produkt. De hexosamine/hexuronzuur-verhouding voor het produkt bleek 1 _+ 0,05 te zijn. Het formaldehyde-25 gehalte in het produkt bleek 0,0150 % te zijn. Het produkt werd derhalve geïdentificeerd als Hylan. Het eiwitgehalte in het produkt was 0,35 % en het beperkende viscositeitsgetal bedroeg 4320 cms/g.

De hanekammen na de eerste extractie werden gemengd met 2,5 1 gedeioniseerd water en de extractie werd gedurende 48 uur bij omgevings-30 temperatuur uitgevoerd. De hanekammen werden afgescheiden en het extract werd zoals bovenstaand beschreven gefiltreerd. De HA-concentratie in het tweede extract bedroeg 0,65 mg/ml. 1,26 g van het produkt werd uit het extract gewonnen door precipitatie zoals bovenstaand is beschreven. Deze fractie werd eveneens gekarakteriseerd als chemisch-gemodificeerd na-35 triumhyaluronaat waarvan het formaldehydegehalte 0,014 % was. Het eiwitgehalte bedroeg 0,27 % en het beperkende viscositeitsgetal bedroeg 4729 cm3/g. Rheologische eigenschappen van een 1 gew.%'s oplossing in - 'i -20- waterige 0,15 M NaCl-oplossing in water werden onderzocht. Deze gegevens worden in tabel A verstrekt.

Een derde extractie met water van de hanekammen werd eveneens op de bovenstaand beschreven wijze uitgevoerd. De HA-concentratie in 5 het derde extract bedroeg 0,33 mg/ml en er werd uit dit extract 0,60 g HA gewonnen, met een eiwitgehalte van 0,20 %, een beperkend viscositeits-getal van 4830 cm3/g en een formaldehydegehalte van 0,0115 %.

In totaal werd behalve 3,61 g chemisch-gemodificeerd natrium-hyaluronaat uit 1 kg hanekammen gewonnen.

10 Voorbeeld II.

1 kg gesneden hanekammen, bereid op de in voorbeeld I beschreven wijze, werden gemengd met een mengsel van 1 kg aceton en 150g 40gev.%-ige oplossing van glutaaraldehyde in water. De pH van het mengsel was 6,9.

Het mengsel werd gedurende 16 uur onder langzaam roeren (ongeveer 1 omw. 15 per minuut) op kamertemperatuur (ongeveer 20°C) gehouden. Daarna werden de hanekammen van de vloeistof afgescheiden, gewassen met aceton en aan de lucht gedroogd tot de helft van het oorspronkelijke gewicht. De gedroogde hanekammen werden met 3 1 gedeïoniseerd water gedurende 96 uur bij een temperatuur van ongeveer 20°C geëxtraheerd. Het extract werd 20 van de hanekammen afgescheiden en gefiltreerd op de in voorbeeld I beschreven wijze. Het HA-gehalte in het extract bedroeg 1,4 mg/ml. Het produkt had na precipitatie met aceton volgens voorbeeld I een eiwitgehalte van 0,42 % en een beperkend viscositeitsgetal van 3700 cm3/g. Voorbeeld III.

25 De in voorbeeld II beschreven procedure werd herhaald met deze uitzondering dat dezelfde hoeveelheid van een 40 gew.%-ige oplossing van glyoxal in water werd gebruikt in plaats van een glutaaraldehyde-oplos-sing. De HA-concentratie in het extract was 0,92 mg/ml. Het eiwitgehalte in het produkt was 0,5 % en het beperkend viscositeitsgetal bedroeg 30 3930 cm3 /g.

Voorbeeld IV.

Hanekammen werden gewassen, .ingevroren, gesneden en met het aceton-formaldehydemengsel behandeld volgens voorbeeld I. De hanekammen werden na tot de helft van het oorspronkelijke gewicht te zijn gedroogd, 35 geëxtraheerd met 2,5 1 0,05 M natriumhydroxyde-oplossing in water (pH groter dan 11) gedurende 120 uur bij een temperatuur van ongeveer S * -21- 20°C. Het extract werd afgescheiden en gefiltreerd op de in voorbeeld I beschreven wijze. De Ha-concentratie in het extract bedroeg 3,6 mg/ml.

Een wit produkt werd met aceton-natriumacetaatmengsel neergeslagen, met aceton gewassen en gedroogd. Men verkreeg 7,5 g van een produkt met een 5 eiwitgehalte van 0,2 % en een beperkend viscositeitsgetal van 1310 cm3/g. Voorbeeld V.

Hanekammen werden gewassen, ingevroren, gesneden en 1 kg hanekam-men werd gemengd met een mengsel dat 1 kg isoporpanol, 100 g 37 %-ig formaline, 50 g natriumacetaat en 100 g chloroform bevatte. De behande-10 ling werd uitgevoerd onder langzaam roeren gedurende 16 uur bij een temperatuur van ongeveer 20°C.De extractie en precipitatie werden op de in voorbeeld I beschreven wijze uitgevoerd. De HA-concentratie in het extract was 0,68 mg/ml. Het eiwitgehalte in het produkt bedroeg 0,46 % en het beperkend viscositeitsgetal was 4900 cm3/g.

15 Voorbeeld VI.

Hanekammen werden gewassen, ingevroren, gesneden, behandeld met een aceton-formaldehydemengsel, gewassen met aceton, gedroogd en geëxtraheerd met water op de in voorbeeld I beschreven wijze. Het extract werd gemengd met een mengsel van 2 1 aceton en 1 1 chloroform. Men verkreeg 20 1,9 g van een wit vezelachtig produkt met een eiwitgehalte van 0,05 % en een beperkend viscositeitsgetal van 4400 cm3/g.

Voorbeeld VII.

1 kg gesneden hanekammen, bereid op de in voorbeeld I beschreven wijze, werd behandeld met een mengsel dat 1 kg aceton, 50 g 37 %-ig 25 formaline, en 50 g natriumacetaat bevatte, gedurende 24 uur onder langzaam roeren bij een temperatuur van ongeveer 20ec. Het extract werd afgescheiden en gefiltreerd, en het produkt werd op de in voorbeeld I beschreven wijze neergeslagen. Men verkreeg 1,6 g van een wit produkt met een eiwitgehalte van 0,45 %, een beperkend viscositeitsgetal van 5300 30 cm3/g en een gecombineerd formaldehydegehalte van 0,008 %-Voorbeeld VIII.

De in voorbeeld I beschreven procedure werd herhaald met deze uitzondering dat na de behandeling met aceton-formaldehyde, de hanekammen werden gedroogd tot 1/3 van hun oorspronkelijke gewicht, en de 35 eerste extractie met water gedurende 96 uur werd uitgevoerd.

De HA-concentratie in het eerste extract bedroeg 1,05 mg/ml. Het uit dit extract neergeslagen produkt had een eiwitgehalte van 0,25 % en -22- een beperkend viscositeitsgetal van 4930 cm3/g. Een oscillatietest van een 1 gew.%-ige oplossing van dit produkt in een waterige 0,15 M NaCl-oplossing gaf een "cross-over point" bij een frequentie van 0,020 Hz.

De HA-concentratie in het tweede extract was 0,58 mg/ml. De uit 5 dit extract verkregen fractie had een eiwitgehalte van 0,19 % en een beperkend viscositeitsgetal van 7300 cm3/g. Het gecombineerde form-aldehydegehalte was 0,01 %. De frequentie van het "cross-over point" in de oscillatietest was 0,005 Hz.

In totaal werd 3,5 g chemisch-gemodificeerd HA met de drie op-10 volgende extracties gewonnen.

Voorbeeld IX.

Hanekammen werden gewassen, ingevroren, gesneden en 1 kg van de verkregen stukjes werd gemengd met 1 kg aceton, 200 g 37 %-ig formaline en 100 g chlorofom. De pH van het mengsel werd met zoutzuur op een 15 waarde van 4,0 ingesteld. De HA-concentratie in het eerste extract was 0,58 mg/ml. Het produkt werd uit het extract gewonnen door precipitatie met aceton-natriumacetaat volgens voorbeeld I. Het eiwitgehalte in het produkt was 0,12 %, het beperkend viscositeitsgetal was 4025 cm3/g. Het gecombineerde formaldehydegehalte in het produkt was 0,02 %. De frequen-20 tie van het "cross-over point" in de oscillatietest voor een 1 gew.%-ige oplossing van het ptodukt in een waterige 0,15 M NaCl-oplossing bedroeg 0,006 Hz.

Voorbeeld X.

Hanekammen werden gewassen, ingevroren, gesneden en 1 kg van de 25 verkregen stukjes werd behandeld met aceton-formaldehydemengsel op de in voorbeeld I beschreven wijze, met deze uitzondering dat de pH van het mengsel met natriumhydroxyde werd ingesteld op 11,0. De hanekammen werden gedroogd en geëxtraheerd met water volgens voorbeeld I. De HA-con-centratie in het extract bedroeg 0,69 mg/ml. Het produkt werd uit het 30 extract neergeslagen volgens voorbeeld I met deze uitzondering dat iso-propanol werd gebruikt in plaats van aceton. Men verkreeg 1,3 g van een wit vezelig materiaal dat een eiwitgehalte van 0,45 %, een beperkend viscositeitsgetal van 5050 cm3/gen een formaldehydegehalte van 0,012 %. De frequentie van het "cross-over point" in de oscillatietest 35 voor 1 gew.%-ige oplossing van het produkt in een waterige 0,15 M NaCl-oplossing was 0,012 Hz.

Voorbeeld XI.

Dit voorbeeld illustreert het verkrijgen van een geltype materiaal . -*s -23- uit hylan. 0/88 g van het uit het tweede extract in voorbeeld I neergeslagen produkt werd gemengd met 28,3 g waterige 0,05 N NaOH-oplossing in water en het mengsel werd gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Aan de verkregen visceuze oplossing werd een mengsel toegevoegd 5 van 0,26 g divinylsulfon en 1,0 g waterig 0,5 tt NaOH. Het verkregen mengsel werd gedurende 10 minuten geroerd en daarna gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur met rust gelaten. Men verkreeg een elastische, kleurloze en heldere gel. De gel werd in 0,5 1 van een 0,15 M zoutoplossing gebracht en een nacht alleen gelaten. Daarna werd de overmaat 10 vloeistof uit de sterk gezwollen gel verwijderd en werd 0,5 1 van een verse zoutoplossing toegevoegd aan de gel en werd het mengsel gedurende 24 uur op een schudmachine gezet. De overmaat vloeistof werd van het gezwollen onoplosbare materiaal afgeschonken. Men verkreeg een geltype helder materiaal. De HA-concentratie in het produkt werd bepaald en 15 bleek 0,275 gew.% te zijn. De Theologische eigenschappen van het materiaal worden getoond in de fig. 5, 6 en 7.

Voorbeeld XII.

14

Behandeling van hanekammen met CH^O.

-

Met een radio-isotoop gelabeld paraformaldehyde ( C^O) met een 20 specifieke activiteit van 500 m Ci/g (I2CN Radiochemicals) werd gemengd in een hoeveelheid die overeenkomt met 5,0 mei, met 1,0 ml 37 gew.%-ige oplossing van formaldehyde in water waaraan 0,1 ml 1 N natriumhydroxyde-oplossing in water werd toegevoegd. Het mengsel werd in een goed afgedichte houder gebracht en tot 60°C verwarmd om het paraformaldehyde te 25 doen oplossen. Daarna werd het mengsel gekoeld tot 0°C en geneutraliseerd met 0,1 ml waterig 1 N azijnzuur. De radioactiviteit van de ver-kregen oplossing werd gemeten in 10 ml Hydrofluor vloeibaar scintil-latie telmedium (National Diagnostic)gebruikmakend van een Searle Isocap 300 vloeistof scintillatieteller met computercorrectie voor rendement, 30 gebaseerd op de externe standaardmethode. De formaldehydeconcentratie werd bepaald met een colorimetrische methode met chromotropinezuur. De gemeten specifieke activiteit van de verkregen oplossing was 0,555 Mci/mmol CH^0· De gelabelde formaldehyde oplossing werd gemengd met 7,5 g aceton, 1 g chloroform en 0,5 g natriumacetaat. 7,5 g gesneden 35 hanekammen werden net de oplossing gemengd en de behandeling werd gedurende 18 uur bij een temperatuur van ongeveer 20°c uitgevoerd. De hanekammen werden van de vloeistof gescheiden, verschillende keren met -24- aceton gewassen en aan de lucht gedroogd tot de helft van. hun oorspronkelijke gewicht. 15 ml 2 x gedestilleerd water werd aan de hanekammen toegevoegd en de extractie liet men gedurende 96 uur bij een temperatuur van ongeveer 20°C plaatsvinden. Het extract werd van de hanekammen afge-5 scheiden en door verschillende lagen filtreerpapier (Whatman R nummer 1) gefiltreerd. Dezelfde procedure werd herhaald om een tweede extract van de hanekammen te verkrijgen. HY werd uit de extracten neergeshgen als een wit vezelachtig materiaal door aan de extracten CH^COONa toe te voegen in een hoeveelheid waardoor een 1 gew.%~ige oplossing werd verkregen,en 10 4 volume-hoeveelheden 95 %-ige ethanol. Het vezelachtige materiaal werd afgescheiden, uitgebreid met aceton gewassen, gedroogd en daarna opnieuw opgelost in water, waarbij een oplossing werd verkregen met een HY-con-centratie van ongeveer 1 mg/ml. Het HY werd opnieuw uit deze oplossing neergeslagen zoals bovenstaand is beschreven en opnieuw grondig met 15 aceton gewassen en gedroogd. Het droge materiaal werd nog een keer opgelost in gedestilleerd water waarbij een oplossing werd verkregen die 0,84 mg/ml HY bevatte. Bij meting bleek de specifieke activiteit van deze oplossing 194 dpm/ug HA te zijn. Uitputtende dialyse van deze oplossing tegen 0,05 M fosfaatbuffer, pH 7,5, welke 0,15 M NaCl bevatte, 20 reduceerde de radioactiviteit op 103 dpm/ug HY. Uitputtende dialyse van deze oplossing tegen 4 M guanidiumhydrochloride verlaagde de activiteit tot 101 dpm/ug HY waaruit bleek dat formaldehyde in het produkt achterbleef, zelfs na behandeling van de oplossing onder condities die tot dissociatie van eiwitten leiden. Gebaseerd op deze gemeten radio-25 activiteit van het produkt en de specifieke activiteit van de formalde-hyde-oplossing waarvan is uitgegaan, werd het gehalte aan formaldehyde in verhouding tot HY berekend als ongeveer 0,2 gew.%. Om te onderzoeken hoeveel van het door een radio-isotoop gelabelde formaldehyde verbonden was met HY, dat gevoelig was voor een enzymatische afbraak met strepto-30 myces hyaluronidase, werd een andere oplossing van het produkt bereid die 0,8 mg/ml HY bevatte en een activiteit had van 1250 dpm/10 ul oplossing. Aan 2 ml van deze oplossing werd 0,1 ml citraat-fosfaatbuffer (pH 5,6) toegevoegd die 33 TRU Streptomyces hyaluronidase (Miles Laboratories, Ine., specifieke activiteit 2000 TRU/mg HA, proteolytische 14 35 activiteit minder dan 5 x 10 eenheden per TRU) bevatte. Aan een andere 2 ml-portie van dezelfde oplossing werd 0,1 ml van de buffer toegevoegd zonder het enzym. Beide porties werden gedurende 20 uur tegen 1000 • /(, -25- volume-hoeveelheden van de citraat-fosfaatbuffer gedialyseerd. De volume-hoeveelheden van de twee monsters na dialyse waren gelijk- Het niet met enzym behandelde monster had een HY-concentratie van 0,76 mg/ml en de radioactiviteit was 552 dpm/10 yl. De HY-concentratie in het met enzym 5 behandelde monster was verlaagd beneden waarneembare niveaus (10 yg/ml) en de radioactiviteit was 414 dpm/10 μΐ oplossing. De hyaluronidase-ge-voelige radioactiviteit correspondeerde derhalve met 20 dpm/yg HY, hetgeen correspondeerde met 0,049 gew.% formaldehyde dat verbonden was met enzymatisch digesteerbaar HY. Dergelijke gelabelde monsters van het 10 produkt werden verder geanalyseerd met gel-permeatie chromatografie op een 1,6 x 90 cm glaskolom, gepakt met glyceryl - CPG 3000, poriëngrootte 2869 +_ 8,3 % (Electronucleonics, Inc.). Voor de elutie werd ontgast 0,02 M boraatbuffer (pH 7,5) toegepast die 0,15 M NaCl bevatte.' Het uitgesloten volume van de kolom (Vo) werd bepaald met een monster HY met 6 15 een molecuulgewicht van 4 x 10 en het totale kolomvolume (Vt) werd bepaald met sucrose. De elutie werd uitgevoerd met een stroomsnelheid van 10 ml/uur bij 6°C. Er werden fracties van 5 ml verzameld en deze werden geanalyseerd op HY-concentratie en radioactiviteit. Gevonden werd dat radioactiviteit samen met HY in het volume van de open ruimten werd 20 geëlueerd, en dat door enzymatische digestie zowel HY als radioactiviteit uit de fracties van het holtenvolume werden verwijderd- Berekening liet zien dat de met het HY van het holt en volume verbonden specifieke activiteit 14,6 dpm/yg HY was, hetgeen correspondeerde met 0,036 gew.% formaldehyde in het polymeer. Dit getal is in goede overeenstemming met . 25 het in de dialyseproef verkregen getal.

Variaties en modificaties kunnen natuurlijk worden aangebracht zonder dat daarmede de geest en omvang van de uitvinding worden verlaten.

' « 4

Claims (28)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van een ohemisch-gemodificeerd hyaluronzuurpreparaat, omvattende: (a) het behandelen van dierlijk weefsel dat hyaluronzuur bevat, met een waterig behandelingsmengsel dat een stof omvat die reactief 5 is ten opzichte van eiwitten en hyaluronzuur, teneinde een chemische modificatie van het in het weefsel aanwezige hyaluronzuur in situ te bewerken, (b) het verwijderen van overmaat behandelingsmengsel van het reactie-mengsel, 10 (c) het extraheren van het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur uit het behandelde dierlijke weefsel met water, (d) het afscheiden van het extract dat het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur bevat, van het behandelde dierlijke weefsel, en (e) het winnen van het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur uit het 15 extract.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de ten opzichte van eiwitten en hyaluronzuur reactieve, zich in het waterige behandelingsmengsel bevindende stof een aldehyde is,

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het aldehyde formaldehyde, 20 glutaaraldehyde of glyoxal is.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het waterige behandelingsmengsel een met water mengbaar oplosmiddel omvat dat niet met het aldehyde reageert.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het oplosmiddel een lager 25 keton, een lagere alcohol of een aprotisch oplosmiddel is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin het oplosmiddel aceton, » methylethylketon, ethanol, isopropanol, dimethylformamide, dimethyl-aceetamide of dimethylsulfoxyde is.

7. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin het waterige behandelings-30 mengsel desgewenst een elektrolyt en een in water onoplosbaar organisch oplosmiddel omvat,

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin de elektrolyt natrium-acetaat is en het in water onoplosbare organische oplosmiddel chloroform is. -27-

9. Werkwijze volgens conclusie 4, waarin de gewichtsverhouding water tot met water-menbgaar oplosmiddel in het behandelingsmengsel 1-5 : 4 - 8,5 bedraagt en de gewichtsverhouding van water tot aldehyde 1-5: 0,02 - 1 is.

10. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin het behandelingsmengsel in gewichtsdelen omvat: water 10-50 met water-mengbaar oplosmiddel 40 - 85 aldehyde 0,2 - 10 10 in water onoplosbaar oplosmiddel 0,5 - 10 elektrolyt 0 - 20

11. Werkwijze volgens conclusie-2, waarin het behandelingsmengsel een pH van 4-10 heeft, de gewichtsverhouding van behandelingsmengsel tot te behandelen weefsel ten minste 10 : 1 is, en de behandeling wordt uit- 15 gevoerd gedurende ongeveer 4-24 uur bij of beneden ongeveer kamertemperatuur. .

12. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het dierlijke weefsel bestaat uit hanekammen en de hanekammen tot plakjes worden gesneden met een dikte van ongeveer 1-3 mm.

13. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin de overmaat behandelings mengsel uit het reactiemengsel wordt verwijderd door het behandelde weefsel te wassen met een oplosmiddel of een oplosmiddel/watermengsel.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarin het voor het wassen van het behandelde weefsel toegepaste oplosmiddel hetzelfde oplosmiddel is 25 als in het behandelingsmengsel is gebruikt.

15. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin de extractie van het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur wordt uitgevoerd bij een temperatuur beneden ongeveer 25°C gedurende ongeveer 6 uur tot verscheidene dagen, waarbij de gewichtsverhouding van water tot behandeld weefsel 30 ongeveer 2-5 : 1 is, gebaseerd op het gewicht van het niet-behandelde weefsel.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarin het behandelde weefsel wordt gedroogd tot ongeveer 25 - 50 % van zijn behandelde gewicht voor de extractietrap.

17. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het extract van het dier lijke weefsel wordt afgescheiden door filtratie, centrifugatie of afschenken. * > <f -28-

18. Werkwijze volgens conclusie 17, waarin de scheiding door filtratie teweeg wordt gebracht.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, waarin de filtratie een twee-traps procedure is, een eerste of grove filtratie door een grof gaas 5 om de stukjes dierlijk weefsel te verwijderen en een tweede of fijne filtratie door een cellulose-achtig materiaal.

20. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur uit het extract wordt gewonnen door precipitatie met een oplosmiddel, gevolgd door wassen en drogen van het verkregen neergesla- 10 gen chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, waarin het voor de precipitatie toegepaste oplosmiddel aceton, ethanol of isopropanol is.

22. Werkwijze volgens conclusie 21, waarin een mineraalzuur of een elektrolyt tijdens de precipitatiestap wordt toegevoegd.

23. Werkwijze volgens conclusie 22, waarin het minerale zuur HC1, H„SO„ of ELPO. is en de elektrolyt natriumacetaat of NaCl is.

24. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur uit het extract wordt verwijderd door lyofilisatie.

25. Werkwijze voor het verknopen van het chemisch-gemodificeerde 20 hyaluronzuur, verkregen volgens de werkwijze van conclusie 2, omvattende het onderwerpen van het chemisch-gemodificeerde hyaluronzuur aan een verknopingsreactie met divinylsulfon onder basische condities bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1 uur.

26. Produkt, verkregen met de werkwijze volgens conclusie 2. 25

27, Produkt, verkregen met de werkwijze volgens conclusie 25.

28. Chemisch-gemodificeerd hyaluronzuurpreparaat, gekenmerkt door de aanwezigheid van ongeveer 0,005 tot 0,05 gew.% aldehydeverknopings-groepen, die covalent met de hyaluronzuurpolymeerketens zijn verbonden. • - - «r