SE468830B - Kemiskt modifierat hyaluronsyrapreparat och metod foer utvinning daerav ur animaliska vaevnader - Google Patents

Description

:s Ü\ CS OJ @ N och J.K. Sheehan, Biochem. J. låå, 1255-1263 (1972); R. Varma, R.S. Varma, W.S. Alten och A.H. Wardi, Carbohydr.

Res. 32, 386-395 (1974)); behandling med jonbytarhartser (T.C. Laurent, J. Biol. Chem. 216, 263-271 (1955); E.R.

Berman, Biochim. Biophys. Acta 5§, 120-122 (1962)); utfäll- ning med katjoniska ytaktiva ämnen (T.C. Laurent, M. Ryan och A. Pietruszkiewicz, Biochim. Biophys. Acta 42, 476-485 (l960)); behandling med trikloroättiksyra (H. Hofmans, O.

Schmut, H. Sterk och H. Koop, Naturforsch. 343, 508-511 (1979); D. Schmut och H. Hofmans, Biochim. Biophys. Acta 613, 192-196 (1981)); preparativ densitetsgradientsedimentering (P. Silpanata, J.R. Dunstone, A.G. Ogston, Biochem. J. 102, 43-50 (l968)); och elektrisk utfällning (S. Roseman, D.R.

Watson, J.F. Duff och W.D. Robinson, Annals Rheumatic Dis- eases 15, 67-68 (1955)). Man kan även använda en metod som innefattar flera olika behandlingar, t.ex. enzymatisk diges- tion och utfällning med cetylpyridiniumklorid (J.E. Scott, Biochem. J. 62, 31 (1956)).

Det största problem som man träffar på vid utvinning av HA från någon biologisk källa innefattar separering av polymeren (HA) från proteiner och andra biologiska polymerer, vilka extraheras från vävnaden tillsammans med HA. Beroende på rå- materialet kan mängden icke önskade polymerer vara mycket stor och mångfaldigt överstiga mängden HA. Metoderna för HA-utvinning som anges ovan användes samtliga för framställ- ning av HA på laboratorier men kan knappast användas för pro- duktion av HA i stor skala på grund av olika olägenheter som är förbundna med var och en av dessa metoder.

Den mest avancerade metoden för HA-utvinning och rening i industriell skala beskrives i US patentet nr 4 141 973 (E.A. Balazs). Enligt denna metod erhålles en ultraren HA med en proteinhalt som är mindre än 0,5 viktprocent och en molekylvikt som är större än 1.200.000 genom vattenextraktion från tuppkammar eller human navelsträng. Proteiner och andra substanser avlägsnas genom flera kloroformextraktioner vid 3 468 830 varierande pH-värden. Vid en kloroformextraktion av vatten- extraktet bildas ett gränsskikt, i vilket denaturerade pro- teiner och andra substanser samlas. Några substanser, t.ex. fetter, solubiliseras, troligen i kloroformfasen. Förfarandet kan även inkludera en behandling med ett proteolytiskt enzym, t.ex. pronas. Genom att kombinera flera ganska besvärliga behandlingar har ett förfarande utvecklats, vilket medger erhållande av en pyrogenfri, icke-inflammatorisk fraktion av HA. Denna produkt saluföres för närvarande som en l % lösning under varumärket Healon(R) och användes inom Visceral kirurgi, där den skyddar vävnader mot mekanisk skada, tillhandahåller utrymme och medger manipulering av vävnader under kirurgiska ingrepp (E.A. Balazs, Healon, J. Wiley and Son, NY, 1983, sid. 5-28).

KORT BESKRIVNING AV RITNINGARNA Fig. l är ett diagram som visar viskositet som funktion av skjuvhastighet för en l % (vikt) lösning av HY (Hylan) i vattenhaltig O,l5M NaCl (V = viskositet; S = skjuv- påkänning); Fig. 2 är ett diagram som ger resultaten av ett oscillations- o\0 test för en l (vikt) lösning av HY i vattenhaltig O,l5M NaCl (V = viskositet; F = fasvinkel; G' = dyna- miska lagringsmoduler; G" = förlustmoduler); Fig. 3 är ett diagram som visar avspänningskurvan för en l % (vikt) lösning av HY i vattenhaltig O,l5M NaCl; Fig. 4 är ett diagram som visar fördelningen av ESD för en l % (vikt) lösning av HY (gränsviskositetstal 4 300 cm3/g) i vattenhaltig O,l5M NaCl; Fig. 5 är ett diagram som visar fördelningen av ESD för en l % (vikt) lösning av HA (gränsviskositetstal 3 562 cm3/9) i vattenhaltig O,l5M NaCl; $> çn OJ CN Fig. 6 är ett diagram som visar viskositet som funktion av skjuvhastighet för en gelëliknande produkt enligt uppfinningen; G Fig. 7 tionstest för en gelêliknande produkt enligt uppfin- ningen (V = viskositet; F = fasvinkel; G' = dynamiska lagringsmoduler; G " = förlustmoduler); och Fig. 8 är ett diagram som visar avspänningskurvan för en gelëliknande produkt enligt uppfinningen.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Enligt en aspekt tillhandahåller föreliggande uppfinning en ny metod för kemisk modifiering in situ av HA i djurvävna- der före dess extraktion därifrån.

Enligt en annan aspekt tillhandahåller uppfinningen en ny metod för utvinning och rening av kemiskt modifierad HA från djurvävnader.

Enligt ytterligare en aspekt tillhandahåller uppfinningen en ny ultraren, pyrogenfri, icke-inflammatorisk kemiskt modi- fierad HA, som innehåller ca 0,005 till 0,05 viktprocent aldehyd-förnätande grupper kovalent bundna till hyaluronsyra- polymerkedjorna.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning grundar sig på upptäckten att HA kan modifieras kemiskt in situ innan den extraheras från djurvävnader genom behandling av vävnaden med en substans, = som reagerar med proteinerna och HA i vattenhaltiga medier.

Bland dessa substanser finns formaldehyd, glutaraldehyd, * v! glyoxal etc. Det har visat sig att denna kemiska modifikation in situ åstadkommer väsentliga förändringar i den primära strukturen hos HA-makromolekylen beträffande molekylstorlek, är ett diagram som visar resultaten av ett oscilla- s A68 830 inter- och intramolekylära interaktioner och beträffande de resulterande reologiska egenskaperna hos lösningar som fram- ställts av den modifierade produkten. Det är därför motive- rat att ge denna kemiskt modifierade HA ett nytt namn. Vi har valt att kalla detta material Hylan (i det följande be- tecknat HY). När HA extraheras ur en animalisk vävnad, går vanligen en stor mängd proteiner i lösning tillsammans med den. Mängden protein kan variera väsentligt beroende på vävnadens egenskaper och extraktionsparametrarna. Vid extrak- tion av HA från tuppkammar kan viktförhållandet mellan HA och proteiner variera från l:0,5 upp till l:4 (US patent nr 4 303 676, E.A. Balazs). Till följd härav är det första problemet vid utvinning av ren HA från djurvävnad avlägsnan- det av proteiner. Det har visat sig att den ovannämnda preli- minära behandlingen av vävnaden tillhandahåller ett vatten- extrakt av HY med en väsentligt lägre proteinhalt än vid frånvaro av en sådan behandling.

Den exakta naturen hos de kemiska händelser som äger rum under behandlingen av vävnaden är inte helt klarlagd och därför bör uppfinningen inte begränsas av någon specifik kemisk reaktion. Det är sannolikt att proteinerna till följd av kemiska reaktioner mellan proteiner i vävnaden och ett reagens i behandlingsblandningen blir denaturerade och immo- biliserade i vävnaderna och därför är olösliga vid den föl- jande vattenextraktionen.

Vilken substans som helst som reagerar med proteiner i ett vattenhaltigt medium kan användas för ändamålet enligt före- liggande uppfinning. Det har visat sig att den mest fördel- aktiga substansen är formaldehyd. Andra aldehyder, såsom glutaraldehyd eller glyoxal, kan även användas vid metoden enligt föreliggande uppfinning.

Behandlingen av vävnaden kan genomföras i en vattenlösning av reaktionsmedlet. Om denna behandling genomföras, inträf- far emellertid en väsentlig förlust av HY på grund av dess .,'..\..

OD CG (JJ goda löslighet i vatten. Av denna anledning är det bäst att genomföra behandlingen av vävnaden i en blandning av vatten och ett med vatten blandbart organiskt lösningsmedel. Lös- ningsmedlet bör inte reagera med reagenset som användes förd protein-immobiliseringen. Bland dessa lösningsmedel finns lägre ketoner, såsom aceton eller metyletylketon, alkoholer, såsom etanol eller isopropanol, aprotiska lösningsmedel, såsom dimetylformamid, dimetylacetamid eller dimetylsulfoxid med flera. När ett sådant lösningsmedel blandas med en väv- nad som innehåller en stor mängd vatten, vanligen 80-90 vikt- procent eller mer, bildas en vatten-lösningsmedelsblandning.

Förhållandet mellan vatten och lösningsmedel i blandningen kan justeras till vilken önskad nivå som helst genom ändring av förhållandet mellan lösningsmedel och vävnad eller genom tillsättning av vatten till blandningen. Det föredragna vatten/lösningsmedel-förhållandet bestämmes av HY-lösligheten genom att HY inte bör vara löslig i den blandning som använ- des för behandlingen av vävnaden. HY-lösligheten beror på den typ av lösningsmedel som användes, vatten/lösningsmedel- förhållandet, närvaron och koncentrationen av en elektrolyt i blandningen och blandningens pH-värde. HY-lösligheten kan minskas väsentligt genom införande av en elektrolyt i bland- ningen. Vilken typ av elektrolyt som helst kan användas som är löslig i vatten-lösningsmedelsblandningen och som till- handahåller det önskade pH-värdet hos blandningen. När aceton användes som lösningsmedel, kan exempelvis natriumacetat lämpligen användas som en löslig elektrolyt.

Sammansättningen för blandningen för behandling av vävnaden kan variera över ett brett intervall beroende på vävnadens egenskaper, typen av lösningsmedel som användes, typen av elektrolyt etc. Såsom anges ovan, bör HY från vävnaden inte vara löslig i behandlingsblandningen, men den sistnämnda bör innehålla tillräckligt mycket vatten för att vävnaden skall kunna svälla och därigenom underlätta reaktionen mellan rea- genset och vävnadspolymererna. Det har visat sig att ifråga om tuppkammar som källa för HY kan samansättningen hos bland- 7 468 850 ningen, varvid man tar hänsyn till vattnet från kammarna, ligga inom följande intervall i viktprocent: vatten 10-50, lösningsmedel 40-85, elektrolyt O-20, reagens 0,2-lO. Flera olika lösningsmedel kan användas i samma behandlingsbland- ning om så önskas. Det har visat sig vara fördelaktigt att använda små mängder med vatten icke blandbara lösningsmedel, såsom kloroform, i behandlingsblandningen. Halten av dessa lösningsmedel i blandningen kan vara från 0,5 till 10 vikt- procent.

Behandlingsblandningens pH kan varieras beroende på egen- skaperna hos reagensen, blandningens sammansättning, tempe- ratur och behandlingstid. Vid utvinning av HY ur animaliska vävnader enligt föreliggande uppfinning är följande hänsyns- taganden mycket viktiga. Några av reagensen, exempelvis form- aldehyd, kan reagera med hydroxylgrupper i HA-makromolekyler vid lågt pH och ge en förnätad polymer som är olöslig i vatten. En förlängd behandling i ett medium med relativt högt pH leder till nedbrytning av HA och endast en polymer med låg molekylvikt kan utvinnas. Det har visat sig att när ett reagens av aldehydtyp användes enligt föreliggande uppfin- ning, erhålles de bästa resultaten med pH i närheten av det neutrala värdet, exempelvis inom intervallet från 4 till 10.

Förhållandet mellan behandlingsblandningen och vävnaden kan variera inom vida gränser. Den undre gränsen bestämmes van- ligen av villkoret att vävnaden, som är ganska voluminös ifråga om tuppkammar, åtminstone bör vara fullständigt täckt med blandningen. Den övre gränsen kan väljas på basis av ekonomiska hänsynstaganden. Vid behandling av tuppkammar enligt föreliggande uppfinning är förhållandet mellan behand- lingsblandningen och vävnaden (beräknat på vävnadens torr- vikt) vanligen mer än l0:l.

Temperaturen påverkar effektiviteten vid behandlingen enligt föreliggande uppfinning. Eftersom HY är känslig för hydrolys vid förhöjd temperatur, är det emellertid bäst att genomföra CT? CJ CN CD a) behandlingen vid rumstemperatur eller vid lägre temperatur för att erhålla en produkt med hög molekylvikt.

Den tid som erfordras för att genomföra behandlingen beror på många faktorer inklusive blandningens sammansättning, vävnadens egenskaper, temperatur etc. Man antar att den be- gränsande faktorn vid behandlingen är reagensets diffusion in i vävnadsskivorna. Av denna anledning är storleken hos dessa skivor en viktig parameter. Det har visat sig att vid behandling av tuppkammar, som är skurna i skivor med en tjocklek av l-3 mm, kan behandlingstiden ligga inom inter- vallet från 4 till 24 timmar.

Den vävnad som behandlats på ovan beskrivet sätt tvättas sedan med ett lösningsmedel eller en lösningsmedel/vatten- blandning för avlägsnande av överskottet av behandlings- blandningen från vävnaden. Det är lämpligt att använda samma lösningsmedel som användes i blandningen för vävnadsbehand- lingen. Man kan använda vilket antal tvättningar som helst, men det har visat sig att en tvättning ger tillfredsställande .resultat.

Den tvättade vävnaden extraheras sedan direkt med vatten för utvinning av HY. Det har visat sig att effektiviteten vid extraktionen beror på förhållandet vatten/vävnad, extrak- tionsmediernas pH, temperatur och tid. Det har även visat sig att effektiviteten vid extraktionen av den behandlade väv- naden kan ökas väsentligt om man först torkar den behandlade vävnaden för att avlägsna det lösningsmedel, som användes i behandlings- och tvättningsstegen. De bästa resultaten er- hålles när vävnaden torkas till l/4 till l/2 av sin ursprung- liga vikt.

Vatten/vävnad-förhållandet i extraktionssteget väljes på basis av flera hänsynstaganden. Först och främst bör det finnas tillräckligt mycket flytande fas för att täcka väv- naden under extraktion. Å andra sidan bör mängden vatten inte I; 468 830 vara alltför stor, eftersom man vill ha en så hög koncentra- tion av HY som möjligt i extraktet för att kunna minska mängden utfällningsmedel i följande steg av förfarandet.

Det har visat sig att ifråga om tuppkammar är det föredragna förhållandet mellan vatten och vävnad från 2 till 5, baserat på de obehandlade kammarnas vikt. pH-värdet i de extraherande medierna kan hållas neutralt, surt eller alkaliskt beroende på den önskade kvaliteten hos slutprodukten. Det har visat sig att pH-värdet i de extra- herande medierna bör ligga inom intervallet 6-8,5 för att man skall erhålla en produkt med ultrahög molekylvikt. Ett högre pH leder till en ökning av HY-koncentrationen i extrak- tet, men på samma gång till en minskning av produktens mole- kylvikt och ändringar i andra polymeregenskaper, som kommer att diskuteras närmare nedan. I vilket fall som helst kan man genom att kontrollera pH-värdet under extraktionssteget lätt reglera egenskaperna hos slutprodukten i önskad rikt- ning.

Det är lämpligt att extrahera den behandlade vävnaden vid en temperatur som är lägre än 25oC, eftersom nedbrytningen av HY vid högre temperaturer kan minska polymerens molekylvikt väsentligt.

Den tid som erfordras för extrahering av den maximala mäng- den HY från den behandlade vävnaden varierar väsentligt med andra parametrar vid extraktionen, såsom pH, vätska/vävnad- förhållande och omröringens intensitet. Det har visat sig att vid extraktion av tuppkammar med vatten kan goda resul- tat erhållas när de behandlade kammarna extraheras under en tid från 6 timmar till flera dygn.

Blandningen av behandlad vävnad och extraktionsmedier kan omröras under extraktionen eller lämnas utan någon omröring.

Det är klart att omröring ökar diffusionshastigheten för HY- molekylerna från vävnaden in i extraktet. Ä andra sidan kan Fx .u ..|.

C*- CC' CI) (_24 CD 10 häftig omröring leda till nedbrytning av HY och sålunda till en minskning av molekylvikten. Det har dessutom visat sig att häftig omröring förorsakar vävnadssönderdelning, som för- svårar separationen av vävnaden från extraktet. Det är därför lämpligt att genomföra extraktionssteget utan omröring eller med mycket långsam och försiktig omröring.

Efter extraktion separeras vävnaden från extraktet med använd- ning av vilken som helst av flera konventionella metoder, inklusive filtrering, centrifugering, dekantering och lik- nande. Det har visat sig att det enklaste och mest ekonomiska sättet är filtrering. Beroende på den typ av vävnad som an- vändes som utgångsmaterial kan det vara bäst att använda en tvåstegsfiltrering. Ifråga om tuppkammar kan sålunda stora vävnadsstycken lätt separeras genom filtrering genom ett nylonnät och finreningen av extraktet kan uppnås genom filt- rering genom vilka täta filtermedier som helst, t.ex. ett cellulosamaterial.

HY-koncentrationen i extraktet beror på många faktorer, inklu- sive pH-värdet under extraktion, tid, vätska/vävnad-förhål- lande och omröringens intensitet. Den ligger vanligen inom intervallet från 0,3 till 3,0 mg/ml och ibland ännu högre.

I några fall, när HY-koncentrationen i extraktet är låg, har det visat sig vara lämpligt att genomföra en andra extrak- tion av vävnaden. Det har även visat sig att den produkt som utfaller ur det andra extraktet vanligen har en högre mole- kylvikt än den HY som utfälles ur det första extraktet.

Detta kan förklaras genom det förhållandet att lågmolekylära HY-fraktioner diffunderar lättare från vävnaden in i extrak- tet och den produkt som utfälles ur det första extraktet berikas med dessa fraktioner.

Man kan använda fler än tvâ extraktioner för att uppnå ett så högt utbyte som möjligt, men koncentrationen av HY i ett extrakt minskar med varje följande extraktion. 11 468 850 HY kan utvinnas ur filtraten enligt vilken tidigare känd metod som helst. Den lämpligaste metoden är utfällning med ett med vatten blandbart lösningsmedel, såsom aceton, etanol, isopropanol etc. Utfällningen kan ske i närvaro av en syra såsom klorvätesyra, svavelsyra, fosforsyra etc., eller i när- varo av neutrala elektrolyter, såsom natriumacetat, natrium- klorid och deras salter. HY och dess salter utfälles vanligen i form av ett vitt fiberliknande material eller ett pulver.

Fällningen kan tvättas med samma lösningsmedel som användes för utfällningen eller med någon annan lösningsmedelsbland- ning som inte löser produkten, exempelvis eter. Den tvättade produkten kan torkas på vilket lämpligt sätt som helst eller också kan den förvaras under ett skikt av ett lös- ningsmedel, såsom aceton, etanol. etc. Alternativt kan filt- ratet frystorkas.

Det är klart att vilka ytterligare steg som helst som är kända enligt tidigare teknik och användes vid HA-rening kan inkluderas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning utan att dennas omfattning begränsas. För att avlägsna pyrogener eller inflammatoriska medel kan man exempelvis extrahera med välkända lösningsmedel, såsom kloroform, i vilka HY är olös- lig men lipoproteiner, glukolipider eller glukolipoproteiner är lösliga eller separeras.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning medger erhållande av HY-produkter med egenskaper som varierar inom ett brett intervall. Följande egenskaper utvärderades. De angivna me- toderna användes för att känneteckna de produkter som erhölls enligt föreliggande uppfinning.

HY-koncentrationen i lösningar bestämdes genom hexuronsyra- analys med användning av den automatiserade karbazolmetoden (E.A. Balazs, K.O. Berntsen, J. Karossa och D.A. Swann, Ana- lyt. Biochem. lg, 547-558 (1965)). Hexosaminhalten bestäm- des enligt den automatiserade kolorimetriska metoden (D.A.

Swan och E.A. Balazs, Biochim. Biophys. Acta 130, ll2-129 J;s /Ix u' \ CO G3 CD 12 (l966)).Proteinhalten i HY-lösningar bestämdes enligt fenol- reagensmetoden (Lowry et al., J. Biol. Chem. l93, 265-275 (1951)).

Formaldehydhalten i produkten bestämdes genom hydrolys av ca 0,1 g av provet i 10 ml l0 % vattenhaltig svavelsyra under 2 timmars kokning och följande ångdestillering av fri formaldehyd från den lösning som erhölls samt bestämning av formaldehyden i destillatet med användning av en kolorime- trisk metod med kromotropinsyra (M.J. Boyd och M.A. Logan, J. Biol. Chem. lgâ, 279 (1942)).

Gränsviskositetstalet (gränsviskositet intrinsic viscosity) definieras som lim (n/no - l)/c, där c och no är viskositeten för lösningen respektive lösningsmedlet och c är koncen- trationen av HY i g/cm3. Mätningarna genomfördes i vatten- haltiga 0,20M NaCl-lösningar i en utspädningsviskosimeter av kapillärtyp enligt Ubbelohde. Viskositet-medelmolekylvik- ten beräknas enligt ekvationen /n/ = 0,0228M0'8l (R.C.

Cleland och J.L. Wang, Biopolymers 2, 799 (1970)).

Vikt-medelmolekylvikten bestämmes enligt lågvinkel-laserljus- spridningsmetoden med användning av ett Chromatix KMX-6 instrument försett med en helium-neon-laseruppsättning vid 632,8 nm. Vikt-medelmolekylvikten beräknas även ur sedimen- tations- och diffusionskonstanterna som bestämts i en analy- tisk ultra-centrifug.

Den dynamiska ljusspridningsmetoden användes för att bestämma aggregationen av molekylerna i relativt koncentrerade lös- ningar av HY. Denna metod ger fördelningen av ekvívalenta sfäriska diametrar (ESD) i lösning.

Reologiska egenskaper bestämdes med Bohlin reometersystemet, som är en datoriserad reometer som kan fungera på tre sätt: viskometri, oscillation och avspänning. Följande parametrar mätes för HY-lösningen: viskositet för det breda intervallet 468 830 13 av skjuvhastigheter, dynamisk viskositet, dynamiska lagrings- moduler och dynamiska förlustmoduler för olika oscillations- frekvenser och avspänningstid.

Såsom nämnts ovan, är produkten enligt föreliggande uppfin- ning (HY) en ny polymer, som erhållits som ett resultat av en kemisk reaktion in situ mellan HA och en bryggbildare, såsom formaldehyd. Det har visat sig genom kemisk analys av HY att halten bunden (combined) formaldehyd i produkter som erhållits från tuppkammar behandlade med en formaldehydhaltig blandning låg inom intervallet från 0,005 till 0,02 viktpro- cent, räknat på polymerens vikt, beroende på de olika behand- lingsparametrarna.

Närvaron av den bundna formaldehyden i produkten bekräftades även genom ett försök, vid vilken behandlingen genomfördes med radioaktivt märkt formaldehyd l4CH2O (se exempel 12 nedan). Resultaten av försöket visar att den enligt uppfin- ningen erhållna produkten innehöll bunden formaldehyd som inte kunde avlägsnas genom upprepade utfällningar eller genom uttömmande dialys av polymerlösningarna. Detta är ett starkt bevis på förekomsten av kovalent bindning av formaldehyd vid de polymera molekylerna i produkten. För att ta reda på om formaldehyd är specifikt förenad med HA behandlades den sistnämnda med bakterie- eller blodigel-hyaluronidaser, enzy- mer som bryter ned HA specifikt. Resultaten av denna behand- ling visade att en märkbar mängd formaldehyd var kovalent bunden direkt vid HY-makromolekylerna.

Proteinhalten i den enligt uppfinningen erhållna produkten är vanligen inte mer än 0,5 %, räknat på vikten av en torr polymer, och kan vara så liten som 0,l % och ännu mindre.

Den kemiska modifieringen av hyaluronsyra genom kovalent bindning av en bryggbildare vid dess makromolekyler, med andra ord ändringarna i polymerens primära struktur, pâver- kar väsentligt dess fysikalisk-kemiska parametrar, såsom O* C92) CO (JJ 14 molekylvikt och molekylstorlek, intermolekylär interaktion och reologiska egenskaper hos polymerlösningar.

HY som erhållits enligt föreliggande uppfinning kan ha mycket hög molekylvikt. Gränsviskositetstalet kan sålunda vara högre än 7000 cm3/g, vilket motsvarar en viskositet-medelmolekyl- vikt av ca. 6 X 106. Vikt-medelmolekylvikten från ljussprid- ningsvärdena kan nå ett värde av 13 X 106. Det har visat sig att denna skillnad mellan vikt- och viskositet-medelmolekyl- vikterna är ganska viktig, såsom diskuteras närmare nedan.

En polymer med väsentligt lägre molekylvikt, t.ex. l X 106 eller mindre, kan givetvis lätt erhållas enligt metoden enligt föreliggande uppfinning, om så önskas. På liknande sätt kan en polymer med vilken önskad molekylvikt som helst erhållas, om HY vid något stadium under dess utvinning och rening exponeras för medel, vilka är kända för att bryta glukosidbindningen i polysackaridkedjan. Sådana välkända medel är specifika enzymer, t.ex. hyaluronidas, system som genererar fria radikaler, skjuvkrafter, värme, starka alka- lier och syror etc.

Den partiella specifika volymen (psv) av HY i lösning beror på lösningens jonstyrka. Den bestämdes genom densitetsmät- ning för HY-lösning i vatten som innehöll O,l5M NaCl i kon- centrationsintervallet från noll till 0,5 mg/ml och visade sig vara 0,627 cm3/g.

ESD-fördelningen för ett prov av HY löst i O,l5M NaCl-lösning i l % lösning presenteras i fig. 4. Det framgår av de angivna värdena att HY föreligger i en höggradigt aggregerad form, även om dessa aggregat är stabila och inte sedimenterar.

De reologiska egenskaperna hos en typisk produkt med ultrahög molekylvikt som framställts enligt föreliggande uppfinning presenteras i fig. l-3. Det har visat sig att denna produkt bildar lösningar (0,5 viktprocent och högre) med anmärknings- värda viskösa och elastiska egenskaper. 468 830 15 Följande parametrar kännetecknar de elastiska egenskaperna hos polymerlösningarna på bästa sätt: dynamiska lagrings- moduler (G'), frekvensen av "överkorsningspunkter" (en punkt vid vilken den dynamiska lagringsmodulen G' blir större än de dynamiska förlustmodulerna G"), fasvinkel och avspännings- tid.

HY bildar mycket viskösa lösningar i vatten eller vattenlös- ning av elektrolyter. Lösningens viskositet beror på poly- merkoncentrationen, elektrolythalten och temperaturen och minskar med skjuvningshastigheten, dvs. HY-lösningarna har väsentlig pseudoplasticitet.

När de reologiska egenskaperna hos NY-lösningar betraktas, bör man förstå att dessa egenskaper i stor utsträckning beror på produktens molekylvikt liksom ifråga om vilken annan polymer som helst. Det nämndes ovan att HY kan erhållas med en molekylvikt som varierar inom ett brett intervall och de reologiska egenskaperna varierar i enlighet därmed. Det har sålunda visat sig att för produkten med ultrahög molekylvikt (gränsviskositetstal högre än 4500 cm3/g) är viskositeten hos en l % (vikt) lösning i 0,l5M NaCl-lösning i vatten upp till 1000 Pa.s och ännu högre vid skjuvhastigheten 0,055, under det att den bara är ca 2 Pa.s för l % (vikt) lösning av polymer med ett gränsviskositetstal omkring l000 cm3/g.

Det har visat sig att de elastiska egenskaperna hos HY-lös- ningar även beror på polymerens molekylvikt. Den dynamiska lagringsmodulen G' för den l % (vikt) lösning av HY med ultra- hög molekylvikt i 0,l5M NaCl är sålunda ca 40 Pa vid en fre- kvens av 0,01 Hz, under det att den endast är ca 0,2 Pa för en lösning av HY med ett gränsviskositetstal omkring 1000 cm3/g. Frekvensen av "överkorsningspunkter“, som på ett mycket bra sätt karakteriserar förhållandet mellan elastiska och viskösa egenskaper hos polymerlösningar, är vanligen mindre än 0,025 Hz för l % (vikt) HY-lösningar i 0,l5M NaCl vid 25oC, när polymerens molekylvikt ligger inom intervallet från ca 1,5 x 106 till 8 x 106 och högre.

JE.. o-.x CJ (JJ LD '. I) 16 De fysikalisk-kemiska och reologiska egenskaperna hos ett HY-prov och dess lösning jämfördes med samma egenskaper hos en HA-produkt som erhållits enligt en välkänd metod och presenteras i tabell l och i fig. 4 och 5. Den produkt som användes för jämförelse är HA som utvunnits ur tuppkammar genom vattenextraktion och följande deproteinisering med det så kallade Sevag-förfarandet, som innefattar flera kloro- formextraktioner (G. Blix, O. Shellman, Arkiv for Kemi, Mineral Geol. l9A, l (1945)).

TABELL l JÄMFÖRANDE FYSIKALISK-KEMISKA OCH REOLOGISKA DATA FÖR HY- OCH HA-PROVER Parameter gå fiê Gränsviskositetstal, cm3/g 4729 3562 Molekylvikt från viskositets- mätningsdata, x 106 3,28 2,30 Molekylvikt från ljusspridnings- data, x 106 13,30 2,86 Molekylvikt från sedimentation- och diffusionsaata, x 106 (PSU) 13,60 2,14 Partiell specifik vo1ym, cm3/g 0,627 0,570 Reologiska egenskaper hos l % (vikt) lösning i O,l5M vattenhaltig NaCl: skjuvviskositet vid skjuvhastig- het o,055'l, Pa.s 969 305 Dynamiska lagringsmoduler (G') vid frekvens 0,01 Hz, Pa 39,8 10,1 Frekvens vid “överkorsningspunkt“, Hz 0,0056 0,035 Avspänningstid för minskning av modulerna till hälften 58 19 468 830 17 Fasvinkel, grader vid frekvens 0,002 Ha 58,7 76 vid frekvens l0 Hz 8,5 12 De data som presenteras i tabell l och i fig. 4 visar tyd- liga skillnader mellan HY och HA. För det första har visko- sitet-medelmolekylvikten och vikt-medelmolekylvikten för den kända produkten ungefär samma värden (vikt-medelmolekylvikten är något lägre), under det att för produkten enligt uppfin- ningen vikt-medelmolekylvikten är ca fyra gånger högre än viskositet-medelmolekylvikten. För det andra bevisar det större värdet för psv hos HY-lösningen i jämförelse med HA att HY-makromolekyler har större storlek. För det tredje tillhandahåller aggregationen av HY-makromolekyler i lösning väsentligt större aggregat i jämförelse med HA-lösningar, vilket inte bara tyder på större storlek hos HY-makromole- kylerna utan även på mycket starkare intermolekylär inter- aktion. Slutligen är HY-lösningar väsentligt mer viskösa och elastiska än lösningar av HA med samma koncentration.

Fastän den ökade viskositeten kan tillskrivas en högre vis- kositet-medelmolekylvikt, kan den iakttagna dramatiska ök- ningen av elasticiteten knappast förklaras på sama sätt.

Alla dessa iakttagelser leder till slutsatsen att den kemiska modifieringen av hyaluronsyra in situ före dess extraktion från vävnaden, även om den endast resulterar i mindre för- ändringar i den kemiska sammansättningen av polymeren, på samma gång åstadkommer vissa dramatiska förändringar i de fysikalisk-kemiska parametrarna och de reologiska egenskaper- na. Detta kan endast ske när förändringen i kemisk samman- sättning motsvarar några större förändringar i den makro- molekylära strukturen.

Formen och strukturen (conformation) hos HA-makromolekyler i lösning har studerats enligt olika metoder och det finns gott om litteratur om detta ämne. Dessa studier tyder på att -I :. _.

Gfl 30 CCD CJ 18 makromolekylerna har en långsträckt slumpmässig spiralkonfi- guration och fastnar i varandra vid en relativt låg koncen- tration (t.ex. 0,1 %) av polymeren i lösningen. Vid högre koncentration innehåller lösningen sannolikt ett kontinuer- ligt tredimensionellt nätverk av polymera kedjor. Glukosid- bindningarna i HA-makromolekylerna har visat sig ha en avse- värd styvhet. Flera mekanismer, såsom interaktion mellan lösningsmedel och löst ämne, interaktion med små mängder proteiner som finns närvarande i många HA-preparat, och inter- aktioner mellan kedjor har föreslagits som förklaring till dessa fenomen. (Se exempelvis E.A. Balazs, Physical Chemistry of Hyaluronic Acid, Fed. Proceed., ll, lO86-1093 (1958)).

Några författare har föreslagit en dubbel spiralformig struk- tur för HA-makromolekylerna och att dubbla spiralformiga segment skulle kunna spela en roll som tvärbindningar och tillhandahålla de ovanliga reologiska egenskaperna hos HA- lösningar (C.M. Dea, R. Moorhous, D.D. Rees, S. Arhott, J.M.

Guss och E.A. Balazs, Science, lig, 560-562 (l972); S. Arnott, A.R. Mitra och S. Raghunatan, J. Mol. Biol., låg, 861-872 (1983)).

Med hänsyn till dessa studier och iakttagelser har vi kommit fram till en hypotes att produkten enligt föreliggande upp- finning (HY) kan innehålla ett ytterligare antal tvärbind- ningar, vilka införts under behandlingen av vävnaden med ett proteinförnätande immobiliserande medel. De medel som användes enligt föreliggande uppfinning, såsom formaldehyd, är mycket reaktiva i förhållande till olika kemiska grupper, varvid deras reaktivitet i huvudsak beror på sådana reak- tionsbetingelser som pH, temperatur, koncentration etc.

Hydroxylgrupperna i hyaluronsyra reagerar tydligen inte med dessa medel under behandlingsbetingelserna, eftersom den erhållna produkten efter behandling alltid är löslig i vat- ten och sålunda inte har någon väsentlig grad av förnätad polymer. Mängden ytterligare tvärbindningar som införts i polymeren under behandlingen är troligen tillräckligt liten för att inte förorsaka olöslighet hos polymeren, men till- 468 830 19 räckligt betydelsefull för att märktbart öka interaktionen mellan makromolekyler och till följd därav elasticiteten hos polymerlösningen. Flera kandidater för en sådan reaktion med ett behandlingsmedel är acetamidogrupperna i hyaluron- syra, icke-acetylerade aminogrupper som kan föreligga i små mängder i hyaluronsyra, och amido-, amino- och andra reak- tiva grupper i proteiner som finns närvarande i den inter- cellulära matrisen i vävnaden under behandlingen. Det är knappast troligt att acetamidogrupperna i HA själva kan till- handahålla intermolekylär förnätning. Vid studier av reak- tionen mellan proteiner och formaldehyd (se exempelvis J.F.

Walker, Formaldehyde, Reinhold Publ. Corp., NY, l953, sid. 3l2-317), visade det sig att amidgrupper i ett protein inte själva kunda åstadkomma förnätning, och en av de mest troliga reaktionerna i förnätningsbildningen är en reaktion mellan formaldehyd och aminogrupper som ger N-metylolaminogrupper, vilka i sin tur reagerar med amidgrupper.

I enlighet härmed är två mekanismer möjliga för införande av ett begränsat antal tvärbindningar i HA-makromolekylerna.

Den första mekanismen innefattar reaktion melan en brygg- bildare, såsom formaldehyd, och acetamido- och fria amino- grupper i HA, vilkas existens i HA är mycket sannolik (E.A.

Balazs, Fed. Proceed. gå, 1817-1822 (1966)).

Den andra möjliga mekanismen föreslår att proteiner eller polypeptider deltager i förnätningsreaktionen. Det förekommer ständigt rapporter i litteraturen att proteiner eller poly- peptider är kovalent bundna vid HA-molekylen (Yuko Mikum- Takagaki och B.P. Toole, J. Biol. Chem. Zââ (16), 8463-8469 (1981)) eller kan associeras med HA-molekylerna på något annat sätt. I det här fallet kan tvärbindningar bildas mellan en HA-makromolekyl och en proteinmolekyldel och en annan HA- makromolekyl, eller mellan ett protein som är kovalent bun- det vid två HA-makromolekyler.

CP- cc» co w 20 Inte någon av dessa mekanismer bör betraktas som en begräns- ning av föreliggande uppfinning. Givetvis är andra mekanis- mer möjliga för införande av små mängder kovalenta tvärbind- ningar i produkten enligt uppfinningen.

I varje fall är det väsentliga kännetecknet för föreliggande uppfinning den kemiska modifieringen av HA i vävnaden under dess utvinningsförfarande, troligen genom införande av ett litet antal tvärbindningar i HA-makromolekylerna, varvid modifieringsgraden är tillräcklig för att väsentligt öka de elastiska egenskaperna hos polymerlösningarna utan att för- orsaka någon ogynnsam effekt på de gynnsamma egenskaperna hos HA, såsom dess förmåga att ge synnerligen viskösa lös- ningar i vattenhaltigt medium, biokompatibilitet etc.

Den kemiskt modifierade hyaluronsyran, HY, framställd enligt föreliggande uppfinning kan med framgång användas för många ändamål inom det biomedicinska området och i kosmetika, exempelvis som ett verktyg vid Visceral kirurgi, för belägg- ningar för förbättring av biokompatibiliteten hos olika material, som en komponent i olika farmaceutiska preparat, i hudvårdsprodukter etc. De förbättrade egenskaperna hos denna polymer, såsom en ökad elasticitet, ger väsentliga för- delar då HY användes.

HY kan även användas som utgångsmaterial för nya produkter, vilka erhålles genom ytterligare kemisk modifiering, såsom förnätning med vanliga förnätningsmedel. Det har visat sig att de speciella egenskaperna hos kemiskt modifierad HA enligt föreliggande uppfinning och dess lösningar ger en möjlighet att erhålla de ovannämnda ytterligare modifierade produkterna, vilka även har vissa ovanliga egenskaper.

Sålunda har det visat sig att ett vattenolösligt gelêliknande material kan erhållas från produkten enligt uppfinning genom förnätning med divinylsulfon i alkalisk lösning. Detta ma- terial är en höggradigt svälld gel. Polymerens koncentration i gelen beror på sammansättningen av den flytande fasen, som 468 830 21 kan vara vatten eller vattenlösningar av olika substanser med låg molekylvikt, såsom elektrolyter. Ifråga om fysiolo- gisk saltlösning (O,l5M NaCl i vatten) kan polymerkoncentra- tionen ligga inom intervallet från 0,15 till 0,40 viktprocent.

Detta material har mycket intressanta reologiska egenskaper (fig. 5, 6 och 7). Den elastiska komponenten i de komplexa dyamiska modulerna (G') är sålunda högre än förlustmodulerna (G") för alla testade frekvenser. På samma gång uppträder materialet som en pseudoplastisk kropp vid låga skjuvhastig- heter, dvs. den har en väsentlig viskositet som minskar med skjuvhastigheten. Det här materialet kännetecknas även av en mycket lång avspänningstid. Det är högst sannolikt att detta är en unik struktur hos HY-lösningar som erhållits enligt föreliggande uppfinning, som gör det möjligt att er- hålla den ovan beskrivna gelëliknande produkten med dessa speciella reologiska egenskaper. De kemiska förändringar i HA som sker under utvinningsprocessen enligt föreliggande uppfinning påverkar med andra ord inte endast strukturen och egenskaperna hos HY utan även egenskaperna hos produkter som erhållits därav. I enlighet härmed har det visat sig att när HA, som erhållits enligt tidigare kända metoder, nämligen genom avlägsnande av protein med kloroformextraktioner, användes som utgångsmaterial för förnätning med divinylsul- fon, erhölls ett olösligt material med reologiska egenskaper som i huvudsak var sämre än egenskaperna enligt föreliggande uppfinning.

Givetvis kan många andra modifierade material erhållas genom ytterligare modifiering av den enligt uppfinningen erhållna produkten, såsom starkt förnätade geler, olösliga filmer, beläggningar etc.

Följande exempel åskådliggör föredragna utföringsformer av uppfinningen utan att begränsa denna.

...Sin Ö'"~ CO CO CN 22 EXEMPEL l Tuppkammar tvättades mycket väl med en l % vattenlösning av cetylpyridiniumklorid och sedan med avjoniserat vatten och frystes slutligen. De frusna kammarna skars till skivor med en tjocklek av ca l-2 mm. En blandning som innehöll l000 g aceton, 100 g 37 % formalin och 50 g natriumacetat bereddes och 1000 g skivade kammar tillsattes. Blandningen av kammar och behandlingsvätska (pH 6,7) hölls 24 timmar vid en tempe- ratur av ca 20°C under långsam omröring. Vätskan separerades sedan från kammarna genom filtrering genom ett nylonnät. De behandlade kammarna tvättades sedan med 500 g aceton och lufttorkades till en slutlig vikt av 500 g. De torkade kam- marna blandades med 2,5 l avjoniserat vatten och extraktio- nen genomfördes under 72 timmar vid en temperatur av ca 20oC under långsam omröring. Kammarna separerades från extraktet genom filtrering genom en nylonväv och extraktet filtrera- des ytterligare genom ett filtermaterial av cellulosatyp (“Micro-media"(R)M70, Ertel Engineering Co.). HA-koncentra- tionen i detta första extrakt var 0,92 mg/ml. 2 l av extrak- tet blandades med 4 l aceton och 20 g natriumacetat. En vit fibrös fällning bildades som uppsamlades, tvättades med ace- ton och torkades i en vakuumugn vid 35°C. l,75 g produkt erhölls. Hexosamin/hexuronsyra-förhållandet för produkten visade sig vara l 1 0,05. Formaldehydhalten i produkten visa- de sig vara 0,0l50 %. Produkten identifierades sålunda som Hylan. Proteinhalten i produkten var 0,35 % och gränsvisko- sitetstalet var 4320 cm3/g.

Efter den första extraktionen blandades kammarna med 2,5 l avjoniserat vatten och extraktionen genomfördes under 48 tim- mar vid rumstemperatur. Kammarna separerades och extraktet filtrerades på ovan beskrivet sätt. HA-koncentrationen i det andra extraktet var 0,65 mg/ml. 1,26 g av produkten utvanns ur extraktet genom fällning på ovan beskrivet sätt. Denna fraktion kännetecknades även som kemiskt modifierat natrium- hyaluronat med formaldehydhalten 0,014 %. Proteinhalten var 23 0,27 % och gränsviskositetstalet var 4729 cm3/g. De reolo- giska egenskaperna hos en l % (vikt) lösning i en O,l5M NaCl-lösning i vatten bestämdes. Dessa data anges i tabell l.

En tredje vattenextraktion av kammarna genomfördes också på beskrivet sätt. HA-koncentrationen i det tredje extraktet var 0,33 mg/ml och 0,60 g HA utvanns ur detta extrakt med en proteinhalt av 0,20 %, gränsviskositetstalet 4830 cm3/g och formaldehydhalten 0,0ll5 %.

Man utvann sålunda totalt 3,61 g kemiskt modifierat natrium- hyaluronat ur l kg tuppkammar.

EXEMPEL 2 l kg skivade tuppkammar, beredda som i exempel l, blandades med en blandning av l kg aceton och 150 g 40 % (vikt) lösning av glutaraldehyd i vatten. Blandningens pH var 6,9. Bland- ningen hölls vid rumstemperatur (ca 20°C) 16 timmar under långsam omröring (ca l varv/min.). Sedan separerades kammarna från vätskan, tvättades med aceton och lufttorkades till hälften av den ursprungliga vikten. De torkade kammarna extraherades med 3 l avjoniserat vatten 96 timmar vid en temperatur av ca 20OC. Extraktet separerades från kammarna och filtrerades på det sätt som beskrivits i exempel l.

HA-halten i extraktet var 1,4 mg/ml. Produkten hade efter utfällning med aceton enligt exempel l en proteinhalt av 0,42 % och gränsviskositetstalet 3700 cm3/g.

EXEMPEL 3 Det i exempel 2 beskrivna förfarandet upprepades med undan- tag av att samma mängd 40 % (vikt) lösning av glyoxal i vat- ten användes i stället för glutaraldehydlösning. HA-koncen- trationen i extraktet var 0,92 mg/ml. Proteinhalten i pro- dukten var 0,5 % och gränsviskositetstalet var 3930 cm3/g.

CW OC? (_;\l (I) 24 EXEMPEL 4 Tuppkammar tvättades, frystes, skivades och behandlades med aceton-formaldehyd-blandningen enligt exempel l. Efter att ha torkats till hälften av sin ursprungliga vikt extra- herades kammarna med 2,5 l 0,05M natriumhydroxidlösning i vatten (pH större än ll) 120 timmar vid en temperatur av ca 20°C. Extraktet separerades och filtrerades på i exempel l beskrivet sätt. HA-koncentrationen i extraktet var 3,6 mg/ ml. En vit produkt utfälldes med aceton-natriumacetat-bland- ning, tvättades med aceton och torkades. 7,5 g av en produkt med en proteinhalt av 0,2 % och gränsviskositetstalet 1310 cm3/g utvanns.

EXEMPEL 5 Tuppkammar tvättades, frystes, skivades och l kg kammar blandades med en blandning innehållande l kg isopropropanol l0O g 37 % formalin, 50 g natriumacetat och 100 g kloroform.

Behandlingen genomfördes under långsam omröring 16 timmar vid en temperatur av ca 20oC. Extraktionen och utfällningen genomfördes på i exempel l beskrivet sätt. HA-koncentratio- nen i extraktet var 0,68 mg/ml. Proteinhalten i produkten var 0,46 % och gränsviskositetstalet var 4900 cm3/g.

EXEMPEL 6 Tuppkammar tvättades, frystes, skivades, behandlades med aceton-formaldehyd-blandning, tvättades med aceton, torkades och extraherades med vatten på i exempel l beskrivet sätt.

Extraktet blandades med en blandning av 2 l aceton och l l kloroform. 1,9 g vit fiberliknande produkt med en protein- halt av 0,05 % och gränsviskositetstalet 4400 cm3/g erhölls. 25 4-68 850 EXEMPEL 7 l kg skivade kammar, beredda på i exempel l beskrivet sätt, behandlades med en blandning innehållande l kg aceton, 50 g 37 % formalin och 50 g natriumacetat under 24 timmar vid en temperatur av ca 20oC under långsam omröring. Extraktet separerades och filtrerades och produkten utfälldes på i exempel 1 beskrivet sätt. 1,6 g vit produkt med en protein- halt av 0,45 %, gränsviskositetstalet 5300 cm3/g och en halt bunden formaldehyd av 0,008 % erhölls.

EXEMPEL 8 Förfarandet i exempel l upprepades med undantag av att kam- marna efter aceton-formaldehydbehandlingen torkades till en tredjedel av sin ursprungliga vikt och den första extraktio- nen med vatten genomfördes under 96 timmar.

HA-koncentrationen i det första extraktet var 1,05 mg/ml.

Den ur detta extrakt utfällda produkten hade en proteinhalt av 0,25 % och gränsviskositetstalet 4930 cm3/g. Ett oscilla- tionstest av en l % (vikt) lösning av denna produkt i en 0,l5M NaCl-lösning i vatten gav en “överkorsningspunkt“ vid en frekvens av 0,020 Hz.

HA-koncentrationen i det andra extraktet var 0,58 mg/ml.

Den ur detta extrakt erhållna fraktionen hade en proteinhalt av 0,19 % och gränsviskositetstalet 7300 cm3/g. Halten bun- den formaldehyd var 0,01 %. Frekvensen vid “överkorsnings- punkten" i oscillationstestet var 0,005 Hz.

Totalt utvanns 3,5 g kemiskt modifierad HA vid de tre på varandra följande extraktionerna.

EXEMPEL 9 Tuppkammar tvättades, frystes och skivades och l kg av skivor- CW CE 2350 26 na blandades med l kg aceton, 200 g 37 % formalin och 100 g kloroform. Blandningens pH justerades till 4,0 med klorväte- syra. HA-koncentrationen i det första extraktet var 0,58 mg/ ml. Produkten utvanns från extraktet genom utfällning med aceton-natriumacetat enligt exempel l. Proteinhalten i pro- dukten var 0,12 %, gränsviskositetstalet var 4025 cm3/g.

Halten bunden formaldehyd i produkten var 0,02 %. Frekvensen vid "överkorsningspunkten" i oscillationstestet för en l % (vikt) lösning av produkten i 0,l5M NaCl-lösning i vatten var 0,006 Hz.

EXEMPEL l0 Tuppkammar tvättades, frystes och skivades och l kg av ski- vorna behandlades med aceton-formaldehyd-blandning på i exempel l beskrivet sätt med undantag av att blandningens pH justerades till ll,0 med natriumhydroxid. Kammarna torkades och extraherades med vatten enligt exempel l. HA-koncentra- tionen i extraktet var 0,69 mg/ml. Produkten utfälldes ur extraktet enligt exempel l med undantag av att isopropanol användes i stället för aceton. l,3 g vitt fibröst material erhölls, som hade en proteinhalt av 0,45 %, gränsviskositets- talet 5050 cm3/g och en formaldehydhalt av 0,012 %. Frekven- sen vid "överkorsningspunkten" i oscillationstestet för en l % (vikt) lösning av produkten i 0,l5M NaCl-lösning i vatten var 0,012 Hz.

EXEMPEL ll Detta exempel åskådliggör erhållande axfettgelëliknande ma- terial från Hylan. 0,88 g av den produkt som utfälldes ur det andra extraktet i exempel l blandades med 28,3 g 0,05N NaOH-lösning i vatten och blandningen omrördes 60 minuter vid rumstemperatur. Den viskösa lösning som erhölls försattes med en blandning av 0,26 g divinylsulfon och 1,0 g O,5N NaOH i vatten. Den erhållna blandningen omrördes 10 minuter och fick sedan stå 50 minuter vid rumstemperatur. En elastisk, rs G\\ Oo Oo gu CD 27 färglös och klar gel erhölls. Gelen sattes till 0,5 1 0,15M saltlösning och lämnades över natten. Sedan avlägsnades överskottet av vätska från den höggradigt svällda gelen och 0,5 1 färsk saltlösning sattes till gelen och blandningen lämnades i en skakapparat 24 timmar. överskottet av vätska dekanterades från det svällda olösliga materialet. Ett gelé- liknande klart material erhölls. HA-koncentrationen i pro- dukten bestämdes till 0,275 viktprocent. De reologiska egen- skaperna hos materialet åskådliggöres i fig. 5, 6 och 7.

EXEMPEL 12 Behandling av tuppkammar med l4CH2Q Radioaktivt märkt paraformaldehyd (14 aktivitet av 500 mCi/g (ICN Radiochemicals) blandades i CHZO) med en specifik en mängd motsvarande 5,0 mCi med 1,0 ml 37 % (vikt) lösning av formaldehyd i vatten, som försatts med 0,1 ml 1N natrium- hydroxidlösning i vatten. Blandningen hälldes i en tätt till- sluten behållare och uppvärmdes till 60OC för upplösning av paraformaldehyden. Sedan kyldes blandningen till OOC och neutraliserades med 0,1 ml 1N ättiksyra i vatten. Den erhåll- na lösningens radioaktivitet mättes i 10 ml Hydrofluor(R) vätskescintillationsräkningsmedium (National Diagnostic) med användning av en Searle Isocap 300 vätskescintillationsräk- nare med datorkorrektion för effektivitet, baserat den externa standardmetoden. Formaldehydkoncentrationen bestämdes enligt en kolorimetrisk metod med kromotropinsyra. Den uppmätta specifika aktiviteten hos den erhållna lösningen var 0,555 mCi/mmol CHZO. Den märkta formaldehydlösningen blandades med 7,5 g aceton, 1 g kloroform och 0,5 g natriumacetat. 7,5 g skivade tuppkammar blandades med lösningen och behandlingen genomfördes under 18 timmar vid en temperatur av ca 20°C.

Kammarna separerades från vätskan, tvättades flera gånger med aceton och torkades i luft till hälften av sin ursprungliga vikt. 15 ml två gånger destillerat vatten sattes till kammarna och extraktionen fick fortgå 96 timmar vid en temperatur av CO CJ (;\| 3 28 ca 20°C. Extraktet separerades från kammarna och filtrerades genom flera skikt av filterpapper (Whatman R nummer 1).

Samma förfarande upprepades för erhållande av ett andra extrakt av kammarna. HY utfälldes från extrakten i form av ett vitt fiberliknande material genom tillsättning till ex- trakten av CH3OONa i en mängd som gav en l % (vikt) lösning och 4 volymer 95 % etanol. Det fiberliknande materialet sepa- rerades, tvättades väl med aceton, torkades och âterupplöstes sedan i vatten för att ge en lösning med en HY-koncentration av ca l mg/ml. HY återutfälldes ur denna lösning på ovan be- skrivet sätt och tvättades ånyo väl med aceton och torkades.

Det torra materialet âterupplöstes en gång till i destillerat vatten och gav en lösning som innehöll 0,84 mg/ml HY. Den specifika aktiviteten hos denna lösning uppmättes till l94 dpm*/pg HA. Uttömmande dialys av denna lösning mot 0,05M fosfatbuffert, pH 7,4, innehållande 0,l5M NaCl minskade radioaktiviteten till l03 dpm/pg HY. Uttömmande dialys av denna lösning mot 4M guanidiumhydroklorid minskade aktivite- ten till 101 dpmflug HY, som antydde att formaldehyd fanns kvar i produkten även efter behandling av lösningen under protein-dissocierande betingelser. På grundval av denna upp- mätta radioaktivitet hos produkten och den specifika aktivi- teten hos den som utgångsmaterial använda formaldehydlös- ningen beräknades halten formaldehyd i förhållande till HY som ca 0,2 viktprocent. För att bestämma hur stor del av den radioaktivt märkta formaldehyden som var associerad med HY, mottaglig för enzymatisk nedbrytning med Streptomyces-hyalu- ronidas, bereddes en annan lösning av produkten som innehöll 0,8 mg/ml HY och hade aktiviteten l250 dpm/10 Pl lösning. 2 ml av denna lösning försattes med 0,1 ml citrat-fosfat- buffert (pH 5,6) innehållande 33 TRU** Streptomyces-hyalu- ronidas (Miles Laboratories, Inc., specifik aktivitet 2000 TRU/mg HA, proteolytisk aktivitet mindre än 5 X l0l4 enheter per TRU). Ytterligare en 2 ml portion av samma lösning för- sattes med 0,1 ml av bufferten utan enzymet. Båda portionerna dialyserades 20 timmar mot 1000 volymer citrat-fosfatbuffert.

Volymerna av de båda proverna var lika stora efter dialys. * sönderfall per minut **grumlighetsreducerande enhet r\ln C \ C D CD LN 3 29 Det prov som inte hade behandlats med enzym hade en HY-kon- centration av 0,76 mg/ml och radioaktiviteten var 552 dpm/ l0 Pl. HY-koncentrationen i det med enzym behandlade provet minskades under detekterbara nivåer (10 ug/ml) och radioak- tiviteten var 414 dpm/10/ul lösning. Den hyaluronidaskänsliga radioaktiviteten motsvarade sålunda 20 dpmÅpg HY, vilket mot- svarade 0,049 viktprocent formaldehyd associerad med enzyma- tiskt nedbrytbar HY. Sådana märkta prover av produkten ana- lyserades ytterligare genom gelkromatografi på en 1,6 X 90 cm glaskolonn som var packad med glyceryl-CPG 3000, porstorlek 2869 i 8,3 % (Elektronucleonics, Inc.). Från gas befriad 0,02M boratbuffert (pH 7,5) innehållande 0,l5M NaCl användes för eluering. Den undantagna volymen av kolonnen (Vo) bestäm- 6 och den des med ett prov av HY med molekylvikten 4 X 10 totala kolonnvolymen (Vt) bestämdes med sackaros. Eluering genomfördes med en flödeshastighet av l0 ml/h vid 6OC. 5 ml fraktioner uppsamlades och analyserades för HY-koncen- tration och radioaktivitet. Det visade sig att radioaktivitet samelueras med HY i tomvolymen och att enzymatisk nedbrytning avlägsnar både HY och radioaktiviteten från tomvolymfraktio- nerna. Beräkning visade att den specifika aktiviteten asso- cierad med tomvolym-HY var 14,6 dpmápg HY, vilket motsvarar 0,036 viktprocent formaldehyd i polymeren. Denna siffra över- ensstämmer väl med den siffra som erhölls i dialysförsöket.

Variationer och modifikationer kan givetvis göras utan att man avviker ifrån uppfinningens idé och omfattning.

Claims (27)

ÅÉR RKÛ W PATENTKRAV

1. l. Metod för erhållande av ett kemiskt modifierat hyaluron- syrapreparat innefattande följande steg: (a) behandling av djurvävnad innehållande hyaluronsyra med en vattenhaltig behandlingsblandning, som inkluderar en aldehyd som är reaktiv med proteiner och hyaluronsyra, för att åstadkomma kemisk modifiering av den hyaluron- syra som ingår i vävnaden, in situ, (b) avlägsnande av överskott av behandlingsblandning från reaktionsblandningen, (c) extrahering av den kemiskt modifierade hyaluronsyran från den behandlade djurvävnaden med vatten, (d) separering av extraktet innehållande den kemiskt modi- fierade hyaluronsyran från den behandlade djurvävnaden och (e) utvinning av den kemiskt modifierade hyaluronsyran från extraktet.

2. Metod enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att aldehyden är formaldehyd, glutaraldehyd eller glyoxal.

3. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att den vattenhaltiga behandlingsblandningen inklude- rar ett med vatten blandbart lösningsmedel, som inte reagerar med aldehyden.

4. Metod enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att lösningsmedlet är en lägre keton, en lägre alkohol eller ett aprotiskt lösningsmedel.

5. Metod enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k n a d därav, att lösningsmedlet är aceton, metyletylketon, etanol, isopropanol, dimetylformamid, dimetylacetamid eller dimetyl- sulfoxid. 31 468 ßšÛ

6. Metod enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att den vattenhaltiga behandlingsblandningen om så önskas inkluderar en elektrolyt och ett i vatten olösligt organiskt lösningsmedel.

7. Metod enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att elektrolyten är natriumacetat och att det i vat- ten olösliga organiska lösningsmedlet är kloroform.

8. Metod enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a d därav, att viktförhållandet mellan vatten och med vatten blandbart lösningsmedel i behandlingsblandningen är l-5:4-8,5 och att viktförhâllandet mellan vatten och aldehyd är l-5: 0,02-l.

9. Metod enligt patentkravet 6, k ä n n e t e c k n a d därav, att behandlingsblandningen innefattar: vatten l0-50 viktdelar med vatten blandbart lösningsmedel 40-85 " aldehyd 0,2-l0 " i vatten olösligt lösningsmedel 0,5-10 " elektrolyt 0,20 " .

10. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att behandlingsblandningen har ett pH av 4-10, att viktförhållandet mellan behandlingsblandning och vävnad som skall behandlas är minst l0:l, och att behandling genomföres under 4-24 timmar vid eller under rumstemperatur.

11. ll. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att djurvävnaden är tuppkammar och att tuppkammarna är skurna i skivor med en tjocklek av l-3 mm. 468 830 32

12. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att ett överskott av behandlingsblandning avlägsnas från reaktionsblandningen genom tvättning av den behandlade vävnaden med ett lösningsmedel eller en lösningsmedel/vatten- blandning.

13. Metod enligt patentkravet 12, k ä n n e t e c k n a d därav, att det lösningsmedel som användes för tvättning av den behandlade vävnaden är samma lösningsmedel som användes i behandlingsblandningen.

14. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att extraktionen av den kemiskt modifierade hyaluron- syran sker vid en temperatur under 25oC under en tid från ca 6 timmar till flera dygn och att viktförhållandet mellan vatten och behandlad vävnad är 2-5:l, räknat på den obe- handlade vävnadens vikt.

15. Metod enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a d därav, att den behandlade vävnaden torkas till 25-50 % av sin behandlade vikt före extraktionssteget.

16. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att extraktet separeras från djurvävnaden genom filt- rering, centrifugering eller dekantering.

17. Metod enligt patentkravet 15, k ä n n e t e c k n a d därav, att separationen sker genom filtrering.

18. Metod enligt patentkravet 17, k ä n n e t e c k n a d därav, att filtreringen är ett tvâstegsförfarande, en första eller grovfiltrering genom ett nät med stora maskor för av- lägsnande av stycken av djurvävnad, och en andra eller fin- filtrering genom ett cellulosamaterial.

19. Metod enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a d därav, att den kemiskt modifierade hyaluronsyran utvinnes 33 468 830 ur extraktet genom utfällning med ett lösningsmedel och följande tvättning och torkning av den erhållna utfällda, kemiskt modifierade hyaluronsyran.

20. Metod enligt patentkravet 19, k ä n n e t e c k n a d därav, att lösningsmedlet som användes för utfällningen är aceton, etanol eller isopropanol.

21. Metod enligt patentkravet 20, k ä n n e t e c k n a d därav, att en mineralsyra eller en elektrolyt tillsättes under utfällningssteget.

22. , Metod enligt patentkravet 21, k ä n n e t e c k n a d därav, att mineralsyran är HCl, HZSO4 eller H3PO4 och att elektrolyten är natriumacetat eller NaCl.

23. Metod enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att den kemiskt modifierade hyaluronsyran avlägsnas från extraktet genom lyofilisering.

24. Metod för förnätning av den kemiskt modifierade hyaluron- syra som erhålles enligt metoden i patentkravet l, k ä n - n e t e c k n a d därav, att nämnda kemiskt modifierade hyaluronsyra underkastas en förnätningsreaktion med divinyl- sulfon under alkaliska betingelser vid rumstemperatur under en timme.

25. Produkt framställd enligt metoden i patentkravet l.

26. Produkt framställd enligt metoden i patentkravet 24.

27. Kemiskt modifierat hyaluronsyrapreparat, k ä n n e - t e c k n a t av närvaron av ca 0,005 till 0,05 viktprocent aldehydförnätande grupper, vilka är kovalent bundna vid hyaluronsyrapolymerkedjorna.