DE3607897A1 - Verfahren zur herstellung einer chemisch modifizierten hyaluronsaeurezubereitung - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer chemisch modifizierten hyaluronsaeurezubereitung

Info

Publication number
DE3607897A1
DE3607897A1 DE19863607897 DE3607897A DE3607897A1 DE 3607897 A1 DE3607897 A1 DE 3607897A1 DE 19863607897 DE19863607897 DE 19863607897 DE 3607897 A DE3607897 A DE 3607897A DE 3607897 A1 DE3607897 A1 DE 3607897A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
hyaluronic acid
water
solvent
chemically modified
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19863607897
Other languages
English (en)
Other versions
DE3607897C2 (de
Inventor
Endre A. Ft. Lee N.J. Balazs
Philip Brooklyn N.Y. Band
Adelya Fairview N.J. Leshchiner
Adolf Leshchiner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Biosurgery Inc
Original Assignee
Biomatrix Inc Ridgefield NJ
Biomatrix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomatrix Inc Ridgefield NJ, Biomatrix Inc filed Critical Biomatrix Inc Ridgefield NJ
Publication of DE3607897A1 publication Critical patent/DE3607897A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3607897C2 publication Critical patent/DE3607897C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

3607891
Beschreibung
Verfahren zur Herstellung einer chemisch modifizierten Hyaluronsäurezubereitung
Die Erfindung betrifft eine chemisch modifizierte Hyaluronsäurezubereitung, die sich durch neuartige chemische/, physikalisch-chemische und Theologische Eigenschaften auszeichnet, sowie ein neuartiges Verfahren, gemäß dem eine solche Zubereitung erhalten wird.
Hyaluronsäure, die nachfolgend einfach als HA bezeichnet wird, ist ein natürlich vorkommendes Glucosaminog lycan von hohem Molekulargewicht mit einer sich wiederholenden Disaccharideinheit von d-Glucuronsäure und N-AcetyIglucosami n-2-acet ami d-2-desoxy-d-g lucose, die durch ß1 ■> 3 glucosidisehe Bindung vereinigt sind. Die Disaccharide sind durch ß1 ■> 4 glucosi di sehe Bindungen so vereinigt, daß sie eine unverzweigte, unvernetzte Po lysaccharidkette bi Iden.
HA tritt in tierischem Gewebe, beispielsweise in Nabelschnur, Glaskörper- und Gelenkflüssigkeit, Hahnenkämmen, Haut usw. auf. Es gibt Berichte, daß das Molekulargewicht gereinigter HA im Bereich von 50 000 bis 8 000 000 liegt, je nach der Quelle, der Isolationsmethode und dem Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichts (Balazs, E.A., Fed. Proceed. 17, 1086-1093 (1958)).
Es sind verschiedene Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von HA aus tierischem Gewebe und Bakterienkulturen vorgeschlagen worden. Dazu gehört die enzymatisehe Digestion von Proteinen (E.D.T. Atkins, CF. Phelps und J.K. Sheehan, Biochem. J. 128, 1255-1263, (1972); R. Varma, R.S. Varma, W.S. Alten und A.H. Wardi, Carbohydr. Res. 32, 386-395, (1974)); Behandlung mit Ionenaustauschharzen (T.C. Laurent, J. Biol. Chem. 216, 263-271, (1955); E.R. Berman, Biochim. Biophys. Acta 58, 120-122 (1962)); Ausfällung mit kationischen Oberflächen-
aktiven Stoffen (T.C. Laurent, M. Ryan, und A. Pietruszkiewicz, Biochem. Biophys. Acta 42, 476-485 (1960)); Behandlung mit TrichLoressigsäure (H. Hofmans, 0. Schmut, H. Sterk, und H. Koop, Naturforsch. 34c, 508-511 (1979); D. Schmut, und H. Hofmans, Biochim Biophys. Acta 673, 192-196 (1981)); präparative DichtegefäLLesenkung (P. SiLpanata, J.R. Dunstone, A.6. Ogston, Biochem. J. 109, 43-50 (1968)); eLektrochemisehe Abscheidung (S. Roseman, D.R. Watson, J.F. Duff, und W.D. Robinson, Annais Rheumatic Diseases, 15, 67-68 (1955)). Man kann auch ein Verfahren anwenden, welches verschiedene Behandlungen umfaßt, ζ. B. enzymatische Digestion und Ausfällung mit Cety IpyridinchLorid (J.E. Scott, Biochem. J., 62, 31 (1956)).
Das bei der Gewinnung von HA aus jeder beliebigen biologischen Quelle auftretende Hauptproblem besteht in der Trennung des Polymerisats (HA) von Proteinen und anderen biologischen Polymerisaten, die gemeinsam mit der HA aus dem Gewebe extrahiert werden. Je nach dem Ausgangsstoff kann die Menge unerwünschter Polymerisate sehr groß sein und die Menge an HA um ein Vielfaches übersteigen. Die vorstehend genannten Verfahren zur Gewinnung von HA werden alle zur Ausfällung von HA im Labor angewendet; sie sind wegen verschiedener jedem dieser Verfahren innewohnender Nachteile kaum zur Erzeugung von HA in großem Maßstab verwendbar.
Das fortschrittlichste Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von HA im Maßstab der Großfabrikation ist in US-PS 4 141 973 (E.A. Balazs) beschrieben. Mit diesem Verfahren wird eine hochreine HA mit einem Proteingehalt von weniger als 0,5 Gew.% und einem MoLekulargewicht von mehr als 1 200 000 durch Wasserextraktion aus Hahnenkämmen oder menschLicher Nabelschnur gewonnen. Proteine und sonstige Stoffe werden mit mehreren Chloroformextraktionen bei unterschiedlichen pH-Werten entfernt. Bei einer Chloroformextraktion des Wasserextraktes bildet sich eine
8 36G7837
Grenzschicht, in der sich denaturierte Proteine und sonstige Stoffe sammeLn. Einige Stoffe, z. B. Fette werden vermutlich in der Chloroformphase lösbar gemacht. Das Verfahren kann auch eine Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, z. B. Pronase umfassen. Durch Zusammenfassen mehrerer, ziemlich ausgefeilter Behandlungen ist ein Verfahren entwickelt worden, mit dem man eine pyrogenfreie, nichtentzündliche Fraktion von HA erhalten kann. Dies Produkt wird gegenwärtig als 1 %ige Lösung unter dem Warenzeichen Healon CWz) vertrieben und in der Organchirurgie verwendet, wo es Gewebe vor mechanischer Beschädigung schützt, Raum bietet und die Handhab ujig von Geweben während der Operation erlaubt (E.A. Balazs, Healon, J. Wiley und Sohn, NY, 1983, S. 5-28).
Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand von Kurven näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der Abhängigkeit zwischen Viskosität und Schergeschwindigkeit für eine 1 Gew.%-Lösung von Hylan CHY) in wässrigem 0,15 M NaCl CV=Viskosität, S=Scherbeanspruchung);
Fig. 2 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Schwingungsversuchs an einer 1 Gew.%-Lösung von HY in wässrigem 0,15 M NaCl CV=Viskositat, F=Phasenwinkel, Gl=dynamisehe Speichermoduli, G"=Ver~ lustmoduli);
Fig. 3 eine Relaxationskurve einer 1 Gew.%-LÖsung von HY in wässrigem 0,15 M NaCl;
Fig. 4 eine graphische Darstellung der Verteilung der "Äquivalentkugeldurchmesser CESD) für eine 1 Gew.%-Lösung von HY CGrenzviskositätszahI 4 300 cm /g) in wässrigem 0,15 M NaCL;
Fig. 5 eine graphische Darstellung der Verteilung der 'Äquivalentkugeldurchmesser CESD) für eine 1 Gew.%-Lösung von HA CGrenzviskositatszah I 3 562 cm /g) in wässrigem 0,15 M NaCl;
Fig. 6 eine graphische Darstellung der gegenseitigen Abhängigkeit von Viskosität und Schergeschwindigkeit bei einem gallertartigen Produkt gemäß der Erfindung;
3607857
Fig. 7 eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Schwingungstests an einem gallertartigen Produkt gemäß der Erfindung (V=Viskosität, F=Phasenwinkel/ G'=dynamisehe Speichermoduli, G"=Verlustmoduli); und
Fig. 8 eine Relaxationskurve eines gallertartigen Produkts gemäß der Erfindung.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren geschaffen, mit dem an Ort und Stelle eine chemische Modifizierung von HA in tierischen Geweben vor der Extraktion aus denselben vorgenommen werden kann. Außerdem wird mit der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von chemisch modifizierter HA aus tierischen Geweben geschaffen. Schließlich wird durch die Erfindung eine neuartige, hochreine, pyrogenfreie, nichtentzündliche, chemisch modifizierte HA geschaffen, die ca. 0,005 bis 0,05 Gew.% Aldehydvernetzungsgruppen enthält, welche homöopolar an die Hyaluronsäurepolymerisatketten gebunden sind.
Die Erfindung geht aus von der Feststellung, daß HA in situ chemisch modifiziert werden kann, ehe es aus tierischem Gewebe extrahiert wird, wenn man das Gewebe mit einem Stoff behandelt, der mit Proteinen und HA in wässrigen Medien umsetzbar ist. Zu diesen Stoffen gehören Formaldehyd, Glutaraldehyd, Glyoxal usw. Diese chemische Modifizierung in situ ruft, wie festgestellt wurde, wesentliche Änderungen in der Primärstruktur des HA-Makromoleküls, der molekularen Größe sowie der inter- und intramolekularen Wechselwirkungen und den sich ergebenden Theologischen Eigenschaften von aus diesem modifizierten Produkt hergestellten Lösungen hervor. Deshalb ist es gerechtfertigt, dieser chemisch modifizierten HA einen neuen Namen zu geben. Es wurde beschlossen, diesen Stoff Hylan zu nennen, hier zurz bezeichnet als HY. Bei der Extraktion von HA aus tierischem Gewebe geht normalerweise eine große Menge von Proteinen mit in die Lösung. Je nach der Art des Gewebes und den Parametern der Extraktion
kann die Proteinmenge deutlich schwanken. Bei der Extraktion von HA aus Hahnenkämmen kann das GewichtsverhäLtnis von HA zu Proteinen von 1 : 0,5 bis zu 1 : 4 schwanken
(US-PS 4 303 676, E.A. Balazs). Folglich stellt die Entfernung von Proteinen die erste Schwierigkeit bei der
Gewinnung reiner HA aus tierischem Gewebe dar. Es wurde
festgestellt, daß sich bei Anwendung der vorstehend genannten vorläufigen Behandlung des Gewebes ein Wasserextrakt von HY mit wesentlich geringerem Proteingehalt ergibt als beim Weglassen einer solchen Behandlung.
Die genaue Art der bei der Behandlung des Gewebes stattfindenden chemischen Vorgänge ist nicht voll aufgeklärt, so daß die Erfindung nicht durch irgendeine spezifische chemische Umsetzung eingegrenzt sein sollte. Es wird davon ausgegangen, daß die Proteine infolge chemischer Umsetzungen zwischen Proteinen im Gewebe und einem Reagens in dem Behandlungsgemisch denaturiert und in den Geweben immobilisiert werden und folglich bei der nachfolgenden
wässrigen Extraktion unlöslich sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige Substanz verwendet werden, die mit Proteinen in
einem wasserhaltigen Medium umsetzbar ist. Es hat sich
erwiesen, daß der vorteilhafteste Stoff Formaldehyd ist. Es können aber auch andere Aldehyde, wie GlutaraIdehyd
oder Glyoxal beim erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden.
Die Behandlung des Gewebes kann in einer Lösung des Reagens in Wasser durchgeführt werden. Allerdings entsteht dabei ein wesentlicher Verlust an HY wegen seiner guten
Löslichkeit in Wasser. Deshalb wird bevorzugt, die Behandlung des Gewebes in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel durchzuführen. Das Lösungsmittel sollte mit dem für die Immobilisierung des Proteins verwendeten Reagens nicht reagieren. Zu diesen Lösungsmitteln gehören niedere Ketone,
z.B. Azeton oder MethyläthyIketon, Alkohole, wie Äthanol oder Isopropanol, aprotische Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder DimethyIsulfoxid und andere. Wird ein solches Lösungsmittel mit einem Gewebe gemischt, welches eine große Menge Wasser enthält, meistens 80-90 Gew.% oder mehr, entsteht ein Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel. Durch 'Ändern des Verhältnisses zwischen Lösungsmittel und Gewebe oder durch Hinzufügen von Wasser zum Gemisch kann das Verhältnis von Wasser zu Lösungsmittel im Gemisch auf jedes beliebige Niveau eingestellt werden. Das bevorzugte Verhältnis zwischen Wasser und Lösungsmittel wird durch die HY-Löslichkeit in dem Sinne bestimmt, daß das HY in dem für die Behandlung des Gewebes benutzten Gemisch nicht löslich sein sollte. Die HY-Löslichkeit hängt von der Art des verwendeten Lösungsmittels, dem Verhältnis Wasser:LösungsmitteI, der Anwesenheit und Konzentration eines Elektrolyten im Gemisch sowie dem pH-Wert des Gemisches ab. Durch Einführen eines Elektrolyten in das Gemisch kann die HY-LösIichkeit wesentlich herabgesetzt werden. Dazu eignet sich jeder beliebige Elektrolyt, der in dem Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel löslich ist und bei dem sich der gewünschte pH-Wert des Gemisches ergibt. Wenn z. B. Azeton als Lösungsmittel benutzt wird, läßt sich als löslicher Elektrolyt zweckmässigerweise Natriumacetat verwenden.
Die Zusammensetzung des Gemisches zur Behandlung des Gewebes kann je nach der Art des Gewebes, der Art des verwendeten Lösungsmittels, der Art des Elektrolyten usw. in weiten Grenzen schwanken. Wie schon erwähnt, sollte HY aus dem Gewebe in dem Behandlungsgemisch nicht löslich sein, dieses aber genügend Wasser enthalten, damit das Gewebe quellen kann, um die Umsetzung zwischen dem Reagens und den Gewebepolymerisaten zu erleichtern. Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung von Hahnenkämmen als Quelle von HY die Zusammensetzung des Gemisches unter Berücksichtigung des Wassers aus den Kämmen im folgenden Bereich^ ausgedrückt in Gewichtsprozent liegen kann:
. 12 3607837
Wasser 10-50, Lösungsmittel 40-85, Elektrolyt 0-20, Reagens 0,2-10. Wenn gewünscht, können mehrere verschiedene Lösungsmittel in dem gleichen Behandlungsgemisch verwendet werden. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, geringe Mengen an nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie Chloroform im Behandlungsgemisch zu verwenden. Der Gehalt an diesen Lösungsmitteln im Gemisch kann von 0,5 bis 10 Gew.% rei chen.
Der pH-Wert des Behandlungsgemisches kann je nach der Art der Reagenzien, der Zusammensetzung des Gemisches, der Temperatur und Behandlungszeit unterschiedlich sein. Bei der Gewinnung von HY aus tierischem Gewebe gemäß der Erfindung sind folgende Überlegungen äußerst wichtig. Ein Teil der Reagenzien, wie Formaldehyd kann mit Hydroxylgruppen von HA-Makromolekülen bei niedrigem pH-Wert umgesetzt werden und ein vernetztes Polymerisat ergeben, welches in Wasser unlöslich ist. Lang ausgedehnte Behandlung in einem Medium mit verhältnismäßig hohem pH-Wert führt zum Abbau von HA, und es kann nur ein Polymerisat von niedrigem Molekulargewicht gewonnen werden. Bei Verwendung eines Aldehyds als Reagens gemäß der Erfindung wurden die besten Ergebnisse mit einem pH-Wert in der Nähe des neutralen Werts, z. B. im Bereich von 4 bis 10 festgestellt.
Das Verhältnis zwischen dem Behandlungsgemisch und dem Gewebe kann innerhalb weiter Grenzen unterschiedlich sein. Die Untergrenze wird meistens dadurch festgelegt, daß das Gewebe, welches im Fall von Hahnenkämmen ziemlich voluminös ist, mindestens vollständig mit dem Gemisch bedeckt sein sollte. Die Obergrenze kann aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen gewählt werden. Bei der Behandlung von Hahnenkämmen gemäß der Erfindung ist das Verhältnis des Behandlungsgemisches zum Gewebe (berechnet auf der Basis des Trockengewichts des Gewebes) meistens höher als 10 : 1.
Die Temperatur beeinflußt die Wirksamkeit der Behandlung gemäß der Erfindung. Da allerdings HY bei hohen Temperaturen für Hydrolyse empfänglich ist, wird eine Behandlung bei Zimmertemperatur oder darunter bevorzugt, um ein Produkt mit hohem Molekulargewicht zu erhalten.
Die für das Behandeln notwendige Zeit hängt von vielen Faktoren, einschließlich der Zusammensetzung des Gemisches, der Art des Gewebes, der Temperatur usw. ab. Der Begrenzungsfaktor bei der Behandlung liegt vermutlich in der Diffusion des Reagens in die Gewebeschnipsel, und aus diesem Grund ist die Größe dieser Schnipsel ein wichtiger Parameter. Bei der Behandlung von Hahnenkämmen, die in Stückchen mit einer Dicke von 1-3 mm aufgeschnitten waren, hat sich eine Behandlungszeit im Bereich von 4-24 Stunden ergeben.
Das auf die vorstehend beschriebene Weise behandelte Gewebe wird dann mit einem Lösungsmittel oder einem Gemisch aus Lösungsmittel und Wasser gewaschen oder gespült, um die überschüssige Behandlungsmischung vom Gewebe zu entfernen. Es ist zweckmäßig, das gleiche Lösungsmittel zu verwenden wie in dem Gemisch für die Behandlung des Gewebes. Man kann eine beliebige Anzahl von Waschvorgängen vornehmen; aber es hat sich erwiesen, daß ein einmaliger Waschprozeß zufriedenstellende Ergebnisse bringt.
Das gewaschene Gewebe wird dann unmittelbar mit Wasser extrahiert, um HY zu gewinnen. Der Wirkungsgrad der Extraktion hängt, wie festgestellt wurde, von dem Verhältnis zwischen Wasser und Gewebe, dem pH-Wert der Extraktionsmittel, der Temperatur und Zeit ab. Der Wirkungsgrad der Extraktion des behandelten Gewebes kann ferner wesentlich erhöht werden, wenn zunächst das behandelte Gewebe getrocknet wird, um das Lösungsmittel zu entfernen, welches für die Behandlungs- und Waschschritte benutzt wurde. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn das Gewebe auf 1/4 bis 1/2 seines ursprünglichen Gewichts getrocknet wird.
Das Verhältnis Wasser:Gewebe beim Extraktionsschritt wird aufgrund von verschiedenen Überlegungen gewählt. Zunächst sollte genügend flüssige Phase vorhanden sein, um das Gewebe während der Extraktion zu bedecken. Andererseits sollte aber die Wassermenge nicht zu groß sein, damit die größtmögliche Konzentration an HY im Extrakt erhalten wird, damit die Menge an Fällungsmittel für den nächsten Verfahrensschritt verringert werden kann. Als bevorzugtes Verhältnis von Wasser zu Gewebe hat sich bei Hahnenkämmen ein Wert von 2 : 5^ ausgehend vom Gewicht der unbehandelten Kämme erwiesen.
Der pH-Wert der Extraktionsmittel kann je nach der gewünschten Qualität des Endprodukts neutral, sauer oder alkalisch gehalten werden. Um ein Produkt mit ultrahohem Molekulargewicht zu erhalten, hat sich erwiesen, daß der pH-Wert der Extraktionsmittel im Bereich von 6-8,5 liegen sollte. Ein höherer pH-Wert führt zu einem Anstieg der HY-Konzentration im Extrakt aber gleichzeitig zu einer Verringerung des Molekulargewichts des Produktes und zu Änderungen anderer Eigenschaften des Polymerisats, die noch näher erläutert werden. Auf jeden Fall kann man durch Steuern des pH-Wertes während der Extraktionsstufe die Eigenschaften des Endprodukts auf zweckmäßige Weise in eine gewünschte Richtung regeln.
Das behandelte Gewebe wird vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 25° C extrahiert, weil der Abbau von HY bei höheren Temperaturen das Molekulargewicht des Polymerisats wesentlich erniedrigen kann.
Die zum Extrahieren der größtmöglichen Menge an HY aus dem behandelten Gewebe nötige Zeit schwankt im wesentlichen mit anderen Parametern der Extraktion, beispielsweise dem pH-Wert, dem Verhältnis F lüssigkeit :Gewebe und der Intensität des Rührens. Es hat sich gezeigt, daß beim Extrahieren von Hahnenkämmen mit Wasser gute Ergebnisse zu erzielen sind, wenn die behandelten Kämme von 6 Stunden bis zu einigen Tagen extrahiert werden.
Das Gemisch aus behandeltem Gewebe und ExtraktionsmitteLn kann während der Extraktion umgerührt oder stehengelassen werden. Natürlich erhöht das Rühren die Diffusionsgeschwindigkeit von HY-Molekülen aus dem Gewebe in den Extrakt. Andererseits kann aber kräftiges Rühren zum Abbau von HY und damit zu einer Erniedrigung des Molekulargewichts führen. Darüberhinaus hat sich gezeigt, daß kräftiges Rühren eine Desintegration des Gewebes verursacht, was es schwierig macht, das Gewebe vom Extrakt zu trennen. Deshalb wird vorzugsweise der Extraktionsschritt ohne Rühren oder mit sehr langsamem und sanftem Rühren durchgefüh rt.
Nach der Extraktion wird das Gewebe vom Extrakt durch Anwendung eines von mehreren bekannten Verfahren, z. B. Filtrieren, Zentrifugieren, Dekantieren oder dgl. getrennt. Als einfachster und wirtschaftlicher Weg hat sich das Filtrieren erwiesen. Je nach der Art des als Ausgangsmaterial verwendeten Gewebes kann eine zweistufige Filtration bevorzugt werden. So können im Fall von Hahnenkämmen große Gewebestücke ohne weiteres durch Trennen durch ein Nylongewebe abgetrennt werden und die feine Reinigung des Extraktes durch Filtrieren durch ein beliebiges dichtes Filtermedium, beispielsweise einen zellulosehalt igen Stoff erzielt werden.
Die HY-Konzentration im Extrakt hängt von vielen Faktoren, einschließlich des pH-Wertes während der Extraktion, der Zeit, dem Verhältnis Flüssigkeit:Gewebe und der Intensität beim Rühren ab und liegt meistens im Bereich von 0,3 bis 3,0 mg/ml und manchmal noch darüber. In einigen Fällen, wenn die HY-Konzentration im Extraktzur niedrigen Seite hin liegt, hat es sich als wünschenswert erwiesen, das Gewebe ein zweites Mal zu extrahieren. Dabei hat sich gezeigt, daß das aus dem zweiten Extrakt ausgefällte Produkt meistens ein höheres Molekulargewicht im Vergleich zum HY aus dem ersten Extrakt hat. Das läßt sich dadurch erklären, daß die Fraktionen von HY mit niedrigerem Mole-
kulargewicht Leichter aus dem Gewebe in den Extrakt diffundieren und das aus dem ersten Extrakt ausgefäLlte Produkt mit diesen Fraktionen angereichert ist.
Es können auch mehr als zwei Extraktionen angewendet werden, um die höchstmögliche Ausbeute zu erzielen; aber die Konzentration an HY im Extrakt nimmt mit jeder nachfolgenden Extraktion ab.
HY kann aus den Filtraten mit Hilfe eines beliebigen bekannten Verfahrens gewonnen werden. Das zweckmäßigste Verfahren besteht im Ausfällen mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Azeton, Äthanol, Isopropanol usw. Die Ausfällung kann in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphorsäure usw. oder in Gegenwart neutraler Elektrolyten wie Natriumacetat, Natriumchlorid und deren Salzen vorgenommen werden. HY und seine Salze werden üblicherweise als ein weißes, faserartiges Material oder als Pulver niedergeschlagen. Der Niederschlag kann mit dem gleichen Lösungsmittel, welches für die Ausfällung verwendet wird, oder mit einem beliebigen anderen Lösungsmittelgetti sch gewaschen werden, welches das Produkt nicht auflöst, z. B. "Äther. Das gewaschene Produkt kann auf beliebige bekannte Weise getrocknet oder unter einer Schicht aus Lösungsmittel, wie Azeton, Äthanol usw. gelagert werden. Andererseits kann das Filtrat aber auch gefriergetrocknet werden.
Es liegt auf der Hand, daß beliebige weitere bekannte Schritte, die für die Reinigung von HA angewandt werden, im Verfahren gemäß der Erfindung mitvorgesehen werden können, ohne daß der Rahmen dadurch eingeengt wird. So kann z. B. zum Entfernen von Pyrogenen oder entzündlichen Stoffen eine Extraktion mit bekannten Lösungsmitteln, wie Chloroform vorgesehen werden, in welchem HY unlöslich aber Lipoproteine, Glycolipide oder Glycolipoproteine lösbar oder trennbar sind.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht es, HY-Produkte zu erhalten, deren Eigenschaften in einem sehr breiten Bereich variieren und von denen die folgenden ausgewertet wurden. Die genannten Verfahren wurden angewandt, um die gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte zu charakterisieren.
Die HY-Konzentration in Lösungen wurde unter Anwendung des automatisierten Carbazolverfahrens mittels der Hexuronsäureprüfung bestimmt (E.A. Balazs, K.O. Berntsen, J. Karossa und D.A. Swann, Analyt. Biochem. 12, 547-558 (1965)). Der HexosamingehaIt wurde mittels des automatisierten kolorimetrisehen Verfahrens bestimmt (D.A. Swan und E.A. Balazs, Biochem. Biophys. Acta 130, 112-129 (1966)). Der ProteingehaLt von HY-Lösungen wurde mittels der Phenolreagensmethode bestimmt (Lowry et al., J. Biol. Chem 193, 265-275 (1951)).
Der Formaldehydgehalt im Produkt wurde mittels Hydrolyse von ca. 0,1 g der Probe in 10 ml 10 %iger, wässriger Schwefelsäure während 2 Stunden unter Sieden, gefolgt von einer Dampfdesti I lation des freien Formaldehyds aus der erhaltenen Lösung bestimmt, wobei das Formaldehyd im Destillat unter Anwendung eines kolorimetrischen Verfahrens mit chromotroper Säure bestimmt wurde (M.J. Boyd und M.A. Logan, J. Biol. Chem., 146, 279 (1942)).
Die begrenzende Viskositätszahl oder Grenzviskositätszahl (Grundviskosität) wird bestimmt als lim (n/no - I) /c, worin "n" und "no" die Viskositäten der Lösung bzw. des Lösungsmittels und "c" die Konzentration von HY in g/cm bedeuten. Die Messungen wurden in wässrigen 0,20 M NaCl-Lösungen in einem KapiIlarviskosimeter nach Ubbelohde vorgenommen. Der Wert Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht wird mittels der Gleichung fnj = 0,0228 M °'81 berechnet (R.C. Cleland und J.L. Wang, Biopolymers 9, 799 (1970)).
Der Wert Gewicht-DurchschnittsmoLekuLargewicht wird mittels der Lichtstreumethode mit einem NiedrigwinkeL Laser bestimmt, wozu ein Instrument Chromatix KMX-6 ausgestattet mit einem auf einer WelLenlänge von 632,8 nm eingestellten Helium-Neon-Laser verwendet wird. Der Wert Gewi cht-DurchschnittsmoLekuLargewicht wird auch anhand der in einer analytischen Ultrazentrifuge bestimmten Sedimentations- und Diffusionskonstanten berechnet.
Das dynamische Lichtstreuverfahren wird angewandt, um die Ansammlung der Moleküle in verhältnismäßig stark konzentrierten Lösungen von HY auszuwerten und ergibt die Verteilung von Äquivalentkugeldurchmessern CESD) in Lösung.
Die Theologischen Eigenschaften wurden mit dem Bohlin Rheometersystem ausgewertet, bei dem es sich um ein rechnergestütztes Rheometer handelt, welches auf dreierlei Weise arbeiten kann: Viskosimetrie. Oszillation und Relaxation. Für die HY-Lösung werden folgende Parameter gemessen: Viskosität für den weiten Bereich von Schergeschwindigkeiten, dynamische Viskosität, dynamische Speichermoduli und dynamische Verlustmoduli für verschiedene Schwingungsfrequenzen und Relaxationszeit.
Wie schon erwähnt, ist das Produkt (HY) gemäß der Erfindung ein neues Polymerisat, welches als Ergebnis der chemischen Reaktion in situ zwischen HA und einem Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd erhalten wird. Durch chemische Analyse von HY hat sich gezeigt, daß der Gehalt an gebundenem Formaldehyd in Produkten, die aus mit einem formaldehydhaltigen Gemisch behandelten Hahnenkämmen erhalten wurden, je nach den verschiedenen Parametern der Behandlung im Bereich von 0,005 bis 0,02 Gew.%, berechnet auf der Basis des Gewichts des Polymerisats, lag.
Das Vorhandensein des gebundenen Formaldehyds im Produkt wurde auch durch einen Versuch nachgewiesen, bei dem die
Behandlung mit einem radioaktiv markierten Formaldehyd
CHpO durchgeführt wurde (siehe Beispiel 12 unten). Die Ergebnisse des Versuchs zeigen, daß das erfindungsgemäß erhaltene Produkt gebundenes Formaldehyd enthielt, welches weder durch wiederholte Ausfällungen noch durch erschöpfende Dialyse der Polymerisat lösungen entfernt wei— den konnte. Das ist ein starker Beweis für das Vorliegen einer kovalenten Bindung des Forma Idehyds an die polymeren Moleküle des Produktes. Um festzustellen, ob Formaldehyd speziell an HA gebunden ist, wurde die Hyaluronsäure mit bakteriellen oder Blutegel-Hyaluronidasen, Enzymen, die speziell HA abbauen, behandelt. Die Ergebnisse dieser Behandlung zeigten, daß eine merkbare Menge Formaldehyd kovalent unmittelbar an die HY-Makromoleküle gebunden war.
Der Proteingehalt in dem erfindungsgemäß erhaltenen Produkt liegt normalerweise nicht über 0,5 %, berechnet auf der Basis des Gewichts eines trockenen Polymerisats, und kann sogar nur 0,1 % und noch weniger betragen.
Die chemische Modifikation der Hyaluronsäure durch homöopolare Bindung eines Vernetzungsmittels an ihre Makromoleküle, mit anderen Worten die Änderungen der Primärstruktur des Polymerisats haben einen wesentlichen Einfluß auf die physikalisch-chemischen Parameter, wie das Molekulargewicht und die Molekulargröße, die intermolekulare Wechselwirkung und auch auf Theologische Eigenschaften der Po lymerisat lösungen .
Gemäß der Erfindung erhaltenes HY kann ein sehr hohes Molekulargewicht haben. So kann die Grenzviskositätzahl über 7 000 cm /g liegen, was einem Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht von ca. 6 χ 10 entspricht. Das sich anhand der Lichtstreudaten ergebende Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht kann einen Wert von 13 χ 10 erreichen. Diese Diskrepanz zwischen Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht und Viskosität-Durchschnittsmo-
lekulargewicht kann ziemLich bedeutungsvoLL sein, wie noch näher erläutert wird. Es sei daran erinnert, daß ein Polymerisat mit erheblich niedrigerem Molekulargewicht, z. B. 1 χ 10 oder darunter ohne weiteres mit dem Verfahren gemäß der Erfindung erhalten werden kann, wenn das gewünscht wird. Ähnlich kann ein Polymerisat mit einem beliebigen gewünschten Molekulargewicht erhalten werden, wenn HY auf beliebiger Stufe seiner Gewinnung und Reinigung Mitteln ausgesetzt wird, von denen bekannt ist, daß sie die Glucosidbindung der Polysaccharidkette brechen. Zu diesen bekannten Mitteln gehören spezifische Enzyme, z. B. Hyaluronidase, freie Reste erzeugende Systeme, Scherkräfte, Wärme, starke Alkalien und Säuren usw.
Das partielle spezifische Volumen (psv) von HY in Lösung hängt von der Ionenstärke der Lösung ab. Es wurde mittels Dichtemessung für HY-Lösung in Wasser bestimmt, welches 0,15 M NaCl im Konzentrationsbereich von 0 bis 0,5 mg/ml enthielt,und betrug 0,627 cm /g.
Fig. 4 zeigt die Verteilung der ÄquivalentkugeLdurchmesser (ESD) in 1 %iger Lösung für eine HY-Probe, die in einer 0,15 M NaCl-Lösung aufgelöst war. Es ergibt sich anhand der dargestellten Daten, daß HY in einer sehr stark zusammengeballten Form existiert, obwohl diese Zusammenbai Lungen stabil sind und sich nicht absetzen.
In den Fig. 1-3 sind die Theologischen Eigenschaften eines typischen erfindungsgemäß hergestellten Produkts mit ultrahohem Molekulargewicht dargestellt. Es wurde festgestellt, daß das Produkt Lösungen (0,5 Gew.% und höher) mit bemerkenswerten viskoelastisehen Eigenschaften bi Idet.
Die folgenden Parameter geben das beste Bild von den elastischen Eigenschaften der Polymerisat lösungen : Dynamische Speichermoduli (G1), Frequenz des "Kreuzungspunktes" (ein Punkt, an dem die dynamischen Speichermo-
duLi G1 größer werden als die dynamischen VerlustmoduLi G"),Phasenwinkel und Relaxationszeit.
HY bildet sehr viskose Lösungen in Wasser oder Wasserlösungen von Elektrolyten. Die Viskosität der Lösung hängt von der Polymerisatkonzentration, dem Elektrolytgehalt und der Temperatur ab und nimmt ab mit der Schergeschwindigkeit, d.h. daß die HY-Lösungen eine wesentliche Pseudop lastiζitat haben.
Bei einer Betrachtung der Theologischen Eigenschaften von HY-Lösungen ist zu bedenken, daß diese Eigenschaften stark abhängig sind vom Molekulargewicht des Produktes, wie bei jedem anderen Polymerisat auch. Es wurde schon erwähnt, daß HY mit einem Molekulargewicht erhalten werden kann, welches innerhalb weiter Grenzen schwankt, und dementsprechend unterschiedlich sind die Theologischen Eigenschaften. So hat sich gezeigt, daß bei einem Produkt mit ultrahohem Molekulargewicht (Grenzviskositätszah I über 4500 cm3/g) die Viskosität einer 1 Gew.%-Lösung in 0,15 M NaCl-Lösung in Wasser bei einer Schergeschwindigkeit von 0,055 bis zu 1000 Pa.s und noch darüber beträgt, während sie nur ca. 2 Pa.s bei einer 1 Gew.%-Lösung eines Polymerisats mit einer Grenzviskositätszahl von ca. 1000 cm /g beträgt. Es hat sich gezeigt, daß die elastischen Eigenschaften von HY-Lösungen auch vom Molekulargewicht des Polymerisats abhängen. So ist der Wert der dynamischen Speichermoduli G1 für eine 1 Gew.%-Lösung von HY mit ultrahohem Molekulargewicht in 0,15 M NaCl ca. 40 Pa bei einer Frequenz von 0,01 Hz, während dieser Wert nur ca. 0,2 Pa bei einer Lösung von HY mit einer Grenzviskositätszahl von ca. 1000 cm /g beträgt. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes", die eine gute Charakterisierung des Verhältnisses zwischen elastischen und viskosen Eigenschaften der Polymerisat lösungen darstellt, ist meistens weniger als 0,025 Hz bei 1 Gew.%-HY-Lösungen in 0,15 M NaCl bei 25° C, wenn das Molekulargewicht des Polymerisats im Bereich von ca. 1,5 χ 10 bis 8 χ 10 und darüber liegt.
Die physikalisch-chemischen und rheoLogise hen Eigenschaften einer HY-Probe und deren Lösung wurden mit den gleichen Eigenschaften eines gemäß einem bekannten Verfahren erzielten HA-Produktes verglichen und sind in Tabelle 1 sowie in Fig. 4 und 5 aufgeführt. Das zum Vergleich herangezogene Produkt ist HA, gewonnen aus Hahnenkämmen durch Wasserextraktion, gefolgt von einer Entproteinisierung nach dem sogenannten Sevag-Verfahren, welches mehrere Chloroformextraktionen beinhaltet CG. Blix, 0. Shellman, Arkiv for Kemi, Mineral Geol. 19A, 1 (1945)).
Tabelle 1
Physikalisch-chemische und Theologische Vergleichsdaten
von HY- und HA-Proben
Parameter
GrenzviskositatszahI, cm /g Molekulargewicht aus Viskosimetriedaten, χ 10
Molekulargewicht aus Lichtstreudaten, χ 10 6
Molekulargewicht aus Sedimentations-Diffusionsdaten, χ 10
(PSU) 13,60 2,14
Partielles spezifisches Volumen
(psv), cm3/g 0,627 0,570
Rheologische Eigenschaften einer
1 Gew.%-Lösung in 0,15 M wässrigem
NaCl: Scherviskosität bei Schergeschwindigkeit 0,055~1, Pa.s 969 305 Dynamische Speichermoduli (G1)
bei 0,01 Hz Frequenz, Pa 39,8 10,1
Frequenz am "Kreuzungspunkt11, Hz 0,0056 0,035 Relaxationszeit zur Reduzierung
der Moduli um die Hälfte 58 19
Phasenwinkel, °
bei 0,002 Hz Frequenz 58,7 76
bei 10 Hz Frequenz 8,5 12
al ,28 3 HA 30
4 729 ,30 562 86
3 2,
13 2,
Die in TabeLle 1 und Fig. 4 angegebenen Daten zeigen deutliche Unterschiede zwischen HY und HA. Zunächst zeigen sich für das bekannte Produkt etwa die gleichen Werte fjr Viskosität-DurchschnittsmolekuLargewicht und Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht (das Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht ist etwas niedriger), während für das Produkt gemäß der Erfindung der Wert Gewicht-Durchschnittsmolekulargewicht etwa viermal höher ist als der Wert Viskosität-Durchschnitt smoleku largewi cht . Zweitens beweist der höhere Wert für psv der HY-Lösung im Vergleich zu HA, daß die Größe der HY-MakromoleküIe größer ist. Drittens führt die Aggregation von HY-Makromolekülen in der Lösung zu wesentlich größeren Zusammenballungen im Vergleich zu HA-Lösungen, was nicht nur auf größere HY-Makromoleküle sondern auch auf eine viel stärkere intermolekulare Wechselwirkung schließen läßt. Schließlich sind HY-Lösungen wesentlich stärker viskos und elastisch als gleich stark konzentrierte Lösungen von HA. Obwohl die gesteigerte Viskosität einem höheren Wert Viskosität-Durchschnittsmolekulargewicht zugeschrieben werden kann, ist die zu beobachtende dramatische Zunahme der Elastizität kaum mit dem gleichen Argument zu erklären.
All diese Beobachtungen haben zu dem Schluß geführt, daß die chemische Modifizierung von Hyaluronsäure in situ vor der Extraktion aus dem Gewebe, auch wenn sie nur zu geringfügigen Änderungen der chemischen Zusammensetzung des Polymerisats führt, zur gleichen Zeit doch zu einigen gewaltigen Änderungen der physikalisch-chemischen Parameter und Theologischen Eigenschaften führt. Das kann nur geschehen, wenn die Änderung in der chemischen Zusammensetzung einigen bedeutenden Änderungen in der makromolekularen Struktur entspricht.
Die Gestalt und der Bau von HA-Makromolekülen in Lösung ist anhand verschiedener Verfahren untersucht worden, und es gibt eine ganze Menge Literatur zu diesem Thema. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, daß die Makromoleküle
eine gestreckte, willkürliche Wendelgestalt haben und sich bei verhältnismäßig geringer Konzentration Cz. B. 0,1 %) des Polymerisats in der Lösung miteinander verheddern. Es wird vermutet, daß die Lösung bei höherer Konzentration ein kontinuierliches, dreidimensionales Netzwerk von polymeren Ketten enthält. Die Glucosidbindungen in den HA-Makromo lekülen haben sich als von beträchtlicher Steifheit erwiesen. Um diese Erscheinungen zu erklären, sind verschiedene Mechanismen vorgeschlagen worden, wie die Wechselwirkung zwischen Lösungsmittel und Gelöstem, die Wechselwirkung mit kleinen Mengen Protein, die in vielen HA-Zubereitungen vorhanden sind, sowie Wechse Iwirkungen zwisehen Ketten (siehe z. B. E.A. Balazs, Physical Chemistry of Hyaluronic Acid, Fed. Proceed., 17, 1086-1093 (1958)). Einige Autoren haben eine Doppelwendelstruktur für HA-Makromoleküle vorgeschlagen und gemeint, daß Doppelwendelsegmente die Rolle von Querverbindungen spielen könnten, welche die ungewöhnlichen Theologischen Eigenschaften von HA-Lösungen erklären (CM. Dea, R. Moorhous, D.D. Rees, S. Arhott, J.M. Guss und E.A. Balazs, Science, 179, 560-562 (1972); S. Arnott, A.R. Mitra und S. Raghunatan, J. Mol. Biol. 169, 861-872 (1983)).
Unter Berücksichtigung dieser Untersuchungen und Beobachtungen ist die Anmelderin zu der Hypothese gelangt, daß das Produkt gemäß der Erfindung, nämlich HY eine zusätzliche Anzahl von Verknüpfungen enthalten kann, die während der Behandlung des Gewebes mit einem Proteinvernetzungsimmobilisator entstehen. Diese erfindungsgemäß eingesetzten Mittel, wie Formaldehyd sind sehr umsetzungsfähig gegenüber verschiedenen chemischen Gruppen, wobei ihr Umsetzungsvermögen wesentlich von Umsetzungsbedingungen wie dem pH-Wert, der Temperatur, Konzentration usw. abhängt. Die Hydroxylgruppen von Hyaluronsäure werden offensichtlich mit diesen Mitteln unter den Behandlungsbedingungen nicht umgesetzt, da das nach der Behandlung erhaltene Produkt immer in Wasser löslich ist und folglich
keinen nennenswerten Grad an vernetztetn Po Lymeri sat enthält. Die Menge der während der Behandlung in das Polymerisat eingeführten zusätzlichen Verknüpfungen ist vermutlich so klein, daß sie keine Unlöslichkeit des Polymerisats hervorruft, aber andererseits signifikant genug, um die Wechselwirkung zwischen Makromolekülen und folglich die Elastizität der Polymerisat lösung merklich zu erhöhen. Verschiedene Kandidaten für eine solche Umsetzung mit einem Behandlungsmittel sind die Acetamido-Gruppen von Hyaluronsäure, nichtacetylierte Amino-Gruppen, die in kleinen Mengen in HA vorhanden sein können, und Amido-, Amino- und andere umsetzungsfähige Gruppen von Proteinen, die in der interzellulären Matrix des Gewebes während der Behandlung vorhanden sind. Es ist kaum wahrscheinlich, daß die Acetamido-Gruppen von HA selbst die intermolekulare Verknüpfung herstellen können. In den Untersuchungen über die Umsetzung von Proteinen mit Formaldehyd (siehe z. B. J.F. Walker, Formaldehyde, Reinhold Publ. Corp., NY, 1953, S. 312-317) wurde festgestellt, daß Amid-Gruppen eines Proteins selbst keine Verknüpfung hervorrufen, und eine der am wahrscheinlichsten auftretenden Reaktionen bei der Bildung der Verknüpfung ist eine Umsetzung von Formaldehyd mit Amino-Gruppen, die N-MethyIol-amino-Gruppen ergibt, welche ihrerseits mit Amid-Gruppen reagieren.
Folglich sind zwei Mechanismen möglich, um eine begrenzte Anzahl von Verknüpfungen in HA-Makromolekülen hervorzurufen. Der erste Mechanismus beinhaltet die Umsetzung zwischen einem Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd und Acetamido- und freien Amino-Gruppen von HA, deren Vorhandensein in HA ziemlich wahrscheinlich ist (E.A. Balazs, Fed. Proceed. 25, 1817-1822 C1966)).
Der zweite mögliche Mechanismus läßt auf die Beteiligung von Proteinen oder Polypeptiden an der Vernetzungsreaktion schließen. Es gibt beharrliche Berichte, daß Proteine oder Polypeptide kovalent an das HA-Molekül gebunden sind (Yuko Mikum-Takagaki und B.P. Toole, J. Biol.
Chem. 256 (16), 8463-8469 (1981)) oder auf andere Weise mit HA-MoleküLen assoziiert werden können. In diesem
FaLL können Verknüpfungen zwischen einem HA-MakromoLeküL und einem ProteinanteiL und einem weiteren HA-MakromoleküL oder zwischen einem kovaLent an zwei HA-MakromoLeküLe gebundenen Protein gebiLdet werden.
Keiner dieser Mechanismen soLLte jedoch aLs einschränkend für die Erfindung aufgefaßt werden. Es sei darauf hingewiesen, daß auch andere Mechanismen für die Einführung
kLeiner Mengen kovaLenter Verknüpfungen in das Produkt
gemäß der Erfindung mögLich sind.
Auf jeden FaLL besteht das wesentLiche MerkmaL der Erfindung in der chemischen Modifizierung von HA im Gewebe
während des Gewinnungsprozesses, vermutLich durch Einführen kLeiner ZahLen von Verknüpfungen in die HA-MakromoLeküLe, wobei der Grad der Modifizierung ausreicht, um die eLastischen Eigenschaften der PoLymerisat Lösungen wesentlich zu erhöhen,ohne eine nachteilige Auswirkung auf die günstigen Eigenschaften von HA zu haben, wie dessen Fähigkeit, stark viskose Lösungen in wässrigem Medium zu Liefern, BiokompatibiLität, usw.
Die erfindungsgemäß hergestellte, chemisch modifizierte
HyaLuronsäure, nämlich HY kann erfolgreich für viele
Zwecke auf dem biomedizinischen Gebiet und in der Kosmetik eingesetzt werden, z. B. als Werkzeug in der Organchirurgie, als Beschichtung, um die Biokompatibilität
verschiedener Stoffe zu verbessern, als Bestandteil verschiedener pharmazeutischer Produkte, für HautpfLegeerzeugnisse und dgl. Die verbesserten Eigenschaften dieses Polymerisats, wie seine größere Elastizität ergeben beim Gebrauch von HY wesentliche Vorteile.
HY kann auch als Ausgangsstoff für neue Produkte benutzt werden, die durch zusätzliche chemische Modifizierung,
beispielsweise Verknüpfung mittels herkömmlicher Vernet-
zungsmittel erhalten werden. So wurde festgesteLLt, daß die besonderen Eigenschaften chemisch modifizierter HA gemäß der Erfindung und ihrer Lösungen die Möglichkeit bieten, die vorstehend genannten, zusätzlich modifizierten Erzeugnisse zu erhalten, die gleichfalls einige ungewöhnliche Eigenschaften haben. Ein in Wasser unlösliches, gallertartiges Material kann z. B. aus dem Erzeugnis gemäß der Erfindung durch Vernetzung mit Divinylsutfon in alkalischer Lösung erhalten werden. Hierbei handelt es sich um ein stark gequollenes Gel. Die Konzentration des Polymerisats in dem Gel hängt von der Zusammensetzung der flüssigen Phase ab, bei der es sich um Wasser oder Lösungen in Wasser von verschiedenen Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Elektrolyten handeln kann. Im Fall einer physiologischen Salzlösung (0,15 M NaCl in Wasser) kann die Polymerisatkonzentration im Bereich von 0,15 bis 0,40 Gew.% liegen. Dieser Stoff hat sehr interessante Theologische Eigenschaften (Fig. 5, 6 und 7). So ist die elastische Komponente der komplexen dynamischen Moduli (G1) höher als die Verlustmoduli (G") bei allen untersuchten Frequenzen. Gleichzeitig verhält sich der Stoff wie ein pseudoplastischer Körper bei niedrigen Schergeschwindigkeiten, mit anderen Worten, er hat eine wesentliche Viskosität, die mit der Schergeschwindigkeit abnimmt. Der Stoff zeichnet sich auch durch eine sehr lange Relaxationszeit aus. Es wird stark vermutet, daß es sich um eine einmalige Struktur von Lösungen von erfindungsgemäß erhaltenem HY handelt, die es möglrch macht, das vorstehend genannte gallertartige Produkt mit diesen speziellen Theologischen Eigenschaften zu erhalten. Anders ausgedrückt, die chemischen 'Änderungen in HA, die in dem erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahren auftreten, beeinflussen nicht nur die Struktur und Eigenschaften von HY sondern auch die Eigenschaften von daraus erhaltenen Produkten. So wurde festgestellt, daß bei Verwendung von gemäß bekannter Verfahren erhaltener HA, nämlich durch Proteinentfernung mit Chloroformextraktionen als Ausgangsstoff für die Vernetzung mit DivinyIsulfon ein unlösliches
Material erhalten wurde, dessen Theologische Eigenschaften wesentlich schlechter waren als die gemäß der Erfindung .
Es sei darauf hingewiesen, daß durch zusätzliche Modifizierung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes viele weitere modifizierte Stoffe erhalten werden können, z.B. stark vernetzte Gele, unlösliche Filme, Beschichtungen usw.
Die nachfolgenden Beispiele geben bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung wieder, ohne diese jedoch zu beschränken.
Bei spi el 1
Hahnenkämme wurden ausgiebig mit einer 1 %igen Lösung von CetyIpyridinchlorid in Wasser und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen und schließlich gefroren. Die gefrorenen Kämme wurden in einer Schnitzelmaschine in Stücke mit einer Dicke von ca. 1-2 mm geschnitten. Es wurde ein Gemisch aus 1000 g Azeton, 100 g eines 37 %igen Formalin und 50 g Natriumacetat zubereitet und diesem 1000 g geschnitzelte Kämme hinzugefügt. Das Gemisch aus Kämmen und Behandlungsflüssigkeit CpH 6,7) wurde unter langsamem Rühren 24 Stunden auf einer Temperatur von ca. 20° C gehalten. Dann wurde die Flüssigkeit durch Filtrieren durch ein Nylonsieb von den Kämmen getrennt. Die behandelten Kämme wurden dann mit 500 g Azeton gewaschen und an Luft auf ein endgültiges Gewicht von 500 g getrocknet. Die getrockneten Kämme wurden mit 2,5 I entionisiertem Wasser gemischt und eine Extraktion 72 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C unter langsamem Rühren durchgeführt. Die Kämme wurden vom Extrakt durch Filtrieren durch eine Nylonmaschenware getrennt, und der Extrakt wurde zusätzlich durch ze Ilulosehaltiges Filtermaterial filtriert ("Micro-media" CWz), M70, Ertel Engineering Co.). Die HA-Konzentration dieses ersten Extraktes betrug 0,92 mg/ml. Dann wurden 2 I dieses Extraktes mit 4 I Azeton
. 29 3607397
und 20 g Natriumacetat gemischt. Dabei biLdete sich eine weiße, fasrige Abscheidung, die gesammelt, mit Azeton gewaschen und in einem Vakuumofen bei 35° C getrocknet wurde. Als Produkt wurde 1,75 g erhalten. Das Verhältnis Hexosamin:Hexuronsäure für das Produkt erwies sich als 1 +_ 0,05. Der Formaldehydgehalt im Produkt war 0,0150 %. Das Produkt wurde so als Hylan identifiziert. Der Proteingehalt des Produktes betrug 0,35 % und die Grenzviskositätszahl war 4 320 cm /g.
Nach der ersten Extraktion wurden die Kämme mit 2,5 I entionisiertem Wasser gemischt und die Extraktion 48 Stunden lang bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Die Kämme wurden abgesondert und der Extrakt filtriert, wie vorstehend beschrieben. Die HA-Konzentrat ion im zweiten Extrakt betrug 0,65 mg/ml. Aus dem Extrakt wurde durch Ausfällung wie oben beschrieben 1,26 g an Produkt erhalten. Diese Fraktion wurde auch als chemisch modifiziertes Natriumhyaluronat gekennzeichnet, dessen Formaldehydgehalt 0,014 % betrug. Der Proteingehalt war 0,27 % und die Grenzviskositätszahl 4 729 cm Iq. Es wurden die rheologischen Eigenschaften in Wasser einer 1 Gew.%-Lösung in wässriger 0,15 H NaCl-Lösung ausgewertet. Diese Daten sind in Tabelle 1 angegeben.
Es wurde auch eine dritte Wasserextraktion der Kämme wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die HA-Konzentration im dritten Extrakt betrug 0,33 mg/ml und aus diesem Extrakt wurde 0,60 g HA gewonnen, dessen Proteingehalt 0,20 % betrug und dessen Grenzviskositätszahl 4 830 cm /g und der Formaldehydgehalt 0,0115 % war.
Somit wurde aus 1 kg Hahnenkämmen insgesamt 3,61 g chemisch modifiziertes Natriumhyaluronat gewonnen.
Bei spie I 2
1 kg geschnitzelter, gemäß Beispiel 1 zubereiteter Hahnenkämme wurde mit einem Gemisch aus 1 kg Azeton und
150 g einer 40 Gew .%-Lösung von GLutaraLdehyd in Wasser gemischt. Der pH-Wert des Gemisches war 6,9. Das Gemisch wurde unter Langsamem Rühren (ca. 1 U/Min.) 16 Stunden Lang auf Umgebungstemperatur (ca. 20° C) gehaLten. Dann wurden die Kämme von der FLüssigkeit getrennt, mit Azeton gewaschen und an Luft auf die HäLfte des ursprünglichen Gewichts getrocknet. Die getrockneten Kämme wurden mit 3 L entionisiertem Wasser 96 Stunden bei einer Temperatur von ca. 20° C extrahiert. Der Extrakt wurde von den Kämmen getrennt und filtriert/ wie im Beispiel 1 beschrieben. Der HA-Gehalt im Extrakt betrug 1,4 mg/ml. Das Produkt hatte nach einer Abscheidung mit Azeton gemäß Beispiel 1 einen Proteingehalt von 0/42 % und eine Grenzviskositätszahl von 3 700 cm /g.
Beispiel 3
Das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde, abgesehen davon, daß statt der Glutara idehydLösung eine 40 Gew.%-Lösung von Glyoxal in Wasser benutzt wurde, wiederholt. Die HA-Konzentration im Extrakt betrug 0,92 mg/ml. Der Proteingehalt im Produkt war 0,5 % und die GrenzviskositätszahL 3 930 cm /g.
Beispiel 4
Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt und mit dem Azeton-Formaldehydgemisch gemäß Beispiel 1 behandelt. Die Kämme wurden, nachdem sie auf die Hälfte des ursprünglichen Gewichts getrocknet worden waren, mit 2,5 I einer 0,05 M Natriumhydroxidlösung in Wasser (pH-Wert größer als 11) 120 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C extrahiert. Der Extrakt wurde dann wie im Beispiel 1 beschrieben getrennt und filtriert. Die HA-Konzentration im Extrakt war 3,6 mg/ml. Es wurde mit einer Azeton-Natriumacetatmischung ein weißes Produkt ausgefällt, mit Azeton gewaschen und getrocknet. Erhalten wurde 7,5 g eines Produktes mit einem Proteingehalt von 0,2 % und einer GrenzviskositätszahL von 1 310 cm /g.
Beispiel 5
Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, und dann wurde 1 kg Kämme mit einem 1 kg Isopropanol, 100 g eines 37 %igen Formalins, 50 g Natriumacetat und 100 g Chloroform enthaltenden Gemisch gemischt. Die Behandlung wurde unter Langsamem Rühren 16 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C durchgeführt. Die Extraktion und Abscheidung erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. Die HA-Konzentration des Extraktes betrug 0,68 mg/ml. Der Proteingehalt des Produktes war 0,46 % und die Grenzviskositätszahl 4 900 cm /g.
Beispiel 6
Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, mit einem Azeton-Formaldehydgemisch behandelt, mit Azeton gewaschen, getrocknet und mit Wasser extrahiert, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extrakt wurde mit einem Gemisch aus 2 I Azeton und 1 I Chloroform gemischt. Es wurde ein weißes, faserartiges Produkt von 1,9 g mit einem Proteingehalt von 0,05 % und einer Grenzviskositätszahl von 4 400 cm /g erhalten.
Bei spiel 7
Es wurde 1 kg geschnitzelter Kämme wie im Beispiel 1 beschrieben zubereitet und mit einem Gemisch, welches 1 kg Azeton, 50 g eines 37 %igen Formalins und 50 g Natriumacetat enthielt, 24 Stunden bei einer Temperatur von ca. 20° C unter langsamem Rühren behandelt. Der Extrakt wurde getrennt und gefiltert und das Produkt wie im Beispiel 1 beschrieben abgeschieden. Es wurde 1,6 g eines weißen Produktes mit einem Proteingehalt von 0,45 %, einer GrenzviskositätszahI von 5 300 cm /g und einem gebundenen Formaldehydgehalt von 0,008 % erhalten.
Beispiel 8
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß die Kämme nach der Azeton-Formaldehydbehandlung auf ein Drittel ihres ursprünglichen Gewichts
. 32 3607837
getrocknet und die erste Extraktion mit Wasser 96 Stunden Lang durchgeführt wurde.
Die HA-Konzentration des ersten Extraktes betrug 1,05 mg/ml. Das aus diesem Extrakt ausgefällte Erzeugnis hatte einen Proteingehalt von 0,25 % und eine Grenzviskositatszahl von 4 930 cm /g. Ein Schwingungsversuch mit einer 1 Gew.%-Lösung dieses Produktes in wässriger 0,15 M NaCl-Lösung ergab einen "Kreuzungspunkt" bei einer Frequenz von 0,020 Hz.
Die HA-Konzentration im zweiten Extrakt betrug 0,58 mg/ ml. Die aus diesem Extrakt erhaltene Fraktion hatte einen Proteingehalt von 0,19 % und eine Grenzviskositatszah I von 7 300 cm /g. Der Gehalt an gebundenem Formaldehyd betrug 0,01 %. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest war 0,005 Hz.
Insgesamt wurde 3,5 g chemisch modifizierter HA bei drei aufeinanderfolgenden Extraktionen erhalten.
Bei spie I 9
Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt, und 1 kg der Schnitzel wurde mit 1 kg Azeton, 200 g eines 37 %igen Formalins und 100 g Chloroform gemischt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 4,0 eingestellt. Die HA-Konzentrat ion im ersten Extrakt betrug 0,58 mg/ml. Das Erzeugnis wurde aus dem Extrakt durch Ausfällung mit Azeton-Natriumacetat gemäß Beispiel 1 gewonnen. Der Proteingehalt des Produktes betrug 0,12 %, die Grenzviskositätszahl war 4 025 cm /g. Das Produkt enthielt gebundenes Formaldehyd in einer Menge von 0,02 %. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest bei einer 1 Gew.%-Lösung des Produktes in wässriger 0,15 M NaCl-Lösung war 0,006 Hz.
ORIGINAL mSPHCTiö
Beispiel 10
Hahnenkämme wurden gewaschen, gefroren, geschnitzelt und 1 kg der Schnitzel mit einem Azeton-Formaldehydgemisch behandelt, wie im Beispiel 1 beschrieben, außer daß der pH-Wert des Gemisches mit Natriumhydroxid auf 11,0 eingestellt wurde. Die Kämme wurden getrocknet und mit Wasser wie beim Beispiel 1 extrahiert. Die HA-Konzentrat ion im Extrakt betrug 0,69 mg/ml. Das Produkt wurde aus dem Extrakt gemäß Beispiel 1 ausgefällt, außer daß statt des Azetons Isopropanol verwendet wurde. Es wurde 1,3 g eines weißen, fasrigen Stoffs erhalten, der einen Proteingehalt von 0,45 %, eine Grenzviskositätszah I von 5 050 cm /g und einen Formaldehydgehalt von 0,012 % hatte. Die Frequenz des "Kreuzungspunktes" beim Schwingungstest für eine 1 Gew.%-l_ösung des Produktes in wässriger 0,15 M NaCl-Lösung war 0,012 Hz.
Bei spie 111
Dies Beispiel zeigt, wie ein gallertartiger Stoff aus Hylan erhalten wird. 0,88 g des aus dem zweiten Extrakt gemäß Beispiel 1 abgeschiedenen Produktes wurde mit 28,3 g wässriger 0,05 N NaOH-Lösung in Wasser gemischt und das Gemisch 60 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Zu der erhaltenen viskosen Lösung wurde ein Gemisch aus 0,26 g DivinyIsuIfon und 1,0 g wässrigem 0,5 N NaOH hinzugefügt. Das entstehende Gemisch wurde 10 Minuten gerührt und dann 50 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Es wurde ein elastisches, farbloses und klares Gel erhalten, welches in 0,5 I einer 0,15 M Salzlösung gegeben und über Nacht stehengelassen wurde. Danach wurde von dem stark gequollenen Gel die überschüssige Flüssigkeit entfernt und 0,5 I frischer Salzlösung zum Gel hinzugefügt und das Gemisch 24 Stunden lang auf einer Schüttelvorrichtung gelassen. Die überschüssige Flüssigkeit wurde von dem aufgequollenen, unlöslichen Material abgegossen, und es wurde ein gallert- oder geleeartiger, klarer Stoff erhalten. Die HA-Konzentration im Produkt wurde mit 0,275 Gew.% bestimmt. Die Theologischen Eigen-
schäften dieses Materials sind in den Fig. 5, 6 und 7 gezeigt.
Bei spiel 12
14 Behandlung von Hahnenkämmen mit CH-,0
Radioaktiv markiertes ParaformaIdehyd C CHpO) mit einer spezifischen Aktivität von 500 mCi/g (I2CN Radiochemikalien) wurde in einer 5/0 mCi entsprechenden Menge mit 1,0 ml einer 37 Gew.%-Lösung von Formaldehyd in Wasser gemischt und diesem 0,1 ml einer 1 N Natriumhydroxidlösung in Wasser hinzugefügt. Das Gemisch wurde in einen eng verschlossenen Behälter gefüllt und auf 60° C erwärmt, um das ParaformaIdehyd aufzulösen. Danach wurde das Gemisch auf 0° C abgekühlt und mit 0,1 ml einer wässrigen 1 N Essigsäure neutralisiert. Die Radioaktivität der erhaltenen Lösung wurde in 10 ml Hydrofluor (Wz), einem flüssigen Szinti I lationszähImedium (National Diagnostic) unter Verwendung eines Searle Isocap 300 Flüssigkeitsszintillationszähler mit Rechnerkorrektur für den Wirkungsgrad auf der Grundlage der externen Standardmethode gemessen. Die Formaldehydkonzentration wurde mit einem kolorimetrischen Verfahren mit chromotroper Säure bestimmt. Die gemessene spezifische Aktivität der erhaltenen Lösung betrug 0,555 mCi/mmol CH2O. Die markierte Formaldehydlösung wurde mit 7,5 g Azeton, 1 g Chloroform und 0,5 g Natriumacetat gemischt. In die Lösung wurde 7,5 g geschnitzelter Hahnenkämme eingemischt und die Behandlung 18 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C durchgeführt. Die Kämme wurden von der Flüssigkeit getrennt, mehrmals mit Azeton gewaschen und in Luft auf die Hälfte ihres ursprünglichen Gewichts getrocknet. Den Kämmen wurde 15 ml doppeltdestilliertes Wasser hinzugefügt, und dann ließ man die Extraktion 96 Stunden lang bei einer Temperatur von ca. 20° C vor sich gehen. Der Extrakt wurde von den Kämmen getrennt und durch verschiedene Schichten Filterpapier (Whatman (Wz) Nr. 1) filtriert. Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, um einen zweiten Extrakt der Kämme zu erhalten. Aus den Ex-
. 35 3607837
trakten wurde HY durch Hinzufügen von CH3OONa zu den Extrakten in solcher Menge, daß sich eine 1 Gew.%-Lösung und 4 Volumen von 95 % Äthanol ergaben, als weißer, faserartiger Stoff abgeschieden. Der faserartige Stoff wurde abgesondert, ausgiebig mit Azeton gewaschen, getrocknet und dann in Wasser neu aufgelöst, um eine Lösung zu bilden, deren HY-Konzentrat ion ca. 1 mg/ml betrug. Aus dieser Lösung wurde das HY in der vorstehend beschriebenen Weise erneut ausgefällt und wiederum gründlich mit Azeton gewaschen und getrocknet. Die trockene Substanz wurde erneut in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine Lösung zu erhalten, die 0,84 mg/ml HY enthielt. Die spezifische Aktivität dieser Lösung wurde mit 194 dpm/\ig HA gemessen. Eine erschöpfende Dialyse dieser Lösung gegen 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5, der 0,15 M NaCl enthielt, reduzierte die Radioaktivität auf 103 dpm^g HY. Eine erschöpfende Dialyse dieser Lösung gegen 4 M Guanidiumhydrochlorid verringerte die Aktivität auf 101 dpm^g HY, was anzeigte, daß selbst nach der Behandlung der Lösung unter Protein dissoziierenden Bedingungen Formaldehyd im Produkt verblieben war. Auf der Grundlage dieser gemessenen Radioaktivität des Produktes und der spezifischen Aktivität der Forma Idehydausgangslösung wurde der Gehalt an Formaldehyd in Beziehung zu HY mit ca. 0,2 Gew.% berechnet. Um abzuschätzen, wie viel des radioaktiv markierten Formaldehyds mit einem enzymatisehen Abbau mit Streptomyces Hyaluronidase zugänglichen HY assoziiert war, wurde eine weitere Lösung des Produktes zubereitet, die 0,8 mg/ml HY enthielt und eine Aktivität von 1 250 dpm/10 μΐ Lösung hatte. 2 ml dieser Lösung wurde 0,1 ml eines Citrat-Phosphatpuffers CpH 5,6) hinzugefügt, der 33 TRU Streptomyces Hyaluronidase enthielt (Miles Laboratories, Inc., spezifische
Aktivität 2 000 TRU/mg HA, proteolytisehe Aktivität we-
14 niger als 5 χ 10 Einheiten pro TRU). Einem weiteren Anteil von 2 ml der gleichen Lösung wurde 0,1 ml des Puffers ohne Enzym hinzugefügt. Beide Anteile wurden 20 Stunden lang gegen 1000 Volumen des Citrat-Phosphatpuf-
fers diaIysiert. Nach der Dialyse waren die Volumen der beiden Proben gleich. Die nicht mit Enzym behandelte Probe hatte eine HY-Konzentrat ion von 0,76 mg/ml und eine Radioaktivität von 552 dpm/10 μΐ. Die HY-Konzentrat ion in der mit Enzym behandelten Probe war unter wahrnehmbare Pegel reduziert (10 μg/ml) und die Radioaktivität betrug 414 dpm/10 μΐ Lösung. Die für Hyaluronidase empfängliche Radioaktivität entsprach 20 dpm^g HY, was 0,049 Gew.% mit enzymatisch verdaubarem HY assoziiertem Formaldehyd entsprach. Derartig markierte Proben des Produktes wurden ferner anhand einer Gelpermeationschromatographie in einer 1,6 χ 90 cm Glassäule analysiert, die mit GIyceryl - CPG 3000 einer Porengröße von 2869 +_ 8,3 % gefüllt war (Electronucleonics, Inc.). Für die Eluierung wurde ein entgaster 0,02 M Boratpuffer CpH 7,5) verwendet, der 0,15 M NaCl enthielt. Das ausgeschlossene Volumen der Säule (Vo) wurde mit einer Probe HY mit einem Molekulargewicht von 4 χ 10 bestimmt und das Gesamtvolumen der Säule (Vt) mit Sucrose. Die Eluierung erfolgte mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/Std. bei 6° C. Es wurden 5 ml Fraktionen gesammelt und auf HY-Konzent ration und Radioaktivität analysiert. Es zeigte sich, daß die Radioaktivität gemeinsam mit HY im Leervolumen eluiert und daß die enzymatische Digestion sowohl HY als auch die Radioaktivität aus den Leervolumenfraktionen entfernt. Berechnungen zeigten, daß die mit dem Leervo lumen-HY assoziierte spezifische Aktivität 14,6 dptn/^g HY betrug, was 0,036 Gew.% Formaldehyd im Polymerisat entspricht. Diese Ziffer steht gut in Übereinstimmung mit der beim Dialyseversuch erhaltenen Zahl.

Claims (28)

1. Verfahren zur Herstellung einer chemisch modifizierten Hyaluronsäurezubereitung,
gekennzeichnet durch
Ca) Behandeln eines Hyaluronsäure enthaltenden tierischen Gewebes mit einem wässrigen Behandlungsgemisch, welches eine Substanz enthält, die mit Proteinen und Hyaluronsäure zur Bewirkung einer chemischen Modifizierung der im Gewebe enthaltenen Hyaluronsäure in situ umsetzbar ist, Cb) Entfernen überschüssigen Behandlungsgemisches vom Reakt i onsgemi sch,
Cc) Extrahieren der chemisch modifizierten Hyaluronsäure aus dem behandelten tierischen Gewebe mit Wasser, (d) Trennen des die chemisch modifizierte Hyaluronsäure enthaltenden Extrakts aus dem behandelten tierischen Gewebe, und
Ce) Gewinnen der chemisch modifizierten Hyaluronsäure aus dem Extrakt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß als im wässrigen Behandlungsgemisch enthaltene Substanz, die mit Proteinen und Hyaluronsäure umsetzbar ist, ein Aldehyd verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß als Aldehyd Formaldehyd, GlutaraLdehyd oder Glyoxal verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Behandlungsgemisch ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel enthält, welches mit dem Aldehyd nicht umsetzbar ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel ein niederes Keton, ein niederer Alkohol oder ein aprotisches Lösungsmittel verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Azeton, Met hy läthy lketon, Äthanol, Isopropanol, Dimethylformamid, Dimethy lacetamid oder Dimethy Isulfoxid verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Behandlungsgemisch wahlweise einen Elektrolyten und ein in Wasser nicht lösliches organisches Lösungsmittel enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß als Elektrolyt Natriumacetat und als in Wasser unlösliches organisches Lösungsmittel Chloroform verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis zwischen Wasser und mit Wasser mischbarem Lösungsmittel im Behandlungsgemisch 1-5 : 4-8,5 und das Gewichtsverhältnis zwischen Wasser und Aldehyd 1-5 : 0,02-1 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, daß das Behandlungsgemisch, ausgedrückt in Teilen pro Gewicht, folgendes aufwei st:
Wasser 10-50 mit Wasser mischbares Lösungsmittel 40-85 Aldehyd 0,2-10 in Wasser unlösliches Lösungsmittel 0,5-10 Elektrolyt 0-20.
11. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß das Behänd-
lungsgemisch einen pH-Wert von 4-10 hat, daß das GewichtsverhäLtnis zwischen dem BehandLungsgemisch und dem zu behandelnden Gewebe mindestens 10 : 1 ist, und daß die Dauer der Behandlung ca. 4-24 Stunden etwa bei Zimmertemperatur oder darunter beträgt.
12. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß als tierisches Gewebe Hahnenkämme verwendet werden, und daß die Kämme in ca. 1-3 mm dicke Schnipsel zerschnitten werden.
13. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß überschüssiges Behandlungsgemisch aus dem Reaktions gemisch durch Waschen des behandelten Gewebes mit einem Lösungsmittel oder einem Gemisch aus Lösungsmittel und Wasser entfernt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel zum Waschen des behandelten Gewebes das gleiche Lösungsmittel wie in dem Behandlungsgemisch verwendet wird.
15. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzei chnet, daß die Extraktion der chemisch modifizierten Hyaluronsäure bei einer Temperatur unterhalb ca. 25° C während ca. 6 Stunden bis zu einigen Tagen durchgeführt wird, wobei das Gewichtsverhältnis zwischen Wasser und Behandlungsgewebe ca. 2-5 : 1 ausgehend vom Gewicht des unbehandeIten Gewebes ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet, daß das behandelte Gewebe auf ca. 25-50 % des Behandlungsgewichts vor der Extraktionsstufe getrocknet wird.
17. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt vom tierischen Gewebe durch Filtern, Zentrifugieren oder Dekantieren entfernt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17,
dadurch gekennzeichnet, daß durch FiI-trierung getrennt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18,
dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß die Filtrierung ein zweistufiges Verfahren ist, und zwar ein erstes oder grobes Filtern durch ein weites Sieb zur Entfernung von Stücken tierischen Gewebes und ein zweites oder feines Filtern durch ein ze I Iu losehaltiges Material.
20. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die chemisch modifizierte Hyaluronsäure aus dem Extrakt durch Ausfällen mit einem Lösungsmittel, gefolgt von Waschen und Trocknen der erhaltenen, abgeschiedenen, chemisch modifizierten Hyaluronsäure gewonnen wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel für die Ausfällung Azeton, Äthanol oder Isopropanol verwendet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet, daß während des Ausfä I Lungsschrittes eine Mineralsäure oder ein Elektrolyt hinzugefügt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22,
dadurch gekennzeichnet, daß als Mineralsäure HCl, H2SO^ oder H3PO/ und als Elektrolyt Natriumacetat oder NaCl verwendet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch g e k e η η ζ eichnet, daß die chemisch modifizierte Hyaluronsäure aus dem Extrakt durch Gefriertrocknung entfernt wird.
25. Verfahren der Vernetzung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 erhaltenen, chemisch modifizierten Hyaluronsäure,
dadurch gekennzei chnet, daß die chemisch modifizierte Hyaluronsäure einer Vernetzungsreaktion mit DivinyIsulfon unter alkalischen Bedingungen bei Zimmertemperatur während ca. einer Stunde ausgesetzt wird.
26. Erzeugnis,
dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 hergestellt ist.
27. Erzeugnis,
dadurch gekennzei chnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 25 hergestellt ist.
28. Chemisch modifizierte Hya luronsäurezubereitung, gekennzei chnet durch das Vorhandensein von ca. 0,005 bis 0,05 Gew.% von homöopolar an die Hyaluronsäurepolymerisatketten gebundenen Aldehydvernetzungsgruppen.
DE19863607897 1985-03-12 1986-03-10 Verfahren zur herstellung einer chemisch modifizierten hyaluronsaeurezubereitung Granted DE3607897A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/710,929 US4713448A (en) 1985-03-12 1985-03-12 Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3607897A1 true DE3607897A1 (de) 1986-09-18
DE3607897C2 DE3607897C2 (de) 1992-02-27

Family

ID=24856100

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19863607897 Granted DE3607897A1 (de) 1985-03-12 1986-03-10 Verfahren zur herstellung einer chemisch modifizierten hyaluronsaeurezubereitung
DE3645226A Expired - Lifetime DE3645226C2 (de) 1985-03-12 1986-03-10
DE3645191A Expired - Lifetime DE3645191C2 (de) 1985-03-12 1986-03-10

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3645226A Expired - Lifetime DE3645226C2 (de) 1985-03-12 1986-03-10
DE3645191A Expired - Lifetime DE3645191C2 (de) 1985-03-12 1986-03-10

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4713448A (de)
JP (2) JPS61207401A (de)
AU (1) AU560956B2 (de)
BE (1) BE904357A (de)
CA (1) CA1276143C (de)
CH (1) CH670092A5 (de)
DE (3) DE3607897A1 (de)
FR (1) FR2582002B1 (de)
GB (1) GB2172295B (de)
IT (1) IT1191981B (de)
NL (1) NL186576C (de)
SE (1) SE468830B (de)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582865A (en) * 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US5099013A (en) * 1985-03-12 1992-03-24 Biomatrix, Inc, Hylan preparation and method of recovery thereof from animal tissues
JPS62502833A (ja) * 1985-05-09 1987-11-12 カリス−ヒル、ディビッド ヒアルロン酸の製法
US4851521A (en) * 1985-07-08 1989-07-25 Fidia, S.P.A. Esters of hyaluronic acid
EP0224987B1 (de) * 1985-11-29 1992-04-15 Biomatrix, Inc. Arzneistoffabgabesysteme auf Basis von Hyaluronan, dessen Derivaten und Salzen sowie Verfahren zu deren Herstellung
SE452469B (sv) * 1986-06-18 1987-11-30 Pharmacia Ab Material bestaende av en tverbunden karboxylgrupphaltig polysackarid och forfarande vid framstellning av detsamma
IT1198449B (it) * 1986-10-13 1988-12-21 F I D I Farmaceutici Italiani Esteri di alcoli polivalenti di acido ialuronico
AU610512B2 (en) * 1986-12-11 1991-05-23 Biomatrix Incorporated Improved hyaluronate-poly (ethylene oxide) mixtures
GB8713662D0 (en) * 1987-06-11 1987-07-15 Skandigen Ab Hyaluronic acid derivatives
US6610669B1 (en) 1987-09-18 2003-08-26 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of polyanionic polysaccharides
US6174999B1 (en) 1987-09-18 2001-01-16 Genzyme Corporation Water insoluble derivatives of polyanionic polysaccharides
AU619760B2 (en) * 1987-12-10 1992-02-06 Genzyme Biosurgery Corporation Hylan preparation and method of recovery thereof from animal tissues
IT1219587B (it) * 1988-05-13 1990-05-18 Fidia Farmaceutici Polisaccaridi carbossiilici autoreticolati
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
US5356883A (en) 1989-08-01 1994-10-18 Research Foundation Of State University Of N.Y. Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use
US5246698A (en) * 1990-07-09 1993-09-21 Biomatrix, Inc. Biocompatible viscoelastic gel slurries, their preparation and use
US5143724A (en) * 1990-07-09 1992-09-01 Biomatrix, Inc. Biocompatible viscoelastic gel slurries, their preparation and use
US5824658A (en) * 1990-09-18 1998-10-20 Hyal Pharmaceutical Corporation Topical composition containing hyaluronic acid and NSAIDS
US5910489A (en) * 1990-09-18 1999-06-08 Hyal Pharmaceutical Corporation Topical composition containing hyaluronic acid and NSAIDS
CA2061703C (en) * 1992-02-20 2002-07-02 Rudolf E. Falk Formulations containing hyaluronic acid
US5990096A (en) * 1990-09-18 1999-11-23 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US5219360A (en) * 1991-05-10 1993-06-15 Fortis Research Corporation Mammary prosthesis fill and method of making same
US5792753A (en) * 1991-07-03 1998-08-11 Hyal Pharmaceutical Corporation Compositions comprising hyaluronic acid and prostaglandin-synthesis-inhibiting drugs
US6103704A (en) * 1991-07-03 2000-08-15 Hyal Pharmaceutical Corporation Therapeutic methods using hyaluronic acid
US5977088A (en) * 1991-07-03 1999-11-02 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
CA2061567C (en) * 1992-02-20 1998-02-03 Rudolf E. Falk Use of hyaluronic acid to repair ischemia reperfusion damage
US6218373B1 (en) 1992-02-20 2001-04-17 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US5767106A (en) * 1992-02-21 1998-06-16 Hyal Pharmaceutical Corporation Treatment of disease and conditions associated with macrophage infiltration
IT1260154B (it) * 1992-07-03 1996-03-28 Lanfranco Callegaro Acido ialuronico e suoi derivati in polimeri interpenetranti (ipn)
US5616568A (en) * 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
US5690961A (en) 1994-12-22 1997-11-25 Hercules Incorporated Acidic polysaccharides crosslinked with polycarboxylic acids and their uses
US5612321A (en) * 1995-06-22 1997-03-18 Hercules Incorporated Antioxidant grafted polysaccharides
AU736876B2 (en) 1996-12-06 2001-08-02 Amgen, Inc. Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US6630457B1 (en) 1998-09-18 2003-10-07 Orthogene Llc Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same
IT1303738B1 (it) * 1998-11-11 2001-02-23 Aquisitio S P A Processo di reticolazione di polisaccaridi carbossilati.
US20040048021A1 (en) * 1999-03-19 2004-03-11 Wan Barbara Y. F. Surface modification of substrates
US6610666B1 (en) 1999-11-08 2003-08-26 Bio-Hyos Ab Hyaluronan product and process for manufacturing thereof
US6521223B1 (en) 2000-02-14 2003-02-18 Genzyme Corporation Single phase gels for the prevention of adhesions
KR100375299B1 (ko) 2000-10-10 2003-03-10 주식회사 엘지생명과학 히알루론산의 가교결합형 아마이드 유도체와 이의 제조방법
ATE312076T1 (de) * 2001-02-22 2005-12-15 Anika Therapeutics Inc Thiol-modifizierte hyaluronan-derivate
WO2003024496A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-27 Hans Biomed Corporation A process for preparing a biomaterial for tissue repair
MXPA01011542A (es) * 2001-11-13 2003-05-22 Alcon Inc Regeneracion del cartilago articular da°ado por la osteoartritis de grado i y ii, mediante la aplicacion intra-articular de una mezcla de hialuronato de sodio y de condroitin sulfato en un vehiculo de gel.
US7186232B1 (en) * 2002-03-07 2007-03-06 Glaukoa Corporation Fluid infusion methods for glaucoma treatment
CN101134119A (zh) 2002-05-24 2008-03-05 血管技术国际股份公司 用于涂覆医用植入物的组合物和方法
US8313760B2 (en) 2002-05-24 2012-11-20 Angiotech International Ag Compositions and methods for coating medical implants
WO2004037164A2 (en) * 2002-06-21 2004-05-06 University Of Utah Research Foundation Crosslinked compounds and methods of making and using thereof
CA2496121C (en) * 2002-08-16 2010-03-30 Yoshiaki Miyata Stable formulations of hyaluronic acid for use in the therapeutic treatment of arthropathy
KR20040022760A (ko) * 2002-09-05 2004-03-18 주식회사 오스코텍 닭벼슬로부터 고순도 히아루론산의 추출방법
US20080063677A1 (en) * 2004-03-10 2008-03-13 New Life Resources, Llc Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations
US20040180025A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-16 New Life Resources, Llc Therapeutic, nutraceutical and cosmetic applications for eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations
US6946551B2 (en) * 2003-03-12 2005-09-20 New Life Resources, Llc Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane
FR2861734B1 (fr) 2003-04-10 2006-04-14 Corneal Ind Reticulation de polysaccharides de faible et forte masse moleculaire; preparation d'hydrogels monophasiques injectables; polysaccharides et hydrogels obtenus
US20070224278A1 (en) 2003-11-12 2007-09-27 Lyons Robert T Low immunogenicity corticosteroid compositions
WO2005051483A2 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Angiotech International Ag Electrical devices and anti-scarring agents
WO2005056763A2 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 University Of Utah Research Foundation Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue
US7625581B2 (en) * 2003-12-19 2009-12-01 Ethicon, Inc. Tissue scaffolds for use in muscoloskeletal repairs
US7091191B2 (en) * 2003-12-19 2006-08-15 Ethicon, Inc. Modified hyaluronic acid for use in musculoskeletal tissue repair
BRPI0418309B8 (pt) * 2003-12-30 2021-05-25 Genzyme Corp "géis coesos de hialuronado e/ou hilano reticulados, processo para a preparação dos mesmos, bem como composições e dispositivos compreendendo os referidos géis".
US8524213B2 (en) * 2003-12-30 2013-09-03 Genzyme Corporation Polymeric materials, their preparation and use
DE102004002001A1 (de) * 2004-01-14 2005-08-11 Reinmüller, Johannes, Dr.med. Mittel zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen
US8580315B2 (en) * 2004-03-10 2013-11-12 Esm Technologies, Llc Anti-inflammatory activity of eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations
CA2567532C (en) * 2004-05-20 2013-10-01 Mentor Corporation Methods for making injectable polymer hydrogels
US7002007B2 (en) * 2004-05-28 2006-02-21 Calcigen Corporation Production of high molecular weight hyaluronates
ITMI20041373A1 (it) 2004-07-09 2004-10-09 Lima Lto S P A N-metil-ammidi di carbossimetilcellulosa acido alginico o carbossimetalamido
PT1817347T (pt) 2004-11-24 2017-07-21 Albumedix As Resumo
CN102416020A (zh) * 2004-12-30 2012-04-18 建新公司 用于关节内粘弹性补充的方案
ITPD20050056A1 (it) 2005-03-02 2006-09-03 Fidia Farmaceutici Derivati ammidici del'acido ialuronico in osteoartrosi
JP2009508596A (ja) 2005-09-19 2009-03-05 ヒストジェニックス コーポレイション 細胞支持基材及びその調製方法
WO2007070547A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Anika Therapeutics, Inc. Treatment of arthritis and other musculoskeletal disorders with crosslinked hyaluronic acid
EP1968499A1 (de) 2005-12-14 2008-09-17 Anika Therapeutics Inc. Bioabsorbierbares implantat aus einem hyaluronsäurederivat zur behandlung von osteochondralen und chondralen defekten
EP2492285A1 (de) 2006-03-07 2012-08-29 ProChon Biotech Ltd. Hydrazidderivate von Hyaluronsäure
ITPD20060219A1 (it) 2006-05-31 2007-12-01 Fidia Farmaceutici Composizioni farmaceutiche contenenti acido ialuronico solfatato nel trattamento dell'osteoartrosi
JP5513893B2 (ja) * 2006-12-22 2014-06-04 クローマ−ファルマ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 組織増大用インプラント
WO2008081463A2 (en) * 2007-01-04 2008-07-10 Hepacore Ltd. Water soluble reactive derivatives of carboxy polysaccharides and fibrinogen conjugates thereof
BRPI0811784A2 (pt) 2007-05-23 2011-05-10 Allergan Inc colÁgeno reticulado e uso do mesmo
US8658148B2 (en) 2007-06-22 2014-02-25 Genzyme Corporation Chemically modified dendrimers
US20110077737A1 (en) * 2007-07-30 2011-03-31 Allergan, Inc. Tunably Crosslinked Polysaccharide Compositions
US8318695B2 (en) 2007-07-30 2012-11-27 Allergan, Inc. Tunably crosslinked polysaccharide compositions
US8697044B2 (en) 2007-10-09 2014-04-15 Allergan, Inc. Crossed-linked hyaluronic acid and collagen and uses thereof
US20110130473A1 (en) * 2007-11-13 2011-06-02 Bio-Technology General (Israel) Ltd. Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers
BRPI0819075A2 (pt) 2007-11-16 2014-10-07 Vicept Therapeutics Inc Método para tratar púrpura em um indivíduo e método para diminuir a púrpura em um indivíduo antes de um procedimento cirúrgico
US8394784B2 (en) 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having multi-stage bioactive agent delivery
US8394782B2 (en) 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having increased longevity
US9044477B2 (en) 2007-12-12 2015-06-02 Allergan, Inc. Botulinum toxin formulation
US9161970B2 (en) 2007-12-12 2015-10-20 Allergan, Inc. Dermal filler
US9109051B2 (en) * 2007-12-19 2015-08-18 Evonik Goldschmidt Gmbh Crosslinked hyaluronic acid in emulsion
US8357795B2 (en) 2008-08-04 2013-01-22 Allergan, Inc. Hyaluronic acid-based gels including lidocaine
AU2009288118B2 (en) 2008-09-02 2014-12-11 Allergan, Inc. Threads of hyaluronic acid and/or derivatives thereof, methods of making thereof and uses thereof
US8624077B2 (en) 2008-10-02 2014-01-07 L.R.R.&D. Ltd. Interface layer wound dressing
CN101721349B (zh) 2008-10-16 2011-07-20 常州百瑞吉生物医药有限公司 可注射原位交联水凝胶及其制备方法和用途
CZ2008705A3 (cs) 2008-11-06 2010-04-14 Cpn S. R. O. Zpusob prípravy DTPA sítovaných derivátu kyseliny hyaluronové a jejich modifikace
US10206813B2 (en) 2009-05-18 2019-02-19 Dose Medical Corporation Implants with controlled drug delivery features and methods of using same
US8273725B2 (en) 2009-09-10 2012-09-25 Genzyme Corporation Stable hyaluronan/steroid formulation
CZ2009835A3 (cs) 2009-12-11 2011-06-22 Contipro C A.S. Zpusob prípravy derivátu kyseliny hyaluronové oxidovaného v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd a zpusob jeho modifikace
CZ302504B6 (cs) 2009-12-11 2011-06-22 Contipro C A.S. Derivát kyseliny hyaluronové oxidovaný v poloze 6 glukosaminové cásti polysacharidu selektivne na aldehyd, zpusob jeho prípravy a zpusob jeho modifikace
US20110172180A1 (en) 2010-01-13 2011-07-14 Allergan Industrie. Sas Heat stable hyaluronic acid compositions for dermatological use
US9114188B2 (en) 2010-01-13 2015-08-25 Allergan, Industrie, S.A.S. Stable hydrogel compositions including additives
WO2011110894A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Allergan Industrie Sas Fluid composition for improving skin conditions
PL3078388T3 (pl) 2010-03-22 2019-08-30 Allergan, Inc. Usieciowane hydrożele do powiększania tkanek miękkich
US8697057B2 (en) 2010-08-19 2014-04-15 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8883139B2 (en) 2010-08-19 2014-11-11 Allergan Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US9005605B2 (en) 2010-08-19 2015-04-14 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8889123B2 (en) 2010-08-19 2014-11-18 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
CZ302994B6 (cs) 2010-12-31 2012-02-08 Cpn S.R.O. Hyaluronová vlákna, zpusob jejich prípravy a použití
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
KR102015676B1 (ko) 2011-06-03 2019-10-21 알러간, 인코포레이티드 항산화제를 포함하는 피부 충전제 조성물
US20130096081A1 (en) 2011-06-03 2013-04-18 Allergan, Inc. Dermal filler compositions
US9393263B2 (en) 2011-06-03 2016-07-19 Allergan, Inc. Dermal filler compositions including antioxidants
US9408797B2 (en) 2011-06-03 2016-08-09 Allergan, Inc. Dermal filler compositions for fine line treatment
DE102011077393A1 (de) * 2011-06-10 2012-12-13 Johannes Reinmüller Antiinfektives Mittel
US10865383B2 (en) 2011-07-12 2020-12-15 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Methods and formulations for orthopedic cell therapy
ES2899992T3 (es) 2011-08-10 2022-03-15 Glycores 2000 Srl Acido hialurónico reticulado de bajo peso molecular resistente a la degradación
US20130244943A1 (en) 2011-09-06 2013-09-19 Allergan, Inc. Hyaluronic acid-collagen matrices for dermal filling and volumizing applications
US9662422B2 (en) 2011-09-06 2017-05-30 Allergan, Inc. Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation
FR2983483B1 (fr) 2011-12-02 2014-11-14 Vivacy Lab Procede de substitution et reticulation simultanees d'un polysaccharide via ses fonctions hydroxyles
CZ2012136A3 (cs) 2012-02-28 2013-06-05 Contipro Biotech S.R.O. Deriváty na bázi kyseliny hyaluronové schopné tvorit hydrogely, zpusob jejich prípravy, hydrogely na bázi techto derivátu, zpusob jejich prípravy a pouzití
KR101240518B1 (ko) 2012-03-26 2013-03-11 주식회사 제네웰 생체 적합성 고분자를 이용한 이식용 재료
ITPD20120098A1 (it) 2012-03-30 2013-10-01 Fidia Farmaceutici "nuove formulazioni faramaceutiche contenenti condroitin solfato e derivati dell'acido ialuronico"
EP2831237B1 (de) 2012-03-30 2017-11-29 The Board of Regents of the University of Oklahoma Hochmolekulare heparosanpolymere sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
ITPD20120173A1 (it) 2012-05-31 2013-12-01 Fidia Farmaceutici "nuovo sistema di rilascio di proteine idrofobiche"
JP6174690B2 (ja) * 2012-06-15 2017-08-02 メルツ ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディト ゲゼルシャフト アウフ アクティーン ヒアルロン酸に基づく組成物の調製方法
CZ304512B6 (cs) 2012-08-08 2014-06-11 Contipro Biotech S.R.O. Derivát kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, způsob jeho modifikace a použití
CN102863631B (zh) * 2012-09-29 2013-11-13 杭州嘉伟生物制品有限公司 外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法
CZ2012842A3 (cs) 2012-11-27 2014-08-20 Contipro Biotech S.R.O. Nanomicelární kompozice na bázi C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy C6-C18-acylovaného hyaluronanu, způsob přípravy nanomicelární kompozice a stabilizované nanomicelární kompozice a použití
JP2016506909A (ja) 2013-01-11 2016-03-07 カービラン セラピューティクス， インコーポレイテッド ヒアルロン酸を含む安定化組成物
US9714361B2 (en) 2013-03-15 2017-07-25 Lake Region Manfacturing, Inc. Oxirane (ethylene oxide) polyurethane coatings
US9255173B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Lake Region Manufacturing, Inc. Oxirane (ethylene oxide) polyurethane coatings
CZ305153B6 (cs) 2014-03-11 2015-05-20 Contipro Biotech S.R.O. Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití
CZ2014451A3 (cs) 2014-06-30 2016-01-13 Contipro Pharma A.S. Protinádorová kompozice na bázi kyseliny hyaluronové a anorganických nanočástic, způsob její přípravy a použití
WO2016051219A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Allergan Industrie, Sas Stable hydrogel compositions including additives
US10077420B2 (en) 2014-12-02 2018-09-18 Histogenics Corporation Cell and tissue culture container
WO2016128783A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Allergan Industrie Sas Compositions and methods for improving skin appearance
CZ309295B6 (cs) 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
CZ2015398A3 (cs) 2015-06-15 2017-02-08 Contipro A.S. Způsob síťování polysacharidů s využitím fotolabilních chránicích skupin
CZ306662B6 (cs) 2015-06-26 2017-04-26 Contipro A.S. Deriváty sulfatovaných polysacharidů, způsob jejich přípravy, způsob jejich modifikace a použití
KR20170090965A (ko) * 2016-01-29 2017-08-08 한미약품 주식회사 복합 히알루론산 가교물 및 그 제조방법
EP3415586B1 (de) * 2016-02-12 2022-11-30 Laimu Corporation Wundbehandlungsmittel und verfahren zur herstellung davon
CZ308106B6 (cs) 2016-06-27 2020-01-08 Contipro A.S. Nenasycené deriváty polysacharidů, způsob jejich přípravy a jejich použití
BR122021001969B1 (pt) 2017-02-02 2022-11-01 Amtixbio Co., Ltd Hidrogel usando, como substrato, derivado de ácido hialurônico modificado com grupo galol e uso do mesmo
AU2019339519A1 (en) 2018-09-13 2021-05-06 Allergan, Inc. Clostridial toxin-hyaluronic acid compositions
US10899944B2 (en) 2018-10-29 2021-01-26 Lake Region Manufacturing, Inc. Polyurethane urea-containing adipic acid dihydrazide where active hydrogens react with the epoxy group found on glycidol to form a diol
KR102400586B1 (ko) 2018-12-07 2022-05-23 한미약품 주식회사 히알루론산 가교물, 히알루론산 수화 겔 및 이들의 제조방법
CN116669781A (zh) 2020-12-30 2023-08-29 康沃特克科技公司 用于皮下装置的表面处理系统和方法
KR20220106283A (ko) 2021-01-22 2022-07-29 (주)앰틱스바이오 자가 가교형 히알루론산 유도체 기반 창상피복재
DE102022202547A1 (de) 2021-12-09 2023-06-15 Beiersdorf Aktiengesellschaft Topisch applizierbare Zubereitung zur Verbesserung des Hautzustandes
WO2023104843A1 (de) 2021-12-09 2023-06-15 Beiersdorf Ag Topisch applizierbare zubereitung zur verbesserung des hautzustandes
IT202100032111A1 (it) 2021-12-22 2023-06-22 Fidia Farm Spa Nuovi sostituti biocompatibili dell’umor vitreo

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2627125A1 (de) * 1975-06-18 1976-12-30 Hayashibara Biochem Lab Vernetztes pullulan
US4141973A (en) * 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
US4303676A (en) 1980-03-21 1981-12-01 Balazs Endre A Hyaluronate based compositions and cosmetic formulations containing same
DE3434104A1 (de) * 1983-12-15 1985-08-29 Biomatrix Inc., Ridgefield, N.J. Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure und verfahren dazu

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT252264B (de) * 1965-03-17 1967-02-10 Etapharm Chem Pharm Lab Ges M Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates
US4048435A (en) * 1976-07-12 1977-09-13 National Starch And Chemical Corporation Method for the preparation of highly substituted granular starches
US4272522A (en) * 1979-10-15 1981-06-09 Balazs Endre A Method for stimulating phagocytic activity and synergistic compositions therefor
SU950735A1 (ru) * 1980-10-28 1982-08-15 Саратовский Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.Н.Г.Чернышевского Способ получени гиалуроновой кислоты
US4517295A (en) * 1983-02-18 1985-05-14 Diagnostic, Inc. Hyaluronic acid from bacterial culture
US4500676A (en) * 1983-12-15 1985-02-19 Biomatrix, Inc. Hyaluronate modified polymeric articles
US4487865A (en) * 1983-12-15 1984-12-11 Biomatrix, Inc. Polymeric articles modified with hyaluronate
US4629623A (en) * 1984-06-11 1986-12-16 Biomatrix, Inc. Hyaluronate-poly (ethylene oxide) compositions and cosmetic formulations thereof
US4605691A (en) * 1984-12-06 1986-08-12 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels
US4582865A (en) * 1984-12-06 1986-04-15 Biomatrix, Inc. Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2627125A1 (de) * 1975-06-18 1976-12-30 Hayashibara Biochem Lab Vernetztes pullulan
US4141973A (en) * 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
US4141973B1 (de) * 1975-10-17 1989-08-08
US4303676A (en) 1980-03-21 1981-12-01 Balazs Endre A Hyaluronate based compositions and cosmetic formulations containing same
DE3434104A1 (de) * 1983-12-15 1985-08-29 Biomatrix Inc., Ridgefield, N.J. Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure und verfahren dazu

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analyt.Biochem. 1965, 12, 547-558
Annals Rheumatic Diseases, 1955, 15, 67-68
Arkiv for Kemi, Mineral.Geol.,1945,19A,1
BALAZS, E.A.: Healon, Wiley and Son, New York 1983,5-28
Biochem.J., 1952, 62, 31
Biochem.J., 1968, 109, 43-50
Biochem.J., 1972, 128, 1255-1263
Biochim.Biophys. Acta, 1960, 42, 472-485
Biochim.Biophys. Acta, 1962, 58, 120-122
Biochim.Biophys. Acta, 1966, 130, 112-129
Biochim.Biophys. Acta, 1981, 673, 192-196
Biopolymers, 1970, 9, 799
Carbohydr.Res., 1974, 32, 386-395
Fed.Proceed., 1958, 17, 1086-1093
Fed.Proceed., 1966, 25, 1817-1822
J.Biol.Chem., 1942, 146, 279
J.Biol.Chem., 1951, 193, 265-275
J.Biol.Chem., 1955, 216, 263-271
J.Biol.Chem., 1981, 256, 8463-8469
J.Mol.Biol., 1983, 169, 861-872
Naturforsch., 1979, 34c, 508-511
Science, 1972, 179, 560-562
WALKER, J.F.: Formaldehyde, Reinhold Publ.Corp., New York 1953, 312-317

Also Published As

Publication number Publication date
CA1276143C (en) 1990-11-13
AU7618087A (en) 1987-10-29
IT8619684A1 (it) 1987-09-10
SE8601135L (sv) 1986-09-13
NL8600644A (nl) 1986-10-01
SE468830B (sv) 1993-03-29
SE8601135D0 (sv) 1986-03-11
AU583464B2 (en) 1989-04-27
JPH01198602A (ja) 1989-08-10
JPH0353321B2 (de) 1991-08-14
NL186576C (nl) 1991-01-02
US4713448A (en) 1987-12-15
JPS61207401A (ja) 1986-09-13
GB8601304D0 (en) 1986-02-26
AU560956B2 (en) 1987-04-30
DE3645226C2 (de) 1993-07-15
DE3645191C2 (de) 1992-12-10
FR2582002B1 (fr) 1988-01-15
DE3607897C2 (de) 1992-02-27
CH670092A5 (de) 1989-05-12
NL186576B (nl) 1990-08-01
BE904357A (fr) 1986-06-30
FR2582002A1 (fr) 1986-11-21
GB2172295A (en) 1986-09-17
AU5289186A (en) 1986-09-18
IT8619684A0 (it) 1986-03-10
IT1191981B (it) 1988-03-31
GB2172295B (en) 1989-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3645191C2 (de)
DE69632313T2 (de) Desorbierbare extrazelluläre matrix für rekonstruktion eines knorpelgewebes
DE3546811C2 (de)
DE3750793T2 (de) Verfahren zur Behandlung von Kollagen zur Erleichterung seiner Vernetzung und das so erhaltene Kollagen.
DE60009574T2 (de) Chondroitinsulfat aus lachsen
DE69711540T3 (de) Lösungsmittel-getrocknete Polysaccharidschwämme
US5099013A (en) Hylan preparation and method of recovery thereof from animal tissues
DE68917009T2 (de) Sulfaminoderivate von Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Hyaluronsäure und ihre pharmakologischen Eigenschaften.
EP0817803B1 (de) Verfahren zur aktivierung von polysacchariden, danach hergestellte polysaccharide und deren verwendung
AT398976B (de) Gemische von polysacchariden mit niedrigem molekulargewicht, deren herstellungsverfahren und verwendung
US6610810B2 (en) Biopolymers obtained by solid state irradiation in an unsaturated gaseous atmosphere
DE3750036T2 (de) Verfahren zur Depolymerisierung von Heparin zum Erhalten eines Heparins mit niedrigem Molekulargewicht und einer antithrombotischen Aktivität.
DE3125260A1 (de) Wasserhaltiges, viscoelastisches gemisch enthaltend hyaluronat und kosmetische mittel enthaltend diese gemische
DE3422407A1 (de) Verwendung von heparinderivaten zur selektiven extrakorporalen praezipitation von low-density-lipoproteinen aus vollserum oder plasma
DE69822285T2 (de) Verfahren zur Herstellung von vernetzter Hyaluronsäure
DE69115181T2 (de) Polysaccharid enthaltende Zusammensetzung oder Polysaccharid mit heparinoidaler Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Antikoagulans welche dieses als aktives Ingredienz enthält.
DE102021104013A1 (de) Gelbildende Extrakte aus den Pilzen der Gattung Ohrlappenpilze (Auricularia) sowie Verfahren zu deren Herstellung
DE3852992T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Hylan und Hylanverbindungen.
DE212020000715U1 (de) Hydrogel auf der Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure
DE60017802T2 (de) Hyaluronan enthaltende zusammensetzung und verfahren zu ihrer herstellung
DE918532C (de) Verfahren zur Herstellung von Polymerhomologen von Dextran
DE19954357C2 (de) Zusammensetzung, enthaltend Heteropolysaccharid und perlenförmiges quervernetztes Polysaccharid, sowie deren Verwendung für medizinische/kosmetische Zwecke
DE4242813A1 (de)
DE4121115B4 (de) Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide und mit niedrigem Molekulargewicht, deren Herstellungsverfahren und Verwendung
DE102021209820A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines flüssigen Cellulose-Komposits

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
8172 Supplementary division/partition in:

Ref country code: DE

Ref document number: 3645191

Format of ref document f/p: P

Q171 Divided out to:

Ref country code: DE

Ref document number: 3645191

8172 Supplementary division/partition in:

Ref country code: DE

Ref document number: 3645226

Format of ref document f/p: P

Q171 Divided out to:

Ref country code: DE

Ref document number: 3645226

AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3645191

Format of ref document f/p: P

Ref country code: DE

Ref document number: 3645226

Format of ref document f/p: P

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3645191

Format of ref document f/p: P

AH Division in

Ref country code: DE

Ref document number: 3645226

Format of ref document f/p: P

8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: GENZYME BIOSURGERY CORPORATION, CAMBRIDGE, MASS.,