DE4121115B4

DE4121115B4 - Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide und mit niedrigem Molekulargewicht, deren Herstellungsverfahren und Verwendung

Info

Publication number: DE4121115B4
Application number: DE4121115A
Authority: DE
Inventors: Roger Debrie
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1991-06-26
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2011-06-27
Also published as: DE4121115A1; DE4121115B9

Abstract

Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet,
– dass sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht besitzen, das geringer ist als dasjenige des Heparins,
– dass sie zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton besitzen,
– dass in ihnen das Verhältnis gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 beträgt,
– dass sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht zwischen etwa 3500 Dalton und etwa 5500 Dalton besitzen und
– dass sie weniger als 2% Dermatansulfat enthalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Heparine mit niedrigem Molekulargewicht. Gegenstand der Erfindung sind im Einzelnen Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide gemäß den Patentansprüchen 1 und 2, deren Herstellungsverfahren gemäß den Patentansprüchen 3 bis 9 und deren Verwendung zur Herstellung antithrombotischer Zusammensetzungen gemäß den Patentansprüchen 10 und 11.
Die Heparine sind biologische, durch Extraktion gewonnene Substanzen der Familie der Glykosaminoglykane, die aufgrund von deren antikoagulierenden und antithrombotischen Eigenschaften verwendet werden. Insbesondere werden sie bei der Behandlung post-operativer, venöser Thrombosen eingesetzt. In ihrer nativen Form besitzen jedoch die Heparine eine bestimmte Anzahl von Nachteilen, die ihre Verwendungsbedingungen einschränken. Insbesondere kann die antikoagulierende Aktivität Hämorrhagien zur Folge haben, und die Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Serumfaktoren, wie pf4, erfordert die Verwendung von relativ hohen Dosen. Es ist somit notwendig, der antithrombotischen Aktivität, die der Antiprothrombinase-Aktivität zuzuschreiben ist, auf Kosten der antikoagulierenden Aktivität, die der Antithrombin-Wirkung zuzuschreiben ist, den Vorzug zu geben.
Zu diesem Zweck wurde empfohlen, die Heparine in Moleküle mit geringeren durchschnittlichen Molekulargewichten aufzuteilen. Insbesondere kannte man im Stand der Technik das EP-Patent 40144. Dieses Patent beschreibt Mischungen sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, die eine ethylenische Doppelbindung an einem ihrer Kettenenden aufweist und deren durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 2000 und 10 000 Dalton liegt. Diese Gemische werden durch Depolymerisation und Verseifung eines Heparinesters erhalten. Es ist angegeben, daß sie eine erhöhte antithrombotische Aktivität und eine niedrigere antikoagulierende Gesamtaktivität als das Heparin besitzen.
Dennoch beruht eines der bei den Heparinen vorzufindenden Hauptprobleme in der Tatsache, daß es sich um sehr heterogene Produkte handelt. Es ist somit schwierig, den Beitrag einer jeden der Species zu der Heparinaktivität zu bewerten, das Verhalten dieser Species bei der Depoly merisation zu kennen und schließlich die Struktur dieser Species und deren jeweilige Anteile in den Endprodukten zu kontrollieren. Dies gilt auch für das EP-Patent 40144, dem weder die Merkmalkombination der erfindungsgemäßen Gemische noch das vorliegende Herstellungsverfahren zu entnehmen sind.
Aus diesen Gründen konnte die vorstehend erwähnten Nachteile nicht völlig zufriedenstellend behoben werden. Insbesondere ermöglichen es die im Stand der Technik und vor allem in dem EP-Patent 40144 beschriebenen Verfahren nicht, Gemische mit den für eine bessere Anwendung erforderlichen pharmakologischen Eigenschaften, nämlich eine ausreichend hohe plasmatische Halbwertszeit, eine ziemlich große Absorptionsgeschwindigkeit, eine hohe Bioverfügbarkeit oder auch ein geringes "Clearance", zu erhalten.
Andere Verfahren wurden indes beschrieben, die es ermöglichen, das Heparin zu zerlegen, um seine unerwünschten Wirkungen zu verringern (Johnson et coll.,Thrombos. Haemostas. Stuttg., 1976, 35, 586; Lane et coll., Thrombosis Research 16, 651; Lasker et coll. US 3 766 167 ). Ein jedes dieser Verfahren scheint anzugeben, daß die gewünschte Aktivität stärker hervortritt, wenn sich der Zerlegungs- bzw. Fragmentierungsgrad des Heparins erhöht (siehe auch die EP-A-301618 betreffend Pentasaccharide mit antithrombotischer Aktivität).
In gleichem Sinn haben neuere Untersuchungen hinsichtlich des Wirkungsmechanismus der Heparine bei der Bildung von Thrombin einen Einfluß des durchschnittlichen Molekulargewichts der Heparine auf deren in vitro-Aktivität gezeigt (Béguin et coll., Thromb.Haemost., 61, 30, 1989). Die Autoren geben an, daß die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht eher eine Antiprothrombinase-Aktivität und die Heparine mit höherem Molekulargewicht eine Antithrombin-Aktivität besitzen.
Parallel wurde auch empfohlen, die Heparine zu fraktionieren, um Gemische mit homogenerem durchschnittlichen Molekulargewicht zu extrahieren. Man kannte insbesondere die EP-Patentanmeldung 337327, die ein Verfahren zur Herstellung von sich von Heparin ableitenden Oligosaccharid-Fragmenten beschreibt, das es ermöglicht, Gemische mit einer verminderten molekularen Streuung zu erhalten. Entsprechend diesem Verfahren eliminiert man zuvor die Fraktionen mit einem Molekulargewicht von geringer als 3000 Dalton, was dazu führt, daß dem Endprodukt die Fragmente, die weniger als 10 bis 16 Saccharide enthalten, und die Species mit einem Molekulargewicht von höher als 7000 Dalton entnommen werden. Nach den Erfindern würde diese Behandlung, die die Homogenisierung des Endgemisches zum Ziel hat, es erlauben, die antikoagulierende Aktivität zu vermindern, wobei jedoch die gewünschte antithrombotische Aktivität beibehalten wird.
Indessen besitzen trotz dieser Arbeiten die erhaltenen Gemische stets eine hämorrhagische Restwirkung oder eine zu geringe antithrombotische Aktivität. Überdies gibt es nichts im Stand der Technik, was es erlauben würde zu bestimmen, welche Eigenschaften es sind, die vereint werden müssen, um zu einer optimalen biologischen Aktivität zu gelangea. Im übrigen ist die Schlußfolgerung der Autoren des vorstehend genannten Artikels vielsagend: "Nous ne savons pas quelle est la combinaison optimale des propriétés de l'héparine. La caractérisation précise de differentes préparations, et la correlation de ces propriétés avec des observations cliniques pourrait eventuellement apporter une réponse" ("Wir wissen nicht, welche die optimale Kombination der Eigenschaften des Heparins ist. Die präzise Charakterisierung von verschiedenen Präparaten und die Korrelation dieser Eigenschaften mit den klinischen Beobachtungen könnten gegebenenfalls zu einer Antwort führen").
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Heparine mit vorteilhaften Eigenschaften, insbesondere für die Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung thrombotischer Unfälle, zu erhalten. Überraschenderweise hat die Anmelderin nun in der Tat gefunden, daß die gleichzeitige Anwesenheit von Species mit hohem und mit niedrigem Molekulargewicht in dem Endprodukt dem Produkt eine bessere Aktivität verleiht. Im Gegensatz zu den Angaben des Standes der Technik scheint es somit besser zu sein, in dem Endgemisch Species mit hohem Molekulargewicht sowie eine bestimmte Heterogenität beizubehalten.
Die pharmakokinetische Untersuchung der erfindungsgemäßen Gemische zeigt, daß sie besonders vorteilhafte Eigenschaften vereinigen.
Insbesondere besitzen die erfindungsgemäßen Gemische eine höhere Halbwertszeit als die bekannten Produkte und auch als das reife Heparin. Im übrigen ist es in bezug auf dieses letztgenannte von Bedeutung hervorzuheben, daß die Halbwertszeit der erfindungsgemäßen Gemische von d er injizierten Dosis unabhängig ist. Dies ist von Interesse, da sich die einstellende Wirkung viel besser vorhersagen läßt als im Falle des Heparins.
Überdies besitzen beim Menschen die erfindungsgemäßen Gemische eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit, gemessen durch die Anti-Xa-Aktivität. Während sie somit etwa 30% für Heparin beträgt, beträgt sie etwa 90% für die erfindungsgemäßen Gemische. Dies ist von großem Vorteil, da es hierdurch möglich wird, die injizierten Dosen zu verringern und die therapeutischen Möglichkeiten zu verbessern.
Im übrigen besteht eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Gemische in deren großer Absorptionsgeschwindigkeit. Dieses Charakteristikum ermöglicht es, eine gleichsam augenblickliche biologische Aktivität zu erzielen, und erlaubt somit eine größere Sicherheit bei der Behandlung, indem man dem Patienten rasch Schutz gibt.
Ein weiteres Charakteristikum der erfindungsgemäßen Gemische ist deren geringes "Clearance" im Vergleich zu. anderen Produkten und zu reifem Heparin. Dank ihrer chemischen Struktur, ihres Molekulargewichts oder ihres Sulfatgehalts besitzen diese Gemische in der Tat eine besondere Beständigkeit gegenüber Abbau (Desulfatierung, Hydrolyse) und gegenüber Eliminierung, was noch deren therapeutische Kapazitäten erhöht.
Auch besitzen die erfindungsgemäßen Präparate eine erhöhte Verweilzeit im Vergleich zu dem Ausgangs-Heparin. Diese Eigenschaft äußert sich in einer Verlängerung der Zeit dauer, während der das Produkt in vivo aktiv bleibt, und somit in einer besseren therapeutischen Wirksamkeit.
Überdies besitzen diese Präparate auch eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Serumfaktoren, was deren Wirkungsdauer in vivo erhöht und es erlaubt, sie in geringen Dosen einzusetzen.
Diese besonders vorteilhaften Eigenschaften werden erhalten, indem man im Verlauf des Herstellungsverfahrens bestimmte strukturelle Merkmale der anwesenden Species sowie deren Molekularverteilung kontrolliert. Die so erhaltenen Gemische liegen in einem günstigen Verhältnis zwischen den Fraktionen mit hohem und mit niedrigem Molekulargewicht vor, das ihnen die erforderlichen antithrombotischen Eigenschaften mit einer geringen hämorrhagischen Wirkung verleiht.
Dieses Merkmal der Erfindung wird ausgedrückt gleichzeitig durch den Prozentanteil an schweren Ketten und an leichten Ketten und durch das Verhältnis zwischen dem mittleren Molekulargewicht in Form des Gewichts der Gemische und deren zahlenmittlerem Molekulargewicht, was die molekulare Streuung wiederspiegelt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht besitzen, das niedriger ist als dasjenige des Heparins, und zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton enthalten und daß in ihnen das Verhält nis von gewichtsmittlerem Molekulargewicht/zahlenmittlerem Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 liegt. Zusätzlich besitzen die erfindungsgemäßen Gemische ein gewichtsmittleres Molekulargewicht zwischen etwa 3500 Dalton und etwa 5500 Dalton und enthalten weniger als 2% Dermatansulfat.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass es möglich ist, noch die Eigenschaften der Gemische zu verbessern, indem man deren Gehalt an Verunreinigungen verringert. Insbesondere enthält die Mehrzahl der Heparine Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, Polypeptide oder verschiedene Polysaccharide. Unter diesen kann man vor allem die Chondroitinsulfate, das Heparan oder das Dermatansulfat nennen. Eine jede dieser Verunreinigungen ist, sei es durch ihr sehr hohes Molekulargewicht, sei es durch Substituenten, die sie enthält, oder ihren Sulfatierungsgrad, in der Lage, bei der Herstellung des Produkts (bei der Depolymerisation beispielsweise) einzugreifen, um die endgültige molekulare Verteilung zu modifizieren oder direkt in die Aktivität durch Modifizierung, insbesondere der Anteile der aktiven Ketten. Die Anmelderin hat nun ein Verfahren bereitgestellt, das es ermöglicht, diese Verunreinigungen zu entfernen und eine Verbesserung der Eigenschaften der dieser Vorbehandlung unterzogenen Gemische festgestellt. Die Wirkung dieser Vorbehandlung kann gemessen werden, indem man als Vergleichsverunreinigung das Dermatansulfat verwendet.
Bevorzugt haben die Ketten der sulfatierten Polysaccharide, die die erfindungsgemäßen Gemische bilden, eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure an einer ihrer Enden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten Gemische sulfatierter Polysaccharide, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die folgenden Stufen durchführt:
in einer ersten Stufe führt man in wäßrigem Milieu ein Heparin mit einem langkettigen, quaternären Ammoniumsalz in ein Salz über,
in einer zweiten Stufe verestert man das so erhaltene Salz, um einen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% zu bilden, und
in einer dritten Stufe depolymerisiert man den erhaltenen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14 %,
wobei man bei der Durchführung des Verfahrens die nachstehend genannten weiteren Bedingungen einhält.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass man das Depolymerisationsniveau und somit die molekularen Eigenschaften des Endprodukts kontrollieren kann, indem man auf den Veresterungsgrad des Ausgangs-Heparinsalzes einwirkt.
Erfindungsgemäß ist es somit möglich, direkt auf reproduzierbare Weise Gemische von sulfatierten Polysacchariden mit den vorstehend angegebenen Merkmalen zu erhalten.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ausgangs-Heparin ist vorzugsweise ein Heparin vom Schwein und insbesondere von der Schleimhaut des Schweins. Es wurde gefunden, dass entsprechend dem Ursprung des Ausgangs-Heparins die Aktivität der erhaltenen Gemische auf beträchtliche Weise variieren konnte. Insbesondere wenn das Ausgangs-Heparin dem Rind entstammt, erhält man Gemische mit einer antikoagulierenden Aktivität, die höher ist als diejenige, die aus dem Heparin der intestinalen Schleimhaut des Schweins erhalten wird.
Bei einer besonders vorteilhaften Variante umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren außerdem eine vorangehende Stufe der Ausfällung von Ausgangs-Heparin mit einem Alkohol. Diese Vorbehandlung ermöglicht es, den Gehalt an Verunreinigungen des Chondroitinsulfat- oder Heparansulfat-Typs zu verringern.
Ein Alkohol, der zu guten Ergebnissen führt, ist beispielsweise Methanol.
Der Reinheitsgrad des Heparinnatriums kann darauf durch sterische Ausschluß-Flüssigkeitschromatographie bestimmt werden.
Diese vorangehende Stufe ermöglicht es vor allem, ein Heparin mit einem Dermatansulfat-Gehalt von niedriger als 2% herzustellen.
Genauer erfolgt die Salzbildung des Heparins auf folgende Weise.
Das Heparinsalz kann durch Umsetzung eines Überschusses des entsprechenden Salzes mit einem Heparinnatrium in wäßrigem Milieu bei einer Temperatur um 20°C erhalten werden. Vorteilhafterweise ist das verwendete quaternäre Ammoniumsalz bevorzugt ein Benzethoniumsalz, wie insbesondere das Benzethoniumchlorid, welches man mit dem Heparinnatrium umsetzen kann.
Was die zweite Stufe anbelangt, wird die Veresterung unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
Der partielle Ester des Heparins in Form des Salzes, dessen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% liegt, wird durch Veresterung des langkettigen, quaternären Ammoniumsalzes des Heparins in einem chlorierten, organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Chlorderivats erhalten. Darüber hinaus wird die Wirksamkeit der Umsetzung erhöht, indem man die Anteile der verschiedenen Reagentien und die Temperatur und Reaktionsdauer kontrolliert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der partielle Ester des Heparins ein aromatischer Ester.
Ebenfalls bevorzugt ist das Chlorderivat das Benzylchlorid, und das chlorierte Lösungsmittel wird unter Chloroform oder Methylenchlorid ausgewählt.
Um einen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% zu erhalten, wird je 1 Gew.-Teil Heparinsalz etwa 1 Vol.-Teil Chlorderivat in dem Medium von 3 bis 5 Vol-Teilen organischem, chloriertem Lösungsmittel verwendet und die Reaktion wird vorzugsweise während einer Zeitdauer von 15 bis 48 Stunden durchgeführt. Die Temperatur liegt hierbei zwischen 25 und 45°C und vorzugsweise zwischen 30 und 40°C.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt der partielle Heparinester in Form eines Natriumsalzes vor.
Die so gebildeten Ester können durch Ausfällung mit einem Alkohol, wie insbesondere Methanol, in Gegenwart von Natriumacetat zurückgewonnen werden. Vorzugsweise verwendet man zwischen 1 und 1,2 Volumina Alkohol je Volumen Reaktionsmilieu. Der Veresterungsgrad des Esters kann hierauf durch Hochleistungschromatographie in flüssiger Phase kontrolliert werden. Insbesondere im Falle des Benzylesters kann man die Menge des erhaltenen Benzylalkohols durch Verseifen des Esters bei 0°C bestimmen.
Die letzte Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auf folgende Weise durchgeführt.
Die Depolymerisation erfolgt durch Behandlung des Esters mit einer starken Base in wässriger Lösung. Genauer kann man Natronlauge verwenden.
Das Gewichtsverhältnis Base/Ester liegt zwischen 0,05 und 0,2 und vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,15.
Die Temperatur des Milieus wird auf einen Wert zwischen 50 und 70°C, vorzugsweise zwischen 55 und 65°C, eingestellt und die Reaktion während einer Dauer von 30 Minuten bis zu 3 Stunden, vorzugsweise von 1 bis 2 Stunden, durchgeführt.
Es wird in einem Milieu gearbeitet, in dem das Gewichtsverhältnis Wasser/Ester zwischen 15 und 30 liegt.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform besteht die Depolymerisation darin, zu mischen:
1 Gew.Teil eines aromatischen Esters des Heparins, wie er in der zweiten Stufe erhalten wurde, in Form des Salzes, dessen Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% liegt,
zwischen 0,08 und 0,15 Gew.Teile Natronlauge und
zwischen 20 und 30 Gew.Teile Wasser
und hiernach 1 bis 2 Stunden die Temperatur zwischen 55 und 65°C zu halten.
Das Produkt kann dann durch Neutralisation des Reaktionsmilieus mit einer verdünnten Mineralsäure und vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure und Ausfällung in Gegenwart eines Alkohols, wie Methanol, gewonnen werden.
Auf diese Weise ist es möglich, direkt und reproduzierbar ein Gemisch sulfatierter Polysaccharide zu erhalten, welches ein gewichtsmittleres Molekulargewicht besitzt, das geringer ist als dasjenige des Heparins,
zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton,
zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton enthält und ein gewichts-mittleres Molekulargewicht zwischen 3500 und 5500 Dalton und ein Verhältnis gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 besitzt und weniger als 2% Dermatansulfat enthält.
Die erfindungsgemäßen Gemische können vorteilhaft als antithrombotische Mittel eingesetzt werden.
Insbesondere sind sie bei der Verhütung von venösen Thrombosen in Situationen mit Risiken anwendbar. Dies besitzt auch Gültigkeit in Situationen mit langanhaltendem Risiko. Insbesondere ermöglichen es diese Gemische, erstmals bei festgelegten Dosen die Risiken thrombotischer Unfälle in der orthopädischen Chirurgie zu verringern. Dieses Risiko, das in Abwesenheit jeglicher Behandlung 70% beträgt und etwa 25% in Anwesenheit von Heparin, liegt bei den erfindungsgemäßen Gemischen. in der Größenordnung von 10% oder gar geringer.
Ebenso können nach Injektion in die Verteiler einer künstlichen Niere diese Gemische die Thrombosen, die sich dort entwickeln können, reduzieren. Diese letztgenannte Anwendung kann auf die Verhütung von Thrombosen in chirurgischem Material ausgedehnt werden.
Eine weitere, vorteilhafte, therapeutische Verwendung der erfindungsgemäßen Gemische beruht in der Verhütung arterieller, thrombotischer Unfälle, insbesondere im Fall eines Herzinfarkts.
Außerdem beruht eine besonders interessante Anwendung der erfindungsgemäßen Gemische auf der Möglichkeit, zur Verhinderung von venösen Thrombosen bei chirurgischen Patienten einen post-operativen Bereich zu verwenden. Diese Anwendung ist überaus vorteilhaft, da sie es erlaubt, während der Operation die Risiken einer Hämorrhagie und die Probleme des Typs und der Dosen des Anästhesiemittels zu vermeiden, welche durch eine Vorbeugung im prä-operativen Bereich bedingt sind.
Die Gesamtheit dieser Eigenschaften zeigt die therapeutischen Möglichkeiten der erfindungsgemäßen Präparate.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Bestimmungstechniken
Die Molekulargewichte und die Verteilungen des Molekulargewichts der Produkte werden durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit zwei Kolonnen in Reihe, z.B. denjenigen, die unter der Bezeichnung TSK G^® 3000SW (30 × 0,75cm) und Lichrosorb^® 100 Diol 10u (25 × 0,75cm) oder TSK G^® 2000SW im Handel erhältlich sind, die mit einem refraktometrischen Detektor gekoppelt sind, bestimmt. Das verwendete Lösungsmittel ist ein Phosphatpuffer 0,3 M, pH 7, und der Durchsatz beträgt 0,7 ml/min. Das System wird mit Standards, hergestellt durch Fraktionierung von Enoxaparin (PHARMUKA) durch Ausschlußchromatographie an Agarose-Polyacrylamid (IBF) nach der von BarrowCliffe et coll., Thromb.res., 12, 27-36 (1977-78), oder D.A.Lane et coll., Thromb.res., 12, 257-271 (1977-78), beschriebenen Technik, geeicht. Die Ergebnisse werden mit Hilfe der GPC6 Software (Perkin Elmer) berechnet.
In den folgenden Beispielen wird die antikoagulierende Gesamtaktivität der Gemische durch Trübungsmessung unter Verwendung des ersten internationalen Heparinstandards mit niedrigem Molekulargewicht bestimmt. Die Antifaktor-Xa(antithrombotische)-Aktivität wird mit der amidolytischen Methode an einem von Teien et coll., Thromb.res., 10, 399-410 (1977), beschriebenen, chromogenen Substrat unter Verwendung des ersten internationalen Heparinstandards mit niedrigem Molekulargewicht bestimmt.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die vorangehende Behandlungsstufe von Heparinnatrium, die es erlaubt, den Gehalt an Verunreinigungen vom Chondroitinsulfat- und Heparansulfat-Typ zu reduzieren.
Zu 10 g im Handel erhältlichem Heparin (Natriumsalz) in Lösung in 100 ml Wasser, welches 3 g Natriumchlorid enthält, gibt man 80 ml Methanol. Nach Ausfällen wird das erhaltene Produkt filtriert, gespült und dann getrocknet. Der Gehalt an Verunreinigungen des so erhaltenen Heparinnatriums wird durch sterische Ausschluß-Flüssigkeitschromatographie mit zwei Kolonnen in Reihe, die unter der Bezeichnung TSR^® 2000SW (60 × 0,75 cm) und TSK^® 3000SW (60 × 0,75 cm) im Handel erhältlich sind, welche mit einem auf 206 nm eingestellten UV-Detektor gekoppelt sind, bestimmt. Die verwendete, bewegliche Phase ist eine mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zirkulierende 0,5M wäßrige Natriumsulfatlösung. Der Versuch wird mit einem Vergleichsheparin verglichen, welches 2% Dermatansulfat enthält.
Unter den vorstehend angegebenen Bedingungen enthält das erhaltene Heparin weniger als 2% Dermatansulfat.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung des quaternären Ammoniumsalzes des Heparins.
Zu einer Lösung von 10 g weniger als 2% Dermatansulfat enthaltendem Natriumheparinat gemäß Beispiel 1 in 100 ml Wasser gibt man eine Lösung von 25 g Benzethoniumchlorid in 125 ml Wasser. Das bei Raumtemperatur erhaltene Produkt wird hierauf filtriert mit Wasser gewaschen und dann getrocknet.
Auf identische Weise stellt man das Benzethoniumsalz eines Heparins her, das keiner Behandlung gemäß Beispiel 1 unterzogen worden ist.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Gemische.
1. Veresterung
Zu einer Lösung von 15 g zuvor nach dem Verfahren des Beispiels 1 behandeltem Benzethoniumheparinat in 75 ml Methylenchlorid gibt man 15 ml Benzylchlorid. Die Lösung wird auf eine Temperatur von 35°C erhitzt, welche 25 Stunden beibehalten wird. Man gibt dann 90 ml einer 10%igen Natriumacetatlösung in Methanol zu, filtriert, wäscht mit Methanol und trocknet. Man erhält so 6,5 g Heparinbenzylester in Form des Natriumsalzes, dessen Veresterungsgrad, bestimmt wie vorstehend angegeben, 13,3 beträgt.
2. Depolymerisation
10 g vorstehend erhaltener Heparinbenzylester in Form des Natriumsalzes werden in 250 ml Wasser gelöst. Zu dieser auf 62°C erhitzten Lösung gibt man 0,9 g Natronlauge. Die Temperatur wird 1 Stunde und 30 Minuten bei 62°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird hierauf auf 20°C abgekühlt und durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Man stellt dann die Konzentration des Reaktionsmilieus auf 10% an Natriumchlorid ein. Das Produkt wird schließlich in 750 ml Methanol ausgefällt, filtriert und getrocknet. Man erhält so ein Heparin mit den folgenden strukturellen Merkmalen:
gewichtsmittleres Molekulargewicht: 3900 Dalton molekulare Verteilung:
20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton
5,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
Dispersion: d = 1,39
Anti-Xa-Aktivität: 106 IE
antikoagulierende Aktivität: 22,6 IE.
Beispiel 4
Auf ähnliche Weise stellt man, ausgehend von Estern mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14%, depolymerisierte Heparinlösungen mit den folgenden strukturellen Merkmalen her:

a) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4425 Dalton molekulare Verteilung: 12,4% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton 9,3% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton Dispersion: d = 1,37 Anti-Xa-Aktivität: 102 IE antikoagulierende Aktivität: 33 IE
b) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4579 Dalton molekulare Verteilung: 11,2% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton 10,4 Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton Dispersion: d = 1,37 Anti-Xa-Aktivität: 104 IE antikoagulierende Aktivität: 37 IE
c) gewichtsmittleres Molekulargewicht: 4446 Dalton molekulare Verteilung: 12,6% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton 9,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton Dispersion: d = 1,38 Anti-Xa-Aktivität: 100 IE antikoagulierende Aktivität: 32 IE.

Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung eines Gemisches, das nicht zu den erfindungsgemäßen Merkmalen führt.
1. Veresterung
Zu einer Lösung von 15 g eines nach dem Verfahren von Beispiel 1 vorbehandelten Benzethoniumheparinats in 60 ml Methylenchlorid gibt man 12 ml Benzylchlorid. Die Lösung wird auf eine Temperatur von 28°C erhitzt, die 30 Stunden beibehalten wird. Man gibt dann 90 ml einer 10%igen Natriumacetat-Lösung in Methanol zu, filtriert, wäscht mit Methanol und trocknet. Man gewinnt so 6,3 g Heparinbenzylester in Form des Natriumsalzes. Der Veresterungsgrad dieses Produkts, bestimmt durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographiemessung der Menge des durch Verseifung bei 0°C freigesetzten Benzylalkohols, beträgt 9,2%.
2. Depolymerisation
10 g des vorstehend in Form des Natriumsalzes erhaltenen Heparinbenzylesters werden in 200 ml Wasser gelöst. Zu dieser auf 58°C erhitzten Lösung gibt man 1,1 g Natronlauge. Die Temperatur wird 1 Stunde bei 58°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird hierauf auf 20°C abgekühlt und durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Man stellt dann die Konzentration des Reaktionsmilieus auf 10% an Natriumchlorid ein. Das Produkt wird schließlich in 600 ml Methanol ausgefällt, filtriert und getrocknet. Man gewinnt so ein Heparin mit den folgenden Strukturmerkmalen:
gewichtsmittleres Molekulargewicht: 5425 Dalton molekulare Verteilung:
9,6% Retten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton
19,5% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton
Dispersion: d = 1,44
Anti-Xa-Aktivität: 122 IE
antikoagulierende Aktivität: 68,6 IE.
Diese Resultate, die eine hohe antikoagulierende Aktivität zum Ausdruck bringen, zeigen die Überlegenheit der erfindungsgemäß hergestellten und die angegebenen Merkmale besitzenden Gemische.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt den Stabilitätsgewinn in vivo der erfindungsgemäßen Gemische, ausgedrückt durch ihre plasmatische Halbwertszeit.
Eine erste pharmakokinetische Untersuchung wurde an Freiwilligen mit einem Alter von 21 bis 30 Jahren durchgeführt. Subkutane Infektionen wurden in Dosen verabreicht, die zwischen 20 und 80 mg/ml variierten. Im Verlauf der Zeit wurden Proben entnommen (4,5 ml) und bei etwa 4°C gelagert. Die Proben wurden dann 15 Minuten bei 2300 g zentrifugiert und das an Plättchen arme Plasma wurde abgetrennt und vor der Analyse eingefroren. Die Halbwertszeit der Gemische wurde hierauf durch Messung der Anti-Xa-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind die folgenden:
Bei den in den Beispielen 3 und 4 erhaltenen Gemischen:
Dosis 40 mg: in 75% der Fälle ist die Halbwertszeit höher als 4 Stunden und sie ist sogar höher als 4 1/2 Stunden in etwa 45% der Fälle;
Dosis 60 mg: in 75% der Fälle ist die Halbwertszeit höher als 3,7 Stunden;
unter identischen Bestimmungsbedingungen besitzt intravenös injiziertes, intaktes Heparin eine Halbwertszeit von etwa 0,6 Stunden;
wird das Produkt nach dem in dem EP-Patent 40144 beschriebenen Verfahren hergestellt, ist die Halbwertszeit höher als 4 1/2 Stunden in 17% der Fälle.
Eine zweite, unter ähnlichen Bedingungen bei 20 Patienten durchgeführte Untersuchung ergab die folgenden Resultate für die erfindungsgemäßen Gemische:
Dosis 40 mg: in 80% der Fälle ist die Halbwertszeit höher als 4 Stunden und sie ist höher als 4 1/2 Stunden in etwa 40% der Fälle;
Dosis 20 mg: in 60 % der Fälle ist die Halbwertszeit höher als 3,9 Stunden.

Claims

Gemische sulfatierter Polysaccharide mit der Grundstruktur der das Heparin bildenden Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet, – dass sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht besitzen, das geringer ist als dasjenige des Heparins, – dass sie zwischen 9 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von geringer als 2000 Dalton und zwischen 5 und 20% Ketten mit einem Molekulargewicht von höher als 8000 Dalton besitzen, – dass in ihnen das Verhältnis gewichtsmittleres Molekulargewicht/zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 1,3 und 1,6 beträgt, – dass sie ein gewichtsmittleres Molekulargewicht zwischen etwa 3500 Dalton und etwa 5500 Dalton besitzen und – dass sie weniger als 2% Dermatansulfat enthalten.
Gemische gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ketten der sulfatierten Polysaccharide eine 2-O-Sulfo-4-enopyranosuronsäure an einem ihrer Enden aufweisen.
Verfahren zur Herstellung von Gemischen sulfatierter Polysaccharide gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die folgenden Stufen durchführt: – man in einer ersten Stufe in wässrigem Milieu ein Heparin mit einem langkettigen, quaternären Ammoniumsalz in ein Salz überführt, – man in einer zweiten Stufe das so erhaltene Salz verestert, um einen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5% und 14% zu bilden, und – man in einer dritten Stufe den erhaltenen Ester mit einem Veresterungsgrad zwischen 9,5 und 14% depolymerisiert, worin man • die zweite Stufe in einem chlorierten, organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Chlorderivats durchführt, indem man 1 Gew.-Teil des Heparinsalzes mit etwa 1 Vol.-Teil eines Chlorderivats in dem Medium von 3 bis 5 Vol.-Teilen des chlorierten, organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen 25 und 45°C mischt, und • die dritte Stufe durchführt, indem man den Ester mit einer starken Base in wässriger Lösung behandelt, in der das Gewichtsverhältnis Base/Ester zwischen 0,05 und 0,2 beträgt, das Gewichtsverhältnis Wasser/Ester zwischen 15 und 30 beträgt, wobei man die Temperatur des Milieus auf einen Wert zwischen 50 und 70°C einstellt und die Reaktion während einer Dauer von 30 Minuten bis 3 Stunden durchführt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der zweiten Stufe das Mischen bei einer Temperatur zwischen 30 und 40°C erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der dritten Stufe das Gewichtsverhältnis Base/Ester zwischen 0,08 und 0,15 beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in der dritten Stufe die Temperatur des Milieus auf einen Wert zwischen 55 und 65°C eingestellt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der dritten Stufe die Reaktion während einer Dauer von 1 bis 2 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der zweiten Stufe das Chlorderivat Benzylchlorid ist und das Lösungsmittel unter Chloroform und Methylenchlorid ausgewählt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer vorhergehenden Stufe das Ausgangs-Heparin mit Hilfe eines Alkohols ausfällt.
Verwendung der Gemische der sulfatierten Polysaccharide gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 zur Herstellung antithrombotischer Zusammensetzungen.
Verwendung gemäß Anspruch 10 zur Herstellung therapeutischer Zusammensetzungen für die Vorbeugung von venösen Thrombosen im post-operativen Bereich.