DE3434104A1

DE3434104A1 - Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure und verfahren dazu

Info

Publication number: DE3434104A1
Application number: DE19843434104
Authority: DE
Inventors: Endre A. Riverdale N.Y. Balazs; Adolf Brooklyn N.Y. Leshchiner
Original assignee: Biomatrix Inc Ridgefield NJ; Biomatrix Inc
Current assignee: Sanofi Biosurgery Inc
Priority date: 1983-12-15
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1985-08-29
Also published as: IT1178588B; FR2556728A1; AU3337984A; AU551628B2; GB2151244B; FR2556728B1; IT8423225A1; CA1238043A; IT8423225A0; GB2151244A; DE3434104C2; GB8420560D0

Description

WASSERUNLÖSLICHE ZUBEREITUNG VON HYALURONSÄURE UND VERFAHREN DAZU

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf biokompatibele, wasserunlösliche Zubereitungen van Hyaluronsäure ("HA"), ujelche - uiegen deren Biokompatibilität - die Möglichkeit für diese schafft, bei zahlreichen In-vivo-Anwendungen, beispielsweise für verschiedene prothetische Vorrichtungen und Mittel, einschließlich künstliche Herzklappen, vaskuläre Transplantate etc., verwendet zu werden. Die wasserunlösliche (oder vernetzte) HA kann auch benutzt werden, um verschiedene polymere Artikel zu modifizieren, die ebenfalls in zahlreichen In-vivo-Anwendungen verwendet werden können.

-U-

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen bei Raumtemperatur.

Hyaluronsäure ist eine bekannte, natürlich varkommende Substanz, welche viele Anwendungen in Medizin und Biologie aufweist. Es sei zum Beispiel auf die US-Patentschrift U 272 522 und die darin angegebenen Veröffentlichungen hingewiesen.

Vernetzte Gele der Hyaluronsäure sind bekannt; sie wurden durch Laurent et al in Acta Chem. Scand. 18 (1964 No. 1, Seiten 274 bis 275), beschrieben.

Die vorliegende Erfindung ist auf wasserunlösliche Zubereitungen von Hyaluronsäure (HA), die biokompatibel sind, gerichtet. Wie hierin benutzt, schließt der Ausdruck HA nicht nur Hyaluronsäure ein, sondern auch die Säureadditionssalze derselben, beispielsweise die Salze von Natrium, Kalium, Natriumkalium, Calcium etc. Wegen ihrer Biokompatibilität können sie sowohl bei zahlreichen In-vivo-Anwendungen per se als auch in Kombination mit verschiedenen polymeren Materialien verwendet werden, welche durch den Einschluß von derartigen wasserunlöslichen Zubereitungen darin modifiziert wurden.

Genauer ausgedrückt, ist die Erfindung auf wasserunlösliche Zubereitungen von Hyaluronsäure, einschließlich der folgenden Arten von Materialien, gerichtet:

1.) Vernetztes Hyaluronsäure-Pulver;

2.) Vernetzter Hyaluronsäure-Film bizw. vernetzte Hyaluronsäure-Membrane;

3.) l/ernetztes Gel der Hyaluronsäure; U.) Vernetzter Hyaluronsäure-Film, durch ein PoIyäthylen-Terephthalat-Gewirke verstärkt, sowie

andere Gewirke, und

5.) Partikuläre Materialien, mit vernetzter Hyaluronsäure bedeckt.

Das Vernetzungsmittel, das verwendet uiird, um die Sofort-Zubereitungen (Instant-Präparationen) herzustellen, ist Divinylsulfon. Es hat sich nun herausgestellt, daß ein unlösliches Hyaluronsäuregel dadurch erzielt werden kann, daß Hyaluronsäure mit Divinylsulfαπ (DUS) in UJasserlösung mit einem pH, höher als 9, bei Raumtemperatur, das heißt etwa 2D °C, vernetzt wird. Abhängig von der Konzentration und der molekularen Größe der Hyaluronsäure in der Lösung, von dem Hyaluronsäure/Divinylsulfon-Verhältnis und der Reaktionszeit, kann das Quellungsverhältnis des Gels über weite Bereiche, das heißt von 20 bis 2000, variieren. Das Quellungsverhältnis ist im wesentlichen abhängig von der Ionenstärke und der Wasserstoff ionenkonzentration des Mediums und nimmt mit der Ionenstärke ab. Dieses Verfahren ist eine Weiterbildung dem Verfahren, das in der Hauptanmeldung (US-Priorität

No. 561 818) beschrieben und beansprucht ist, und zwar dadurch, daß bei der vorliegenden Erfindung DVS bei Umgebungstemperaturen unter alkalischen Bedingungen verwendet wird, während bei der Hauptanmeldung DVS als Vernetzungsmittel nur unter Rückfluß bzw. Rücklauf (ca. 60 bis 65 ⁰C) verwendet wird.

Die folgenden Beispiele, (bei welchen alle angegebenen Teile gewichtsmäßig angegeben sind, wenn nicht anders aufgeführt), veranschaulichen die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung, ohne jedoch eine Einschränkung derselben darzustellen, wobei die Erfindung allein durch die Patentansprüche umrissen ist.

Beispiel 1

Einem Idasser-Aceton-Gemisch uiurde eine 37 geuiichts· prozentige UJasserlösung von Formaldehyd und konzentrierter Salzsäure beigemischt. Das erhaltene Gemisch bestand aus folgenden Zusammensetzungen (Geuiichtsprozent): CH₂D, 0,27; HCl, 0,19; Lüasser/Aceton-Uerhältnis 1 : 28. Natriumhyaluronatpulver (G,5 g) uiurde zum Rückfließen gebracht: 10 Minuten lang in 50 ml des Gemisches. Dann uurde das Pulver abgefiltert, mit einem Ulasser/Aceton-Gemisch 1 : 3 sorgfältig gewaschen, dann mit Aceton und schließlich in einem V/akuumofen getrocknet. Das erhaltene Hyaluronsäurepulver uar in LJasser unlöslich und enthielt 1,if1 % kombiniertes CH₂O.

Beispiel 2

Das obige Beispiel uiurde mit dem vernetzenden Gemisch der folgenden Zusammensetzung (Gewichtsprozent) 2Q wiederholt: CH₂O, 2,5; HCl, 0,38; Uasser/Aceton-Uerhältnis 1 : 2. Der CH₂0-Gehalt des Produktes war 5,3 %.

Bei den Beispielen 1 und 2 wurde die Vernetzung eines Hyaluronsäurepulvers in LJasser-Aceton-Gemischen durchgeführt. Durch Änderung des Uasser/Aceton-Verhältnisses und der CH-Q-Konzentration ist es möglich, das Quellungsverhältnis des Produktes zu steuern und zu regeln. Somit war das Quellungsverhältnis 178 % für das Produkt des Beispiels 1 und 230 % für das Produkt des Beispiels 2. Das Quellungsverhältnis kann dadurch reduziert werden, daß der Betrag des Acetons in dem Gemisch und die CH 0-Konzentration erhöht werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die V/erwendung einer Polyaziridin-Uerbindung als Uernetzungs-

mittel. Diese Verbindung des Polyaziridin-Typs vernetzt Hyaluronsäure unter Trockenbedingungen und bei Umgebungstemperatur, was bei Hyaluronsäure sehr wichtig ist, da es sich bei letzterer um ein uiärmeempfindliches Polymer handelt.

Beispiel 3

113,0 gm einer Natriumhyaluronatlösung in Wasser (Konzentration 1^,2 mg/ml) wurden 0,<+2 g einer Polyaziridin-Verbindung - Cross-Linker CX-100 (Polyvinyl-Chemikalie) - beigemischt. Das Molverhältnis des Vernetzungsmittels zu Hyaluronsäure war 0,5. Das Gemisch wurde in eine Glasplatte als eine 5 mm dicke Schicht gegossen und bei Raumtemperatur 2 Tage lang trocknen gelassen. Ein klarer Film aus vernetzter Hyaluronsäure wurde erhalten, der in Wasser nicht löslich war und ein Quellungsverhältnis in ülasser von 1S0 % hatte.

Beispiel h

0,5 g eines trockenen Natriumhyaluronatpulvers wurden mit 50 ml einer 1/oigen Lösung von Cross-Linker CX-100 in Aceton vermischt, 5 Minuten lang gelassen und abgefiltert. Das Pulver wurde an der Luft 2 Stunden lang getrocknet, dann mehrmals mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen bei ^O ⁰C U Stunden lang getrocknet. Das Quellungsverhältnis des vernetzten Pulvers in Wasser war 135 %.

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Polyaziridin-Verbindung zur Erzielung vernetzter Hyaluronsäure mit einem hohen Grad an Quellung.

-B-

Beispiel 5

0,6 g festes IMatriumhyaluronat wurde mit 9,2 g einer D,6%igen Lösung, gewichtsmäßig, van Crass-Linker CX-100 in Wasser gemischt. Die erhaltene Lösung hatte ein Malverhältnis von CX-100 zu Natriumhyaluranat = 0,1. Der Natriumhyaluronatgehalt in der Lösung war 6,0^ Gewichtsprozent. Der pH-Wert des erhaltenen sehr viskosen Gemisches wurde mit 2 % HCl auf 2,5 eingeregelt. Der sich ergebende Film war in Wasser leicht löslich. Der Film wurde bei 60 ⁰C 3D Minuten lang erwärmt. Die Wärmebehandlung lieferte einen dauerhaften und wasserunlöslichen Film.

Beispiel 6

Faserartiges Natriumhyaluranat (0,1093 g) wurde mit 25 ml einer 1%igen Lösung van Palyisacyanat (Desmadur IM—75, Mabay Chemical Corp.) in Aceton vermischt, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang zum Rückfließsn gebracht. Das Präzipitat wurde separiert und dreimal mit Aceton gewaschen, im Vakuum bei ^5 min Hg und 60 ⁰C 30 Minuten lang getrocknet und schließlich in einem Vakuum-Dessicatar über Phasphorpentaxid getrocknet. Das erhaltene Produkt ( 0,1127 g) war in Wasser unlöslich und hatte einen Quellungsgrad von 120 %.

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung van DimethylolMthylenharnstaff für das Vernetzen von Hyaluronsäure.

Beispiel 7

6,0 g Natriumhyaluronatlösung in Wasser (Kanzentration 9,8 mg/ml) wurden mit 0,017 g IM,IM¹ -Dimetyloläthylenharnstoff und 0,005 g Zinknitrat gemischt. Das Bemisch wurde auf eine Glasplatte gegossen und über Nacht trocknen gelassen. Der erhaltene Film wurde bei 110 C 15 Minuten lang wärmebehandelt. Er wurde in Wasser unlöslich und hatte einen Quellungsgrad von 1**5 %.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Verwendung von Divinylsulfon für das Vernetzen von Hyaluronsäure .

Beispiel S

35 ml Natriumhyaluronatlösung enthielt 0,**01 g (1 MillimoDDivinylsulfon. Der pH des Gemisches wurde auf ungefähr 8,5-9 mit einer 1%igen Lösung Natriumhydroxid eingeregelt. Man erhielt dadurch einen Film aus dem Gemisch, daß man es auf eine Glasplatte goß und es über Nacht bei Raumtemperatur trocknete. Dieser Film war in Wasser leicht löslich. Der Film wurde bei 60 C 30 Minuten lang erwärmt. Die Wärmebehandlung lieferte einen festen, dauerhaften und wasserunlöslichen Film.

Beispiel 9

Ein trockener Film einer nichtvernetzten Hyaluronsäure wurde in eine Lösung von 0,6 g Divinylsulfon in einem Gemisch von 26 g Aceton und 13 g Wasser gelegt und 10 Minuten lang darin belassen. Der Film wurde aus der Lösung entfernt, 10 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann in einem Ofen 20 Minuten lang bei 65 ⁰C erhitzt. Ein dauerhafter vernetzter Film der Hyaluronsäure wurde erzielt.

BeiSDiel 10

2,95 gm lufttrockenes Natriumhyaluronat ujurde mit 57,35 gm einer 0,2 N Lösung von NaOH in Wasser gemischt und mit einem Glasstab gerührt, bis es völlig gelöst war. Dann wurde 1,0 gm Divinylsulfon in das Gemisch gerührt, und letzteres wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wandelte sich in ein hartes Gel. Das Gel wurde zusammen mit 100 ml HO in ein Homagenisiergerät Vir-Tis "£+5" gelegt und 5 Minuten lang bei 30.000 UpM behandelt. Stark gequollene kleine Partikel wurden erzielt. Die Partikel wurden mehrmals mit Wasser gewaschen und mit Ansaugung an einem Glasfilter abgefiltert. Um das Quellungsverhältnis zu bestimmen, wurde etwa 1 gm des Gels in einen 15 ml Glasfilter gelegt, das wiederum in ein Kunststoffzentrifugenrohr gelegt wurde. Das Gel wurde 30 Minuten lang mit 3.000 UpM zentrifugiert. Das herausgedrückte Wasser sammelte sich am Boden des Rohres. Es stellte sich heraus, daß die Hyaluronsäurekonzentration in dem Gel 0,21 % betrug, das heißt, das Schwellungsverhältnis in Wasser war if76.

Beispiel 11

Das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren wurde

wiederholt, aber das Gel, das man erhielt, wurde in einer 0,15 M Lösung NaCl in Wasser dispergiert, und die Teilchen wurden in der gleichen Lösung gewaschen. Die Hyaluransäurekonzentration in dem Gel nach der Zentrifugierung betrug 1,29 %, und das Quellungsverhältnis war 77,5.

Beispiel 12

1,0 gm lufttrockenes Natriumhyaluronat uurde in 9,0 gm von 0,2 M NaOH gelöst, während mit einem Glasstab gerührt wurde. 0,33 gm Divinylsulfon wurde in die erhaltene viskose Lösung eingerührt, und das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das erhaltene harte Gel wurde behandelt, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die Hyaluronsäurekonzentration in dem Gel nach der Zentrifugierung war ^,30 %, das heißt, das Quellungsverhältnis war 23,6.

Die Biokompatibilität der Zubereitungen gemäß der Erfindung wurde durch das nachstehend beschriebene Testverfahren bewiesen.

Beispiel 13 - Blutkompatibilitätstest

Die Freisetzung von Η-Serotonin durch menschliche Blutplättchen wurde in vorausgehenden Studien angewendet, um die Blutreaktivität einer gemäß Beispiel 10 zubereiteten Probe abzuschätzen. Normales menschliches venöses Blut wurde in Kunststoffspritzen abgezogen und unmittelbar in Kunststaffröhrchen übermittelt, die 3,8 % Natriumcitrat (Heil Citrat zu neun Teile Wollblut) enthielten. Blutplättchenreiches Plasma wurde durch Zentrifugierung bei ^ ⁰C 15 Minuten lang mit 125 χ g zubereitet und durch eine serologische Pipette in eine Kunststoff- oder silizierte Teströhre entfernt. H-Serotonin ( H-5-Hydroxytryptamin, H-5HT; New England Nuclear, 26,3 Ci/mmol, lmCi/ml Äthanol-tJasser) wurde dem plättchenreichen Plasma (platelet rich plasma = PRP), 0,2-0,5 ul/ml PRP, beigemischt und 15 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Bei der Prüfung wurden silizierte oder Polypropylen-Teströhren verwendet; Thrombin wurde als Positivkontrolle benutzt,

belegte und unbelegte Proben wurden geprüft. 1,0-2,G ml

H-5HT-PRP idurde jeder van Duplikatröhren, die zu untersuchende Proben enthielten , zugegeben; eine 50 ul Aliquote uurde zur Ermittlung der Gesamtradioaktivität aus dem Kontrollgemisch entfernt. Im Anschluß an die entsprechende Inkubationszeit (10-12D Minuten) wurden D_f2-0,5 ml Aliquoten der Suspension entfernt und 2 Minuten bei 12.000 χ g über Silikonöl in einer Eppendorf-Microfuge zentrifugiert. 50 ul des Überstandes wurden aus jeder Röhre entfernt, mit 5 ml eines flüssigen Szintillationsfluids vermischt, und die Radioaktivität wurde durch Betaspektrometrie gemessen. Der Betrag von H-5HT, durch Thrombin freigesetzt oder die Testproben, war die Zunahme an Radioaktivität des Überstandes (Radioaktivität der experimentellen Proben minus Radioaktivität der Kontrolle). Das Testmaterial brachte keine signifikante Blutplättchenfreisetzung von H-5HT für bis zu 120 Minuten mit sich.

Variationen und Modifikationen können natürlich vorgenommen werden, ohne von dem Gedanken und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Zipse&Habersack : ^:~^: ' ^: ί Ratentanwälte

Kemnatenstraße 49, D-8000 München 19 beim Europäischen Patentamt

Telefon (089) 17 0186, Telex (07) 81307 zugelassene Vertreter

Biomätrix Inc. PM 03 Z

USA-Ridgefield, New Jersey 07657 16. Sept.1984

Patentansprüche

M.) Verfahren zur Herstellung einer uasserunlöslichen Hyaluronsäure-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronsäure oder ein Säureadditiünssalz davon in Form eines Pulvers,· eines Films oder eines Gelees einer Behandlung mit Divinylsulfon bei etwa 2D ⁰C in einem wäßrigen alkalischen Medium unterzogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einem pH von mehr als etwa pH 9 bewirkt uird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung 1 Stunde bis 20 Stunden lang bewirkt wird.

if. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich-2D net, daß das Verhältnis Hyaluronsäure zu Divinylsulfon

geuiichtsmäßig etuia 3:1 ist.

5. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß dieses gemäß dem V/erfahren nach Patentanspruch 1 hergestellt ist.