DE3434104C2

DE3434104C2 -

Info

Publication number: DE3434104C2
Application number: DE3434104A
Authority: DE
Inventors: Endre A. Riverdale N.Y. Us Balazs; Adolf Brooklyn N.Y. Us Leshchiner
Original assignee: Biomatrix Inc
Current assignee: Sanofi Biosurgery Inc
Priority date: 1983-12-15
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1991-06-20
Also published as: IT1178588B; CA1238043A; IT8423225A1; IT8423225A0; AU551628B2; GB2151244A; GB2151244B; FR2556728B1; DE3434104A1; GB8420560D0; AU3337984A; FR2556728A1

Description

Die Erfindung stellt eine weitere Ausführungsform der Erfindung gemäß Hauptanmeldung P 34 34 082.3 dar und betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen, biokom patiblen Hyaluronsäure-Zubereitung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie die verfahrensgemäß erhaltene Hyaluronsäure- Zubereitung.

Hyaluronsäure ist eine bekannte, natürlich vorkommende Substanz, welche viele Anwendungen in Medizin und Biologie hat. Es sei zum Beispiel auf die US-PS 42 72 522 und die darin angegebenen Veröffentlichungen hingewiesen.

Vernetzte Gele der Hyaluronsäure sind bekannt; sie wur den durch Laurent et al in Acta Chem. Scand. 18 (1964) Nr. 1, Seiten 274 bis 275 beschrieben, wobei als Vernetzungsmittel 1, 2, 3, 4-Diepoxybutan verwendet wurde.

Die DE-OS 26 27 125 beschreibt die Herstellung von ver netztem Pullulan zur Gewinnung von umweltverträglichen Kunst stoffen.

Die DE-OS 26 31 908 beschreibt die gemeinsame Vernetzung von Mucopolysacchariden mit Kollagen unter Verwendung von Al dehyden.

Die DE-OS 23 12 615 beschäftigt sich mit einem Verfahren zum Kuppeln von Verbindungen mit Hydroxyl- und/oder Amino gruppen an Polymere, wobei Divinylsulfon als Kupplungsmittel beschrieben wird.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein neues Verfah ren zur Herstellung wasserunlöslicher Hyaluronsäure-Zuberei tungen zur Verfügung zu stellen, mit dem insbesondere biokom patible Hyaluronsäure-Zubereitungen erhalten werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß An spruch 1 bzw. dem verfahrensgemäß erhaltenen Produkt.

Die Erfindung ist auf biokompatible wasserunlösliche Zu bereitungen der Hyaluronsäure gerichtet. Aufgrund ihrer Bio kompatibilität können diese Zubereitungen sowohl bei zahlrei chen In-vivo-Anwendungen per se als auch in Kombination mit verschiedenen polymeren Materialien verwendet werden, welche durch den Einschluß derartiger wasserunlöslicher Zubereitungen darin modifiziert wurden. Solche In-vivo-Anwendungen sind bei spielsweise verschiedene prothetische Vorrichtungen und Mit tel, einschließlich künstlicher Herzklappen und vaskulärer Trans plantate. Die wasserunlösliche vernetzte Hyaluronsäure kann auch benutzt werden, um verschiedene polymere Artikel zu modifizieren, die ebenfalls in zahlreichen In-vivo-Anwendungen verwendet werden können. Im Sinne der Erfindung schließt der Ausdruck "Hyaluronsäure" nicht nur die Säure selbst ein, son dern auch deren Säureadditionssalze, beispielsweise die Natrium-, Kalium-, Natriumkalium- und Calciumsalze.

Genauer ausgedrückt, ist die Erfindung auf wasser unlösliche Zubereitungen von Hyaluronsäure, einschließ lich der folgenden Arten von Materialien, gerichtet:

1. Vernetztes Hyaluronsäure-Pulver;
2. Vernetzter Hyaluronsäure-Film bzw. vernetzte Hyaluronsäure-Membran;
3. Vernetztes Gel der Hyaluronsäure;
4. Vernetzter Hyaluronsäure-Film, durch ein Poly äthylen-Terephthalat-Gewirke verstärkt, sowie andere Gewirke, und
5. Partikuläre Materialien, mit vernetzter Hya luronsäure bedeckt.

Das Vernetzungsmittel, das verwendet wird, um die Sofort-Zubereitungen (Instant-Präparationen) herzustel len, ist Divinylsulfon. Es hat sich nun herausgestellt, daß ein unlösliches biokompatibles Hyaluronsäuregel dadurch erzielt wer den kann, daß Hyaluronsäure mit Divinylsulfon (DVS) in Wasserlösung mit einem pH, höher als 9, bei Raumtempe ratur, das heißt etwa 20°C, vernetzt wird. Abhängig von der Konzentration und der molekularen Größe der Hyaluron säure in der Lösung, von dem Hyaluronsäure/Divinyl sulfon-Verhältnis und der Reaktionszeit, kann das Quell verhältnis des Gels über weite Bereiche, das heißt von 20 bis 2000, variieren. Das Quellverhältnis ist im wesentlichen abhängig von der Ionenstärke und der Was serstoffionenkonzentration des Mediums und nimmt mit der Ionenstärke ab. Dieses Verfahren ist eine Weiterbildung des Verfahrens, das in der Hauptanmeldung P 34 34 082.3 mit der US-Priorität 5 61 818 beschrieben und be ansprucht ist, und zwar dadurch, daß bei der vorliegen den Erfindung DVS bei Umgebungstemperaturen unter alkalischen Bedingungen verwendet wird, während bei der Hauptanmeldung DVS als Vernetzungsmittel nur unter Rück fluß bzw. Rücklauf (ca. 60 bis 65°C) verwendet wird.

Die folgenden Beispiele, (bei welchen alle ange gebenen Teile gewichtsmäßig angegeben sind, wenn nichts anderes gesagt ist), veranschaulichen die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung, zur Verwendung von Divinylsulfon für das Vernetzen von Hyaluron säure.

Beispiel 1

35 ml Natriumhyaluronatlösung enthielt 0,401 g (1 Millimol) Divinylsulfon. Der pH-Wert des Gemisches wurde auf ungefähr 8,5-9 mit einer 1%igen Lösung Natrium hydroxid eingeregelt. Man erhielt dadurch einen Film aus dem Gemisch, daß man es auf eine Glasplatte goß und es über Nacht bei Raumtemperatur trocknete. Dieser Film war in Wasser leicht löslich. Der Film wurde bei 60°C 30 Minuten lang erwärmt. Die Wärmebehandlung lieferte einen festen, dauerhaften und wasserunlöslichen Film.

Beispiel 2

Ein trockener Film einer nichtvernetzten Hyaluron säure wurde in eine Lösung von 0,6 g Divinylsulfon in einem Gemisch von 26 g Aceton und 13 g Wasser gelegt und 10 Minuten lang darin belassen. Der Film wurde aus der Lösung entfernt, 10 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann in einem Ofen 20 Minuten lang bei 65°C erhitzt. Ein dauerhafter vernetzter Film der Hyaluronsäure wurde erzielt.

Beispiel 3

2,95 gm lufttrockenes Natriumhyaluronat wurde mit 57,35 gm einer 0,2 N Lösung von NaOH in Wasser ge mischt und mit einem Glasstab gerührt, bis es völlig gelöst war. Dann wurde 1,0 gm Divinylsulfon in das Ge misch gerührt, und letzteres wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wandelte sich in ein hartes Gel. Das Geld wurde zusammen mit 100 ml H₂O in ein Homogenisiergerät Vir-Tis "45" gelegt und 5 Minuten lang bei 30 000 min^-1 behandelt. Stark gequol lene kleine Partikel wurden erzielt. Die Partikel wur den mehrmals mit Wasser gewaschen und mit Ansaugung an einem Glasfilter abgefiltert. Um das Quellverhält nis zu bestimmen, wurde etwa 1 gm des Gels in einen 15 ml Glasfilter gelegt, das wiederum in ein Kunststoffzentri fugenrohr gelegt wurde. Das Gel wurde 30 Minuten lang mit 3000 min^-1 zentrifugiert. Das herausgedrückte Wasser sammelte sich am Boden des Rohres. Es stellte sich heraus, daß die Hyaluronsäurekonzentration in dem Gel 0,21% betrug, das heißt, das Quellverhältnis in Wasser war 476.

Beispiel 4

Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, aber das Gel, das man erhielt, wurde in einer 0,15 M Lösung NaCl in Wasser dispergiert, und die Teilchen wurden in der gleichen Lösung gewaschen. Die Hyaluronsäurekonzentration in dem Gel nach der Zentri fugierung betrag 1,29%, und das Quellverhältnis war 77,5%.

Beispiel 5

1,0 mg lufttrockenes Natriumhyaluronat wurde in 9,0 gm von 0,2 N NaOH gelöst, während mit einem Glas stab gerührt wurde. 0,33 gm Divinylsulfon wurde in die erhaltene viskose Lösung eingerührt, und das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Das erhaltene harte Gel wurde behandelt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Hyaluronsäurekonzentration in dem Geld nach der Zentrifugierung war 4,30%, das heißt, das Quellverhältnis war 23,6.

Die Biokompatibilität der Zubereitungen gemäß der Erfindung wurde durch das nachstehend beschriebene Test verfahren bewiesen.

Beispiel 6 - Blutkompatibilitätstest

Die Freisetzung von ³H-Serotonin durch menschliche Blut plättchen wurde dazu verwendet, die Blutreaktivität einer ge mäß Beispiel 3 hergestellten Probe abzuschätzen. Normales mensch liches venöses Blut wurde in Kunststoffspritzen aufgezogen und unmittelbar in Kunststoffröhrchen überführt, die 3,8% Na triumcitrat enthielten (1 Teil Citrat zu neun Teile Vollblut). Blutplättchenreiches Plasma wurde durch Zentrifugieren herge stelllt (15 Minuten lang mit 125 g bei 4°C) und mit einer serologischen Pipette in ein Kunststoff- oder siliziertes Reagenzglas überführt. ³H-Serotonin (³H-5-Hydroxytryptamin, ³H-5 HT; New England Nuclear 26,3 Ci/mmol, 1 mCi/ml Ethanol- Wasser) wurde dem plättchenreichen Plasma (platelet rich plas ma = PRP), 0,2 bis 0,5 µl/ml PRP, beigemischt und dann 15 Mi nuten lang bei 37°C inkubiert. Für die Untersuchungsmessung wurden silizierte oder Polypropylen-Reagenzgläser verwendet, Thrombin wurde als positive Vergleichsprobe eingesetzt, und es wurden beschichtete und unbeschichtete Proben untersucht. 1,0 bis 2,0 ml ³H-5 HT-PRP wurden in jeweils zwei Reagenzgläser ge geben, die zu untersuchende Proben enthielten. Ein 50 µl Ali quot wurde zur Ermittlung der Gesamtradioaktivität aus dem Vergleichsgemisch entnommen. Im Anschluß an die entsprechende Inkubationszeit (10 bis 120 Minuten) wurden 0,2 bis 0,5 ml Aliquote der Suspension entnommen und 2 Minuten lang bei 12 000 g über Silikonöl in einer Eppendorf-"Microfuge" zentri fugiert. 50 µl des Überstandes wurden aus jedem Reagenzglas entnommen, mit 5 ml eines flüssigen Szintillationsfuids ver mischt, und die Radioaktivität durch Betaspektrometrie gemes sen. Die durch Thrombin oder die zu untersuchenden Proben freigesetzte Menge an ³H-5 HT entsprach der Zunahme an Radio aktivität des Überstandes (Radioaktivität der experimentellen Proben minus Radioaktivität der Vergleichsproben). Das Testma terial führte innerhalb eines Zeitraums von bis zu 120 Minuten zu keiner Signifikaten Blutplättchenfreisetzung von ³H-5 HT.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen, bio kompatiblen Hyaluronsäure-Zubereitung durch Behandlung von Hyaluronsäure mit einem Vernetzungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man
Hyaluronsäure in Form eines Pulvers, eines Films oder eines Gels einsetzt, und daß man
die Behandlung mit Divinylsulfon als Vernetzungsmittel bei Raumtemperatur in wäßrigem alkalischen Medium bei einem pH- Wert von mehr als 9 durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung über einen Zeitraum von 1 bis 20 Stunden durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis Hyaluronsäure zu Divinylsulfon etwa 3 : 1 beträgt.

4. Produkt, erhalten mit dem Verfahren nach einem der vorher gehenden Ansprüche.