DE69207263T2

DE69207263T2 - Nichtporöse Kollagenfolie zur therapeutischen Verwendung, und Verfahren und Vorrichtung zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE69207263T2
Application number: DE69207263T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Bonfanti; Diego Furlan; Giuseppe Scappaticci
Original assignee: Euroresearch SRL
Current assignee: Euroresearch SRL
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1992-04-29
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2012-04-30
Also published as: IT1249315B; CA2064993C; CA2064993A1; ATE132517T1; EP0514691A2; EP0514691B1; JP3423330B2; ITMI911423A1; JPH05117162A; ITMI911423A0; EP0514691A3; KR100229304B1; CN1066790A; KR920021161A; DE69207263D1

Description

Kollagen ist ein Skleroprotein, das in der Natur weit verbreitet ist. Es stellt etwa ein Drittel der gesamten Proteine des menschlichen Körpers.
In der medizinischen Praxis ist seit kurzem die Einführung der Verwendung von Kollagen als stimulierendes Agens im Narbungsbildungsprozeß beobachtet worden, wobei eine Wechselwirkung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren eingeschlossen ist, z.B. seine "einfangende" Wirkung auf Fibronektin, ein Glykoprotein, das eine Zellbindung und die Wanderung und Replikation von resultierenden Zellen fördert (siehe "I1 collageno nella cicatrizzazione" von B. Palmieri, publ. Artestampa, Januar 1990, S. 40-42) sowie andere Wirkungen, die noch nicht völlig geklärt sind. Das bekannte Kollagen- Produkt wird in stabiler Form unter Verwendung eines besonderen nicht-denaturierenden Verfahrens hergestellt, und zwar nach einem Extraktionsverfahren aus tierischen Organen, die reich an diesem Skleroprotein sind, Reinigung und anschließende Gefriertrocknung. Das Endprodukt liegt in Form von Matten mit größerer oder kleinerer Dicke vor und ist durch ein hohes Absorptionsvermögen (Exsudate und Flüssigkeiten im allgemeinen) charakterisiert, und zwar aufgrund seines Aufbaus in Form von Fasern, die voneinander beabstandet und verzweigt sind, so daß eine große spezifische Oberfläche für eine Absorption verfügbar ist (bis zum 50- fachen seines Gewichts). Die hydrophile Natur von Collagen begünstigt dieses Absorptionsvermögen noch stark.
Zusätzlich zu der oben genannten Funktion wird die Rolle von Kollagen bei der Narbenbildung durch eine Kollagen/Thrombozyt-Wechselwirkung und die Bildung einer Bindung zwischen dem Kollagen, dem Fibronektin und den Wachstumsfaktoren, Moleküle, von denen bekannt ist, daß sie bei der Steuerung des Narbenbildungsprozesses beteiligt sind (siehe S. 45-46 der oben genannten Literaturstelle) charakterisiert.
Es gibt allerdings Fälle, in denen die Absorbensbildung des Kollagenschwamms und seine hydrophile Natur zu einem übermäßigen Verlust physiologischer Flüssigkeiten führen. Es ist bekannt, daß normalerweise ein Verdunstungsprozeß durch die nicht geschädigte Haut abläuft, und daß dieser im Fall einer Hautverletzung beträchtlich verstärkt ist, was zu einer Dehydratisierung der tiefer liegenden Schichten führt. Dieses Phänomen tritt z.B. in Fällen von Verbrennungen auf, wenn große Hautteile traumatisch geschädigt sind. In diesem Fall verstärkt der Absorptionseffekt von lyophilisiertem Kollagen den Verdunstungsprozeß stärker, was zu einer Schädigung der tiefer liegenden Struktur führt.
Eine weitere Art eines bekannten Medikaments auf Collagenbasis, das für die Wundheilung verwendbar ist, wird durch das membranöse Kollagenmaterial dargestellt, daß durch die EP-A-0 376 931 offenbart wird und das hergestellt wird, indem eine Kollagengel-Matrix zertrümmert und zentrifugiert wird, um so Kollagen auszufällen, das ausgefällte Material in Form einer Paste homogenisiert wird, die Paste dann gegossen und getrocknet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Produkt bereit, das - während die Eigenschaften einer schnellen Narbenbildung von Kollagen aufrechterhalten werden - gleichzeitig eine übermäßige Verdunstung verhindert, eine konstante Inspektion des Wundbetts erlaubt, ohne daß es entfernt werden muß (Durchsichtigkeit), das einfach und praktisch im Gebrauch ist, ausreichend an der verletzten Oberfläche haftet, keine häufige Erneuerung erfordert, das transpirieren kann, um eine Sauerstoffversorgung des Wundbetts zuzulassen, während es seine Verunreinigung durch Bakterien verhindert, das in biologischen Flüssigkeiten, mit denen es in Kontakt kommt, absorbierbar, aber nicht löslich ist, ausgenommen durch eine spezifische enzymatische Wirkung, und das strukturell homogen ist.
Ein weiteres wichtiges Merkmal des Kollagens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß es als Interpositionsmaterial zur Verhinderung von Verwachsungen bei inneren Operationen geeignet ist.
Um ein Produkt mit diesen Merkmalen zu erhalten, wurde Typ I-Kollagen verwendet, wie es in Tabelle 1, Seite 3, der oben zitierten Literaturstelle definiert ist, und das die Molekularstruktur [α1(I)&sub2;]α2(I) hat. Dieses Kollagen hat die Eigenschaft, in verschiedenen Typen biologischer Flüssigkeiten unlöslich zu sein. Typ I-Kollagen, das in der Haut enthalten ist, stellt etwa 80% des gesamten Kollagens, das in der Tiefendermis lokalisiert ist, 90 bis 95% des in den Sehnen und 100% des in den Knochen lokalisierten Kollagens. Typ I-Kollagen ist daher dem in der menschlichen Haut enthaltenen Kollagen biologisch am ähnlichsten.
Um ein Produkt mit homogener Struktur zu erhalten, wurde wegen der Unlöslichkeit des Kollagens von dem bekannten Verfahren eines Dispergierens von fibrösem Kollagen in verdünnter Essigsäurelösung mit einem pH von etwa 2,5 und Rührens, bis eine gute Dispersion der Kollagenfasern in der Flüssigkeit errreicht ist, Gebrauch gemacht. Bei diesem pH-Wert quellen die Fasern unter Bildung eines Gels. Das erhaltene Gel, das noch Faserfraktionen, die noch nicht vollständig geliert sind, und möglicherweise Korpusceln fremder Substanzen enthält, wird weiter mit einer Essigsäurelösung, die einen pH von 2,5 bis 3,5 hat, verdünnt, bis eine zufriedenstellende Fluidmasse erhalten wird, die dann filtriert wird.
Das Filtrieren, das unter Vakuum durchgeführt wird, verwendet einen Spezialfilter, dessen kennzeichnende (aber nicht limitierende) Merkmale später angegeben werden, und erlaubt praktisch eine völlige Eliminierung der unvermeidlichen Luftblasen, die sich während des Gelierens bilden und die schwierig zu entfernen sind, wobei die Viskosität des Kollagengels erzielt wird.
Durch die Wirkung des Vakuums, das in der Größenordnung von 3999 Pa Restdruck sein muß, vergrößern diese Blasen ihr Volumen, das Durchgehen durch das Sieb zerstört sie dann und eliminiert sie. Es wurde experimentell festgestellt, daß die besten Filtrationsbedingungen, um das beschriebene Phänomen zu erreichen, wie folgt waren: Geltemperatur 10 bis 30ºC, 7998 Pa (20 bis 60 mmHg), vorzugsweise etwa 3999 Pa (30 mmHg).
Diese Daten sind in die indikativ; und es wurde experimentell festgestellt, daß sie am wirksamsten sind, obgleich sie keine Beschränkung für die Betriebsbedingungen dieses Verfahrens darstellen.
Das filtrierte Gel wird in einem verschlossenen Behälter gesammelt, der unter Vakuum gehalten wird und so gebaut ist, daß das filtrierte Gel an Behälterzwischenwänden entlangläuft, welche unter dem Filtersieb angeordnet sind und zur Herstellung eines kontinuierlichen Flüssigkeitsfilms strukturiert sind, wobei dieser Flüssigkeitsfilm keine weitere Luftabsorption nach der Filtration, die dem Einschluß von Luftblasen folgt, erlaubt.
Das filtrierte Gel wird weiter unter einem Vakuum von 2666 bis 3332,5 Pa (20 bis 25 mmHg) gehalten, und zwar für eine weitere Stunde, um eine völlige Eliminierung von irgendwelchen Luftblasen, die immer noch im Gel vorhanden sind, zuzulassen.

FILTERAPPARATUR

Der Filter, der zum Filtrieren des Kollagengels erforderlich ist und der außer den festen Partikel, die auf dem Sieb zurückgehalten werden, auch die darin enthaltenen Luftblasen eliminiert, besteht aus einem oberen zylindrischen Mantel aus Stainless Steel, der mit einem Schabrührer ausgestattet ist, um das Kollagengel gemischt zu halten und um feste Partikel aus dem Sieb zu entfernen, so daß diese es nicht verstopfen. Der Boden des zylindrischen Mantels weist ein Sieb aus Stainless Steel mit einer Maschengröße von weniger als 0,1 mm auf (es wurde festgestellt, daß Taurail-Siebe sehr wirksam sind).
Der untere Teil (unter dem Sieb) besteht aus einem zylindrischen Mantel, in dem mit einer geeigneten Pumpe Vakuum erzeugt werden. Die Luftblasen, die in dem Gel, das durch das Sieb geht, enthalten sind, vergrößern aufgrund des Vakuums ihr Volumen beträchtlich.
Etwa 3 mm unterhalb des Filtersiebs gibt es eine Vorrichtung, die aus einer Reihe von Platten aus Stainless Steel besteht, die vertikal oder schräg und parallel zueinander angeordnet sind. Das filtrierte Gel geht entlang diesen Platten in Form eines kontinuierlichen Flüssigkeitsfilms nach unten und läuft durch die Schwerkraft in Richtung des Behälterbodens.
Die Luftblasen, die nicht durch die Wirkung des reduzierten Drucks zusammenbrechen, bleiben hauptsächlich im oberen Teil der Vorrichtung zurück, wohingegen das Gel, das nun von Luft frei oder fast frei ist, zum Boden des Behälters läuft. Einige sehr kleine Blasen, die immer noch im filtrierten Gel vorhanden sind, reduzieren ihr Volumen bei Rückkehr zu atmosphärischem Druck beträchtlich, so daß sie praktisch weg sind.
Wegen des Unterschieds zwischen dem Druck der Gelumgebung vor der Filtration und dem Restdruck unter dem Sieb (etwa 3999 Pa) nimmt das Blasenvolumen während der Filtration auf mehr als das 25-fache zu. Beim Übergang vom Vakuum zu dem Umgebungsdruck nimmt das Blasenvolumen entsprechend um das 25-fache ab. Demnach haben die Luftblasen mit einem Durchmesser von weniger als 0,100 mm (empfohlene Siebdurchgangsgröße) einen Durchmesser von weniger als 0,034 mm, wenn sie zu atmosphärischem Druck zurückkehren, d.h. sie sind praktisch unsichtbar. Während des Trocknens werden diese Restblasen entfernt, ohne daß sie nennenswerte Krater in der Struktur der erhaltenen Folie zurücklassen.
Dies bedeutet, daß über die gesamte Folienoberfläche eine gleichmäßige Dicke erhalten werden kann, so daß jede Porosität verhindert wird, die ein bevorzugter Angriffspunkt für eine enzymatische Wirkung darstellen könnte und die Schutzwirkung gegen ein Eintreten von Mikroorganismen zunichte machen würde.

TROCKNUNG

Das filtrierte Gel, das wie beschrieben erhalten wird, und das frei von Fremdpartikeln und Luftblasen ist und vollkommen klar und transparent ist, kann zur Herstellung von Folien einer gewünschten Dicke und eines gewünschten Durchmessers verwendet werden. Nach Analyse zur exakten Bestimmung der Konzentration des filtrierten Gels, müssen zum Erhalt von Folien mit der gewünschten Kollagendicke exakt abgemessene Mengen in geeignete Behälter gefüllt werden. Dieses Füllen erfolgt im allgemeinen mit einer geeigneten Schlauchpumpe, die eine Aufnahme von Luft in das Gel verhindert, während gleichzeitig ein Erwärmen oder eine Reibung verhindert wird, welche die Struktur des Kollagenproteins schädigen könnte. Die Behälter haben die Form eines Trockenblechs und sind aus einem antihaftenden Material hergestellt.
Die beschriebenen Trockenbleche, die in einer kontrollierten Umgebung (relative Feuchtigkeit 60 bis 80%, Temperatur 20 bis 22ºC, Umgebungsklasse 10.000 oder weniger) beschickt worden sind, werden in einen geeigneten gesteuerten Trocknungsofen gestellt, wo sie für mindestens zwei Stunden stehengelassen werden, um eine perfekte Gleichmäßigkeit der Geldicke zu erreichen. Der Ofen wird für etwa 30 Minuten mit einem Stickstoffstrom gespült, um Luft und Sauerstoff vollständig zu entfernen, um auf diese Weise konstante Arbeitsbedingungen zu gewährleisten und eine mögliche Oxidation zu verhindern.
Es hat sich auch gezeigt, daß durch diese Arbeitsweise das Wachstum von Mikroorganismenkolonien, die manchmal auftreten, wenn der Vorgang bei Luft in der Umgebung durchgeführt wird, praktisch total blockiert wird. Die Trocknung erfolgt in einem Stickstoffstrom in einem geschlossenen Zyklus. Die Trocknung, die die kritische Stufe zum Erhalt von Folien mit den gewünschten Merkmalen darstellt, wird unter besonderen Bedingungen in einem geeigneten Ofen, der schematisch in Fig. 1 dargestellt ist, durchgeführt.
Darin bezeichnet Bezugszeichen 1 die Trockenbleche, die auf perforierten Seitenwänden liegen; bezeichnet V den Ventilator zur Zirkulation von Stickstoff durch die Apparatur; bezeichnet N&sub2; das Stickstoffzuführventil; bezeichnet GF die Kühleinheit mit Spule; stellt S eine Vorrichtung aus parallelen Platten zur Abtrennung von Kondensattropfen dar; stellt T&sub1; ein erstes Thermometer dar; gibt SC die Ableitung für Kondenswasser an; bezeichnet R die Heizvorrichtung; bezeichnet T&sub2; ein zweites Thermometer; bezeichnet I&sub1; ein erstes Hygrometer; bezeichnet MO ein Sauerstoffmeßgerät (Analysator); bezeichnet Sg die Gasableitung; bezeichnet Tr einen Überdruckbehälter und bezeichnet 12 ein zweites Hygrometer.
Der Ofen ist in dieser Weise aufgebaut, um so den folgenden Anforderungen zu genügen:
1) die Leichtigkeit zum Eliminieren von Luft, in dem mit Stickstoff bis zu einem Restsauerstoffgehalt von weniger als 2% gespült wird;
2) die Leichtigkeit zum Verändern der Stickstoffkühlung und -erwärmungstemperatur auf maximal 30ºC, um so die relative Feuchtigkeit in der Trocknungskammer und die Wasserverdunstungsgeschwindigkeit zu steuern;
3) die Leichtigkeit zur Steuerung der Geschwindigkeit einer Stickstoffzirkulation durch die Kammer, um so keine Punkte mit hoher Strömung zu bilden, und damit eine gleichmäßige Trocknungsgeschwindigkeit über die gesamte Oberfläche aufrechtzuerhalten und die Bildung von Falten zu verhindern, welche außer, daß sie vom Gesichtspunkt des Aussehens her unerwünscht sind, ein Anzeichen für unterschiedliche Kollagenkonzentrationen und eine schlechte Homogenität der Trocknung (lokalisierte Trocknung) sind. Der Wassergehalt des Produktes darf nicht höher als 20 Gew.-% sein. Es ist bevorzugt, einen höheren Trocknungsgrad (herunter bis 2% oder 3% Wasser) zu erreichen, insbesondere eine saubere Eliminierung der im ursprünglichen Gel enthaltenen Essigsäure zu gewährleisten. Das erhaltene getrocknete Produkt absorbiert leicht wieder Feuchtigkeit aus der Umgebung, wenn es innerhalb des maximalen Limits von 20% gehalten wird.

BEISPIEL

Die Bedingungen, die experimentell als am geeignetsten für einen Trocknungszyklus gefunden wurden, werden nachfolgend als nicht-limitierendes Beispiel angegeben.

1. Stufe:

Spülen mit Stickstoff, bis der Sauerstoffgehalt weniger als 1% ist, 2-stündiges Stehenlassen, um ein Gleichgewicht zu erreichen; Level des eingefüllten Gels 10 ml; Kollagengel- Konzentration 0,5%.

2. Stufe:

Beginn der Stickstoffzirkulation mittels Ventilator;
Stickstofftemperatur nach Kühlung -5ºC (T&sub1;);
Stickstofftemperatur nach Erhitzen 26 bis 28ºC (T&sub2;);
Zeit etwa 12 Stunden;
relative Feuchtigkeit beim Eintritt in den Trocknungsbereich (Punkt I&sub1;) 12 bis 14%;
relative Feuchtigkeit beim Austritt aus dem Trocknungsbereich (Punkt I&sub2;) 70 bis 80%.

3. Stufe:

Stickstofftemperatur nach dem Kühlen -15ºC (T&sub1;);
Stickstofftemperatur nach dem Erwärmen 26 bis 28ºC (T&sub2;);
Zeit etwa 12 Stunden;
relative Feuchtigkeit beim Eintritt in den Trocknungsbereich (Punkt 11) 6 bis 7%;
relative Feuchtigkeit beim Austritt aus dem Trocknungsbereich (Punkt I&sub2;) 45 bis 50%.

4. Stufe:

Endtrocknung;
Stickstofftemperatur nach Kühlung -40ºC (T&sub1;);
Stickstofftemperatur nach Erwärmen 26 bis 28ºC (T&sub2;);
Zeit etwa 12 Stunden.

5. Stufe:

Produktentnahme, Herstellung einer neuen Beschickung. Vollständige Entfernung von Wasser aus der Kühlspule und Spülen des Ofens durch Zirkulation von Stickstoff bei 70 bis 80ºC 2 Stunden lang, Kühlen auf 20ºC und Beschicken mit dem neuen Produkt.
Die Stickstoff-Durchflußgeschwindigkeit durch den Trockner wird auf der Basis des verlangten Trocknungsgrades eingestellt.
Es wird eine semitransparente Folie mit einer Dicke von etwa 200 um erhalten. Die Dicke kann im allgemeinen zwischen 0,02 und 2 mm variieren. Dies stellt eine nicht-spezifische Größe zum Zwecke der therapeutischen Anwendung dar, da sie nur die Absorptionszeit des Produktes, aber nicht seine spezifischen Merkmale bestimmt. Der Trocknungsgrad kann also - wie festgestellt - variieren.
Die Merkmale der erhaltenen Folie sind:
- Aufrechterhalten der "natürlichen" Struktur der Kollagenfaser (die klassische Dreifachspiralenstruktur von Kollagen wurde durch das Elektronenmikroskop gezeigt);
- Fehlen von Abbauprodukten, wie z.B. Monomere oder Dimere, von Kollagen, die nicht in Fasern eingebaut sind, oder Gelatine, eine Anzeige für eine potentielle Allergenität;
- hoher Proteinstickstoffgehalt (übersteigt 90%);
- hoher Hydroxyprolingehalt (übersteigt 12%);
- geringes Absorptionsvermögen (das etwa 10- bis 15-fache ihres Gewichts gegenüber dem 50-fachen für das lyophilisierte Produkt des Standes der Technik);
- hohe Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Angriff;
- gute Produkttransparenz;
- hervorragende Plastizität nach Eintauchen in physiologische Lösung.
Das in dieser Weise erhaltene Produkt wird durch Bestrahlung mit γ-Strahlen sterilisiert und bei der Behandlung von Verbrennungen und allgemein in allen Fällen von Hautentfernung oder -schädigung verwendet.
Das Resultat ist sowohl hinsichtlich einer Verträglichkeit < es wurde kein Fall einer Allergenität oder Überempfindlichkeit gegenüber dem Medikament berichtet, da die natürlichen Eigenschaften des Produktes während des Verfahrens unverändert erhalten bleiben) als auch hinsichtlich einer Schmerzlinderung hervorragend. Die Narbenbildungszeit ist sehr kurz und die Produktabsorption im Vergleich zu einer entsprechenden Behandlung unter Verwendung von lyophilisiertem Kollagen (Schwamm) beträchtlich länger; entsprechend muß es weniger häufig ersetzt werden. Der Verlust an Exsudat ist sehr gering, und zwar viel geringer als bei Verwendung von lyophilisiertem Kollagen.
Die Transparenz des Produktes bedeutet, daß die Veränderung der Verletzung betrachtet werden kann, ohne daß die Entfernung der Kollagenfolie (im allgemeinen eine schmerzvolle Prozedur) notwendig ist.
Das Produkt kann in Form von Folien verschiedener Abmessungen (quadratisch, rechteckig, rund, elliptisch oder anders) präsentiert werden, wobei dieser durch Klebstoffe (wie z.B. Pflaster) oder durch Folien aus inerten Substanzen, wie z.B. Nylon, Polyurethan, Polyethylen, usw., unterstützt werden kann oder auch nicht, oder während des Trocknungsprozesses, oder anschließend, mit pharmakologisch aktiven Substanzen kombiniert wird.

Claims

1. Folie aus Typ I-Kollagengel, das die Molekularstruktur [α1(I)]&sub2;α2(I) hat und für die therapeutische Narbenbildungsbehandlung geeignet ist, wobei die Folie von Abbauprodukten natürlichen Kollagens frei ist, einen Wassergehalt hat, der 20 Gew.-% nicht übersteigt; eine gleichmäßige Dicke zwischen 0,02 und 2 mm hat, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie eine transparente Struktur aufweist, eine homogene Struktur hat, daß sie die klassische Dreifachhelix-Struktur von natürlichem Kollagen hat, bei atmosphärischem Druck Gasblasen mit einem Durchmesser von weniger als 0,034 mm enthält, ihre Kapazität zur Absorption wäßriger biologischer Flüssigkeit auf ein Maximum des 15-fachen ihres Gewichts limitiert ist, und sie eine hohe Beständigkeit gegenüber einem enzymatischen Angriff hat.

2. Verfahren zur Herstellung einer Folie aus Typ I-Kollagengel nach Anspruch 1 aus wäßrigem verdünntem Kollagengel mit einem pH von 2,5 bis 3,5, umfassend

- Filtrieren des Gels durch eine Filteroberfläche mit einer Durchgangsgröße von weniger als 0,1 mm, wobei der untere Teil der Filtrierapparatur unter einem Vakuum von 2666 bis 7998 Pa steht und in dem Bereich unmittelbar unter dem Filtersieb bereitgestellt ist, mit einer Vorrichtung, die aus Reihen von Platten besteht, welche senkrecht oder schräg und zueinander parallel angeordnet sind;

- Trocknen des flüssigen Gels, das in Schalen enthalten ist, durch Spülen mit Stickstoff bis zu einem Restsauerstoffgehalt von weniger als 2%, bei einer Temperatur von 20 bis 22ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 60 bis 80%.

3. Vorrichtung, die zum Filtrieren des Kollagengels nach Anspruch 2 geeignet ist, und die aus einem oberen Mantel, der mit einem Shabrührer ausgestattet ist; einem Metallsieb mit einer Maschengröße von weniger als 0,1 mm, das am Boden des oberen Mantels angeordnet ist; einem unteren Mantel, der mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, besteht, und die im Bereich unmittelbar unter dem Filtersieb mit einer Reihe von Platten, die vertikal oder schräg und zueinander parallel angeordnet sind, zum Zwecke eines Beförderns des Filtrats, das aus dem Kollagengel besteht, als kontinuierliche flüssige Folie, versehen ist.

4. Verwendung der Folie aus Typ I-Kollagengel nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung von Wunden und Verbrennungen sowie als Interpositionsmaterial zur Verhinderung von Verwachsungen bei inneren Operationen verwendbar ist.