DE2631908A1 - Vernetztes polymeres - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft polymere Stoffe, die hier wegen ihrer Zusammensetzung aus zwei miteinander chemisch verbundenen Komponenten auch als polymere Verbundprodukte bezeichnet werden und sich für medizinische und chirurgische Anwendungszwecke eignen.

Kollagen, ein Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren, wird in grossem Umfange medizinisch und chirurgisch für die Herstellung von chirurgischem Nahtmaterial, Blutgefassimplantaten und allen Formen von chirurgischen Prothesen verwendet. Obwohl sich Kollagen für diese Anwendungszwecke besser eignet als die meisten Stoffe, hat es auch einige bedeutende nachteilige Eigenschaften.

Eine solche Eigenschaft des Kollagens ist seine geringe Widerstandsfähigkeit gegen die Resorption, da es ein resorbierbares tierisches Protein ist, welches durch Gewebeenzyme (Kollagenasen) , die an den Implantationsstellen vorhanden sind, abgebaut wird. Man hat versucht, dieser Schwierigkeit durch Vernetzen des Kollagens Herr zu werden; diese Versuche haben sich aber nur als teilweise erfolgreich erwiesen, weil ziemlich hohe

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Vernetzungsgrade erforderlich sind, um das Kollagen nicht-resorbierbar zu machen» Die Vernetzung löst zwar ein Problem, bringt aber ein anderes mit sich; denn die Zugfestigkeit und andere mechanische Eigenschaften des Kollagens können erheblich leiden, wenn ein zu hoher Vernetzungsgrad erforderlich ist, um die Resorption auf ein sehr geringes Maß zu beschränken.

Eine andere nachteilige Eigenschaft, die das Kollagen bei der Verwendung für chirurgische Prothesen und andere Anwendungszwecke aufweist, ist die, dass das Kollagen, wie die meisten anderen polymeren Stoffe, mit Blut unverträglich ist. Um als blutverträglich zu gelten, darf ein Stoff weder Plättchenaggregation noch das Gerinnen der roten Blutkörperchen verursachen. Kollagen verursacht beides. Blutplättchen haften be-, kanntlich an freigelegtem Kollagen an, wie es geschieht, wenn Blutgefässe mechanisch verletzt werden, und diese Wechselwirkung zwischen dem Kollagen und den Plättchen führt zur Plättchenaggregation. Die mechanistischen Erscheinungen dieser Wechselwirkung sind im einzelnen sehr eingehend untersucht und im Schrifttum beschrieben worden; vgl. z.B. R. Muggli und H.R. Baumgartner, "Thromb. Res.", 3, 715 (1973); sowie G.A. Jamieson, CL. Urban und A.J. Barber, "Nature New Biol.", 254, 5 (1971). Ferner ist Kollagen an der Beschleunigung der Blutgerinnung durch Aktivierung des Hageman'sehen Faktors (Gerinnungsfaktor. XII) beteiligt; vgl. G.D. Wilner, H.L. Nossel und E.C. LeRoy, "J. Clin. Invest.", 47, 2608 (1968).

Die bisherigen Bemühungen zur Synthese von blutverträglichen Stoffen waren grösstenteils Versuchen gewidmet, ein blutverträgliches Material an die Oberfläche eines unverträglichen Materials zu binden. Die erfolgreichsten Stoffe wurden durch Binden von Heparin, einem bekannten Antikoagulans, an die Oberfläche verschiedener synthetischer Polymerer hergestellt.

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Die Bindung von Heparin an solche Oberflächen erfolgte nach den verschiedensten Methoden, die allgemein entweder als Ionenwechselwirkung oder chemische Reaktion klassifizierbar sind. Diese beiden allgemeinen Methoden bringen aber Nachteile mit sich..-Wenn die Substratoberfläche nicht vollständig bedeckt ist, können die unbedeckten Teile, die mit dem Blut in Berührung kommen, zur Bildung eines Blutpfropfens oder Gerinnsels führen. Ferner besteht die Möglichkeit, dass bei der Hantierung oder Verwendung solcher beschichteter Oberflächen die Oberflächenbeschichtung aus Heparin sich auf Grund eines mechanischen Zwischenfalls ablösen kann, Hydrolyse erleiden kann oder anderweitig chemisch oder biochemisch von. Stoffen angegriffen werden kann, die sich im Blut oder in dem Gefässgewebe vorfinden; auf die dadurch entstehende Unterbrechung des Oberflächenüberzuges folgt die Freilegung des darunterliegenden, unverträglichen Substrats. Noch ernster ist vielleicht die Schwierigkeit, dass Heparin gelegentlich von dem Substrat desorbiert wird und in das Blut wandert, wo es, da es ein starkes Antikoagulans ist, das Gerinnungsvermögen von gesundem Blut stark "beeinträchtigt, was sehr unerwünscht ist.

Die Erfindung bezieht sich auf die Synthese neuer Zusammensetzungen ,(die hier als Verbundprodukte bezeichnet werden), die sich für eine grosse Anzahl medizinischer und chirurgischer Anwendungszwecke eignen. Diese Stoffe werden durch inniges Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des polymeren Produkts hergestellt« Geeignetes Kollagen kann aus einer Anzahl von tierischen Quellen entweder in Form einer Lösung oder in Form einer Dispersion gewonnen werden, und zu den geeigneten Mucopolysacchariden gehören z.B. Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat,-Heparansulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat,. Heparin und Hyaluronsäure.

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Das Vernetzen kann auf chemischem Wege, durch Bestrahlung, dehydrothermisch oder nach einem sonstigen geeigneten Verfahren erfolgen. Eine geeignete chemische Methode ist die Aldehydvernetzung; jedoch sind andere chemische Vernetzungsmittel ebenso geeignet. Die dehydrothermische Vernetzung, die bevorzugt wird, erfolgt durch Herabsetzung des Feuchtigkeitsgehalts der Verbundprodukte auf einen sehr niedrigen Wert, z.B. indem man das Verbundprodukt der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und Hochvakuum aussetzt. Die dehydrothermische Vernetzung vermeidet die Notwendigkeit, Vernetzungsmittel zuzusetzen und im Falle von toxischen Stoffen, wie Aldehyden, das nicht-umgesetzte Vernetzungsmittel nachträglich zu entfernen; durch dehydro thermische Vernetzung entstehen auch Verbundprodukte, deren Mucopolysaccharidgehalt in einem weiteren Bereich liegt.

Es wird angenommen, dass die Produkte dieser Synthesen aus Kollagenmolekülen oder Kollagenfibrillen bestehen, an die lange Mucopolysaccharidketten gebunden sind. Offenbar werden die Mucopolysaccharidketten durch das Vernetzen so fest an das Kollagen gebunden, dass sie sich nicht eluieren oder anderweitig von ihnen trennen lassen. Mechanisch können diese Stoffe als Analoge von faserverstärkten Verbundstoffen aufgefasst werden, in denen das Kollagen die Faser und das Mucopolysaccharid die Einbettungsmasse bildet, weswegen diese Stoffe hier auch als polymere Verbundprodukte bezeichnet werden.

Es wurde gefunden, dass vernetzte Verbundprodukte aus Kollagen und Mucopolysaccharid die vorteilhaften Eigenschaften des nativen Kollagens beibehalten. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass diese Stoffe, obwohl sie verhältnismassig hochgradig vernetzt sind, aussergewöhnliche mechanische Eigenschaften aufweisen. So können z.B. Stoffe synthetisiert werden, die hinsichtlich ihrer Bruchfestigkeit, Bruchdehnung und anderer mechanischer Eigenschaften dem bis zu der gleichen

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Vernetzungsdichte vernetzten Kollagen ebenbürtig oder überlegen sind. Vielfach übertreffen die vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte in ihren mechanischen Eigenschaften das native Kollagen, das nicht künstlich vernetzt ist. Deshalb kann man durch Vernetzung der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte jeden beliebigen Grad von Widerstands fähigkeit gegen die Resorption von der geringen Widerstandsfähigkeit, die das nicht künstlich vernetzte native Kollagen aufweist, bis zu einer praktisch vollständigen Widerstandsfähigkeit erzielen. Die Fähigkeit, den Grad der Widerstandsfähigkeit gegen die Resorption nach Wunsch zu steuern, ohne dafür eine Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften, in Kauf nehmen zu müssen, stellt eine bedeutende Variationsfähigkeit für chirurgische Prothesen usw. dar, die bisher bei keiner Gruppe von resorbierbaren Stoffen zur Verfügung stand.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die meisten der hier besehriebenen vernetzten Kollagen-Mukopolysaccharid-Verbundprodukte mit Blut verträglich sind. Ein derartiger Stoff kann aus Kollagen, einem bekannten thrombogenen Material, und Chondroitin-6-sulfat hergestellt werden. Chondroitin-6-sulfat ist ebenso löslich im. Blut wie Heparin, weist aber zum Unterschied von Heparin einen so geringen Grad von Antikoagulationsaktivität auf, dass es in dieser Beziehung als inert betrachtet werden kann. (Versuche zeigen zum Beispiel, dass Chondroitin-6-sulfat bei äquivalenten Konzentrationen zwischen 1/3000 und 1/5000 der Antikoagulatiοnsaktivität des Heparins aufweist). Durch die Umsetzung mit Mucopolysacchariden wird offenbar im wesentlichen die gesamte Prokoagulationsaktivität und thrömbogene Natur des nativeη Kollagens unterdrückt. Daher verursachen die meisten dieser Verbundprodukte keine Blutplättchenaggregation und keine Gerinnung und beeinträchtigen - mit Ausnahme des Verbundprodukts aus Kollagen und Heparin -

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nicht das Gerinnungsvermögen von Blute Da die Stoffe homogen sind, werden alle Probleme, die bei der Oberflächenbeschichtung von thrombogenen Stoffen mit blutverträglichen Stoffen auftreten, vermieden.

Kollagen ist ein Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren., Es kommt oft in Form makroskopischer Pasern vor, die sich chemisch und mechanisch von den nicht aus Kollagen bestehenden Gewebekomponenten trennen lassen. Für die Zwecke der Erfindung eignet sich Kollagen beliebiger Herkunft, und zwar unlösliches Kollagen, in. sauren, neutralen oder basischen wässrigen Lösungen lösliches Kollagen sowie die im Handel erhältlichen Kollagene. Typisches Ausgangsgut zur Gewinnung von Kollagen sind Kalbsfell, Rinder-Achillessehne und Rinderknochen.

Im Kollagen gibt es mehrere Niveaus der strukturellen Organisation, wobei die primäre Struktur aus einer Aufeinanderfolge von Aminosäuren besteht. Kollagen besteht aus 18 Aminosäuren in relativen Mengen, die für verschiedene Tierarten bekannt, in ihren Reihenfolgen aber noch nicht vollständig bestimmt worden sind. Der Gesamtgehalt an sauren, basischen und hydroxylierten Aminosäureresten übersteigt bei weitem den Gehalt an lipophilen Resten, so dass das Kollagen ein hydrophiles Protein ist. Daher sind polare Lösungsmittel mit hohen Löslichkeitsparametern gute Lösungsmittel für Kollagen«

Mindestens zwei Gruppen von charakteristischen Eigenschaften, durch die sich Kollagen von anderen Proteinen unterscheidet, sind: (1) die Aminosäurezusammensetzung, die nicht nur einzigartig, sondern auch wegen ihres hohen Gehalts an Glycyl-, Pro-IyI- und Hydroxyprolylresten unterscheidend ist, und (2) das ^iTeitwinkel-Röntgenbeugungsspektrum, welches einen starken meridionalen Bogen, entsprechend einem Abstand von etwa 2,9 A,

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und einen starken äquatorialen Fleck zeigt₃ der bei feuchtem
Kollagen einem Abstand von etwa 15 S. entspricht. Eine mehr ins einzelne gehende physikalisch-chemische Definition des Kollagens in festem Zustande gibt I.V. Yannas in einer Arbeit über »Collagen and Gelatin in the Solid State", "J. Macromol.. Sei. Revs. Macromol. Chem.», C7(1) 49-104 (1972)»

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Der Ausdruck "Mucopolysaccharid" bezeichnet hexosarainhaltige Polysaccharide tierischen Ursprungs. Diese Klasse von Verbindungen wird auch oft als "Glykosaminoglykane" bezeichnet.
Chemisch sind Mucopolysaccharide in abwechselnder Reihenfolge aufgebaute Copolymere aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die sich in mehr oder weniger regelmässiger Weise entweder mit Hexuronsaureresten oder mit Hexoseresten abwechseln; vgl. "Carbohydrate Metabolism and its Disorders" von
K.So Dodgson und A.G. Lloyd, herausgegeben von F. Dickens und Mitarbeitern, Band 1, Verlag Academic Press (1968).

Einige der besser bekannten Mucopolysaccharide tierischen Ursprungs entsprechen den folgenden Strukturformeln:

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CI IrOH

Hyaluronsäure

Chondroitin— 4-sul£at

Chondroitin-6-sul£at

Dermatansulfat

Kerätansulfat

HO.SO

HEPARIN

COOH

NHAo

OH CH.OH

NHAo

OH M.COSOfH

COOH

Ö—

NHAe

ΟΠ CH.OH HO.SO J O

eooH ZX X~~°"

HHAo

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CHXH

OSO>H

COOH HjCOSo₃.

Heparansulfat

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Zur Herstellung der hier beschriebenen Verbundprodukte eignen sich auch andere Mucopolysaccharide, die der Fachmann entweder kennt oder durch Routineversuche ermitteln kann« Eine eingehendere Beschreibung von Mucopolysacchariden findet sich in dem Werk "Polysaccharides" von G.0„ Aspinall, Verlag Pergamon Press, Oxford (1970).

Typische Ausgangsstoffe für Heparin sind Schweinedarm, Rinderlunge, Rinderleberkapsel und Mäusefell. Hyaluronsäure kann aus Hahnenkamm und menschlicher Nabelschnur gewonnen werden, während Chondroitin-4-sulfat und Chondroitin-6-sulfat aus Rinderknorpel und Haifischknorpel gewonnen werden können« Dermatansulfat und Heparansulfat können aus Schweineschleimhautgewebe gewonnen werden, während Keratansulfat aus Rinderhornhaut gewonnen werden kann.

Kollagen lässt sich mit einem Mucopolysaccharid in wässrigen Lösungen umsetzen, die sauer, basisch oder neutral sein können. Diese Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. In typischer Weise werden geringe Mengen von Kollagen, z.B. 0,3 Gewichtsprozent, in verdünnter Essigsäure dispergiert und die Dispersion gründlich gerührt. Dann setzt man langsam, z.B. tropfenweise, das Polysaccharid zu der wässrigen Kollagendispersion zu, was zur gemeinsamen Ausfällung von Kollagen und Mucopolysaccharid führt. Der gemeinsam ausgefällte Niederschlag ist eine verschlungene Masse von Kollagenfibrillen, die mit Mucopolysaccharid überzogen sind, und ähnelt etwas einem Garnknäuel. Diese verschlungene Fasermasse kann durch Homogenisieren in eine homogene Dispersion von feinen Fasern übergeführt werden^ die dann abfiltriert und getrocknet werden. Gemeinsam ausgefällte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte sind von V. Podrazky, F.S. Steven, D₀S, Jackson, J.B. Weiss und S.J. Leibovich untersucht worden,' vgl« "Biochim. Biophys. Acta.'S 229, 690 (1971).

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Obwohl das Reaktionsprodukt aus Kollagen und Mucopolysaccharid aus dem wässrigen Medium, in dem es sich bildet, gemeinsam ausfällt, wurde gefunden, dass die Mucopolysaccharidkomponente in anderen wässrigen Lösungen in Lösung gehen kann. Dies trifft besonders auf konzentriertere wässrige Salzlösungen, wie Körperflüssigkeiten, zu. Es ist z.B„ bekannt, dass gemeinsame Äusfällungen von Kollagen und Mucopolysaccharid in 0,01-molarer Kochsalzlösung unlöslich, in 0,1-molarer Kochsalzlösung etwas löslich und in 0,4-molarer Kochsalzlösung recht löslich sind - die physiologische Konzentration beträgt etwa 0,14-molar NaCl. Diese Reaktionsprodukte haben daher nur eine begrenzte Unlöslichkeit und kommen als solche nicht für implantierbare chirurgische Prothesen usw. in Betracht.

Während die oben beschriebene Mitfällungsmethode bevorzugt wird, können Kollagen und Mucopolysaccharide auch in anderer Weise umgesetzt v/erden. Das wesentliche Erfordernis ist, dass die beiden Stoffe unter solchen Bedingungen innig miteinander in Berührung gebracht werden, dass sich die Mucopolysaccharide an die Kollagenketten binden können. Eine andere geeignete Methode ist das Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid, indem man z.B. aus Kollagen hergestellte Erzeugnisse, wie Blätter, Folien und Röhren, in eine Lösung des Muoopolysaccharids eintaucht«, Eine geeignete Abänderung des letztgenannten Verfahrens besteht darin, dass man zuerst ein Erzeugnis, wie ein Blatt, eine Folie oder eine Röhre, das aus einem anderen Material als Kollagen, wie Z₀B₀ aus einem synthetischen, natürlichen oder modifizierten natürlichen Polymeren, besteht, mit Kollagen beschichtet und 'das mit Kollagen beschichtete Erzeugnis (Blatt, Folie, Röhre usw.) dann in die Mucopolysaccharidlösung eintaucht» Eine noch andere geeignete Methode besteht darin, das Kollagen mit den Mucopolysacchariden, beide in Form von trockenem Pulver₉. innig zu mischen.

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Der Fachmann auf dem Gebiete der Herstellung von Folien, Filmen, Röhren und anderen Formkörpern nach Methoden, die in der Kunststoff-, Elastomer- und Textilindustrie bekannt sind, versteht ohne weiteres, dass das, wie oben beschrieben, hergestellte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt sich nach diesen Methoden ebenfalls zu Folien, Filmen, Röhren und sonstigen Formkörpern verformen lässt.

Um eine bedeutende Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen die Kollagenresorption zu erzielen, müssen mindestens etwa 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid an die Kollagenketten gebunden sein. Die obere Grenze richtet sich nach den an dem Kollagen für die Bindung des Mucopolysaccharids zur Verfügung stehenden Stellen. Für Verbundprodukte, bei denen das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist, sind Mucopo^saccharidgehalte von etwa 28 Gewichtsprozent erzielt worden; mit Hyaluronsäure andererseits ist als obere Grenze etwa 25. % erzielt worden«

Die Umsetzung mit den Mucopolysacchariden verleiht dem Kollagen auch eine weitere wertvolle Eigenschaft, nämlich die Unfähigkeit, bei einem Wirtstier eine Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) hervorzurufen. Um Kollagen in ein Material überzuführen, welches nach dem Implantieren nicht als Fremdkörper erkannt wird, muss das Kollagen mit mindestens etwa 1 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid umgesetzt werden.

Der Unlöslichkeitsgrad der Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte kann durch Vernetzung nach Wunsch erhöht werden. Allgemein eignet sich für die Vernetzung dieser Verbundprodukte jede Vernetzungsmethode, die sich auch zum Vernetzen von Kollagen eignet. Durch die Vernetzung wird die Auflösung des Mucopolysaccharids in wässrigen Lösungen verhindert, wodurch diese Stoffe für chirurgische Prothesen usw. geeignet werden.

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Die Vernetzung hat auch noch eine andere wichtige Aufgabe, indem sie die Widerstandsfähigkeit dieser Stoffe gegen Resorption erhöht. Die genaue Funktion der Vernetzung in dieser Beziehung ist noch nicht bekannt; es kann jedoch sein, dass die Mucopolysaccharideinheiten durch die Vernetzung fest an Stellen auf der Kollagenkette gebunden werden, die normalerweise von Kollagenase angegriffen werden.

Es wurde gefunden, dass die vernetzten Verbundprodukte ein M (Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen Vernetzungsstellen) zwischen etwa 800 und 60 000 aufweisen sollen. Stoffe mit ]Yl·-Werten unter etwa 800 oder über etwa 60 000 zeigen eine be— deutende Verschlechterung ihrer mechanischen Eigenschaften. Verbundprodukte mit einem K zwischen etwa 5000 und 10 000 haben offenbar die "beste Kombination von mechanischen Eigenschaften und werden daher bevorzugt.

Die Verhetzung kann nach vielen Methoden erfolgen, die in die allgemeinen Kategorien der chemischen Vernetzung, der Strahlungsvernetzung und der dehydrothermischen Vernetzung fallen. Ein Vorteil der meisten, hier in Betracht gezogenen Vernetzungsmethoden einschliesslich der Vernetzung durch Glutaraldehyd und der dehydrothermischen Vernetzung ist der, dass dabei auch das Bakterienwachstum auf diesen Stoffen vernichtet wird. Die Verbundprodukte werden also bei ihrer Vernetzung . gleichzeitig sterilisiert.

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Eine geeignete chemische Vernetzungsmethode für Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte ist die Aldehydvernetzung. Bei diesem Verfahren werden die Stoffe in wässriger Lösung mit Aldehyden "behandelt, die als Vernetzungsmittel wirken,, Geeignete Aldehyde sind z.B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal. Der bevorzugte Aldehyd ist Glutaraldehyd, weil er die gewünschte Vernetzungsdichte schneller liefert als andere Aldehyde und ausserdem imstande ist, die Vernetzungsdichte auf einen verhältnismässig hohen Wert zu erhöhen. Wenn man die Verbundprodukte in Aldehydlösungen taucht, kommt es zum teilweisen Entzug der Polysaccharidkomponente durch Auflösung, wodurch der Gehalt des Endprodukts an Polysaccharid vermindert wird. Wicht-umgesetzte Aldehyde sollen aus den Kollagen-Mucopolysaccharidprodukten entfernt werden, da restliche Aldehydmengen recht toxisch wirken.

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Andere geeignete chemische Methoden sind die Carbodiimidkupplung, die Äzldkupplung und die Diisocyanatvernetzung.

Die bevorzugte Vernetzungsmethode wird hier als dehydrothermisches Verfahren "bezeichnet. Bei der dehydrothermischen Vernetzung braucht kein besonderes Vernetzungsmittel zugesetzt zu werden. Das Verfahren beruht auf dem Entzug eines grossen Prozentsatzes des Wassers aus dem zu vernetzenden .Produkte Die Menge an Wasser, die entzogen werden muss, richtet sich nach vielen Faktoren; allgemein muss jedoch eine ausreichende Menge Wasser entzogen werden, um die gewünschte Vernetzungsdichte zu erreichen. So kann man das Kollagen-Mucopolysaceharidprodukt der Einwirkung erhöhter Temperaturen und/oder von Vakuum unterwerfen, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf äusserst geringe Vierte vermindert worden ist. Wenn kein Vakuum zu Hilfe genommen wird, können Temperaturen über etwa 80 G und vorzugsweise über 90° C angewandt werden. Bei 23° C eignet sich ein Vakuum

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von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule und vorzugsweise weniger als 10" mm Quecksilbersäule. Erhöhte Temperatur und Vakuum können auch gemeinsam angewandt werden, und dies- ist die vorteilhafteste und daher bevorzugte Methode. Bei einem Vakuum von mindestens etwa 10 - mm Quecksilbersäule arbeitet man vorzugsweise bei Temperaturen von mindestens etwa 35 G. Im allgemeinen werden die Stoffe der Einwirkung von erhöhten Temperaturen und Vakuum ausgesetzt, bis der gewünschte Grad' von Unlöslichkeit erreicht ist. Je höher die Temperatur ist, desto geringer ist das Vakuum, das'erforderlich ist, um eine gegebene Vernetzungsdichte zu erzielen, und'-umgekehrt« Ein typisches -Vernetzungsverfahren zur Erreichung eines M_ zwischen etwa 5000 und 10 000 besteht darin, dass man das Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt 24 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 95° C und eines Vakuums von 0,01 mm.Hg unterwirft. Dieses dehydrοthermische Vernetzungsverfahren vermeidet gewisse Nachteile der Aldehydvernetzungs-

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methode und führt zur Bildung von Verbundprodukten, bei denen verhältnismässig grosse Mengen von Mucopolysaccharid fest an die Kollagenkette gebunden sind»

Der Mechanismus, nach dem die dehydrothermische Vernetzung verläuft, ist noch nicht genau bekannt. Es kann sich um eine Amidkondensation handeln, an der ^-Aminogruppen.des Kollagens und Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt sind, es kann sich um eine Veresterung handeln, an der Carboxylgruppen das Kollagens und Hydroxylgruppen des Mucopolysaccharids beteiligt sind, oder es kann sich um eine Veresterung der Carboxylgruppen des Mucopolysaccharids mit den Hydroxylgruppen des Kollagens handeln. Möglicherweise finden alle drei Arten von Reaktionen zu einem gexvissen Ausmaß statt» Eine genauere Beschreibung der dehydrothermischen Vernetzung geben I₀V. Yannas und A.V. Tobolsky in der Arbeit "Crosslinking of Gelatin by Dehydration», "Nature", Band 215, Nr. 5100, Seite 509-510, 29. Juli 1967.

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Stoffe, die sich für Gefässprothesen eignen sollen, müssen ein Minimum an gewissen mechanischen Eigenschaften aufweisen» Hierbei handelt es sich um mechanische Eigenschaften, die das Annähen der in Betracht kommenden Stoffe an Teile von natürlichen Gefassen ermöglichen« Beim Nähen dürfen solche Implantate unter den auf die Naht bei der Herstellung des Knotens ausgeübten Zugkräften nicht reissen. Die Nähbarkeit steht in Beziehung zum Durchmesser der Naht, zu der auf -die Naht ausgeübte Spannung und zu der Geschwindigkeit, mit der der Knoten zugezogen wird. Versuche haben gezeigt, dass die mechanischen Mindestanforderungen zum Einnähen eines Implantats von mindestens 0,25 mm Dicke (1) eine Bruchfestigkeit von mindestens

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3,5 kg/cm und (2) eine Bruchdehnung von mindestens 10 % sind.

Die für Gefässprothesen am besten geeigneten Stoffe sollen so weit wie möglich das gleiche mechanische Verhalten aufweisen wie natürliche Gefässe. Die schärfsten physiologischen Beladungsbedingungen treten in den elastischen Arterien, wie der Aorta, auf, wo es infolge von Blutdruckschwankungen auf Grund des Systole-Diastole-Rythmus zu Ermüdungserscheinungen kommen kann. Als mechanisches Modell können die statischen mechanischen Eigenschaften der Brustaorta verwendet werden» Die Spannungs-Dehnungskurve der Brustaorta von 20 bis 29 Jahre alten Personen in der Längsrichtung ist von Yamada bestimmt worden; vgl. H. Yamada: "Strength of Biological Materials", herausgegeben von F.G. Evans, Kapitel 4, Verlag Williams & Wilkins (1970). Aus diesem Diagramm wurden die mechanischen Eigenschaften berechnet, wobei sich die folgenden Werte ergeben haben: (1) Bruchfestigkeit 25,3 kg/cm², (2) Bruchdehnung 85 %,

(3) Tangentenmodul bei 1-prozentiger Dehnung 3,5 kg/cm und

(4) Brucharbeit, d.h. Arbeit bis zum Bruch (ein Maß für die

Zähigkeit) 1470 kg/cm -%. Diese vier mechanischen Eigenschaften dienen als quantitative Norm für die mechanischen Eigenschaften von Gefässprothesen.

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Werte für diese mechanischen Eigenschaften wurden für die hier beschriebenen Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte mit Hilfe eines Instron-Zugfestigkeitsprüfgeräts bestimmt. Wie zu erwarten war, hängen die mechanischen Eigenschaften weitgehend von der Anwesenheit des eingelagerten Mucopolysaccharids, dem Grad der Fibrillenaggregation der Kollagenfibrillen und der Anzahl der Vernetzungsstellen je Volumeneinheit ab_o Für Kollagen-Verbundprodukte, deren Fibrillen eine konstante Grosse haben, wird das mechanische Verhalten eine Funktion des Mucopolysaccharidgehalts und des Vernetzungsgrades.

Die günstigsten mechanischen Eigenschaften wurden bei reinen Kollagenmaterialien bei M -Werten von etwa 5000 bis 10 000 erhalten. Der Vernetzungsgrad ist der reziproke ¥ert von M_, dem mittleren Molekulargewicht zwischen Vernetzungsstellen. Nach dem dehydrothermischen Vernetzungsverfahren hergestellte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte zeigten eine bessere Bruchdehnung, Festigkeit und Zähigkeit als Kollagen von ähnlichen M,-Werten. Dehydrothermisch vernetzte Verbundprodukte genügten ohne weiteres den Anforderungen an die Nähbarkeit und besassen mechanische Eigenschaften, die sich denjenigen der Brustaorta annäherten.

Viele der hier beschriebenen Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte zeigen eine aussergewöhnliche Blutverträglichkeit. Dies steht im Gegensatz zu den meisten Stoffen, insbesondere zu synthetischen Polymeren, die fast durchweg mit Blut unverträglich sind. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck ."blutverträglich", dass das betreffende Material sich in drei Beziehungen ähnlich verhält "wie menschliche Blutgefässe, nämlich hinsichtlich (1) seiner Neigung, keine Plättchenaggregation zu verursachen, (2) seiner Neigung, keine Gerinnung der roten Blutkörperchen zu verursachen, und vor-

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zugsweise (3) seiner Neigung, das Gerinnungsvermögen von gesundem Blut nicht zu beeinträchtigen„

Untersuchungen in vitro und in vivo haben ergeben, dass sich viele der Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte so synthetisieren lassen, dass sie blutverträglich sind. Zum Beispiel wurden Verbundprodukte, die entweder Chondroitin-6-sulfat oder Heparin enthielten, mit Blutgerinnungszeiten (whole blood clotting times) (WBCT) von mehr als 60 Minuten hergestellt, und diese Werte sind normalem Endothel vergleichbar. Der WBCT-Test ist ein bekanntes in vitro-Verfahren zur qualitativen Bewertung des Einflusses von Stoffen auf (1) die Blutkoagulation, (2) die Plättenenaggregation und (3) die Aggregation der roten Blutkörperchenj dieser Test ist im einzelnen in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Andere in vitro-Versuche einschliesslich der Thrombinzeit (TT), der aktivierten partiellen Thrombinzeit (APTT) und der Prothrombinzeit (PT), ferner Plättchenaggregationsuntersuchungen und in vivo-Untersuchungen bestätigen die blutverträgliche Natur vieler der hier beschriebenen Stoffe.

Aus den durchgeführten Untersuchungen ergibt sich, dass eine gewisse Mindestmenge an Mucopolysaccharid vorhanden sein muss, um Blutverträglichkeit zu erzielen. Diese Mindestmenge liegt, wie angenommen wird, bei etwa 6 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht des Verbundprodukts, um Stoffe zu erhalten, deren Blutverträglichkeit bedeutend besser ist als diejenige des nativen Kollagens. Ferner scheint die Anwesenheit einer oder mehrerer Sulfatgruppeh in dem Mucopolysaccharid wichtig zu sein, was sich aus den niedrigen WBCT-Werten der aus Hyaluronsäure hergestellten Verbundprodukte ergibt, um ein Material mit nicht-gerinnenden Eigenschaften zu erhalten. Verbundprodukte auf der Basis von Hyaluronsäure verursachen aber, wie gefunden wurde, keine Plattchenaggregation.

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Auf Grund ihrer Widerstandsfähigkeit gegen die Resorption, ihrer Freiheit von Fremdkörperreaktion, ihrer mechanischen Eigenschaften und ihrer Blutverträglichkeit werden vernetzte Verbundprodukte, die mindestens etwa 0,5 % gebundenes Mucopolysaccharid enthalten, bevorzugt. Verbundprodukte, die etwa 6 bis 15 % sulfathaltiges Mucopolysaccharid enthalten, werden wegen ihrer aussergewöhnlichen Blutverträglichkeit besonders bevorzugt. Der hier angegebene Prozentsatz an Mucopolysaccharid ist derjenige, den man erhält, wenn man die Bestimmung unmittelbar nach dem Vernetzen durchführt. Chondroitin-6-sulfat ist ein besonders gutes Mucopolysaccharid für solche Verbundprodukte, weil es, selbst wenn es in den Blutstrom eluiert wird, den normalen Koagulationsprozess nicht beeinträchtigt, wie es bei Heparin der Fall ist ^

Die hier beschriebenen vernetzten Kollagen-Mucöpolysaccharid-Verbundprodukte haben für viele Anwendungszwecke ausgezeichnete Eigenschaften. In erster Linie eignen sie sich für medizinische und chirurgische Anwendungszwecke, besonders für chirurgische Nähte, Blutgefassimplantate und allgemein zur Herstellung von chirurgischen Prothesen/ Ausserdem eignen sie sich für die Herstellung von blutverträglichen Komponenten für die Herstellung von künstlichen, blutpumpenden Organen, wie künstlichen Nieren, und für die Herstellung von blutverträglichen Ausrüstungen, wie Blutoxygenatoren, sowie für die Herstellung von verschiedenen Geräten zum Hantieren und Aufbewahren von Blut, wie Pumpen, Röhren, Schläuchen und Lagerungsbeuteln.

Um blutverträgliche Produkte zu erhalten, können wahrscheinlich auch andere Stoffe, als Kollagen mit Chondroitin-6-sulfat oder anderen Mucopolysacchariden umgesetzt werden. Als solche Stoffe kommen z.B. synthetische Polymere, wie segmentierte Polyurethane, Polymethacrylsäurehydroxyäthylester und andere "Hydrogele", Silicone, Polyäthylenterephthalat und Polytetra-

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fluoräthylen, oder modifizierte natürliche Polymere, wie Celluloseacetat, oder natürliche Polymere, wie Elastin (das faserförmige, unlösliche, nicht aus Kollagen bestehende Protein, das in Bindegewebe, wie der Brustaorta und dem Nackenband, vorkommt) , oder pyrolytischer Kohlenstoff und andere Kohlenstoffarten in Betracht, die thermisch oder mit dem elektrischen Lichtbogen behandelt worden sein können. Solche Verbundprodukte können entweder hergestellt werden, indem man die pulverförmigen Feststoffe innig mischt, oder indem man verträgliche Lösungen oder Dispersionen der beiden Bestandteile mischt, oder indem man einen der in diesem Absatz erwähnten Stoffe mit einem Mucopolysaccharid beschichtet. Ungeachtet der Methode zum Kontaktieren des Mucopolysaccharide mit dem anderen Stoff können die beiden Komponenten kovalent unter Bildung eines Materials gebunden werden, aus dem sich das Mucopolysaccharid durch Behandeln mit Lösungsmitteln für das Mucopolysaccharid, wie wässrigen Elektrolytlösungen, nicht herauslösen oder extrahieren lässt. Die kovalente Bindung kann durch Strahlungs— pfropfcopolymerisation, z.B. durch Bestrahlung mit y-Strahlen aus einer Kobalt-60-Strahlungsquelle, herbeigeführt werden. Bei allen diesen Verfahren werden Chondroitin-6-sulfat oder andere Mucopolysaccharide, die die normale Blutgerinnung nicht beeinträchtigen, wenn sie bei der Verwendung zufällig aus dem Verbundprodukt eluiert werden, unbedingt gegenüber Heparin bevorzugt, welches die normale Blutgerinnung stark beeinträch-tigt.

Es ist auch durchaus wahrscheinlich, dass sich blutverträgliche Stoffe herstellen lassen, indem man das vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukt in Form einer Folie, eines Films, eines granulierten Feststoffs, eines Pulvers oder in anderer Form mit Hilfe eines Klebstoffs an ein Substrat, das verschiedenen Arten angehören kann, bindet. Solche Substrate sind z.B. synthetische Polymere, wie segmentierte Polyurethane, Polymethacrylsäurehydröxyäthylester und andere

- 21 6 0 9 8 8 6 /12 0 2

"Hydrogele", Silicone, Polyäthylenterephthalat und Polytetrafluorethylen oder modifizierte natürliche Polymere, wie Celluloseacetat, oder natürliche Polymere, wie Elastin, oder pyrolytischer Kohlenstoff oder andere Kohlenstoffarten, die thermisch oder mit dem elektrischen Lichtbogen behandelt worden sein können, oder Metalle, wie Vitalium, Titan oder verschiedene Stahlsorten. Ein geeigneter Klebstoff ist z.B_o ein Siliconkautschuk.

- 22 8 0 9 8 8 6/1202

Beispiel 1

Herstellung von Kollagendispersionen und Mucopolysaccharidlösungen

Das in diesem Beispiel verwendete Kollagen wurde hergestellt, indem gekalkte Kalbshäute in Streifen von 9,5 mm Breite und dann zu dünnen Stücken zerschnitten wurden. Diese dünnen Hautstücke wurden mit 3 Teilen ¥asser behandelt, die 0,3 % Propionsäure und 0,1 % Benzoesäure enthielten. Nach 4 Stunden hatte sich ein Gleichgewicht eingestellt, und die Lösung hatte einen pH-Wert von ungefähr 5,3« Die Kollagenaufschlämmung wurde von dem Wasser getrennt und mit Hilfe eines zentrifugal wirkenden Schneid- und Mahlgeräts zu Produkten von.unterschiedlichen Teilchengrössen und Strukturen vermählen. Die Kalbshautkollagenaufschlämmung (Gewichtsverhältnis von Wasser zu Haut 1:1) hatte einen Gelatinegehalt von etwa 2 %. Ferner enthielt sie 0,41 % Calcium und 0,041 % Magnesium. Physikalisch bestand die Aufschlämmung aus hochgradig verschlungenen Fibrillenaggregaten.

Die Kalbshautkollagenaufschlämmung wurde durch wiederholte Ausfällung aus einer trüben Dispersion in 0,05-molarer Essigsäure mit 0,2-molarer Mononatriumphosphatlösung (NaHpPO^) gereinigt. Nach dem Reinigen wurde das Kollagen in 0,05-molarer Essigsäure oder in einer Citronensäure-Pufferlösung von einem pH-Wert von 3,2 (0,1-molare Citronensäure, 0,2-molares Mononatriumphosphat) dispergiert. Die Dispersion wurde gründlich in einem Waring-Mischer homogenisiert, bis die Extinktion einer 0,3 g Kollagen je 100 ml enthaltenden Dispersion bei 440 πιμ, bestimmt mit einem Spektrophotometer (CoTeman"Junior" II A, Maywood, Illinois), 0,5 betrug. Die so erhaltenen Kollagendispersionen wurden bis zur Weiterverarbeitung bei 4° C gelagert.

Mucopolysaccharidlösungen wurden aus Natriumheparin, Hyaluronsäure bzw. Chondroitin-6-sulfat hergestellt. Das Natrium-

- 23 -

6 0 9 8 8 6/1202

heparin, aus Schweinedarmschleimhaut gewonnen, mit 143 U.S»P«- Aktivitätseinheiten je mg wurde von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois, erhalten» Die Hyaluronsäure wurde aus-Hahnenkamm nach der von D.A. Swann in "Biochim,, Biophys. Acta", 156, 17 (1968), beschriebenen Methode hergestellt. Die so erhaltene Hyaluronsäure enthielt 47,1 % Hexuronsäure und 42,6 % Hexosamin. "

Chondroitin-4-sulfat aus Rindernasenknorpel wurde nach der Methode hergestellt, die von L. Roden, J.R. Baker, J.A. Cifonelli und M..B. Mathews in "Methods of Enzymology", herausgegeben von V. Ginsburg, Band 28B, Verlag Academic Press, New York, Seite 73, beschrieben ist.. Heparansulfat und Dermatansulfat wurden aus Schweineschleimhautgewebe extrahiert und nach den Methoden gereinigt, die von J.A. Cifonelli und L. Roden in »Biochemical Preparations", 1_2, 12 (1968), beschrieben sind.

Chondroitin-6-sulfat, gewonnen aus Haifischknorpel - Gütegrad B, wurde von Calbiochem, San Diego, California, erhalten. Es enthielt 2,66 % Stickstoff, 37,2 % Glucuronsäure und 5,61 % Feuchtigkeit.

Heparin, Hyaluronsäure, Chondroitin-4-sulfat, Heparansulfat, Dermatansulfat und Chondroitin-6-sulfat wurden in einer Konzentration von 1 g je 100 ml in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) gelöst. Die Mucopolysaccharidlösungen wurden bei 4° C aufbewahrt.

Beispiel 2 . ·

Herstellung von gemeinsamen Niederschlagen aus Kollagen und Heparin sowie aus Kollagen und Hyaluronsäure

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml 0,05-molarer Essigsäure wurde bei 23° C mit einem Polytetrafluoräthylenrüh-

- 24 -

6 0 9886/1202

rer gründlich gerührt. Während des Mischens der Dispersion wurde Heparin bzw. Hyaluronsäure in einer Konzentration von 1 g •je 100 ml 0,05-molarer Essigsäure aus einer Bürette mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/sec zugetropft. Beim Zusatz des Mucopolysaccharids wurde das Kollagen in Form einer verschlungenen Masse aus mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfibrillen mitgefällt, die einem Garnknäuel ähnelte« Sobald 90 Gewichtsprozent Kollagen mit 10 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid in dieser Weise gemeinsam ausgefällt worden waren, zeigte eine systematische Massenbilanz, dass 95 % des ursprünglichen Mucopolysaccharids mitgefällt worden waren.

Nach der gemeinsamen Ausfällung wurde die verschlungene Fibrillenmasse im Waring-Miseher homogenisiert, bis die Fibrillen etwa 1 mm lang waren. Das Gemisch aus Fibrillen in 0,05-molarer Essigsäure trennte sich, wenn es länger als 5 Minuten ruhig stehengelassen wurde, in zwei Phasen, weswegen es vor dem Filtrieren gemischt werden musste. Die Kollagen-Mucopolysaccharid-Dispersion wurde durch eine Nutsche, auf der sich ein Filterpapier von Schleicher und Schuell (Keene, New Hampshire) Nr. 576 befand, abgesaugt. Der gemeinsame Niederschlag wurde unter atmosphärischen Bedingungen dehydratisieren gelassen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 20 Gewichtsprozent betrug.

Beispiel·^

Herstellung von gemeinsamen Ausfällungen von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat

Eine Dispersion von 0,3 g Kollagen je 100 ml Citronensäure-Phosphatpufferlösung (pH 3,2) wurde bei 23° C mit einer 1 g Chondroitin-6-sulfat je 100 ml Pufferlösung (pH 3,2) von 23° C gemeinsam ausgefällt. Der Niederschlag wurde gemäss Beispiel 2 homogenisiert, filtriert und an der Atmosphäre trocknen gelassen.

' - 25 -

6 0 9 8 8 6/1202

Beispiel 4

Aldehydvernetzung eines Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukts

Die nach Beispiel 3 hergestellte gemeinsame Ausfällung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat wurde durch Eintauchen in eine 0,02-molare Lösung von Glutaraldehyd vernetzt. Durch diese Behandlung wurde ein Bruchteil der Polysaccharidkomponente auf den KoIlagenfibrillen oder -molekülen immobilisiert. Die Vernetzung machte sich daran bemerkbar, dass es nicht gelang, das Polysaccharid aus dem mit dem Aldehyd behandelten Film durch längeres Auswaschen mit einer Phosphatpufferlösung, die 0,4-molar an Natriumchlorid war und einen pH-Wert von 7,4 aufwies, und die als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, zu entfernen. Nicht-umgesetzter Aldehyd wurde durch Behandeln mit einer Lösung von 5,5-Dimethylcyclohexandion-(1,3) (Dimedon) entfernt. Nach dem Verdampfen des Wassers hinter-· blieb ein Film, der bis etwa 10 Gewichtsprozent Polysaccharid enthielt.

Beispiel 5 Dehydrothermische Vernetzung von Kollagen-Chondroitin-6-sulfat

Das Produkt des Beispiels 3 wurde in einem Vakuumofen 48 Stunden der Einwirkung einer Temperatur von 115 C und eines Vakuums von mindestens 0,3 mm Hg ausgesetzt. Nach dieser Behandlung Hessen sich weniger als 10 Gewichtsprozent des ursprünglich in den Film eingelagerten Polysaccharids durch 48-stündiges Eintauchen in destilliertes Wasser,'welches als Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat bekannt ist, entfernen.

Beispiel

Hexosarainanälyse und Molekulargewicht zwischen den Vernetzungsstellen

Da Mucopolysaccharide hexosaminhaltige Polymere sind, steht der Hexosamingehalt in direkter Beziehung zu der Menge des je·

- 26 609886/1202"

weiligen Mucopolysaccharxds in einem Verbundprodukt. Sobald erst einmal die Beziehung zwischen dem Hexosamingehalt und dem Gewicht für ein jedes Mucopolysaccharid festgestellt worden ist, ist die Bestimmung einfach. Die Analyse ist im einzelnen in der Doktorarbeit von C. Huang, Mech„ Eng. Dept., M.I.To, Cambridge, Massachusetts, Kapitel 3, 4 (1974), beschrieben. Die Methode kann folgendermaßen zusammengefasst werden: Eine bekannte Gewichtsmenge des 48 Stunden bei-105 C im Vakuum getrockneten Verbundprodukts wird in eine 5 ml fassende Ampulle'eingebracht und mit 1 ml 8-molarer Salzsäure versetzt. Die Ampulle wird evakuiert, dann mit Stickstoff gespült und unter Vakuum zugeschmolzen. Die Hydrolyse beginnt, wenn die Ampulle in einen Ofen mit Luftumlauf bei 95 C eingesetzt wird. Nach 4-stündigem Verweilen bei 95° C wird die Ampulle mit Leitungswasser auf 10° C gekühlt. Dann wird der Inhalt bei 40 C zur Trockne eingedampft, bis nur noch trockenes Hydrolysat hinterbleibt. Das Hydrolysat wird in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von etwa 50 bis 150 mg Mucopolysaccharid je ml ¥asser gelöst. 1 ml der Hydrolysatlösüng wird zu 1 ml einer 8-volumprozentigen Lösung von Acetylaceton in. 1-molarer Natriumcarbonatlösung zugesetzt. Bei 1-stündigem Erhitzen auf 95° C reagiert das in dem Hydrolysat enthaltene Hexosamin mit dem Acetylaceton in alkalischer Lösung unter Bildung von Pyrrolderivaten. Nach dem Kühlen der Lösung auf 10 C setzt man 5 ml 95-prozentiges Äthanol und 1 ml Ehrlichsches Reagens [hergestellt durch Lösen von 1,33 g p-Dimethylaminobenzaldehyd (DAB) in 50 ml 6-molarer Salzsäure und Zusatz von 50 ml 95-prozentigem Äthanol] zu und mischt dann •gründlich. Die Reaktion zwischen dem DAB-und den Pyrrolderivaten führt zur Bildung eines Chromophors, welches dem Produkt eine intensive rote Farbe verleiht. Nach 2-stündigem Stehenlassen der Mischung wird die Extinktion bei 527 mji gegen eine Reagens-Leerprobe mit Hilfe eines Coleman Junior II A-Spektrophotometers gemessen. Die Ergebnisse der Analyse werden mit genormten Eichkurven für ein jedes Mucopolysaccharid ver-.glichen. ·

-27-609 886/1202'

Die Ergebnisse der Hexosaminanalyse verschiedener vernetzter Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte, die nach den Verfahren der vorhergehenden Beispiele hergestellt worden sind, finden sich in Tabelle I. Der Mucopolysaccharidgehalt vor dem Vernetzen betrug für jedes in Tabelle I aufgeführte Verbundprodukt etwa 10 %.- Offenbar sind während des Vernetzens mit GIutaraldehyd und beim nachfolgenden Waschen grosse Mengen an Mucopolysaccharid verlorengegangen. Dies bedeutet, dass die Löslichkeit der unvernetzten Mucopolysaccharide in der wässrigen Glutaraldehydlösung, in die sie zum Zwecke der Vernetzung eingetaucht werden, hoch ist. Bei der dehydrothermischen Vernetzung wurden nur höchstens 10 % Mucopolysaccharid ausgewaschen, während bei der Vernetzung mit Glutaraldehyd bis zu 61 % ausgewaschen wurden.

Die mechanischen Eigenschaften der Verbundprodukte werden stark von der Anzahl der Vernetzungsstellen je Polymerkette beeinflusst. Das Molekulargewicht zwischen Vernetzungsstellen (M-_c) ist umgekehrt proportional der Anzahl der Vernetzungsstellen je Volumeneinheit. Die Werte für M_ können durch Messen des Spannungs-Dehnungsverhaltens der thermisch denaturierten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte bestimmt werden. Diese Methode ist in dem Werk ^frThe Physics of Rubber Elasticity" von L.R.G. Treloar, 2.Auflage, Verlag Clarendon Press.(1958), beschrieben. Eine Zusammenfassung der Versuchsergebnisse für verschiedene Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukte findet sich in Tabelle I. ·

- 28 609886/1202

Material

Kollagen Kollagen-Η Kollagen-Η Kollagen-Η

Kollagen-Η Kollagen-CS-6 Kollagen-CS-6 Kollagen-HA Kollagen-HA

	a b	<J	(24,	7,4).	I	2631908	- 10 %)
T	eile	(24,	3,2)	% MPS		500
	Vernetzung	(48,	7,4)	0,0		400
G	(24,	3,2	5,7±1,2	1	200
G	24,	7.4)	5,5*1,3·.,	9	800
G	(48,	90° C)	4,0^1,0	1
G	(24,	3,2)		1	800
	(48,	90° C)	9,7*1,0		800
D	(24,	7,4)	3,9-0,3	2	200
G	(48,	90° C)	9,6*1,1	6	200
D		2,3±0,4	1	500
G	9,0*0,5	2
D	2

G = Glutaraldehyd bei 23° C (Stunden, pH) D = dehydrothermisch (Stunden, Temperatur) H = Heparin " CS-6 ■=.. Ghondroitin-6-sulfat HA = ■ Hyaluronsäure MPS = Mucopolysaccharid

B e i s ρ i e 1 7 ' ·

Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysacchariden
hergestellte Verbundprodukte

Es wurden Mucopolysaccharidlösungen durch Lösen von 40 mg des betreffenden Mucopolysaccharids in 20 ml Citronensäure-Phosphatpuffer (pH 3,2) hergestellt. Ein Stück einer unlöslichen Kollagenfolie wurde dann zu jeder der Mucopolysaccharidlösungen zugesetzt und das Ganze auf einer konstanten Temperatur
von 37° C gehalten und 24 Stunden inkubieren gelassen. Dann
wurde zu der Lösung Glutaraldehyd bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,025 Mol/l zugesetzt. Das Kollagen wurde weitere 24 Stunden in dieser Lösung belassen und dann in eine auf
einem pH-Wert von 7,4 gehaltene, 0,025-molare Lösung von GIu-

- 29 60 9886/1202

taraldehyd überführt. Die letztere Verfahrensstufe wurde durchgeführt, um eine wirksame Vernetzung des Kollagens zu gewährleisten. Nach 24-stündIgem Verbleiben in der Glutaraldehydlösung wurden die Kollagenfasern zweimal mit destillierten! Wasser- gesprült und in eine 0,2-gewichtspro.zentige Lösung von Dimedon überführt, um den Überschuss von nicht-umgesetztem Aldehyd zu entfernen. Nach weiterem 24-stündigem Verbleiben in der Dimedonlösung wurden die Fasern fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4° C in Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 aufgehoben. Die gewichtsprozentuale Menge von Mucopolysaccharid, die sich an das Kollagen gebunden hatte, wurde durch Hexosaminanalyse bestimmt« Das Molekulargewicht M zwischen den Vernetzungsstellen wurde nach dem von R.L.G. Treloar in "The Physics of Rubber Elasticity", 2.Auflage, Clarendon Press (1958), beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle II.

Tabelle

II

	Material	% MPS (±0,5)	KS	Mc	3	(±500)
	Kollagen	O	= Mucopolysaccharid - -	4	800
	Kollagen-CS-6	11,3	4	100 "
	Kollagen-CS-4	8,7	4	000
	Kollagen-HA	8,2	3	200
	Kollagen-DS	8,2	3	900
	Kollagen-H	8,7	3	800
	Kollagen-KS	10,5	800
CS-6	= Chondroitin-6-sulfat DS	= Dermatansulfat
CS-4	= Chondroitin-4-sulfat H-	= Heparin
HA	= Hyaluronsäure	= Keratansulfat
MPS

- 30 -

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Beispiel 8

Enzymatiseher Abbau von durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbundprodukten

Es wurde eine Untersuchung des enzymatischen Abbaues von nach Beispiel 7 durch Beschichten von Kollagenfasern mit Mucopolysaccharid hergestellten Verbundprodukten durchgeführt. Die mit Mucopolysaccharid beschichteten Kollagenfolien wurden in Bandform in Gegenwart einer Lösung von Kollagenase (40 Einheiten je ml) um 4,0-0,5 % gedehnt, und die auf das Band ausgeübte Kraft als Funktion der Zeit registriert. Es wurde gefunden, dass die Kraft durch eine einzige negative Exponentialgrosse der Zeit dargestellt werden kann und daher ein Diagramm der Abhängigkeit des Logarithmus der Kraft von der Zeit eine gerade Linie ergibt. Die Steigung der Geraden ergibt 1/^*, einen Wert, der als Maß für die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaues des Kollagens durch Kollagenase verwendet wird. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle III.

	Tabelle	III	ι/ι
Material	% MPS (±0,5)
Kollagen	ό
Kollagen-CS-6	11,3
Kollagen-CS-4	8,7
Kollagen-HA	8,2
Kollagen-DS	8,2
Kollagen-H	8,7
Kollagen-KS	10,5
1 χ 104 '(±0,07)
(min~1)
8,48
1,46
0,88
5,38
. 0,90
0,98
1,10

- 31 609886/1 202

Beispiel 9

Enzymatischer Abbau von durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellten Verbundprodukten

Nach dem Verfahren des Beispiels 4 aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundprodukte wurden auf ihre Anfälligkeit für den Abbau durch Kollagenase untersuchte Hierbei wurde die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Methode mit dem Unterschied angewandt, dass der Dehnungsgrad 20-2 % betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

T a b €	000	IV	1/ε χ ίο2 (±0,009)
	000		(min"1)
ϊ 1 1 e	000		0,255
	000		0,149
Mr (±1000)	000		0,153
15	000		0,093
14	000		0,084
12	000		0,049
13	000		0,052
11	000		0,047
9		0,064
10		0,067
12
11
14

% CS-6 (±0,2)

1,8 3,0 4,8 6,5

8,6 11,2 13,3 14,9 16,0

Beispiel 10 . -· ·

Mechanische Eigenschaften von vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten

Die mechanische Untersuchung erfolgte mit einem Instron-Zugfestigkeitsprüfgerät unter Verwendung einer Belastungszelle vom Typ B. Von jedem zu untersuchenden Material wurden hanteiförmige Proben von 6,35 mm Breite und 0,25 mm Dicke hergestellt. Das obere Ende einer jeden Probe wurde an der BeIa-

- 32 609886/1202

stungszelle des Zugfestigkeitsprüfgerätes befestigt, während das untere Ende durch eine Klemmvorrichtung an der Gleitbacke befestigt wurde. Die Dehnung der Probe wurde aus der Bewegung der Gleitbacke berechnet. Alle Messungen wurden bei konstanter Dehnungsgeschwindigkeit von 50 %/min unter Spannung bei 3.7° C in einer Citronensäure-Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,4 durchgeführte

Für jedes Material wurden aus der experimentellen Spannungs-Dehnungskurve die Werte für die Kraft je Flächeneinheit beim Bruch oder die Bruchfestigkeit (U.T.S.), die Tangente ander Spannungs-Dehnungskurve bei 1-prozentiger Dehnung (1 %-Tangen tenmodul), die Bruchdehnung (E.B.) und die zum Bruch erforder liche Arbeit (Brucharbeit) berechnet.

Die Ergebnisse finden sich in Tabelle V.

- 33 609886/1202

Tabelle

Material

Vernetzung

D

(24,

900C)

7,4

% MPS

Mc

•

1 % Tangen

U.T.S.,

85

Bruch

4

Brust-Aorta

D

(48,

900C)

3,2)

—■

_

tenmodul ,

kg/cm

40*10

arbeit 2

5

Kollagen

G

(0,25, 7,4)

3,2)

0,0

9200

kg/cm

25,2

45*5

kg/cm -

Kollagen

G

(24,

9O0C)

0,0

6500

. 3,5

26,6*0,7

15*2

*10 %

. Kollagen

G

(24,

7,4)

0,0

3800

16,45*3,5

36,75*4,55

10*1

1470

CD

Kollagen '

G

(48,

3,2)

0,0

1200

35*4,55

23,4*3,57

23*2

616

CO

Kollagen-H

D

(48,

3,2)

5,7*1,2

9400

66,5*7

25,13*0,77

16*2

756

CO

. It

Kollagen-H

G

(24,

7,4)

5,7*1,2

6800

126*14

9,1*1,4

35*1

350

CD OO

Cj CD

Kollagen-H

G

(24,

900C)

9,7*1,0

2800

14,2*2,1

11,2*1,4

14*3

133

CX) ca .

Kollagen-H

G

(48,

900C)

5,5*1,2

1800

33,25*4,9

30,1*2,8

21*2

84

-^, VjJ

Kollagen-CS-6

G

(24,

G = Glutaraldehyd bei 230C

3,9*0,3

6800

21*0,7

26,6*3,5

16*2

77

ro l

Kollagen-CS-6

D

(48,

3,7*0,3

5500

133*42

9,1*0,7

11*3

371

O

Kollagen-CS-6

D

(48,

3,5*0,3

2500

24*8,4

6,44*2,8

20*1

224

Kollagen-CS-6

9,6*1,1

1200

15,8*0,7

9,31*2,1

20*1

77

Kollagen-HA

9,0*0,5

2500

17,7*6,44

44,17*1,96

= Hyaluronsäure

57,

(Stunden, pH)

49*4,55

34,3*4,9

= Chondroitin-6-

45,

D = dehydrothermisch (Stunden, Temperatur)

30,1*2,8

497

MPS = Mucopolysaccharid

HA

266

H '= Heparin

CS-6

U.T.

•sulfat

E.B.

S. = Bruchfestigkeit

= Bruchdehnung

Beispiel 11

Erhöhte Zähigkeit auf Grund der Einlagerung von Mucopolysacchariden

Ein Vergleich von Proben aus Kollagen und aus vernetzten Kollagen-Mucopolysaccharid-Verbundprodukten bei ähnlichem Vernetzungsgrad führt zu der Schlussfolgerung, dass die Anwesenheit des Mucopolysaccharide die Zähigkeit des Kollagens bedeutend erhöht. Beispielsweise ist die Brucharbeit für aus der vorhergehenden Tabelle ausgewählte Stoffe bei ähnlichen Vernetzungsdichten in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Brucharbeit, Material % MPS M.' kg/cm²-% ±10 %'.

Kollagen 0,0 1200 133 Kollagen-CS-6 9,6Ϊ1,1 1200 497

Wie sich aus der Tabelle ergibt, wird durch die Einlagerung von etwa 10 Gewichtsprozent Chondroitin-6-sulfat in Kollagen die Brucharbeit von 133 auf 497 kg/cm -% erhöht. Da die Brucharbeit bei einem M.-Wert von etwa 6500 maximal ist, ist es

wahrscheinlich, dass ein Verbundprodukt aus Kollagen und Chondroitin-6-sulfat mit einem Mucopolysaccharidgehalt von 10 Gewichtsprozent und einem M_ von 6500 eine Bruchenergie von mehr als etwa 770 kg/cm -%, der höchsten Bruchenergie aufweisen könnte, die für reines Kollagen unter den Bedingungen dieser Versuche festgestellt worden ist.

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596 111
Beispiel 12

Blutverträglichkeit von nach verschiedenen Vernetzungsmethoden hergestellten Verbundprodukten in vitro

Der Blutgerinnungstest (WBCT) ist eine in vitro-Methode zur qualitativen Bewertung des Einflusses von Stoffen auf (1) die Blutkoagulation, (2) die Plättchenaggregation und (3) die Aggregation der roten Blutkörperchen. Dieser Test beruht auf dem Umstand, dass in einem mit normalem Endothel ausgekleideten Venenabschnitt isoliertes Blut innerhalb einer Stunde Anzeichen für Gerinnung zeigt und innerhalb 2 bis 8 Stunden vollständig zu einem festen Gel koaguliert. Selbst normales Endothel kann die Koagulationszeit von Blut nicht unbegrenzt verlängern, wenn es der Schutzwirkungen des Fliessmechanismus und des natürlichen Filtrationsmechanismus beraubt wird. Die zu prüfenden nicht-thrombogenen Stoffe können daher dann als dem normalen Endothel in Berührung mit Blut gleichwirkend angesehen werden, wenn sie in weniger als 60 Minuten keine Gerinnung herbeiführen. So untersuchtes Blut muss aber eine endliche Gerinnungszeit aufweisen, da eine Verlängerung der Gerinnungszeit von Blut über 60 Minuten hinaus den Verdacht von künstlicher Verzögerung, wie durch Proteinadsorption oder Denaturierung, hervorruft und für die Bestimmung der Oberflächenwirkungen der Aktivierung des Faktors XII nicht beweiskräftig ist. Wenn entweder Denaturierung eines oder mehrerer der Proteinfaktoren des Koagulationsprozesses oder eine andere Fornrvon Antikoagulation (z.B. Hemmung eines Koagulationsfaktors) für die Verlängerung der Blutgerinnungszeit (WBCT) verantwortlich ist, dann gerinnt-mit der zu prüfenden Oberfläche in Berührung gebrachtes Blut normalerweise innerhalb 60 Minuten nicht, selbst wenn es auf eine aktive Oberfläche, wie Glas, überführt wird. Wenn das überführte Blut jedoch gerinnt, dann muss die WBCT-Verlängerung in erster Linie auf der Wirkung der Oberfläche und nicht auf Proteinadsorption, Denaturierung oder bleibender Antikoagulation beruhen. Der WBCT-Test wird daher angewandt, um die Wirkung der auf ihre

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Eignung zu prüfenden Stoffe qualitativ (1) auf die Blutkoagulation, (2) auf die Plättchenaggregation und (3) auf die Aggregation der roten Blutkörperchen zu "bewerten. Mit den zu untersuchenden Stoffen in Berührung stehendes Blut mit WBCT-Werten von mehr als einer Stunde wird in Glas überführt und auf Heparin oder heparinartige Antikoagulantien analysiert, um klar zu beweisen, dass weder Proteinadsorption noch Denaturierung noch bleibende Antikoagulation für die "Verlängerung der Gerinnungszeit verantwortlich ist. Weitere Einzelheiten über den WBCT-Test finden sich bei R.I. Lee und P.D. White in »Am. J. Med. Sei.», 145, 495 (1913).

4 cm lange Röhren mit einem Durchmesser von 0,7 cm aus einem Jeden der zu prüfenden Stoffe wurden am unteren Ende mit einer Arterienklemme abgeklemmt. In die Röhren wurden 1 bis 2 ml frisch entnommenes menschliches. Blut eingebracht., Um eine Vergleichsgerinnungszeit zu erhalten, wurde Blut in Glasröhren von ähnlichen Abmessungen gegossen, die als Versuchsröhren dienten. Jede Röhre wurde in einen Heizblock von 37° C eingesetzt und alle 30 Sekunden seitlich geneigt, um das Fliessvermögen des Blutes zu beobachten. Der Endpunkt der Gerinnungszeit wurde willkürlich als der Zeitpunkt festgesetzt, bei dem das Blut vollständig in ein Gel übergegangen war.

Um geringe Mengen des Antikoagulans Heparin in dem Blut festzustellen, wurde der Thrombinzeittest (TT) angewandt. Heparin stört bekanntlich die durch Thrombin auf die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin ausgeübte Katalyse. Wenn Thrombin zu citrathaltigem Plasma zugesetzt wird, wird die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin in Gegenwart von Heparin gehemmt. Im allgemeinen wird dieser Versuch durchgeführt, indem man das Plasma der Einwirkung der zu prüfenden Oberfläche in Gegenwart von Rinderthrombin unter genormten Bedingungen aussetzt, bis mit einem Fibrometer Koagulation nachgewiesen wird. Als Kontrollprobe dient ein der Einwirkung einer Prüfoberfläche nicht aus-

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gesetztes Plasma. Einzelheiten dieses Tests finden sich in dem Werk "Human Blood Coagulation and Its Disorders" von R₀ Biggs und R.G. MacFarlane, Oxford (1962).

Die Thrombinzeitversuche wurden durchgeführt, indem Blut 60 Minuten in Röhren aus einem jeden der zu untersuchenden Stoffe bei 37° C gehalten und mit 10 Volumprozent einer '.. Lösung von 3,8 g Natriumeitrat je 100 ml antikoaguliert wurde. Das Plasma wurde dann durch Zentrifugieren bei 23 C von den zellenförmigen Komponenten abgetrennt und bis zu seiner Untersuchung auf Eis gehalten.

0,1 ml "Vergleichsplasma, das nicht mit einer Prüfoberfläche in Berührung gekommen war, wurde mit 0,1 ml Rinderthrombin (Parke-Davis, Detroit, Michigan) koaguliert. Die Rinderthrombinaktivität wurde durch Verdünnen mit normaler Kochsalzlösung eingeregelt, bis die Koagulationszeit, bestimmt mit einem Fibrometer (Baltimore Biological Laboratories, Baltimore, Maryland) 20 Sekunden betrug. Plasma, das zuvor der Einwirkung einer jeden der zu untersuchenden Oberflächen ausgesetzt worden war, wurde in der gleichen Weise wie die auf eine Thrombinzeit von 20 Sekunden eingestellte Kontrollprobe koaguliertI In verschiedenen Phasen dieser Versuche wurden eingestellte Rinderthrombinaktivitäten im Bereich von 0,7 bis 3,5 Einheiten je ml angewandt. Wenn Heparin in dem der Einwirkung einer Prüfoberfläche.ausgesetzten Blut enthalten war, betrug die Thrombinzeit mehr als 20 Sekunden. Die genaue Heparinkonzentration des der Einwirkung, der. Oberfläche ausgesetzten Plasmas wurde durch Neutralisation mit Protaminsulfat ermittelt; vgl. "Bleeding Disorders" von R.M. Hardisty und G.I.C. Ingrim, Verlag Blackwell Scientific Publications, Oxford (1965). 1 mg Protaminsulfat neutralisiert die Aktivität von etwa 85 Einheiten Heparin.

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596 111

Protaminsulfat wurde in verschiedenen Mengen zu dem exponierten Plasma zugesetzt, bis die Thrombinzeit wieder 20 Sekunden betrug. Durch die Menge an Protaminsulfat, die erforderlich ist, um die Aktivität des Heparins zu neutralisieren, wird die Menge des in der Probe in Lösung gegangenen Heparins quantitativ bestimmt. Sobald erst einmal die Anzahl der Heparineinheiten in einer jeden Probe bekannt war, wurde die Heparinkonzentration in Einheiten je ml in einer jeden Blutprobe berechnet, indem die Anzahl der Einheiten durch das Volumen der Probe dividiert und mit 0,65, dem volumetrischen Anteil des Plasmas an dem Blut, multipliziert wurde«, Der Thrombinzeittest enthüllt nur Fehler in dem Mechanismus für die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin. Die selektive Adsorption eines Plasmaproteins konnte die Gerinnung des Blutes verhindern, wenn dieses der Einwirkung einer Oberfläche ausgesetzt wurde. Alle etwaigen, durch Proteinadsorption oder Antikoagulation verursachten Koagulationsfehler wurden dadurch offensichtlich, dass das Blut nicht gerann, wenn das der Einwirkung der zu prüfenden Oberfläche ausgesetzte Blut auf eine aktive Oberfläche, wie Glas, überführt wurde.

Die Ergebnisse finden sich in Tabelle VII.

- 39 .-■

8098 86/120

596

111

Kollagen-CS-6

T

a b

ell

G

(24,

7,4)

e VII

Kontrolle

min

5

2631908

Kollagen-HA

G

(24,

7,4)

3,5

5

Kollagen-HA

Vernetzung

G

(24,

3,2)

% MPS

3,0

5

;, WBCT,

Material

G

(48,

7,4)

0,0

3,5

5

min

(A)

Kollagen

D

(48,

900C)

4,1*1,0

3,5

25,3*5

(B)

Kollagen

G

(24,

3,2)

5,7-1,2

4,5

60+

(C)

Kollagen-Η

D

(48,

900C)

5,5*1,3

.5*0,

60+

(D)

Kollagen-Η

G

(24,

7,4)

9,7*1,0

3

,οίο,

60+

(E)

Kollagen-Η

D

(48,

900C)

3,9^0,3

3

,5*0,

60+

(F) Kollagen-CS-6

9,7*1,0

3

,0*0,

23*3

(G)

2,3*0,4

3

60+

(H)

9,0^0.5

14±Ο,5

(D

21,5*2,0

- Fortsetzung der Tabelle VII -

Ausgewas chene s

Thrombinzeit, . Heparin,

Material Waschen see Einheiten/ml

(C) Kollagen-Η H_£0 - 180+ 2,75

Kochsalz-

lösung *

(E) Kollagen-H ' H₂O 180+ 5,5

S^z" ¹⁸⁰⁺ °·³³

(G) Kollagen-CS-6 . 20

G = Glutaraldehyd bei 23 C (Stunden, pH)

D = dehydrothermisch (Stunden, Temperatur)

H = Heparin

CS-6 = Chondroitin-6-sulfat

HA = Hyaluronsäure

MPS = Mucopolysaccharid

Kontrolle = Gerinnungszeit auf Glas

HpO = 3 Tage bei 23° C in Wasser gewaschen

Kochsalzlösung = 2 Tage in Wasser und dann 3 Tage in normaler Kochsalzlösung bei 37 C gewaschen«

- 40 -

09886/1 202

Beispiel 13

Blutverträglichkeit von mit verschiedenen Mucopolysacchariden hergestellten Verbundprodukten in vitro

Kollagen wurde mit 0,05-molarer Essigsäure nach der Methode von K.A. Pieζ und Mitarbeitern, "J. Biochim. Biophys. Acta", 53, 596 (1961), aus Rattenschwanzsehnen extrahiert. Eine Stammlösung wurde unter Kühlung bei 4° C gelagert.

Aus Haifischknorpel gewonnenes Chondroitin-6-sulfat wurde von Calbiochem, San Diego, CA, erhalten. Hyaluronsäure wurde aus Hahnenkamm nach der Methode von D.A. Swann, "Biochim. Biophys. Acta», 1j?6, 17 (1968), hergestellt.

Folien aus vernetzten ionogenen Kollagen-Mucopolysaccharid-Komplexverbindungen wurden folgendermaßen hergestellt: Eine Lösung oder Dispersion von Kollagen wurde mit einer Lösung je eines der Mucopolysaccharide bei einem pH-Wert von 3,2 unter Rühren "gemischt. Der dabei entstandene Niederschlag, eine ionogene Kollagen-Mucopolysaccharid-Komplexverbindung, wurde als filmartiger Rückstand gesammelt, an der Luft getrocknet und 48 Stunden bei 23° C in eine 0,02-molare Lösung von GIutaraldehyd von einem pH-Wert von 7,4 eingetaucht. Nicht-umgesetzter Aldehyd wurde durch Reaktion mit einer Dimedonlösung entfernt.

Genormte hämatologische Untersuchungen wurden in vitro mit frisch entnommenem menschlichem Venenblut durchgeführt. Die Blutgerinnungszeit (WBCT) und die Thrombinzeit (TT) wurden, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, bestimmt.

Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wurde durch Inkubieren von citrathaltigem Plasma mit Kaolin und-Cephalin (Thrombofax, Ortho, Raritan, New Jersey), einem partiellen Thromboplastin, in Röhren aus dem zu untersuchenden Material

- 41 - ■. 6 0 9 8 8 87 1 2 0 2

UJ

596 111

und Beobachtung der Koagulationszeit mit einem Fibrometer nach der Rekalzifizierung bestimmt; zur Kontrolle wurde das Verfahren in Abwesenheit der zu prüfenden Oberfläche wiederholt. Diese Untersuchungsmethode ist im einzelnen von R₀R₀ Proctor und S.I. Rapaport in "Am. J. Clin. Path„», 36, 212 (1961), beschrieben worden.

Die Prothrombinzeit (PT) wurde als die Gerinnungszeit nach dem Rekalzifizieren von Plasma bestimmt, das ein Gewebeextrakt-Thromboplastin (Hyland, Costa Mesa, CA) enthielt und zuvor mit dem zu prüfenden Material in Berührung gebracht worden war. Diese Untersuchungsmethode ist im einzelnen in dem Werk "A Practical Guide to Blood Coagulation and Haemostasis" von J.M. Thomson, Verlag Churchill, London (1970), beschrieben worden.

Die Plättchenaggregation wurde untersucht, indem das zu prüfende Material (in Pulverform) in einem plättchenreichen Plasma in einem Aggregometer (Chrono-Log, Broomall, PA) gerührt und die optische Dichte des Systems als Funktion der Zeit registriert wurde. Die Plättchenaggregation war von einer Zunahme der Durchsichtigkeit (Abnahme der optischen Dichte) des ursprünglich trüben Mediums begleitet.

Die Ergebnisse aller Untersuchungen ausser derjenigen auf Plättchenaggregation sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

WBCT, APTT, TT, ' PT, Material % MPS min see see see

Kontrollprobe - 3,5-5 36,0^0,5 19,5-0,5 13,0^0,2

Kollagen - 25-5 57^3 20,5-0,5 25^4

Kollagen-CS-6 9,6Ϊ1,1 >6θ 35,8±0,4 21,0^0,5 13,0-0,2

Kollagen-HA 9,oio,5 21,5-2 36,βίθ,5 19,4^0,4 13,2^0,5

Kollagen-H 9,7^1,0 >60 >180 >180 13,0^0,3

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Beim Plättchenaggregationstest war die optische Dichte des · Kollagens nach 4 Minuten von anfänglich etwa 9 auf unter 4 gesunken, während die optische Dichte aller Mucopolysaccharide enthaltenden Verbundprodukte in der gleichen Zeitspanne nur wenig auf einen Wert von etwa 8,75 gesunken war.

Beispiel 14

Blutverträglichkeitsprüfung der Verbundprodukte in vivo

Vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidprodukte wurden mit nur geringen oder keinen Schwierigkeiten zum Nähen verwendet. Beim Nähen wurde kaum ein Zerreissen und keine Undichtigkeit beobachtet, wenn aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat hergestellte röhrenförmige Prothesen als arterielle Transplantate in Schafe und Hunde implantiert wurden. Die Beobachtung der arteriellen Blutströmung nach der Operation unter Verwendung eines Ultraschall-Signaldetektors zeigte, dass die röhrenförmige Prothese aus Kollagen-Chondroitin-6-sulfat, die auf die Karotis eines Lammes verpflanzt worden war, eine im wesentlichen stetige arterielle Strömung aufrechterhalten konnte. Diese Beobachtung wurde zwei Wochen später unmittelbar vor dem Entfernen des Transplantats mit den gleichen Ergebnissen wiederholt. Beim Entfernen stellte sich heraus, dass das proximale Lumen des Transplantats sich teilweise infolge der Anwesenheit eines Thrombus verengt hatte; etwa 50 % des Lumens waren an dieser Stelle frei. Das distale Ende enthielt sehr wenig Thrombus, während etwa 90 % des Lumens frei waren und für die Blutströmung an dieser Stelle zur Verfügung standen. Der Thrombus schien an der proximalen Nahtlinie seinen Ursprung zu haben und sich über etwa 50 % der Prothesenlänge zu erstrecken. Wenn das Transplantat längs seiner Achse aufgeschnitten wurde, trennte sich der Thrombus leicht von der Oberfläche des Transplantats und schien nicht an ihr anzuhaften. Anfängliche Beobachtungen mit dem optischen Mikroskop ergaben, dass weder grosse Plättchenklumpen noch Fibrinogen an der Lumenoberfläche

Β 0 9 8 £6/1202

2631

596 111

des Transplantats anhafteten. Mikroskopische Beobachtungen zeigten ferner, dass sich eine dichte Schicht von Granulationsgewebe auf der äusseren Oberfläche des Transplantats·ab gelagert hatte.

- 44 6 0 9886/1202

B e i s pie! 15

Untersuchung der Widerstandsfähigkeit gegen Resorption und des Nichtauftretens von Fremdkörperreaktion gegen die · Verbundprodukte in vivo

In diesem Beispiel wurden vernetzte Kollagen-Mucopolysaccharidmembranen, die einerseits durch Beschichten von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 7 und andererseits durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen mit je einem der Mucopolysaccharide gemäss Beispiel 2 und 3 hergestellt worden wären, subkutan in Meerschweinchen implantiert, wie nachstehend beschrieben.

Die Kollagen-Mucopolysaccharidmembranen waren durch das Vernetzungsverfahren sterilisiert worden. Das Eintauchen in ein Aldehydbad (und insbesondere ein Glutaraldehydbad) für eine Zeitdauer von mehreren Stunden, wie in Beispiel 4 beschrieben, ist eine bekannte Methode zum chemischen Sterilisieren verschiedener Stoffe vor dem Implantieren oder sonstigen chirurgischen Verfahren» Ferner ist bekannt, dass die mehrstündige Einwirkung von Temperaturen über 100° C eine andere Methode zum Sterilisieren von Stoffen ist, die implantiert oder anderweitig in der Chirurgie verwendet werden sollen. Wenn andererseits die Stoffe längere Zeit vor dem Implantieren hergestellt worden sind, sollen sie vorzugsweise unmittelbar vor dem Implantieren durch 24-stündiges Eintauchen in ein Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser bei 23° C desinfiziert werden. Durch das Eintauchen in diese Flüssigkeit werden weder die Vernetzungsdichte noch andere wichtige Strukturmerkmale · der Kollagen-Mucopölysaccharid-Verbundprodukte geändert.

Die subkutane Implantation wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Weisse weibliche Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von ungefähr 400 g wurden als Versuchstiere verwendet. Über 7 Tage vor der Implantation hinweg wurde eine Gewichtsänderungsgeschichte für jedes Tier aufgenommen. Kurz vor

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der Implantation wurde der Rücken eines jeden Tieres mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in einer Fläche von etwa 6 cm χ 5 cm geschoren, und lose Haarabfälle wurden sorgfältig abgesaugt. Dann wurde das Tier durch Einwirkung eines Gemisches aus Sauerstoff und Halothan anästhesiert und sein Rücken mit einem Gemisch aus 70 % Isopropanol und 30 % Wasser gewaschen.

Auf einer Seite des Rückens des Tieres wurde ein 2,5 cm langer Schnitt geführt. Der Schnitt wurde so ausgeführt, dass zwischen der Dermis und dem Panniculus carnosus eine Tasche entstand. In diese Tasche wurde die Probe so eingesetzt, dass die ganze Probe flach in der -Tasche lag. Dann wurde der Schnitt mit Nylon-Nahtmaterial zugenäht. Um den Schnitt zu schliessen, wurden etwa 5 bis 6 Stiche ausgeführt. Auf der anderen Seite des Rückens des Meerschweinchens wurde das Verfahren mit einer gleichen Probe wiederholt. Dann wurde die rechte Seite für histologische Untersuchungen verwendet, während Proben von der linken Seite nach dem Explantieren zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung verwendet wurden.

Am 4., 10. bzw. 20. Tag nach der Implantation wurden die Tiere getötet, indem sie in einen Äther enthaltenden Exsikkator eingebracht wurden. Sowohl von den linken als auch von den rech-, ten Implantationsstellen wurden unter der subkutanen Schicht Gewebequadrate von 3,8 cm χ 3,8 cm derart ausgeschnitten, dass sie implantierten Proben in dem Gewebe verblieben. Das Gewebe von der rechten Seite wurde in 10-prozentige Formalinlösung eingelegt und dann, wie nachstehend beschrieben, für histologische Untersuchungen verwendet. Das Gewebe von der linken Seite wurde in 50 ml sterile Dulbeccosche Lösung eingetaucht, die einige Tropfen Chloroform (als Bactericid) enthielten, und nicht langer als 24 Stunden vor der Entfernung der Probe unter Kühlung gelagert.

- 46 609886/1202

Das Entfernen der Probe in dem Gewebe erfolgte, indem das Gewebe auf den Tisch eines schwach vergrössernden Mikroskops (das mit einer Kamera ausgerüstet war) gelegt und das subkutane Gewebe derart von der Dermis abgezogen wurde, dass der Zustand der Probe in dem Gewebe klar in dem Mikroskop untersucht werden konnte. Dies wurde ermöglicht, indem zuerst ein Schnitt zwischen der Dermis und dem subkutanen Gewebe geführt wurde und die beiden Teile dann vorsichtig mit einer Pinzette voneinander getrennt wurden. Bei Beobachtung im Mikroskop konnten an dem Gewebe und der darin eingebetteten Probe Merkmale, wie die Bindung von Geweben an das implantierte Material, festgestellt werden. Das Entfernen der Probe aus dem Gewebe erfolgte auf dem Mikroskoptisch mit Hilfe einer Pinzette. Nachdem das Material aus dem Gewebe entfernt worden war, wurde es bei 4 C in Dulbeccoscher Lösung aufbewahrt, bis es zur Bestimmung der folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften benötigt wurde: ■

1. Die bruchteilmässige (anteilige) Gewichtsänderung der Probe Δ¥/¥^. Dieser Wert wurde durch Bestimmung des Trockengewichts der Proben (nach 48-stündigem Dehydratisieren bei 105° G unter einem Druck von 10 mm Hg) erhalten. Die anteilige Gewichtsänderung wurde dann aus der Gleichung

W_ - W,

berechnet, in der W das Trockengewicht der explantierten Pro be und ¥_i das Trockengewicht der Probe vor dem Implantieren bedeutet (der letztgenannte ¥ert wurde unter Verwendung einer kontrollpro'be bestimmt).

2. Zugmodul E (indyn/cm ). Dieser wurde nach der in Beispiel 10 beschriebenen Methode mit dem- Unterschied erhalten, dass der Modul als die Steigung des geraden Teils der Spannungs-Dehnungskurve bestimmt wurde. -

609886/-1202

3. Molekulargewicht M_Q zwischen Vernetzungssteilen. Dieses wurde gemäss Beispiel 4 bestimmt.

Die charakteristischen Eigenschaften von Kollagen-Mucopolysaccharidproben unmittelbar vor der Implantation sowie am 4., 10. und 20. Tag nach der Implantation sind für Produkte, die durch Beschichten von Kollagen mit verschiedenen Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle IX und für Produkte, die durch gemeinsame Ausfällung von Kollagen mit Mucopolysacchariden vor der Vernetzung hergestellt worden sind, in Tabelle X angegeben«

- 48 009886/1202

Tabelle IX

Durch Beschichten von Kollagen mit Mucopolysacchariden
hergestellte Verbundprodukte.

Eigenschaften vor und nach der Implantation„ Eigen- ImpLnta- Verweil ze it in vivo

schäften tion 4 Tage 1O Tage 20 Tage (1) Kollagen .

0,00^0,04 -0,16^0,04 -0,15-0,04 -0,31^0,04

_Q

^{E x 1}^₂ 3,3io,3 2,5-0,3 1,4^0,3- 1,6*0,3 (dyn.cm )

M^ χ 10³ 3,8^0,5 6,6^0.5 . 6,1-0,5 8,6-^0,5

(2) Kollagen-Hyaluronsäure

AwZf₁ 0,00i0,04 -0,12^0,04 -0,30^0,04 -0,28^0,04

—9

^{E X 1}°2 3,5-0,3 2,3^0,3 1,8^0,3 -0,9-0,3

(dyn.cm )

M_c χ 10~³ 4,2^0,5 7,2Ϊ0,5 6,7^0,5 8,5^0,5

(3) Kollagen-Heparansulfat

AwZW₁ Ο,Οθίθ,θ4 -0,06^0,04 +0,04-0,04 +0,38^0,04

—9 '

^{Ξ X 1}U₂. 4,oio^3 3,5-0,3 3j8io,5 3i6±O,5

(dyn«cm )

M_c χ 10~³ 3,8^0,5 4,6^0,5 4,7^0,5 4,5-0,5

(4) Kollagen-Heparin

₁ Ο,Οθίθ,θ4 -0,02^0,04 +0,08^0,04 +0,32-0,04

—9

^{E X Λ}% 4,2ίθ,3 3,9±0,3 4,2^0,3 4,3^0,3 (dyn»cm )

M₀ χ 10~³ 3,sio,5 4,3-0,5 4,3^,5 3,6^0,5

- 49 609 886/1 202

- Fortsetzung der Tabelle IX -

_. _T °F f^r Verweilzeit in vivo

Eigen- Implanta-

schaften tion 4 Tage 10 Tage 20 Tage ( 5) Kollagen-Dermatansulfat

AwZw₁ o,ooio,o4 -0,09^0,04 -0,05-0,04, +0,31-0,04

-9

^{E X 1}°₂ 3,9^0,3 4,θίθ,3 3,oio,3 3,1-0,3 (dvn»cm )

M^ χ 10"³ 4_foio_?5 4,9-0,5 5,3-0,5 5,2io,5 (6) Kollagen-Chondro itin-6-sulfat

AlIiW₁ 0,00^0,04 -0,02^0,04 -0,07-0,04 +O,4oio,O4

—9

^{E X 1}-2 ⁴»^0±0>3 3,6io,3 3,2^0,3 3,3ίθ.,3 (dyn«cm )

χ 10"³ 4,1^0,5 4,3-0,5 5,7-0,5 5,4^0,5

- 50 609886/1202

Tabelle X

Durch gemeinsames Ausfällen von Kollagen
mit Chondroitin-6-sulfat hergestellte Verbundproduktej
Eigenschaften vor und nach der Implantation

Eigen- lipLSta- Verweilzeit in vivo

schäften tion 4 Tage 10 Tage ' 20 Tage

(1) Kollagen

Δ¥/¥_± 0,00^0,02 -O,16±O,O2 -0,52-0,02 -O₅60^0,02

—8 '

^{E x 1}°₂ 1,8^0,2 1,3-0,2 1,4-0,2 0,7^0,2 (dyn*cm~ )

M_nx10""⁴ 1,5-0,1 2,4ίθ,1 3,5-0,1 3,8±0_s1

(2) 1,8 Gew. -% Chondroitin-6-sulfat

Δ¥/¥_± 0,00-0,02 -Ο,2θίθ,Ο2 -Ο,28ίθ,Ο2 -Ο,39^Ο₉2

^{Ε Χ 1}^₂ 1,9-0,2 1,5-0,2 1,oio,2 ' 1,0^0,2 (dyn·cm" ) -

M, χ 10"⁴ 1,4^0,1 1,8ίθ,2 2,9^0,2 3,0^0,2

(3) 4,8 Gew.-^ Chondroitin-6-sulfat

Δ¥/¥_± 0,00^0,02 -0,04^0,02 -Ο,Ο8ίθ,Ο2 +0,33-0,2

-8

^{Ε Χ 1}°ρ 1,8-0,2 1,5-0,2 1,2^0,2 1,3-0,2

(dyn·cm )

M_c χ 10"*⁴ 1,3^0,1 1,5-0,2 2,0^0,2 2,4^0,2

(4) 11,2 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat

Δ¥/¥_± 0,00^0,02 -O,O4io,O2 +0,18^0,2 +0,65^0,2 ¹»9-0,2- 1,6io,2 1,6i0,2 Λ,7-0,2

—ft

2 »9, (dyn»cm ) M_c χ 1O"⁴ 1,0^0,1 1,4io,1 1,3^0,1

;'■; - 51 -

609886/ 1202'

Aus den Tabellen IX und X geht hervor, dass In fast allen Fällen, in denen Kollagen mit einem Mucopolysaccharid entweder nach dem Beschichten oder nach der gemeinsamen Ausfällung mit einem Mucopolysaccharid vernetzt wurde, der anteilige Gewichtsverlust unterdrückt wurde, woraus sich ergibt, dass der Abbau des Kollagens durch die Umsetzung mit dem Mucopolysaccharid in wirksamer Weise verhindert wurde. Die einzigen Ausnahmen waren mit Hyaluronsäure (einem nicht-rsulfatierten Mucopolysaccharid) beschichtetes Kollagen und mit nur 1,8 Gewichtsprozent ChondroItin-6-sulfat gemeinsam ausgefälltes Kollagen; im letzteren Falle wurde der anteilige Gewichtsverlust des Kollagens nicht vollständig verhindert, sondern nur verzögert. In allen anderen Fällen kehrte sich ein gelegentlicher sehr geringer anfänglicher Gewichtsverlust, der möglicherweise auf die Entquellung der implantierten Probe zurückzuführen war, gewöhnlich am 10. Tage um, bis das Implantat am 20. Tage schwerer als zur Zeit der Implantation war. Die Gewichtszunahme des Implantats war auf das Anhaften einer gewissen Menge des umgebenden Gewebes an dem Implantat zurückzuführen, wenn das letztere aus dem Versuchstier entfernt wurde. Das an dem Implantat anhaftende Gewebe wurde analysiert, wobei sich herausstellte, dass es fast vollständig aus Kollagen bestand, eine Beobachtung, die zeigt, dass durch die Zellen in den umgebenden Geweben neues Kollagen synthetisiert worden war. Daher verhinderte die Reaktion mit sulfatierten Mucopolysacchariden nicht nur den Abbau des Kollagens, sondern führte auch zur Bildung eines Verbundproduktes, welches imstande war, die Synthese von neuem Bindegewebe auf seiner Oberfläche durch die Zellen in dem umgebenden Gewebe hervorzurufen.

Der Schutz gegen Resorption, den das Kollagen durch die Umsetzung mit sulfatierten Mucopolysacchariden.erhält, äussert sich auch in der Verhinderung einer wesentlichen Abnahme des Moduls E und einer Abnahme der Vernetzungsdichte (Erhöhung von M^), die bei Kollagen selbst oder bei einem Verbundprodukt aus

-- 52 -

60 9 886/1202

Kollagen und Hyaluronsäure beobachtet wird. Die Aufrechterhaltung von E und M_ auf verhältnismässig konstanten Höhen (innerhalb der experimentellen Unsicherheitsgrenzen) bis zum 20.. Tage nach der Implantation von Verbundprodukten aus Kollagen und einem der sulfatierten Mucopolysaccharide ist ein Anzeichen für ein vernetztes makromolekulares Netz, welches in dem Gewebe des lebenden Tieres mindestens 20 Tage intakt bleibt. .-■""-.

An dem aus der rechten Seite des Versuchstieres am 4., 10. und 20. Tage entnommenen Gewebe-Implantatblock wurden histologische Untersuchungen durchgeführt. Zur Herstellung der Proben für die histologische Untersuchung wurde das folgende genormte Verfahren angewandt:

1.-. Das Gewebe wurde mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur in 10-prozentigem Formalin (Fischer Scientific Co., NJ) fixiert,

2. Dann wurde es durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus ¥asser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von 50 %, 70 %, 85 %, 95 % bzw. 100 % dehydratisiert, vrobei die Dauer des Eintauchens in ein jedes Gemisch 1 Stunde betrug,

3. Dann wurde das Gewebe 2 Stunden in Dioxan getaucht, bevor es in ein Gewebe-Einbettungsmedium (Paraplast; F* 56-57°C|; Curtin Scientific Co., Houston, Texas) eingebettet wurde. Das Einbetten erfolgte, indem das Gewebe zunächst 4 Stunden in das auf 58 C gehaltene geschmolzene Paraffin eingebracht wurde, wobei das Paraffin stündlich ausgewechselt wurde. Dann wurde das Gewebe in eine Form eingelegt und in einen frischen Ansatz von Paraffin eingebettet.

4. Der das Gewebe enthaltende Paraffinblock wurde dann

20 Minuten in einem zerkleinertes Eis enthaltenden Bad auf 0° C

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s*r

gekühlt und auf einem Mikrotom (Minot' Custom Microtome; International Equipment Co., Needham Heights, MA.) montierte Scheiben des das Gewebe enthaltenden Paraffins wurden mit dem Mikrotom auf Dicken von etwa 6 μ. geschnitten.

5. Die mit dem Mikrotom geschnittene Probe wurde dann auf einem klaren Mikroskop-Objektträger montiert und durch je 3 Minuten langes Eintauchen der montierten Probe in zwei Ansätze von Xylol von Paraffin befreit.

6c Dann wurde die Probe durch aufeinanderfolgendes Eintauchen in Gemische aus Wasser und Äthylalkohol mit Alkoholgehalten von 100 %, 95 %, 85 %, 70 %_f 50 % bzw. 0 % dehydratisiert, wobei die Eintauchzeit in jedes Gemisch 1 Stunde betrug. Schliesslich wurde die Probe gründlich mit destillier- ' tem ¥asser gespült.

7. Dann wurde die Probe 5 Minuten mit Hämatoxylin gefärbt und kurz mit destilliertem Wasser gespült. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Spülen der Probe mit 0,5-prozentigem Säurealkohol (70 % Äthylalkohol in konzentrierter Salzsäure) entfernt. Schliesslich wurde der Säurealkohol durch Spülen der Probe und 1/2-stündiges Eintauchen in Wasser ausgewaschen.

8. Die Probe wurde sodann 3 Minuten in 0,5-prozentiger wässriger Eosinlösung gefärbt und hierauf fünfmal mit frischem Wasser gespült.

9. Die Probe wurde, wie für Stufe (2) beschrieben, dehydratisiert und dann einige Male mit Xylol gewaschen.

10. Hierauf wurde die Probe mit Hilfe eines bleibenden Montiermittels (Harleco Synthetic Resin; Hartman-Leddon Co., Philadelphia, PA) auf einem reinen Deckglas montiert.

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11. Das die gefärbte Probe aufweisende Deckglas wurde unter dem Mikroskop untersucht.

Die histologischen Untersuchungen zeigten, dass das Ausmaß und die Stärke von chronischer Entzündung in dem das Kollagenimplantat umgebenden Gewebe stetig abnahm, wenn der Chondroitin-6-sulfatgehalt einer Reihe von Implantaten auf der Basis von gemeinsam ausgefällten Kollagen-Chondroitin-6-sulfat-Verbundprodukten im Bereich von 1,8 bis 11,2 Gewichtsprozent zunahm. Diese Ergebnisse zeigten, dass das in den Verbundprodukten verwendete Kollagen zwar für sich allein eine mäßige Immunreaktion hervorrief, die Umsetzung des Kollagens mit dem Chondroitin-6-sulfat jedoch zu einer praktisch vollständigen Unterdrückung dieser Immunreaktion führte. Gleiches wurde auch festgestellt, wenn das Implantat aus einem Verbundprodukt bestand, welches durch Beschichten von Kollagen mit einem der sulfatierten Mucopolysaccharide erhalten worden war. Die histologischen Beobachtungen zeigten, dass die Fähigkeit von implantiertem Kollagen, bei dem Wirtstier eine Fremdkörperreaktion hervorzurufen, durch Umsetzung mit einem jeden der sulfatierten Mucopolysaccharide gesteuert und unterdrückt werden konnte.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Vernetztes Polymeres aus Kollagen und einem Mucopolysaccharid,

   2. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 0,5 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.

   3. Vernetztes Polymeres nach Anspruch Λ, dadurch gekennzeichnet, dass es
   vernetzt ist.

   net, dass es bis zu einem M -Wert von etwa 800 bis 60 000

   4. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net ρ dass es etwa 6 bis 15 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.

   5. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, dass das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe aufweist.

   6. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich net, dass das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Keratansulfat, Heparansulfat oder Dermatansulfat ist.

   7. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es
   vernetzt ist.

   net, dass es bis zu einem M -Wert von etwa 5000 bis 10

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   8. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat ist.

   9. Vernetztes Polymeres, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Inberührungbringen von Kollagen mit einem Mucopolysaccharid unter Bildung eines Kollagen-Mucopolysaccharidproduktes und anschliessendes Vernetzen des Produktes hergestellt worden ist.

   10. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Beschichten von Kollagenfasern mit einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des Produktes hergestellt worden ist.

   11. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es durch gemeinsames Ausfällen von Kollagen und einem Mucopolysaccharid und anschliessendes Vernetzen des Produktes hergestellt worden ist.

   12. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Behandeln·des Kollagen-Mucopolysaccharidproduktes mit einem chemischen Vernetzungsmittel ver netztworden ist.

   13. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als chemisches Vernetzungsmittel ein Aldehyd verwendet worden ist.

   14. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Aldehyd Glutaraldehyd verwendet worden ist.

   15· Vernetztes Polymeres nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es dehydrothermisch vernetzt worden ist.

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   Ι6_β Vernetztes Polymeres nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die dehydrothermische Vernetzung durch Einwirkenlassen eines Vakuums von mindestens etwa 10 mm Quecksilbersäule auf das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt "bis zur Erreichung eines M
   geführt worden ist.

   Erreichung eines M -Wertes von etwa 800 bis 60 000 durch-

   17. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass die dehydrothermische Vernetzung durch Einwirkenlassen einer erhöhten Temperatur von mindestens etwa 80 C auf das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt bis zur Erreichung eines M.-Wertes von etwa 800 bis 60 000 durchgeführt worden ist.

   18. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die dehydrothermische Vernetzung durch Einwirkenlassen eines Vakuums von mindestens etwa 0,01 mm Quecksilbersäule und einer erhöhten Temperatur von mindestens etwa 35° C auf das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt bis zur Erreichung eines M -Wertes von etwa 5000 bis 10 000 durchgeführt worden ist.

   19. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt etwa 6 bis 15 % Mucopolysaccharid enthält.

   20. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, dass das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe enthält.

   21. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat oder Dermatansulfat ist.

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   22. Vernetztes Polymeres nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es einen M_c~Wert zwischen etwa 5000 und 10 000 aufweist.

   23. Verfahren zur Herstellung von vernetzten Kollage.n-Muco— polysaccharid-Verbundproduktens, dadurch gekennzeichnet, dass man

   a. Kollagen mit einem Mucopolysaccharid unter Bildung eines Kollagen-Mucopolysaccharidproduktes in Berührung bringt,

   b. das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt isoliert und

   c. das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt durch Entfernen von so viel ¥asser dehydrothermisch vernetzt, dass das vernetzte Produkt einen M_c~¥ert zwischen etwa 800 und 60 000 aufweist. . ...... -..____

   24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass man das Wasser aus dem Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt durch Anwendung einer erhöhten Temperatur von mindestens etwa 80° C entfernt.

   25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass man das Wasser aus dem Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt entfernt, indem man das Produkt der Einwirkung eines Vakuums von mindestens etwa 10 .mm Quecksilbersäule unterwirft.

   26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet ₃ dass man das Kollagen-Mucopolysaccharidprodukt zusätzlich auf einer erhöhten Temperatur von mindestens etwa 35 C hält.

   27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass ,- man als Mucopolysaccharid Keratansulfat, Dermatansulfat, Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparansulfat,

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   Heparin oder Hyaluronsäure verwendet«

   28. Blutverträgliche Prothese bzw« Nahtmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass sie (es) aus einem polymeren Verbundprodukt aus Kollagen und einem Mucopolysaccharid besteht, welches mindestens etwa 4 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält. ■ ·

   29. Blutverträgliche Prothese bzw. Nahtmaterial nach Anspruch

   28, dadurch gekennzeichnet, dass sie (es) etwa 8 bis 12 Gewichtsprozent Mucopolysaccharid enthält.

   30. Blutverträgliche Prothese bzw. Nahtmaterial nach Anspruch

   29, dadurch gekennzeichnet, dass das Mucopolysaccharid eine Sulfatgruppe aufweist.

   31. Blutverträgliche Prothese bzw. Nahtmaterial nach Anspruch

   30, dadurch gekennzeichnet, dass das sulfathaltige Mucopolysaccharid Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Heparin, Keratansulfat, Heparansulfat oder Dermatansulfat ist.

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