DE3434082A1

DE3434082A1 - Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure

Info

Publication number: DE3434082A1
Application number: DE19843434082
Authority: DE
Inventors: Endre A. Riverdale N.Y. Balazs; Adolf Brooklyn N.Y. Leshchiner
Original assignee: Biomatrix Inc Ridgefield NJ; Biomatrix Inc
Current assignee: Sanofi Biosurgery Inc
Priority date: 1983-12-15
Filing date: 1984-09-17
Publication date: 1985-07-11
Also published as: DE3434082C2; JPS60130601A

Description

Wasserunlösliche Zubereitung von Hyaluronsäure

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf biokompatibele, wasserunlösliche Zubereitungen der Hyaluronsäure ("HA"), welche - wegen deren Biokompatibilität die Möglichkeit für diese schafft, bei zahlreichen In-vivo-Anwendungen, beispielsweise verschi'edenenprothetischenV/orrichtungen und Mittel, einschließlich künstlich enHerzklappen,vaskulärenTransplaηtaten etc, verwendet zu werden. Die wasserunlösliche Coder vernetzte) HA kann auch benutzt werden, um verschiedene polymers Artikel zu modifizieren, die ebenfalls in zahlreichen In-vivo-Anwendungen verwendet werden können. '

Hyaluronsäure ist eine bekannte, natürlich vorkommende Substanz, welche viele Anwendungen in Medizin und Biologie aufweist. Es sei zum Beispiel auf die US-Patentschrift k 272 522 und die darin angegebenen Veröffentlichungen hingewiesen.

Vernetzte Gele der Hyaluronsäure sind bekannt; sie wurden durch Laurent et al in Acta Chem. Scand. IB (196U) IMd. 1, Seiten 27U bis 275, beschrieben.

Die vorliegende Erfindung ist auf wasserunlösliche Zubereitungen der Hyaluronsäure gerichtet, die biokompatibel sind, lüegen ihrer Biokompatibilität können sie SDidohl bei zahlreichen In-vivo-Anwendungen per se als auch in Kombination mit verschiedenen polymeren Materialien verwendet werden, welche durch den Einschluß derartiger wasserunlöslichen Zubereitungen darin modifiziert wurden.

Genauer ausgedrückt, ist die Erfindung auf wasserunlösliche Zubereitungen von Hyaluronsäure, einschließlich der folgenden Arten von Materialien, gerichtet:

1.) Vernetztes Hyaluronsäure-Fulver; 2.) Vernetzter Hyaluransäure-Film bzw. vernetzte Hyaluronsäure-Membrane;

3.) Vernetztes Gel der Hyaluronsäure;

k.) Vernetzter Hyaluransäure-Film, durch ein Polyäthylen -Terephthalat -Gewirke verstcärkt, und

5.) Partikuläre Materialien, mit vernetzter Hya- ·· luransäure bedeckt.

Die Vernetzungsmittel, die verwendet werden können, um die raschen Zubereitungen (Instant-Präparationen) herzustellen, schließen ein:

1.) Formaldehyd;

2.) Dimethylalharnstoff;

3.) DimethylDläthylenharnstaff;

k.) Polyaziridinylverbindung;

5.) Äthylenoxid;

6.) PolyisQcyanat und
7.) Divinylsulfon.

Die folgenden Beispiele, (bei welchen alle angegebenen Teile geuichtsmäßig angegeben sind, wenn nicht

anders spezifiziert), veranschaulichen die verschiedenen Ausführungsfarmen der Erfindung, ohne jedoch eine Einschränkung derselben darzustellen, wobei die Erfindung allein durch die Patentansprüche umrissen ist. 10

Beispiel 1

Einem LJasser-Aceton-Gemisch wurde eine 37 gewichts· prozentige üJasserlösung von Formaldehyd und konzentrierter Salzsäure beigemischt. Das erhaltene Gemisch bestand aus folgenden Zusammensetzungen (Gewichtsprozent): CH₂D, 0,27; HGl, 0,19; Wasser/Aceton-Uerhältnis 1 : 28. IMatriumhyaluranatpulver (0,5 g) wurde zum Rückfließen gebracht: 1D Minuten lang in 50 ml des Gemisches. Dann wurde das Pulver abgefiltert, mit einem bJasser/Aceton-Gemisch 1 : 3 sorgfältig gewaschen, dann mit Aceton und schließlich in einem Uakuumüfen getrocknet. Das erhaltene Hyaluronsäurepulver war in Wasser unlöslich und enthielt 1,M % kombiniertes CH₂O.

Beispiel 2

Das obige Beispiel wurde mit dem vernetzenden Gemisch der folgenden Zusammensetzung (Gewichtsprozent) wiederholt: CH 0, 2,5; HCl, 0,38; lüasser/Aceton-Uerhältnis 1 : 2. Der CH O-Gehalt des Produktes war 5,3 %.

Bei den Beispielen 1 und 2 wurde die Vernetzung eines Hyaluronsäurepulvers in Ulasser-Aceton-Gemischen durchgeführt. Durch Änderung des Uasser/Aceton-Uerhält-

-G-

nisses und der CH^O-Konzentration ist es möglich, das Quellungsverhältnis des Produktes zu steuern und zu regeln. Somit war das Quellungsverhältnis 178 % für das Produkt des Beispiels 1 und 230 % für das Produkt des Beispiels 2. Das Quellungsverhältnis kann dadurch reduziert werden, daß der betrag des Acetons in dem Gemisch und die CH„O-Kanzentratian erhöht werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Uerwendung einer Polyaziridin-Verbindung als Vernetzungsmittel. Diese Verbindung des Polyaziridin-Typs vernetzt Hyaluronsäure unter Trockenbedingungen und bei Umgebungstemperatur, luas bei Hyaluronsäure sehr wichtig ist, da es sich bei letzterer um ein wärmeempfindliches- Polymer handelt.

Beispiel 3

113,G gm einer Hyaluronsäurelösung in Wasser (Konzentration 14,2 mg/ml) wurden 0,^2 g einer Polyaziridin-Verbindung - Crass-Linker CX-100 (Polyviny1-Chemikalie) beigemischt. Das Malverhältnis des Uernetzungsmittels zu Hyaluronsäure war 0,5. Das Gemisch wurde in eine Glasplatte als eine 5 mm dicke Schicht gegossen und bei Raumtemperatur 2 Tage lang trocknen gelassen. Ein klarer Film aus vernetzter Hyaluronsäure wurde erhalten, der in Wasser nicht löslich war und ein Quellungsverhältnis in Wasser von 160 % hatte.

Beispiel k

0,5 g eines trockenen Hyaluronsäurepulvers wurden mit 50 ml einer 1%igen Lösung von Crosp-Linker CX-100 in Aceton vermischt, 5 Minuten lang gelassen und abgefiltert. Das Pulver wurde an der Luft 2 Stunden lang ge-

trocknet, dann mehrmals mit Wasser gewaschen und in einem l/akuuraofen bei 40 Ck Stunden lang getrocknet.

Das Quellungsverhältnis des vernetzten Pulvers in Wasser

O/
/O.

war 135 ^0/-

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung der Folyaziridin-Uerbindung zur Erzielung vernetzter Hyaluronsäure mit einem hohen Grad an Quellung.

Beispiel 5

D,6 g festes Natriumhyaluronat uiurde mit 9,2 g einer 0,6%igen Läsung, gewichtsmäßig, von Cross-Linker CX-10D in Wasser gemischt. Die erhaltene Lösung hatte ein Molverhältnis von CX-100 zu IMatriumhyaluronat = 0,1. Der Natriumhyaluronatgehalt in der Lösung uar 6,04 Gewichtsprozent. Der pH-Wert des erhaltenen sehr viskosen Gemisches uiurde mit 2 % HCL auf 2,5 eingeregelt. Der sich ergebende Film war in Wasser leicht löslich. Der Film kiurde bei 60 ⁰C 30 Minuten lang eruiärmt. Die Wärmebehandlung lieferte einen dauerhaften und wasserunlöslichen Film.

Beispiel 6

Ein trockener Film einer nichtvernetzten Hyaluronsäure wurde in eine Lösung von 0,6 g Divinylsulfon in einem Gemisch von 26 g Aceton und 13 g Wasser gelegt und 10 Minuten lang darin belassen. Der Film wurde aus der Lösung entfernt, 10 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann in einem Ofen 20 Minuten lang bei 65 ⁰C erhitzt. Ein dauerhafter vernetzter Film der Hyaluronsäure wurde erzielt.

Die Biokompatibilität der Zubereitung gemäß der Erfindung wurde durch das nachstehend beschriebene Testverfahren bewiesen.

Beispiel 7 - BlutkDmpatibilitätstest

Die Freisetzung van H-Serotanin durch menschliche Blutplättchen uurde in vorausgehenden Studien angewendet, um die Blutreaktivität einer gemäß Beispiel 3 zubereite-1D ten Probe abzuschätzen. Normales menschliches venöses Blut wurde in Kunststoffspritzen abgezogen und unmittelbar in Kunststoff röhrchen übermittelt, die 3,8 "M Natriumnitrat (1 Teil Citrat zu neun TeilenUollblut) enthielten. Blutplättchenreiches Plasma wurde durch Z.entrif ugierung bei U ⁰C 15 Minuten lang mit 125 χ g zubereitet und durch eine serologische Pipette in eine Kunststoff- oder silizierte Teströhre entfernt. H-Serotonin ( H-5-Hydroxytryptamin, H-5HT; Neu England Nuclear, 26,3 Ci/mmol, lmCi/ml Äthanol-klasser) wurde dem plättchenreichen Plasma (platelet rich plasma = PRP), 0,2-0,5 ul/ml PRP, beigemischt und 15 Minuten lang bei 37 ^DC inkubiert. Bei der Prüfungjwurden silizierte oder Polypropylen-Teströhren verwendet; Thrombin wurde als Positivkontrolle benutzt, belegte und unbelegte Proben wurden geprüft. 1,0-2,0 ml H-5HT-FRP wurde jeder von Duplikatröhren, die zu untersuchende Proben enthielten, zugegeben; eine 50 ul Aliquote wurde zur Ermittlung der Gesamtradioaktivität aus dem Kontrollgemisch entfernt. Im Anschluß an die entsprechende Inkubationszeit (10-120 Minuten) wurden 0,2 - 0,5 ml Aliquoten der Suspension entfernt und 2 Minuten bei 12.000 χ g über Silikonöl in einer Eppendorf-Microfuge zentrifugiert. 50 ul des Liberstandes wurden aus jeder Röhre entfernt, mit 5 ml eines flüssigen Szintillationsfluids vermischt, und die Radioaktivität wurde durch Betaspektrometrie gemessen. Der Betrag von H-5HT, durch

Thrombin freigesetzt oder die Testproben, mar die Zunahme an Radioaktivität des Überstandes (Radioaktivität der experimentellen Proben minus Radioaktivität der Kontrolle) . Das Testmaterial brachte keine signifikante Blutplättchenfrei! Minuten mit sich.

Blutplättchenfreisetzung von H-5HT für bis zu 12Q

Variationen und Modifikationen können natürlich vorgenommen werden, ohne von dem Gedanken und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Zipse&Habersack : : i : : ^: ■ Patentanwälte

Kemnatenstraße 49, D-8000 München 19 beim Europäischen Patentamj

Telefon (089) 17 0186, Telex (07) 81307 zugelassene Vertreter

Biomatrix, Inc. PM 0 3

USA-Ridgefield, New Jersey 07657 16. Sept.1984

Patentansprüche

1./Verfahren zur Herstellung einer wasserunlöslichen Hyaluronsäure-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß Hyaluronsäure in Farm eines Pulvers, eines Films oder Gels einer Behandlung mit einem Vernetzungsmittel unterzogen wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Formaldehyd, Dimethylolharnstoff, Dimethyloläthylenharnstoff, Äthylenoxid, einem PoIyaziridin, einem Folyisocyanat und Divinylsulfon besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB das Vernetzungsmittel Formaldehyd ist und daß die Behandlung in einem wäßrigen Medium bei Rücklauf- bzw. Rektifikationstemperatur bewirkt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel ein Pülyaziridin ist und daß die Behandlung unter trockenen Bedingungen bei Umgebungstemperatur bewirkt wird.

it. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel ein Polyisacyanat ist und daß die Behandlung in Aceton bei Rücklauf- hzuj. Rektifikationstemperatur bewirkt ujird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel Dimethyloläthylenhsrnataff
uiird.

stoff ist und daß die Behandlung bei etwa 11D ⁰C bewirkt

S. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel Divinylsulfon ist und daß die Behandlung bei etuja 60 bis 65 C bewirkt ujird.

7. Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt ist.