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Hintergrund der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft niedermolekulare Carboxymethylcellulose-Zusammensetzungen,
die innerhalb von 30 Tagen nach dem Datum der Implantation in den
Körper
vom Körper
eines Subjekts absorbiert und im Wesentlichen aus diesem beseitigt
werden. Die niedermolekularen Carboxymethylcellulose-Zusammensetzungen
dieser Erfindung können
in einer breiten Vielfalt von medizinischen Anwendungen, wie in
medizinischen Implantaten und pharmazeutischen Abgabevehikeln für verlängerte Freisetzung,
sicher verwendet werden.
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Polyanionische
Polysaccharide, wie Carboxymethylcellulose („CMC"), Carboxymethylamylose und Hydroxyethylcellulose,
sind in einer breiten Vielfalt von medizinischen Anwendungen, wie
bei der Arzneistoffabgabe und der Vorhinderung von chirurgischer
Adhäsionsbildung,
nützlich.
Derartige Polysaccharide können sich
leicht in Wasser lösen,
um viskose Flüssigkeiten
zu erzeugen.
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Bioverträgliche Polymere
sind allgemein verwendet worden, um implantierbare medizinische
Vorrichtungen herzustellen. Für
derartige Vorrichtungen sollten die Resorption des Polymers und
seine nachfolgende Clearance aus dem Körper innerhalb von 30 Tage
beendet sein, damit die Implantate, die aus einer polymeren Zusammensetzung
hergestellt wurden, unter den gegenwärtigen FDA-Bestimmungen als
Kurzzeitimplantate zu bezeichnen sind. Diese Bestimmungen zeichnen
eine klare Unterscheidung hinsichtlich der Einhaltung zwischen Kurzzeit-
und Langzeitimplantat-Vorrichtungen und erfordern erheblich größere regulatorische
Prüfung für Langzeitimplantate.
Diese Prüfung
basiert hauptsächlich
auf den Sicherheitsauflagen für
Vorrichtungen, die für
einen längeren
Zeitraum im Körper
bleiben sollen.
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Hyaluronsäure („HA") und CMC im chemisch
modifizierten (derivatisierten oder vernetzten) Formen sind als
chirurgische Hilfsmittel nützlich,
um Adhäsionen
oder Verwachsungen von Körpergeweben
während des
postoperativen Zeitraums zu verhindern. Das derivatisierte HA-Gel
oder -folie wird in den Ort zwischen den Geweben eingespritzt oder
eingefügt,
die getrennt gehalten werden sollen, um ihre gegenseitige Adhäsion zu hemmen.
Chemisch modifizierte HA kann auch für die Arzneistoffabgabe mit
regulierter Freisetzung nützlich sein (siehe
US-Patent Nr. 4,937,270 und US-Patent Nr. 5,017,229, die derivatisierte
Versionen von HA offenbaren, die zum Beispiel durch Umsetzen von
HA mit einem Carbodiimid hergestellt wurden. Die Clearance dieser
Polymere aus dem Körper
ist vom Molekulargewicht der chemisch modifizierten und/oder vernetzten
Polymere abhängig.
Die Polymere werden aus dem Blut durch Glomerulusfiltration in den
Nieren beseitigt.
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US-Patent
Nr. 6,030,958 beschreibt Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen
CMC-Zusammensetzungen
durch Umsetzen der CMC mit einem Carbodiimid, wie EDC. Die Zusammensetzungen
können zu
wasserunlöslichen
Gelen erzeugt werden, welche auch Arzneistoffe enthalten können. Das
Molekulargewicht der CMC, die verwendet wird, um diese Zusammensetzungen
herzustellen, wird als im Bereich von 9 × 104 Da
bis 3 × 106 Da liegend beschrieben.
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EP-A-0815879
offenbart bioabsorbierbare medizinische Vorrichtungen, die durch
Oxidieren von Derivaten der Cellulose, einschließlich Methylcellulose, CMC
und Celluloseacetat, hergestellt werden. Die so erhaltenen modifizierten
Cellulosederivate können
zu niedermolekularen Fragmenten gespalten werden, die durch die
Nieren ausgeschieden werden können.
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Elkins
et al., Adhesion Prevention by Solutions of Sodium Carboxymethylcellulose
in the Rat, Fertility and Sterility (1984), beschreiben die Verweilzeit
von Lösungen
von Natriumcarboxymethylcellulose und Dextrose im peritonealen Raum
von Ratten. Diese Materialien wurden für die Wirksamkeit gegen postoperative
Adhäsionen
bewertet. Die Natriumcarboxymethylcellulose-Lösungen wiesen Molekulargewichte
von bis zu etwa 350.000 Da auf.
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Cellulose
und Derivate der Cellulose sind chemisch sehr beständig gegen
hydrolytische Depolymerisation. CMC wird durch Umsetzen von Alkalicellulose
und Natriumchloracetat unter sehr basischen Bedingungen bei erhöhten Temperaturen
hergestellt. Carboxymethylcellulose in chemisch nicht modifizierter
Form ist wasserlöslich
und dispergiert leicht in Wasser.
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Cellulose
und Cellulosederivate können
durch verschiedene Nichtsäugetierorganismen
enzymatisch depolymerisiert werden. Es ist gezeigt worden, dass
verschiedene bakterielle Spezies CMC unter Verwendung von â-Glucanasen
depolymerisieren (siehe Sierks, M.R., et al., Appl. Environ. Microbiol.
50 (3), 634, (1985); Lamot, E., et al, Z. Allg. Mikrobiol. 19, (5), 345,
(1976); C.G. van Ginkel et al, Environ. Tox. Chem., 15, (3), 270, (1996)).
Pilze besitzen auch die Enzyme, die zur Depolymerisierung von Cellulose
und CMC erforderlich sind, vornehmlich die Pilze, die für die Holzfäule verantwortlich
sind (siehe Almin, K.E., et al, Eur. J. Biochem. 51, (1), 207, (1975);
und Kanda, T, et al, J. Biochem. (Tokyo), 84, (5), 1217, (1978)).
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Säugetiersysteme
können
Cellulose nicht abbauen, weil sie die abbauenden Enzyme nicht besitzen, die
in einigen Bakterien und Pilzen gefunden werden. Deshalb werden
Cellulose und Cellulosederivate nicht leicht abgebaut, wenn sie
Säugetieren
implantiert werden oder durch sie aufgenommen werden. Weil die katabolischen
Stoffwechselwege zum Abbau von Cellulose und Cellulosederivaten
Säugetieren
nicht zur Verfügung
stehen, müssen
Cellulose und Cellulosederivate durch Wasserlöslichkeit und Passage durch
die Nieren beseitigt werden.
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Die
Clearance eines exogenen Arzneistoffs, gelösten Stoffs oder Polymers in
einem Säugetier
tritt auf, nachdem das Material in den Kreislauf gelangt ist. Wenn
es einmal in den Kreislauf gelangt ist, werden die exogenen Materialien
vom Körper
entweder durch den Lebermetabolismus, Gallenausscheidung oder Nierenfiltration
beseitigt. Die Clearance durch die Leber wird durch mehrere Faktoren,
wie Blutfluss zur Leber, Bindung des gelösten Stoffs an Serumproteine
und ob der gelöste
Stoff an Leberenzyme oder Bindungsstellen bindet oder nicht, reguliert
(siehe Cecil Textbook of Medicine; Wyngaarden, J.B., und Smith,
L.H., Jr., Hrsg.; W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1982, S.
50). Weil die abbauenden Enzyme für Cellulose und Cellulosederivate
für Bakterien
und Pilze typisch sind, binden Cellulose und Cellulosederivate nicht
an eines der Leberenzyme in Säugetieren,
und werden wiederum nicht durch die Leber beseitigt. Deshalb ist
der vorherrschende Weg der Clearance dieser Polysaccharide durch
Nierenfiltration, genauer durch Glomerulusfiltration.
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Die
Passage eines gelösten
Stoffs durch die Nieren wird durch die Passage durch den Glomerulus
reguliert. Die Geschwindigkeit und Leichtigkeit des Transportes
durch den Glomerulus wird wiederum durch das Molekulargewicht, die
Ladung und den Stokes-Einstein-Radius
des gelösten
Stoffs reguliert (siehe Oliver, J.D., et al., Bull. Math. Biol.,
56, (3), 369, (1994)). Die Struktur des Glomerulus besteht aus einem
Netzwerk von Typ IV-Kollagenfibrillen
und negativ geladenen Heparinsulfatproteoglykanen (siehe Langer,
K.H., Klin. Wochen. 63, (18), 835, (1985)). Die anionische Ladung
der Glomerulusmembran schließt
negativ geladene Makromoleküle,
wie Serumalbumin, aus. Von der Fähigkeit
von ungeladenen Makromolekülen,
sich Glomerulusfiltration zu unterziehen, ist in der Literatur berichtet
worden. Ungeladene Makromoleküle
zwischen 40.000 Da und 80.000 Da, wie Dextran und Polyvinylpyrrolidon,
gehen leicht durch das Glomerulus (siehe Alt, J.M. et al., Con. Nephrol.
19, 217, (1980)). Es ist gezeigt worden, dass für jede bestimmte Größe negativ
geladene Makromoleküle
die Glomeruluswand nicht leicht durchqueren (siehe Brenner, B.M.,
et al. Am. J. Physiol. 234, (6), F455, (1978)).
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Demgemäß würde ein
Fachmann nicht erwarten, dass negativ geladene Cellulosederivate,
wie Carboxymethylcellulose, von Säugetieren durch die Nieren
beseitigt werden, weil die Glomerulusmembran dazu neigen würde, negativ
geladene Spezies auszuschließen.
Außerdem
würde das
Fehlen eines Enzyms zum Abbau von Cellulosederivaten in Säugetieren
die Clearance durch die Leber verhindern.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung kennzeichnet niedermolekulare Cellulose-Zusammensetzungen,
die verwendet werden, um medizinische Implantate, Vorrichtungen
und pharmazeutische Abgabevehikel herzustellen. Die Cellulose-Zusammensetzungen
dieser Erfindung sind nicht modifiziert und in der Lage, im Körper eines
Subjekts innerhalb von 30 Tagen nach dem Datum der Implantation
resorbiert zu werden. Typische Cellulose-Zusammensetzungen schließen solche
ein, die auf Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose beruhen.
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Überraschend
ist festgestellt worden, dass CMC-Zusammensetzungen mit einem Molekulargewicht von
kleiner als etwa 100 kDa, vorzugsweise kleiner als etwa 85 kDa und
am meisten bevorzugt kleiner als etwa 75 kDa, in der Lage sind,
vom Körper
eines Subjekts vollständig
resorbiert und ausgeschieden zu werden. CMC-Zusammensetzungen mit
einem Molekulargewicht, das 100 kDa übersteigt, sind allgemein nicht
in der Lage, vom Körper
innerhalb von 30 Tagen resorbiert zu werden und erfüllen folglich
nicht die gegenwärtigen FDA-Bestimmungen
für Kurzzeitimplantate.
Diese Beziehung zwischen dem Molekulargewicht von CMC und der Fähigkeit
des Körpers,
das CMC zu absorbieren, ist auf dem Fachgebiet vorher nicht bekannt
gewesen.
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Verschiedene
Implantat-Vorrichtungen können
mit den CMC-Zusammensetzungen dieser Erfindung hergestellt werden,
und schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf prosthetische Vorrichtungen, typischerweise synthetische oder
bioprosthetische Vorrichtungen, Stents, Transplantate, Nahtmaterialien,
Katheter, Röhrchenmaterialien,
Führungsdrähte und
dergleichen. Diese Vorrichtungen können im Körper unter Verwendung von chirurgischen
Routineverfahren installiert werden. Beispiele von chirurgischen Routineimplantationen
sind subkutane, intramuskuläre
oder intravenöse
Injektion durch eine Nadel oder Kanüle, und Einbringen des Implantats
in den Körper
nach Laparotomie oder Endoskopie.
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Die
CMC-Zusammensetzungen dieser Erfindung können auch als implantierbare
Arzneistoffabgabevorrichtungen verwendet werden. In dieser Ausführungsform
ist der Arzneistoff innerhalb der CMC-Polymermatrix dispergiert.
Die Zusammensetzung kann dann zu jeder gewünschten Form zur Implantation
im Körper geformt
oder extrudiert werden. Geeignete Medikamente schließen Proteine,
wie Wachstumsfaktoren und Enzyme, Pharmazeutika, Antikörper, Biopolymere
und biologisch verträgliche
synthetische Polymere ein. Die CMC-Zusammensetzung kann formuliert
werden, um bestimmte Eigenschaften zeitlich festgelegter Freisetzung
bereitzustellen, um die Wirksamkeit des abgegebenen Arzneistoffs
zu maximieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Implantat-Vorrichtung
durch Auswählen
einer nicht modifizierten Cellulose-Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht
von kleiner als 100 kDa, Auswählen
eines therapeutischen Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung
eines Patienten mit einem bestimmten medizinischen Zustand, der
Behandlung erfordert, und Kombinieren des Medikaments und der Cellulose-Zusammensetzung,
um die Implantat-Vorrichtung herzustellen. Vorzugsweise weist die
Cellulose-Zusammensetzung ein Molekulargewicht von weniger als etwa
85 kDa und stärker
bevorzugt von weniger als 75 kDa auf. Das Medikament und die Cellulose-Zusammensetzung
können durch
Mischen oder Vermischen der Komponenten physikalisch kombiniert
werden, um eine Implantat-Vorrichtung herzustellen. Die Arzneistofffreisetzungseigenschaften
der Vorrichtung hängen
vom relativen Anteil der Komponenten, der Art und Löslichkeit
des ausgewählten
Polymers und der Teilchengröße und -verteilung
des Arzneistoffs in der Vorrichtung ab.
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Diese
Erfindung soll auch umfassen, wenn nicht anders definiert, dass
alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet
werden, dieselbe Bedeutung haben, wie allgemein von einem Fachmann
auf dem Gebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl
jedes Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleich solchen
sind, die hier beschrieben sind, bei der Ausübung oder Prüfung der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben.
Wenn nicht etwas anderes erwähnt
ist, sind die hier verwendeten oder erwogenen Techniken Standardverfahren,
die dem Fachmann bekannt sind. Die Materialien, Verfahren und Beispiele
veranschaulichen nur und sollen nicht beschränken.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
und aus den Patentansprüchen
ersichtlich.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
eine graphische Darstellung der Menge an radioaktiv markiertem CMC,
das aus dem Körper beseitigt
wird, als Funktion des Ausgangsmolekulargewichts des Polymers.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
Cellulose-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind nicht
modifizierte Versionen von Cellulose. Bestimmte Celluloseverbindungen,
welche bei der Ausübung
der Erfindung nützlich
sind, schließen Carboxymethylcellulose,
Carboxymethylamylose und Hydroxyethylcellulose ein. Die Cellulose-Zusammensetzungen
können
auch Zusatzstoffe, andere Polymere, und in einigen Anwendungen Medikamente
einschließen.
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Die
CMC-Zusammensetzungen dieser Erfindung sollten auch bioverträglich sein.
Ein „bioverträglicher" Stoff, wie dieser
Begriff hier verwendet wird, ist einer, der keine medizinisch unannehmbaren
toxischen oder schädlichen
Wirkungen auf die biologische Funktion des Subjekts hat.
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Carboxymethylcellulose
ist ein polyanionisches Polysaccharid, das mindestens einen negativ
geladenen Rest enthält,
in welchem die -CH2COOH-Reste an den Glukoseeinheiten
der Cellulosekette durch eine Etherbindung substituiert sind. Allgemein
kann CMC zum Beispiel durch Umsetzung von Alkalicellulose und Natriumchloracetat
hergestellt werden. Der Grad der Löslichkeit der Carboxymethylcellulose
hängt von
den Graden der Substitution der Carboxymethylgruppen an den Glukoseeinheiten
ab. Ähnlich
hängt der
Grad der Löslichkeit
anderer Celluloseverbindungen der Erfindung auch vom Grad der Substitution
derartiger Verbindungen ab. Ähnlich
hängt der
Grad der Löslichkeit
anderer Celluloseverbindungen dieser Erfindung auch vom Grad der
Substitution an der Verbindung ab.
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Der
Begriff „Cellulose", wie hier verwendet,
soll die nicht modifizierten Versionen von Carboxymethylcellulose,
Carboxymethylamylose und Hydroxyethylcellulose einschließen. Er
soll Polymere mit verschiedenen Graden an Wasserlöslichkeit,
sowie nicht modifizierte Versionen, wie hier bereitgestellt, bezeichnen.
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Der
Begriff „Subjekt", wie hier verwendet,
soll jedes Säugetier,
wie Schwein, Pferd, Kuh, Ziege und dergleichen abdecken, bezieht
sich aber vorzugsweise auf einen Menschen.
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Die
CMC-Zusammensetzung kann zum Schluss durch Autoklavieren der Zusammensetzung
sterilisiert werden, und dieses Verfahren hat keine nachteilige
Auswirkung auf die Struktur des Polymers. Endsterilisation ist ein
kosteneffektives Verfahren zur Herstellung der implantierbaren Vorrichtung
oder Arzneistoffabgabevehikels, weil sie eine geringere Biolast
aufweist als aseptische Verarbeitung, und verringert dadurch die Gefahr
der Infektion wegen der Gegenwart des Implantats. Typischerweise
schließt
Endsterilisation das Dampfautoklavieren der wässrigen Präparation ein.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete CMC-Zusammensetzung kann
entweder wasserlöslich oder
-unlöslich
sein. Der Begriff „wasserunlöslich" bedeutet allgemein,
dass das Polymer intakt bleibt, wenn es im Körper eines Subjekts, d.h. in
einer allgemeinen wässrigen
Umgebung, mindestens 7 Tage lang implantiert ist, und innerhalb
von 30 Tagen vollständig
vom Körper
absorbiert wird. Genauer sind die „wasserunlöslichen" CMC-Zusammensetzungen
dieser Erfindung Zusammensetzungen, welche, wenn sie unter Verwendung
einer 1%igen Lösung
von CMC, das gemäß der Erfindung
modifiziert wurde, zu einem Festkörper mit Abmessungen von 3
cm × 3
cm × 0,3
mm geformt werden, und sie ohne Rühren bei 20°C in einem 50 ml-Becher mit
destilliertem Wasser stehen dürfen,
nach 20 Minuten strukturell intakt bleiben, wobei die strukturellen
Grenzen und Ränder
des Materials nach 24 Stunden noch immer vorliegen. Folglich sind
die CMC-Zusammensetzungen dieser
Erfindung sowohl wasserlöslich
als auch -unlöslich,
sowie bioverträglich.
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Die
Carboxymethylcellulose-Zusammensetzung dieser Erfindung kann auch
andere bioverträgliche Polymere,
wie andere polyanionische Polysaccharide und insbesondere Hyaluronsäure, einschließen. Die
anderen Polymere können
in Mengen vorliegen, die der Zusammensetzung vorteilhafte Eigenschaften
verleihen, ohne für
die Verwendung des CMC als Implantat oder Arzneistoffabgabevorrichtung
schädlich
zu sein. Derartige Eigenschaften schließen verbesserte Antifäulnis- und
Anti-Blutplättchenadhäsionsaktivierungseigenschaften
ein. Der Begriff „Blutplättchenadhäsion", wie hier verwendet,
bedeutet das Ansammeln oder die Aggregation von Blutplättchen an
der Oberfläche
einer implantierten Vorrichtung (z.B., einer Gefäßwand, einer prosthetischen
Vorrichtung) durch Wechselwirkungen der Blutplättchen mit der Oberfläche, und
eine Vorrichtung, welche „Anti-Blutplättchenadhäsions"-Eigenschaften aufweist,
verhindert derartiges Ansammeln.
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Die
CMC-Zusammensetzungen dieser Erfindung können verwendet werden, um medizinische
Implantat-Vorrichtungen herzustellen. Die Zusammensetzungen können zu
jeder gewünschten
Form geformt und in den Körper
eines Subjekts implantiert werden. Spritzgießen ist eine nützliche
Technik zu diesem Zweck. Geeignete medizinische Implantat-Vorrichtungen schließen prosthetische
Vorrichtungen, synthetische oder bioprosthetische Vorrichtungen,
Stents, Transplantate, Nahtmaterial, Katheter, Röhrchenmaterial und Führungsdrähte ein.
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Die
CMC-Zusammensetzungen dieser Erfindung können auch verwendet werden,
um implantierbare Arzneistoffabgabevorrichtungen herzustellen. Derartige
Vorrichtungen sind hauptsächlich
zur Abgabe verschiedener Arzneistoffe an das Subjekt, einschließlich Proteine,
wie die Wachstumsfaktoren oder Enzyme, Pharmazeutika, Antikörper, Biopolymere
und biologisch verträgliche
synthetische Polymere, nützlich.
Die Arzneistoffabgabevorrichtung kann formuliert werden, um sie
für die
zeitlich festgesetzte Freisetzung des Arzneistoffs bereitzustellen.
Andere Zusatzstoffe und Excipienten, welche auf dem Fachgebiet bekannt
sind, können auch
in die CMC-Zusammensetzung eingeschlossen werden und in die Arzneistoffabgabe-Vorrichtungsformulierung
eingebracht werden, die Polyetheylenglykol, Polyvinylpyrrolidon,
Dextran, Dextransulfat, Serumalbumin, Sorbit, Mannit und dergleichen
einschließt.
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Aus
der vorstehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen
Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ermitteln, und kann, ohne
vom Wesen und Schutzbereich davon abzuweichen, verschiedene Änderungen
und Abwandlungen der Erfindung durchführen, um sie an verschiedene
Verwendungen und Bedingungen anzupassen.
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Wie
der Fachmann erkennt, können
die Zusammensetzungen dieser Erfindung unter Verwendung von Verfahren
hergestellt werden, die sich in bestimmten Einzelheiten von solchen
Verfahren unterscheiden können,
die hier beispielhaft angegeben sind.
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Die
folgenden Beispiele der Erfindung werden nur zur Veranschaulichung
bereitgestellt, und sollen die Erfindung nicht beschränken, ausgenommen,
wie in den angehängten
Patentansprüchen
aufgezeigt.
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BEISPIEL 1
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Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung von radioaktiv markierten CMC-Zusammensetzungen.
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Eine
radioaktiv markierte Carboxymethylcellulose-Lösung im Bereich von 125 kDa
bis 250 kDa wurde durch Umsetzen von C-1-[C14]-2-Chloressigsäure mit
Baumwoll-Linters in wasserfreiem Isopropylalkohol unter basischen
Bedingungen unter Erwärmen
hergestellt. Der so erhaltene Feststoff wurde durch Waschen mit überschüssigem Isopropylalkohol
und Trocknen unter vermindertem Druck isoliert. Dadurch wurde ein
gebrochen weißes
Pulver erhalten, das hochwasserlöslich
war. Das Molekulargewicht des Reaktionsprodukts wurde durch SEC-MALLS-Analyse
analysiert und erzeugt, damit ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts
von 250 kDa erhalten wurde.
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Radioaktiv
markiertes CMC mit einem Gewichtsmittel des Molekulargewichts von
125 kDa wurde durch ungefähr
zwei Jahre langes Altern des höhermolekularen
CMC bei 2°C
bis 8°C
erhalten. Radioaktiv markiertes CMC mit einem Gewichtsmittel des
Molekulargewichts von 70 kDa wurde von New England Nuclear Corp.,
Billerica, Massachusetts erworben.
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BEISPIEL 2
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Dieses
Beispiel beschreibt die Molekulargewichtsanalyse von radioaktiv
markiertem CMC.
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Die
Molekulargewichtanalyse wurde unter Verwendung einer HPLC, die Tandem-SEC-Säulen (TSK G6000PW und G4000PW)
hatte, durchgeführt.
Die mobile Phase war 0,05 M wässriges
Na2SO4, der pH-Wert betrug
9, mit einer Flussrate von 0,6 ml/min und das Injektionsvolumen
betrug 100 μl.
Das Molekulargewicht wurde unter Verwendung eines Mehrwinkellaserlichtstreuungsdetektor
(multiangle laser light scattering detector) (Wyatt Technologies),
verbunden mit einem Brechungsindexdetektor (Hewlett-Packard), bestimmt.
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Um
die radioaktive Reinheit zu bestimmen, wurden die Fraktionen der
HPLC gesammelt (von 10 ml bis 20 ml (> 40 kDa) und von 20 ml bis 31 ml (< 40 kDa)) und auf
Radioaktivität
auf einem Flüssigkeitsszintillationspektrophotometer
(Modell TRI-CARB 1500, Packard) analysiert. Ein ml aus Fraktion
10–20
(Probe) und ein ml aus Fraktion 20–31 (Lösungsmittel) wurden gesammelt
und mit 10 ml Szintillationsflüssigkeit
gemischt (Biodegradable Counting Sensalator Lot A3426, Amersham).
Die mobile Phase wurde als Kontrolle verwendet.
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Die
Ergebnisse der Molekulargewichtanalyse des C14-markierten CMC, das
in den Clearancestudien verwendet wurde, die in Beispiel 3 beschrieben
sind, sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle
1
Gruppe | Molekulargewicht
durch SEC-MALLS |
niedermolekulare
CMC | 80
kDa |
mittelmolekulare
CMC | 120
kDa |
hochmolekulare
CMC | 250
kDa |
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BEISPIEL 3
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Dieses
Beispiel beschreibt CMC-Clearancestudien in Ratten.
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Die
C14-markierte CMC, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde,
wurde in Succinat-gepufferte Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von
4,0 und bei Konzentrationen von 0,5 % (w/v) mit einer spezifischen
Aktivität
von 10–15 μCi/ml gelöst. Jedes
Tier empfing zwischen 25 und 40 μCi
der radioaktiven CMC durch IP-Injektion. Die Radioaktivität wurde
im Urin, Kot, in den Resten im Käfig,
Organen und im Kadaver des verbleibenden Tieres für bis zu
30 Tagen nach der Injektion analysiert. 1 zeigt
die Menge an Radioaktivität, die
aus dem Körper
beseitigt wird, als Funktion des CMC-Ausgangsmolekulargewichts.
Wie in 1 gezeigt, ist die Verteilung von C14-markierter
CMC in Ratten nach 30 Tagen eine Funktion des Molekulargewichts
des Polymers, wobei die maximale Clearance aus dem Körper bei
den Niedermolekulargewichtsbereichen des Polymers auftritt.