CN104004208A - 交联透明质酸钠生物膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种交联透明质酸钠生物膜及其制备方法，在制得交联度达到60%～80%的凝胶后将凝胶冷冻干燥，冻干后压制成膜，得到交联透明质酸钠生物膜。所述凝胶制备时获得交联透明质酸钠干粉后，将收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤；将经DMSO洗涤后的粉末用乙醇洗涤；然后真空干燥获得交联透明质酸钠粉末；将粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，用高速分散机中进行匀质微化处理，然后收集均匀凝胶颗粒得到用于制备生物膜的交联透明质酸钠凝胶。本发明所制备的交联透明质酸钠生物膜无热原、无菌、无残留交联剂，并且细胞毒性低；在体内的停留时间较长，防粘连效果好，具有良好的生物相容性和组织修复性能。

Description

交联透明质酸钠生物膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于手术创面、特别是用于预防手术后粘连的材料，具体涉及一种交联透明质酸钠生物膜及其制备方法。

背景技术

临床上对局部止血和术后防粘连有较高要求，手术后局部出血、组织粘连可能导致严重的临床并发症。理想的止血、防粘连材料应具有良好的生物相容性、无明显毒副作用、生物可吸收性、体内降解速率与伤口愈合同步、止血迅速、良好的组织粘附性；并且防止术后粘连效果好，能促进创面迅速愈合，粘膜损伤轻。

目前研发的防粘连材料中，聚乳酸防粘连膜强度较低、柔韧性较差，使用时常需要裁剪和缝针固定，对较深病灶使用不方便；壳聚糖膜与机体粘附性差，活性的保持时间较短，植入前期易出现轻度炎症反应和异物反应，降解速度不易控制；胶原蛋白止血效果明显，但防粘连效果差，可能引起严重的致敏反应；纤维素是外源物质，成膜性好，具有局部促进愈合和止血功效，但人体内并无降解纤维素的酶，生物可吸收性差。

透明质酸是广泛存在于人和动物体内的一种天然物质，具有优异的生物相容性。但是目前以透明质酸为主要材料的防粘连材料产品大多是天然透明质酸，天然透明质酸降解吸收迅速，机械强度差，易溶于水，在临床应用时可能会随病人体位改变而流动，在伤口愈合的所需时间内，无法发挥生物屏障的作用，限制了应用。

将透明质酸进行适当程度的交联制成的膜不改变其生物相容性和生物降解性，但是适当程度交联的透明质酸粘弹性和力学强度增强，水溶性减弱，与未交联的透明质酸生物膜相比在体内的停留时间增长，防粘连效果持续增强。

例如中国专利文献CN 103055353 A（申请号 201310020855.6）公开了一种手术用防粘连膜的制备方法，将透明质酸钠与羟甲基纤维素或羟乙基纤维素或羟丙基纤维素溶于去离子水中，配制成溶液，调节pH值10至12得碱性溶液；向碱性溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚，搅拌均匀于40℃～50℃反应；调节反应液pH值2至5，倒入模具中流延成型，干燥成膜。所制得的防粘连膜中透明质酸钠与羟甲基纤维素的质量比为1∶0.25～2。但是该防粘连膜中的羟甲基纤维素由于是外源性物质，生物相容性较差；透明质酸钠与羟甲基纤维素由于是两种不同物质，在体内的降解速度不同，不同时期透明质酸钠与羟甲基纤维素的组成比例都在变化，对人体的刺激较大。另一方面该专利未对防粘连膜中交联剂的残留量作限量规定，也未公开交联剂残留量的检测方法。

市场上已有类似进口的产品赛诺菲的防粘连薄膜Seprafilm^R是由透明质酸钠和羟甲基纤维素组成，与上述专利文献公开的产品类似，其产品同样存在上述问题。

中国专利文献CN 102558600 A（申请号 201110393380.6）公开了一种交联透明质酸海绵及其制备方法，将透明质酸原料溶胀于水中得到透明质酸胶液，加碱调节透明质酸胶液为碱性后，加入交联剂进行交联反应得到交联透明质酸凝胶；清洗所述交联透明质酸凝胶后经低温冷冻干燥得到交联透明质酸海绵。但是海绵的机械强度低导致使用时操作不便，无实际应用价值，更达不到工业化要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种交联透明质酸钠生物膜及其制备方法。

实现本发明第一目的的技术方案是一种交联透明质酸钠生物膜的制备方法，包括以下步骤：

①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）。

②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末。

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤2～6次。

⑤将步骤④经DMSO洗涤后的粉末用乙醇洗涤2～6次。

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶。

⑧向步骤⑦收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶。

⑨将步骤⑧收集的凝胶送入高速分散机中进行匀质微化处理，检测交联度。

⑩将步骤⑨匀质微化处理后经检测交联度达到60%～80%的凝胶冷冻干燥，冻干后的交联透明质酸钠压制成膜，得到交联透明质酸钠生物膜。

上述步骤⑨检测交联度时，称取匀质微化处理后的凝胶，与透明质酸酶液、PBS溶液一起装入玻璃试管中，在恒温水浴锅进行酶解反应直到体系澄清为止，然后灭活酶解结束；将酶解后的物料在离心机离心分离取上清液冷冻干燥，将上述冻干的酶解产物进行NMR检测；对交联透明质酸钠酶解产物的核磁1H-NMR图谱进行分析，以交联透明质酸残基的亚甲基（S₁）和透明质酸双扩基或残基的甲基（S₂）的峰面积的比例来计算交联度，交联透明质酸钠的交联度=3S₁/4S₂×100%。

上述步骤④用二甲基亚砜洗涤时，第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入DMSO直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与DMSO搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉DMSO完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的DMSO直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第3至第6次的洗涤操作同第一次。

上述步骤⑤用乙醇洗涤时，第一次洗涤时，向每30g经DMSO洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与无水乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉乙醇完成一次洗涤操作；后续第2次至第6次的洗涤操作同第一次。

上述步骤⑨匀质微化后的凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm；凝胶中交联剂DMSO的含量低于0.2ppm；凝胶中蛋白质浓度低于0.1%。

上述步骤⑨匀质微化后的凝胶中交联剂DMSO的残留量的检测采用毛细管气相色谱法测定。

实现本发明第二目的的技术方案是如上所述的方法制备的交联透明质酸钠生物膜。

本发明具有积极的效果：（1）本发明所制备的交联透明质酸钠生物膜无热原、无菌、无残留交联剂，并且细胞毒性低；在体内的停留时间较长，可以在整个纤维蛋白渗出期保持“屏障作用”，具有确切和有效防粘连效果，具有良好的生物相容性和组织修复性能，能够快速止血和吸收术后渗出液；交联透明质酸钠生物膜首先在体内降解为透明质酸钠，最后降解为二氧化碳和水，对人体无毒。

交联透明质酸钠生物膜是将交联透明质酸钠凝胶真空冻干后碾压成膜；本发明在制备交联透明质酸钠凝胶的过程中控制交联剂的含量低于2ppm，用DMSO洗涤除去交联透明质酸钠凝胶中可能生成的干扰蛋白质检测的“假蛋白”， 并且用毛细管气相色谱法检测确认制得的凝胶中不含DMSO，因此制得的凝胶质量更好，杂质含量更低，用该凝胶制得的生物膜杂质含量低，生物安全性高。

（2）在制备交联透明质酸钠生物膜的过程中，第二次冻干后溶胀、洗涤得到的凝胶送入匀质机中进行匀质微化处理，将小凝胶颗粒聚集成的不稳定的大凝胶颗粒分散，经过匀质处理的凝胶中凝胶颗粒大小更加均匀、粒径大小更稳定，消除小凝胶颗粒聚集成大颗粒及大颗粒分散成小颗粒的情况，冻干压制得到的生物膜经扫描电子显微镜检测，膜中粒径分布均匀，从而生物膜的表面各处吸水、粘附性能一致。

（3）本发明在制备得到交联透明质酸钠凝胶后，用核磁共振检测凝胶的交联度，不同交联度的交联透明质酸钠凝胶冻干压制得到的生物膜降解速率不同，本发明检测凝胶的交联度从而确定该批次的生物膜是否合格。

附图说明

图1为实施例1交联透明质酸钠生物膜的扫描电子显微照片。

图2为实施例1经过匀质处理后的凝胶的核磁共振H谱图。

图3为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的DMSO对照品溶液的气相色谱图；

图4为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的空白溶剂的气相色谱图；

图5为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的步骤⑨经过均质处理的交联透明质酸钠凝胶的气相色谱图。

具体实施方式

（实施例1）

本实施例所用试剂均为分析纯。

本实施例的交联透明质酸钠生物膜的制备方法包括以下步骤：

①向20g的白色透明质酸钠干粉中加入500mL的由10 wt%～20 wt%（本实施例中为15wt%）的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液，或者向500mL的由15wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中加入20g白色透明质酸钠干粉；所述透明质酸钠的平均分子量为50万～160万道尔顿（本实施例中为150万道尔顿）；搅拌使透明质酸钠均匀分散后获得透明质酸钠碱性混悬液，即透明质酸钠部分溶解于氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中，还有部分以固态形式存在；然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入11.1mL交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应。上述白色的透明质酸钠干粉的加入量控制在所述反应物料中，透明质酸钠的浓度为2wt%～5wt%。

在搅拌状态下将反应液于40℃保温5小时后反应结束，得到交联透明质酸钠。然后加入37wt%的浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7。

上述氢氧化钠水溶液和丙酮的混合溶液中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6），本实施例中为3∶7。所述透明质酸钠（CAS号：9067-32-7）来自鸡冠或者由细菌发酵而得。

②将步骤①反应后pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料中包括白色交联透明质酸钠粉末及透明的交联透明质酸钠凝胶，剩余物料用丙酮洗涤至气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测BDDE含量低于2ppm；然后将洗涤后的物料真空干燥获得交联透明质酸钠粉末。所用气相色谱-质谱联用仪为日本岛津公司的QP-2010型号气相色谱-质谱联用仪。

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过40目筛分离，收集过筛的粉末，未过筛的粉末由于其中可能包含具有粘性的杂质，弃之不用。

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜（以下简称DMSO）洗涤2～6次。

第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入DMSO直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与DMSO搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉DMSO完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的DMSO直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第二次洗涤的操作与第一次相同。若还需进行第3至6次洗涤操作，则重复上述步骤。每30g过筛粉末的DMSO洗涤过程总共消耗1.5L～5L的DMSO。本实施例的过筛粉末用DMSO洗涤4次，第四次洗涤时粉末沉降后倒掉DMSO，粉末待进一步处理。

⑤将步骤④经DMSO洗涤后的粉末用无水乙醇洗涤2～6次。

第一次洗涤时，向每30g经DMSO洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉无水乙醇完成一次洗涤操作，向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的无水乙醇直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第二次洗涤的操作与第一次相同。若还需进行第3至6次洗涤操作，则重复上述步骤。每30g经DMSO洗涤后的粉末的洗涤过程总共消耗1.5L～5L的无水乙醇。本实施例的粉末用乙醇洗涤4次，第四次洗涤时粉末沉降后倒掉无水乙醇，无水乙醇洗涤后的粉末待处理。

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入足量去离子水，交联透明质酸钠于室温25℃溶胀纯化8小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶，纯化过程中隔1小时更换去离子水。

加入去离子水后干粉吸水膨胀形成凝胶，去离子水的加入量应保证每次能完全没过干粉吸水溶胀后形成的凝胶。

⑧向步骤⑦收集的凝胶中加入3倍凝胶体积的等渗PBS缓冲液（每1000mL含有NaH₂PO₄·2H₂O 90mg，Na₂HPO₄·12H₂O 1.12g，NaCl 17g，其余为水），于室温25℃纯化8小时后，除去PBS，收集凝胶。

⑨将步骤⑧收集的凝胶送入IKA公司的T25数显型Ultra-turrax高速分散机中进行匀质微化处理。

匀质微化处理应用德国IKA的混合分散技术，为了达到更好的均质处理效果，增加使用剪切泵；处理时选用TM/2分散头，最高耐压16Bar（KD机械密封），最高耐温250℃。

匀质微化处理后的凝胶进行交联度检测，交联透明质酸钠的交联度在60%～80%，可进行下一步的处理。

交联度的检测采用核磁共振法检测，具体包括以下步骤：

在恒温水浴锅内水位合理的情况下，打开恒温水浴锅设置温度37开始加热。

称取匀质微化处理后的凝胶0.5g，10u/mL的透明质酸酶液1.25mL，PBS溶液0.75mL，将上述三种物质加入到10mL玻璃试管中，做三个平行样。

将装有三种物质的玻璃试管放入试管架中并放入恒温水浴锅，进行酶解反应37度，直到体系澄清为止，然后沸水浴30分钟高温灭活，酶解结束。

将酶解后的物料在离心机离心分离15至20分钟，转速10000转/分，取上清液冷冻干燥。冷冻干燥时先将上清液转移到培养皿中再冷冻柜预冻，预冻后的产品在深度冷冻-78℃～-80℃冷冻干燥24至48小时。

将上述冻干的酶解产物进行NMR检测。

核磁氢谱测试参数如下：脉冲序列：zg30  ； 扫描次数NS : 1024  ；空扫次数DS : 0 ；  峰宽SW : 20.023 ppm   ； O1P : 6.175ppm  ；采集时间AQ : 5.5 s ； SF : 300.13 MHz ；  弛豫时间D1 : 1.0 s  ； PW : 14.5μs。

核磁碳谱测试参数如下：脉冲序列: zgpg30  NS : 40960   DS : 0   SW : 238.871 ppm  O1P : 99.989 ppm  AQ : 1.818 s  SF : 75.468 MHz   D1 : 2.0 s   PW : 9.5 μs  LB : 1 Hz  RD : 2.0 s。

H-H COSY:  NS : 128  DS : 16  SW(F1) = SW(F2): 13.349 ppm   O1P(F1) = O1P(F2) : 6.012 ppm   AQ(F1) : 0.256 s  AQ(F2) : 0.0160 s   SF : 300.13 MHz  D1 : 2.0 s   PW : 14.5 μs。

对交联透明质酸钠酶解产物的核磁1H-NMR图谱进行分析计算出交联度。以交联透明质酸残基的亚甲基（S1）和透明质酸双扩基或残基的甲基（S2）的峰面积的比例来计算交联度。交联透明质酸钠的交联度=3S₁/4S₂×100%。

见图2，交联透明质酸残基的亚甲基出现在4.2ppm，透明质酸残基的甲基出现在1.85ppm。

本实施例的交联透明质酸钠的交联度=3*2.0/4*2.32=65%。

不同交联度的交联透明质酸钠凝胶冻干压制得到的生物膜降解速率不同，本发明要求交联透明质酸钠的交联度为60%～80%，符合上述范围的交联透明质酸钠凝胶进行下一步处理。

⑩将步骤⑨匀质微化处理后经检测交联度达到要求的凝胶在-25℃预冷冻24小时后，再在-78℃～-80℃深度冷冻干燥24至48小时。预冻温度低于交联透明质酸钠的共晶点。

冻干后的交联透明质酸钠转移至三辊研磨机中压制成膜，得到交联透明质酸钠生物膜，交联透明质酸钠生物膜的厚度为0.2mm～1mm，将其进行裁切、包装后灭菌得到可临床使用的成品。

本实施例所制得的交联透明质酸钠生物膜的扫描电子显微照片见图1，由图1可见生物膜中各处粒径分布均匀，从而生物膜的表面各处吸水、粘附性能一致。

为了了解制备的交联透明质酸钠生物膜的性质，按照以下方法对生物膜进行检测：

1、耐酶性检测。取0.5g待测交联透明质酸钠生物膜，向其加入1.25mL浓度为10U/mL的透明质酸酶溶液后加pH为7.2的PBS至体积为2.5mL，于37℃酶解24小时；用离心机以10000rpm离心40分钟，取上清液，按照上述离心方法再离心分离两次，每次都取上清液，合并上清液。采用改良咔陛显色法（参考文献：Bitter .T，Muir H.M，(1962) A modified uronic acid carbarbazole reation .Anal.Biochem.4,330-333.）测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为透明质酸钠含量，作为a值，以凝胶中透明质酸钠含量c即2.05%为b值，计算a/b。

本实施例交联透明质酸钠生物膜按照上述方法，a/b=0.21。

2、细胞毒性检测。

根据GB/T16886国家标准，交联透明质酸钠作为国家三类医疗器械进行体外细胞毒性测试。

先将待测交联透明质酸钠生物膜与RPMI1640培养液按0.2g/mL混合，置于37℃，5%二氧化碳孵箱中浸提72小时，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到浸提液。

然后将1*105个/mL的L929细胞悬浮液接种于96孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时；待细胞贴壁生长后，去除上清液，分成空白对照组和实验组两组，对照组加入RPMI1640培养液，实验组用含50%上述浸提液的RPMI1640培养液进行交换。分别置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养，于2天后取出，培养板每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，于37℃继续培养4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入200μL DMSO，振荡10分钟混匀后，用酶联免疫检测仪在630nm下分别测定其吸光度值。

根据下面的公式计算细胞相对增值率（RCR），RCR（%）=（实验组平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值）*100%。

细胞相对增值率与细胞毒性分级关系如下：RCR不小于100%，细胞毒性分级为0级；RCR为75-99%，细胞毒性分级为1级；RCR为50-74%, 细胞毒性分级为2级；RCR为25-49%，细胞毒性分级为3级；RCR为1-24%，细胞毒性分级为4级；RCR为0%, 细胞毒性分级为5级。

本实施例的交联透明质酸钠生物膜按照上述方法，RCR为85%，细胞毒性低。

3、生物膜中交联剂DMSO残留量的检测。

采用毛细管气相色谱法测定步骤⑨交联透明质酸钠凝胶中DMSO的残留量，测定凝胶中DMSO的残留量也即测定了生物膜中的残留量。

具体包括以下步骤：

①对照品溶液的制备。用电子天平称取二甲基亚砜53.57mg，用无水乙醇溶解并定量稀释制成1mL中含二甲基亚砜1.0714mg的溶液，作为对照品储备液。用移液管量取对照品储备液0.2mL至10mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度作为对照品溶液。

②供试品溶液的制备。

用电子天平称取待测凝胶1.0g，转移至5mL量瓶中，加入无水乙醇并稀释至刻度，漩涡混合器混合，凝胶变成絮状沉淀，然后再超声20分钟，取上清液，用0.45μm针头过滤器过滤后作为供试品溶液。

③系统适应性试验。

色谱条件：色谱柱：SE-30毛细管柱（50m×0.53mm×3.0μm）；柱流速：4mL/min，载气：氮气；柱温：150℃；进样口温度：210℃；FID检测器温度：230℃；进样量：1μL。

取DMSO对照品溶液，在上述色谱条件下进样，DMSO对照品溶液的气相色谱图见图3，其中4至5之间出现的峰即为DMSO的色谱峰（空白溶剂的气相色谱图见图4）；DMSO的理论塔板数为32437，空白溶剂污水乙醇对测定无干扰。

④重现性试验。将DMSO对照品溶液在系统适应性试验的色谱条件下进样测定6次，DMSO峰面积的RSD为2.2%（n=6）。

⑤线性关系考察。

用移液管量取对照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、1.0mL，分别转移至10mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度，DMSO的浓度分别为2.1428、4.2856、6.4284、8.5712、10.714、21.428、107.140μg/mL，连同对照品溶液（DMSO浓度1071.4μg/mL），在系统适应性试验的色谱条件下进行测定，记录色谱图，以色谱峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得DMSO的线性回归方程为：Y=4919.1X-6413.1（r=1）。DMSO在2.1428～1071.4μg/mL浓度范围内线性关系良好。

⑥定量限与检测限。逐步稀释对照品溶液，在系统适应性试验的色谱条件下进样，当信噪比为10∶1时，定量限为0.5μg/mL；当信噪比为3∶1时，检测限为0.2μg/mL。

⑦DMSO回收率实验。取9份待测凝胶，每份1.0g，分别转移至5mL量瓶中；向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液0.8mL，向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液1.0mL，向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液1.2mL；然后分别用无水乙醇稀释至刻度，漩涡混合器混合后超声20分钟，取上清液，用0.45μm针头过滤器过滤，作为回收率供试品溶液。分别取对照品溶液与回收率供试品溶液，在上述色谱条件下以外标法进行测定，结果平均回收率为100.99%，RSD为4.1%（n=9）。

具体数据如下：

  交联透明质酸钠凝胶在水中不溶，但在无水乙醇中能完全析出。无水乙醇不会溶解样品，但能完全溶解DMSO，所以采用无水乙醇作为溶剂。为了更好的将待测凝胶中可能存在的DMSO溶出，采用了无水乙醇与待测凝胶样品漩涡混合并超声的处理方式。用上述检测方法DMSO与凝胶能得到很好的分离，峰面积与质量浓度线性关系良好，回收率良好，因此上述检测方法可用于交联透明质酸钠凝胶中DMSO残留量的检测。

⑧取步骤⑨经过均质处理的交联透明质酸钠凝胶，按照步骤②制备成供试品，按照系统适应性试验的色谱条件下进样检测，气相色谱图见图5，步骤⑨经过均质处理的交联透明质酸钠凝胶中未检出DMSO。

4、体内降解实验。

实验方法：按照国家GB 16866系列标准的方法，将生物膜用PBS溶胀恢复凝胶状后皮下注射至实验鼠中观察降解情况。

实验结果：在皮下注射后4、26、52和104周后进行肉眼观察，植入部位在所有时间点周围组织都反应良好。

1）、在第4周所注射的凝胶体积无变化。

2）、在第26周注射的凝胶体积减少1/4，老鼠肌肉中的胶原纤维紧紧地植入凝胶中。

3）、在第52周注射的凝胶体积稍比第26周减少，部分鼠中体积降低至1/2，胶原纤维缠绕较26周时变松。

4）、在第104周时，植入物完全被吸收，在植入点周围可以用显微镜观察到胶原纤维增生。

5、止血实验。

实验方法：实验组和空白对照组各取5组平行例，在小白鼠的后肢创造2cm×1cm大小的出血创面。实验组分别用实施例1制得的生物膜覆压止血，记录止血时间。空白对照组记录小白鼠的创面不用任何止血材料所需的止血时间。

实验结果：实验组的平均止血时间为29秒；空白对照组的平均止血时间为52秒。

6、防粘连实验。

实验方法：实验动物为SD大鼠，体重220±40g，雌雄不分，每组动物10只。实验动物均使用2%无巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，麻醉后开腹手术，逐层切开，暴露腹腔，距回肠部5cm处选取3cm回肠段，用干纱布来回摩擦20次，肠管充血并有点状出血点，空白对照组不加任何材料直接关腹，实验组在摩擦部位放置3cm×2cm的生物膜轻轻按压后关腹。各组在相同条件下饲养，术后三周处死全部动物。

参照粘连等级分级法，腹腔内粘连情况进行评定分级。粘连等级分级法具体为：0级无粘连，回肠浆膜面完全修复；Ⅰ级仅疏松少量粘连，易分离，无渗血，回肠浆膜大部修复；Ⅱ级粘连较Ⅰ级略密，分离时渗血，回肠浆膜修复一半左右；Ⅲ级粘膜连成团状或与其他脏器广泛粘连，但无梗阻，回肠浆膜少部分修复；Ⅳ级粘连广泛，致密，有肠梗阻，近端肠管扩张明显。

实验结果：实验组中有7只无粘连，3只Ⅰ级粘连。

          空白对照组1只Ⅰ级粘连，3只Ⅱ级粘连，6只Ⅲ级粘连。

Claims (7)

1.一种交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）；

②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末；

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤2～6次；

⑤将步骤④经DMSO洗涤后的粉末用乙醇洗涤2～6次；

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶；

⑧向步骤⑦收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；

⑨将步骤⑧收集的凝胶送入高速分散机中进行匀质微化处理，检测交联度；

⑩将步骤⑨匀质微化处理后经检测交联度达到60%～80%的凝胶冷冻干燥，冻干后的交联透明质酸钠压制成膜，得到交联透明质酸钠生物膜。

2.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：步骤⑨检测交联度时，称取匀质微化处理后的凝胶，与透明质酸酶液、PBS溶液一起装入玻璃试管中，在恒温水浴锅进行酶解反应直到体系澄清为止，然后灭活酶解结束；将酶解后的物料在离心机离心分离取上清液冷冻干燥，将上述冻干的酶解产物进行NMR检测；对交联透明质酸钠酶解产物的核磁1H-NMR图谱进行分析，以交联透明质酸残基的亚甲基（S₁）和透明质酸双扩基或残基的甲基（S₂）的峰面积的比例来计算交联度，交联透明质酸钠的交联度=3S₁/4S₂×100%。

3.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：步骤④用二甲基亚砜洗涤时，第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入DMSO直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与DMSO搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉DMSO完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的DMSO直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第3至第6次的洗涤操作同第一次。

4.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：步骤⑤用乙醇洗涤时，第一次洗涤时，向每30g经DMSO洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与无水乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉乙醇完成一次洗涤操作；后续第2次至第6次的洗涤操作同第一次。

5.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：步骤⑨匀质微化后的凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm；凝胶中交联剂DMSO的含量低于0.2ppm；凝胶中蛋白质浓度低于0.1%。

6.根据权利要求5所述的交联透明质酸钠生物膜的制备方法，其特征在于：步骤⑨匀质微化后的凝胶中交联剂DMSO的残留量的检测采用毛细管气相色谱法测定。

7.一种如权利要求1所述的方法制备的交联透明质酸钠生物膜。