DE68928754T2

DE68928754T2 - Kollagen-polymer-konjugate

Info

Publication number: DE68928754T2
Application number: DE68928754T
Authority: DE
Inventors: Hanne Newark Ca 94560 Bentz; Ramon A. Jr. Fremont Ca 94539 Burns; Frank Belmont Ca 94002 Delustro; Louis Los Altos Ca 94002 Fries; Alan S. Chestnut Hill Massachusetts 02167 Michaels; Woonza Palo Alto Ca 94306 Rhee; Donald G. Menla Park Ca 94025 Wallace
Original assignee: Cohesion Technologies Inc
Current assignee: Angiodevice International GmbH
Priority date: 1988-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1999-01-14
Anticipated expiration: 2009-11-22
Also published as: JP2505312B2; US5550188A; JPH04502027A; US5292802A; CA2003538A1; DE68928754D1; EP0444157B1; CA2003538C; US5324775A; US5308889A; WO1990005755A1; US5446091A; EP0444157A4; AU4660989A; US5162430A; EP0444157A1; US5328955A; AU638687B2; US5413791A; ES2119743T3

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft Proteine und chemisch modifizierte Proteine. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Collagen, das durch Konjugation mit synthetischen hydrophilen Polymeren modifiziert worden ist.

Hintergrund der Erfindung

Collagen ist die hauptsächliche Proteinkomponente von Knochen, Knorpel, Haut und Bindegewebe in Tieren. Collagen ist in seiner nativen Form typischerweise ein starres, stabförmiges Molekül von etwa 300 nm Länge und 1,5 nm Durchmesser. Es ist aus drei Collagen-Polypeptiden aufgebaut, welche eine feste bzw. enge Tripelhelix bilden. Die Collagen-Polypeptide sind durch einen langen Mittelabschnitt gekennzeichnet, der die sich wiederholende Sequenz - Gly-X-Y- aufweist, wobei X und Y oft Prolin oder Hydroxyprolin sind, an jedem Ende begrenzt durch die "Telopeptid"-Regionen, welche weniger als etwa 5% des Moleküls ausmachen. Die Telopeptidregionen der Collagenketten sind typischerweise verantwortlich für die Quervernetzung zwischen den Ketten und für die Immunogenität des Proteins. Collagen tritt in mehreren "Typen" auf, die verschiedene physikalische Eigenschaften besitzen. Die häufigsten Typen sind die Typen I-III.
Collagen wird typischerweise aus natürlichen Quellen isoliert, wie aus Rinderhaut, Knorpel oder Knochen. Knochen werden gewöhnlich getrocknet, entfettet, zerkleinert und entmineralisiert, um Collagen zu extrahieren, während Haut und Knorpel gewöhnlich zerhackt und mit (von Collagenase verschiedenen) proteolytischen Enzymen verdaut werden. Da Collagen gegenüber den meisten proteolytischen Enzymen beständig ist, dient dieses Vorgehen zweckmäßigerweise zur Entfernung des Großteils des kontaminierenden Proteins, das mit Collagen anzutreffen ist.
Collagen kann durch Kochen denaturiert werden, wodurch das bekannte Produkt Gelatine hergestellt wird.
Daniels et al., U. S. -Patent Nr. 3 949 073, beschrieben die Herstellung von löslichem Collagen durch Auflösen von Gewebe in wäßriger Säure, gefolgt von enzymatischem Verdau. Das resultierende Atelopeptid-Collagen ist löslich und wesentlich weniger immunogen als nicht-modifiziertes Collagen. Es kann in geeignete Stellen eines Subjektes mit einem Fibrillenbildungs-Promotor (in dem Patent beschrieben als ein Polymerisierungs-Promotor) injiziert werden, um in situ fibrilläre Collagenimplantate zur Vermehrung von hartem oder weichem Gewebe zu bilden. Dieses Material ist jetzt im Handel von Collagen Corporation (Palo Alto, CA) unter dem Warenzeichen Zyderm®-Collagen-Implantat erhältlich.
Luck et al., U. S. -Patent-Nr. 4 488 911, beschrieben ein Verfahren zur Herstellung von Collagen in Lösung (CIS), wobei natives Collagen aus tierischem Gewebe in verdünnter wäßriger Säure extrahiert wird, gefolgt von einem Verdau mit einem Enzym, wie Pepsin, Trypsin oder Pronase®. Der Enzym-Verdau entfernt die Telopeptid-Anteile der Collagenmoleküle, wodurch "Atelopeptid"-Collagen in Lösung bereitgestellt wird. Das so hergestellte Atelopeptid-CIS ist im wesentlichen nicht-immunogen und ist auch, wegen dem Verlust der hauptsächlichen Quervernetzungsregionen, im wesentlichen nicht-quervernetzt. Das CIS kann danach durch Dialyse in einer gemäßigten Scher-Umgebung gefällt werden, um Collagenfasern herzustellen, welche nativen Collagenfasern ähneln. Die gefällten, rekonstituierten Fasern können zusätzlich unter Verwendung eines chemischen Mittels (zum Beispiel Aldhyde, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd) oder unter Verwendung von Wärme oder Strahlung quervernetzt werden. Die resultierenden Produkte sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und verminderten Immunogenität geeignet zur Verwendung in medizinischen Implantaten.
Wallace et al., U. S. -Patent Nr. 4 424 208, offenbarten eine verbesserte Collagenformulierung, die geeignet zur Verwendung bei der Vermehrung von weichem Gewebe ist. Die Formulierung von Wallace umfaßt rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptid-Collagen (zum Beispiel Zyderna®-Collagen) in Kombination mit teilchenförmigem quervernetzten Atelopeptid-Collagen, dispergiert in einem wäßrigen Medium. Die Zugabe von teilchenförmigem quervernetzten Collagen verbessert die Beständigkeit des Implantats oder das Vermögen, einer Schrumpfung im Anschluß an die Implantation zu widerstehen.
Smestad et al., U. S. -Patent Nr. 4 582 640, offenbarten eine mit Glutaraldehyd quervernetzte Atelopeptid-CIS-Präparation (GAX), die zur Verwendung in medizinischen Implantaten geeignet ist. Das Collagen wird unter Bedingungen quervernetzt, welche die intrafibrilläre Bindung eher als die interfibrilläre Bindung begünstigen, und stellt ein Produkt mit höherer Beständigkeit als nicht-quervernetztes Atelopeptid-Collagen zur Verfügung und ist im Handel von Collagen Corporation unter dem Warenzeichen Zyplast®-Implantat erhältlich.
Nguyen et al., U. S. -Patent Nr. 4 642 117, beschrieb ein Verfahren zur Verminderung der Viskosität von Atelopeptid-CIS durch mechanische Scherung. Rekonstituierte Collagenfasern werden durch ein feinmaschiges Sieb hindurchgelassen, bis die Viskosität auf einen für Injektion praktischen Wert verringert ist.
Nathan et al., U. S. -Patent Nr. 4 563 350, beschrieben osteoinduktive Knochenreparatur-Zusammensetzungen, umfassend einen osteoinduktiven Faktor, mindestens 5% nicht- rekonstituiertes (afibrilläres) Collagen, und den Rest aus rekonstituiertem Collagen und/oder Mineralpulver (z. B. Hydroxyapatit). CIS kann für das nicht-rekonstituierte Collagen verwendet werden, und Zyderm®-Collagenimplantat (ZCI) wird für die rekonstituierte Collagenkomponente bevorzugt. Das Material wird in Knochendefekte oder -brüche implantiert, um das Einwachsen von Osteoklasten zu beschleunigen und neues Knochenwachstum zu fördern.
Chu, U. S. -Patent Nr. 4 557 764, beschrieb ein "Zweit-Nukleations"-Collagenpräzipitat, welches eine gewünschte Geschmeidigkeit und eine Kittähnliche Konsistenz aufzeigt.
Collagen wird in Lösung bereitgestellt (z. B. bei 2-4 mg/ml), und ein "Erst-Nukleationsprodukt" wird durch rasche Titration und Zentrifugation gefällt. Der verbleibende Überstand (welcher die Hauptmasse des ursprünglichen Collagens enthält) wird danach dekantiert und über Nacht stehen gelassen. Das präzipitierte zweite Nukleationsprodukt wird durch Zentrifugation abgesammelt.
Chu, U. S. -Patent Nr. 4 689 399, offenbarte eine Collagen-Membranpräparation, welche durch Komprimieren und Trocknen eines Collagengels hergestellt wird. Das resultiernde Produkt besitzt eine hohe Zugfestigkeit.
J. A. M. Ramshaw et al., Anal Biochem (1984), 141 : 361-65, und PCT-Anmeldung WO87/04078, offenbaren die Präzipitation von Rindercollagen (Typen I, II und III) aus wäßrigen PEG-Lösungen, wobei keine Bindung zwischen Collagen und PEG vorliegt.
Werner, U. S. -Patent Nr. 4 357 274, beschrieb ein Verfahren zur Verbesserung der Haltbarkeit von Skleroprotein (z. B. Gehirn-Meningen) durch einige Stunden langes Einweichen des entfetteten Gewebes in H&sub2;O2 oder PEG vor der Lyophilisierung. Das resultierende modifizierte Gesamtgewebe zeigt eine gesteigerte Beständigkeit.
Hiroyoshi, U. S. -Patent Nr. 4 678 468, offenbarte die Herstellung von Polysiloxanpolymeren mit einem durchsetzenden Netzwerk aus wasserlöslichem Polymer, welches darin verteilt ist. Das wasserlösliche Polymer kann ein Collagenderivat sein, und das Polymer kann zusätzlich Heparin einschließen. Die Polymere werden zu künstlichen Blutgefäß-Implantaten geformt und sind zur Verhinderung von Gerinnung entworfen.
Andere Patente offenbaren die Verwendung von Collagenpräparationen mit Knochenfragmenten oder -mineralien. Zum Beispiel beschrieben Miyata et al., U. S. -Patent Nr. 4 314 380, ein Knochenimplantat, das durch Backen von Tierknochensegmenten und Einweichen der gebackenen Segmente in einer Lösung von Atelopeptid-Collagen hergestellt wird. Deibig et al., U. S. -Patent Nr. 4 192 021, beschrieben ein Implantatmaterial, welches pulverisiertes Calciumphosphat in einer pastenartigen Formulierung mit einem bioabbaubaren Polymer (welches Collagen sein kann) umfaßt. Auf dem Fachgebiet gibt es mehrere Bezugnahmen auf Proteine, die durch kovalente Konjugation an Polymere modifiziert sind, um die Löslichkeit, Antigenität und biologische Clearance des Proteins zu verändern. Zum Beispiel offenbarte das U. S. -Patent Nr. 4 261 973 die Konjugation mehrerer Allergene an PEG oder PPG (Polypropylenglykol), um die Immunogenität des Proteins zu verringern. Das U. S. -Patent Nr. 4 301 144 offenbarte die Konjugation von Hämoglobin mit PEG und anderen Polymeren, um das Sauerstoff-Tragevermögen des Proteins zu steigern. Die EPO 98 110 offenbarte, daß die Kopplung eines Enzyms oder Interferons an ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen (POE- POP)-Blockpolymer die Halbwertszeit des Proteins in Serum steigert. Das U. S. -Patent Nr. 4 179 337 offenbarte, daß die Konjugation von hydrophilen Enzymen und Insulin an PEG oder PPG die Immunogenität verringert. Davis et al., Lancet (1981) 2 : 281-83, offenbarten, daß das Enzym Urikase, modifiziert durch Konjugation mit PEG, den Harnsäure-Stoffwechsel in Serum bei einer langen Halbwertszeit und niedriger Immunogenität vorsieht. Nishida et al., J. Pharm Pharmacol (1984) 36 : 354-55, offenbarten oral an Hühner verabreichte PEG-Urikase- Konjugate, wobei verminderte Serumspiegel an Harnsäure aufgezeigt wurden. Inada et al., Biochem & Biophys Res Comm (1984) 122 : 845-50 offenbarten, daß Lipoprotein-Lipase- Konjugation mit PEG diese in organischen Lösungsmitteln löslich machen. Takahashi et al., Biochem & Biophys Res Comm (1984) 121 : 261-65, offenbarten, daß die Konjugation von HRP mit PEG das Enzym in Benzol löslich macht. Abuchowski et al., Cancer Biochem Biophys (1984) 7 : 175-86, offenbarten, daß Enzyme, wie Asparaginase, Katalase, Urikase, Arginase, Trypsin, Superoxiddismutase, Adenosindesaminase, Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, und dergleichen, konjugiert mit PEG, in Serum eine längere Halbwertszeit und eine verminderte Immunogenität aufzeigen. Allerdings sind diese Bezugsstellen im wesentlichen mit der Modifizierung der Löslichkeit und biologischer Merkmale von Proteinen beschäftigt, welche in geringen Konzentrationen in wäßriger Lösung verabreicht werden.
M. Chvapil et al., J. Biomed. Mater Res. (1969) 3: 315-32, offenbarten eine Zusammensetzung, welche hergestellt wird aus Collagenschwamm und einem quervernetzten Ethylenglykol-Monomethacrylat-Ethylenglykol-Dimethacrylat-Hydrogel. Der Collagenschwamm wurde durch Lyophilisieren eines wäßrigen Gemisches aus Rinderhaut-Collagen und Methylglyoxal (einem Gerbmittel) hergestellt. Die Schwamm-Hydrogel-Zusammensetzung wurde durch Polymerisieren von Ethylenglykol-Monomethacrylat und Ethylenglykol- Dimethacrylat in dem Schwamm hergestellt.
Lloyd et al., Journal of Polymer Science, Polymerchemie-Ausgabe, Bd. 17 : 3 473- 3 483 (1979), beziehen sich auf die Kopplung von Collagen, und dessen denaturiertem Gegenstück Gelatine, an Acrylpolymere unter Verwendung eines Carbodiimides.
Die WO-A-87/04078 betrifft die Verwendung eines wasserlöslichen Polymeren zur Fällung, aus einer wäßrigen Lösung, von Collagen in taktoider Form.

Beschreibung der Erfindung

Wir haben festgestellt, daß Formulierungen mit rekonstituiertem fibrillären Atelopeptid- Collagen in Kombination mit teilchenförmigen Mineralkomponenten (nützlich z. B. zur Behandlung von Knochendefekten und -brüchen) mit der Zeit eine physikalische Instabilität aufzeigen und dazu neigen, sich in mehrere Phasen oder Schichten aufzutrennen. Ferner sind die Handhabungsmerkmale derartiger Zusammensetzungen nicht ideal, und die Geschmeidigkeit und Elastizität derartiger Formulierungen könnte verbessert werden.
Wir haben nun ein neues Collagen/Polymer-Konjugat erfunden, welches überlegene Merkmale hinsichtlich der Handhabung und chemischen Stabilität aufweist. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat vorgesehen, umfassend ein nicht- toxisches, nicht zu Entzündungen führendes (bei subkutaner Verabreichung), im wesentlichen wasserlösliches synthetisches hydrophiles Polymermolekül, das kovalent an einen verfügbaren Lysinrest von Atelopeptid-Collagen gebunden ist.
Das Polymer kann monofunktionell oder polyfunktionell sein, und es besitzt ein Ende, das in der Lage zur Anbindung ist, oder zwei oder mehr Enden, die fähig zur Anbindung sind. Wenn das Polymer polyfunktionell ist, kann es über ein oder mehrere Enden an Collagen geknüpft sein, d. h. das Polymer kann Collagenmoleküle quervernetzen. Die Collagen/Polymer- Konjugate können verwendet werden, um weiches Gewebe zu ersetzen oder zu verstärken, und können in Kombination mit einem geeigneten teilchenförmigen Material verwendet werden, um Knochendefekte zu behandeln. Diese Materialien sind ebenfalls zur Beschichtung von Implantaten (wie Katheter und Knochenimplantate) nützlich, um Immunogenität und Fremdkörper-Reaktionen zu verringern. Getrocknete Collagen/Polymer-Konjugate, in eine membranartige Form gegossen, können verwendet werden, um beschädigte Haut (z. B. verbrannte Haut), Nervenscheiden, Blutgefäße, Herzklappen, ophthalmische Schilde und Hornhautlinsen zu ersetzen oder zu reparieren. Diese Formen können auch in zahnmedizinischen Anwendungen verwendet werden (z. B. für die gerichtete Geweberegeneration).
Die Vernetzungsreaktion zwischen dem Collagen und dem Polymeren kann in vitro durchgeführt werden, oder ein Reaktionsgemisch kann zur Vernetzung in situ injiziert werden. Bei ausreichender Dichte ähneln vernetzte Collagen/Polymer-Konjugate einem Knorpel und sind als Substitute dafür verwendbar (z. B. Schädel-Abdeckung bzw. -Onlay, Ohren- und Nasenrekonstruktion und dergleichen). Polyfunktionellle Polymeren können auch verwendet werden, um Collagenmoleküle an andere Proteine (z. B. Glykosaminoglykane, Chondroitinsulfate, Fibronectin und dergleichen), insbesondere Wachstumsfaktoren, zu vernetzen, und zwar für Zusammensetzungen, die besonders für Wundheilung, Osteogenese und Immunmodulation geeignet sind. Eine derartige Anbindung von Wachstumsfaktoren an Collagenmoleküle stellt ein effektives Arzneimittelabgabesystem mit langsamer Freisetzung zur Verfügung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt die Kraft, die notwendig ist, um drei Zusammensetzungen zu extrudieren: Zydem®-Collagenimplantat (ZCI), ein Glutaraldehyd-quervernetztes Collagen (GAX) und ein Collagen/PEG-Konjugat der Erfindung.
Die Fig. 2 veranschaulicht die Ergebnisse des im Beispiel 6E durchgeführten Experimentes, wobei die Zurückhaltung von biologisch aktivem TGF-β 1 in einer quervernetzten Collagen/dPEG-Zusammensetzung gezeigt wird.

Arten zur Ausführung der Erfindung

A. Definitionen

Der Begriff "Collagen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf alle Formen von Collagen, einschließlich denjenigen, welche verarbeitet oder anderweitig modifiziert worden sind. Collagene für ein Konjugat der vorliegenden Erfindung werden behandelt worden sein, um die immunogenen Telopeptid-Regionen zu entfernen ("Atelopeptid-Collagen"). Sie können zu einer fibrillären Form rekonstituiert worden sein. Typ I-Collagen ist für die meisten Anwendungen, einschließlich Knochen- oder Knorpelreparatur, am besten geeignet. Allerdings sind andere Formen von Collagen bei der Ausübung der Erfindung ebenfalls nützlich und werden hier nicht aus der Betrachtung ausgeschlossen. Unter Verwendung von Wärme, Strahlung oder chemischen Mitteln, wie Glutaraldehyd, vernetztes Collagen kann mit Polymeren konjugiert werden, wie hierin beschrieben, um besonders starre Zusammensetzungen zu bilden. Unter Verwendung von Glutaraldehyd oder anderen (nicht-polymeren) Verknüpfungsmitteln vernetztes Collagen wird hierin als "GAX" bezeichnet, wohingegen Collagen, das unter Verwendung von Wärme und/oder Strahlung quervernetzt worden ist, als "HRX" bezeichnet wird.
Der Begriff "synthetisches hydrophiles Polymer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein synthetisches Polymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht und einer Zusammensetzung, welche das Polymer im wesentlichen wasserlöslich machen. Die meisten hydrophilen Polymere erreichen diese Eigenschaft durch Einbinden einer ausreichenden Anzahl von Sauerstoffatomen (oder weniger häufig Stickstoffatomen), welche zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken in wäßriger Lösung verfügbar sind. Hierin verwendete hydrophile Polymere werden im allgemeinen Polyoxyethylen, Polyethylenglykol, Polymethylenglykol, Polytrimethylenglykole, Polyvinylpyrrolidone oder Derivate davon sein. Die Polymere sind bevorzugt linear oder nur leicht verzweigt (d. h. sie haben nur etwa 2-10 signifikante freie Enden) und werden im wesentlichen nicht-vernetzt sein. Andere geeignete Polymere schließen Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere und -Copolymere ein. Polyoxyethylen- Polyoxypropylen-Blockpolymere mit einem Ethylendiamin-Kern (und daher mit vier Enden) sind ebenfalls erhältlich und können bei der Ausübung der Erfindung verwendet werden. Natürlich vorkommende Polymere, wie Proteine, Stärke, Cellulose, Heparin, sind vom Umfang dieser Erfindung ausdrücklich ausgeschlossen. Alle geeigneten Polymer werden nicht-toxisch und nicht zu Entzündungen führend sein, wenn sie subkutan verabreicht werden, und werden vorzugsweise in vivo über eine Zeitdauer von mindestens einigen Monaten im wesentlichen nicht-abbaubar sein. Das hydrophile Polymer kann die Hydrophilizität des Collagens erhöhen, macht dieses aber nicht wasserlöslich. Vorliegend bevorzugte hydrophile Polymere sind mono- und difunktionelle Polyethylenglykole (PEG). Monofunktionelles PEG besitzt nur eine reaktive Hydroxylgruppe, wohingegen difunktionelles PEG vorzugsweise reaktive Gruppen an jedem Ende aufweist. Monofunktionelles PEG besitzt vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 300 und 15 000, weiter bevorzugt zwischen 1 900 und 8 000, und am stärksten bevorzugt etwa 5 000. Difunktionelles PEG besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von 400 bis 20 000, weiter bevorzugt von 3 000 bis 10 000. PEG kann durch Bilden eines Alkylenethers an einem Ende monofunktionell gemacht werden. Der Alkylenether kann jeder geeignete Alkoxyrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen sein, zum Beispiel Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 2-Propoxy, Butoxy und Hexyloxy. Methoxy wird derzeit bevorzugt. Difunktionelles PEG wird durch Gestatten einer reaktiven Hydroxylgruppe an jedem Ende des linearen Moleküls vorgesehen. Die reaktiven Gruppen befinden sich vorzugsweise an den Enden des Polymeren, können jedoch entlang der Länge davon vorgesehen sein. Polyfunktionelle Moleküle sind fähig zur Quervernetzung der Zusammensetzungen der Erfindung, und können verwendet werden, um biologische Wachstumsfaktoren an Collagen anzuheften.
Der Begriff "chemisch konjugiert", wie hierin verwendet, bedeutet über eine kovalente chemische Bindung angebunden. Bei der Ausübung der Erfindung können ein synthetisches hydrophiles Polymer und Collagen unter Verwendung eines Verknüpfungsrestes chemisch so konjugiert werden, daß das Polymer und Collagen jeweils an den Rest geknüpft sind, aber nicht direkt aneinander. Der Begriff "Collagen/Polymer" bezieht sich auf Collagen, das chemisch an ein synthetisches hydrophiles Polymer konjugiert ist, innerhalb der Bedeutung dieser Erfindung. Somit bezeichnet "Collagen/PEG" (oder "PEG/Collagen") eine Zusammensetzung der Erfindung, wobei Collagen chemisch an PEG konjugiert ist. "Collagen-dPEG" bezieht sich auf Collagen, das chemisch an difunktionelles PEG konjugiert ist, wobei die Collagenmoleküle typischerweise vernetzt sind. "Vernetztes Collagen" bezieht sich auf Collagen, worin Collagenmoleküle durch kovalente Bindungen mit polyfunktionellen (einschließlich difunktionellen) Polymeren verknüpft sind. Begriffe, wie "GAX-dPEG" und "HRX-dPEG" deuten auf Collagen hin, das vernetzt ist sowohl durch ein difunktionelles hydrophiles Polymer als auch ein Vernetzungsmittel, wie Glutaraldehyd oder Wärme.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, daß synthetische Polymeren, wie Polyethylenglykol, in der Praxis nicht mit exakten Molekulargewichten hergestellt werden können, und daß der Begriff "Molekulargewicht", wie hierin verwendet, das durchschnittliche Molekulargewicht einer Anzahl von Molekülen in jedweder gegebenen Probe bezeichnet, wie üblicherweise im Fachgebiet verwendet. Somit kann eine Probe von PEG 2000 Polymermoleküle im Gewichtsbereich von, zum Beispiel, 1 200 bis 2 500 Dalton enthalten. Die Angabe eines Bereichs des Molekulargewichts deutet darauf hin, daß das durchschnittliche Molekulargewicht jeglicher Wert zwischen den angegeben Grenzen sein kann, und Moleküle außerhalb dieser Grenzen einschließen kann. Somit gibt ein Molekulargewichtsbereich von 800 bis 20 000 ein durchschnittliches Molekulargewicht von mindestens etwa 800 im Bereich bis zu etwa 20 kDa an.
Der Begriff "verfügbarer Lysinrest", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Lysinseitenketten, welche auf der Außenoberfläche von Collagenmolekülen exponiert sind, und die auf eine Weise positioniert sind, daß eine Reaktion mit aktiviertem PEG zugelassen wird. Die Anzahl verfügbarer Lysinreste kann durch Reaktion mit Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat (TNB5) bestimmt werden.
Die Begriffe "Behandeln" und "Behandlung", wie hierin verwendet, beziehen sich auf Vermehrung, Reparatur, Prävention oder Abmilderung von Defekten, insbesondere Defekten aufgrund Verlust oder Abwesenheit von weichem Gewebe oder weichem Gewebeträger, oder wegen Verlust oder Abwesenheit von Knochen. Darüber hinaus beziehen sich "Behandeln" und "Behandlung" auch auf die Prävention, Pflege bzw. Bewahrung oder Abmilderung von Störungen oder Erkrankungen unter Verwendung eines biologisch aktiven Proteins, welches an die Collagen/Polymer-Zusammensetzung der Erfindung gekoppelt ist. Folglich schließt die Behandlung von weichem Gewebe die Vermehrung von weichem Gewebe, zum Beispiel die Implantation von Collagen/Polymer-Konjugaten der Erfindung, zur Wiederherstellung von normalen oder erwünschten Hautkonturen, wie bei der Entfernung von Hautfalten oder -furchen, oder wie bei dem Ersatz von subkutanem Fett in maxillaren Bereichen, wo Fett durch Alterung verlorengegangen ist, ein. Die Behandlung von Knochen und Knorpel schließt die Verwendung von Collagen/Polymer-Konjugaten und insbesondere Collagen/PEG in Kombination mit geeigneten teilchenförmigen Materialien, ein, um Knochengewebe zu ersetzen oder zu reparieren, zum Beispiel bei der Behandlung von nicht-zusammenwachsenden Knochen oder Knochenbrüchen. Die Behandlung von Knochen schließt auch die Verwendung von knorpelartigen Collagen-dPEG-Zusammensetzungen, mit oder ohne zusätzliche Knochenwachstumsfaktoren, ein. Zusammensetzungen, welche Collagen/Polymer mit keramischen Teilchen, vorzugsweise Hydroxyapatit und/oder Tricalciumphosphat, umfassen, sind aufgrund von dessen hoher Zugfestigkeit besonders nützlich für die Reparatur von Knochen, die Belastungen ausgesetzt sind. Zusammensetzungen der Erfindung können zusätzlich biologisch aktive Faktoren einschließen, um bei der Heilung oder dem Nachwachsen von normalem Gewebe zu helfen. Züm Beispiel kann man Faktoren einbinden, wie Epidermiswachstumsfaktor (EGF), transformierenden Wachstumsfaktor(TGF)-alpha, TGF-β (einschließlich jedweder Kombination von TGF-β's), TGF-β1, TGF-β2, von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), basischen FGF, Bindegewebe-aktivierende Peptide (CTAP), β-Thromboglobulin, insulinartige Wachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktor (TNF), Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), Erythropoietin (EPO), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Interferone (IFN) und osteogene Faktoren. Die Einbindung derartiger Faktoren und geeigneter Kombinationen von Faktoren kann das Nachwachsen und Nachmodellieren des Implantats in normales Knochengewebe erleichtern, oder kann bei der Behandlung von Wunden verwendet werden. Ferner kann man die Faktoren chemisch an die Collagen/Polymer-Zusammensetzung verknüpfen, indem eine geeignete Menge von polyfunktionellen Polymermolekülen während der Synthese eingesetzt wird. Die Faktoren können dann an die freien Polymerenden durch das gleiche Verfahren angeknüpft werden, welches verwendet wurde, um PEG an Collagen anzubinden, oder durch ein beliebiges anderes geeignetes Verfahren. Durch Anbinden von Faktormolekülen an das Implantat wird die effektive Menge von Faktor wesentlich verringert. Getrocknete Collagen/PEG-Zusammensetzungen mit schwammmartigen Merkmalen können als Wundverband hergestellt werden, oder sie dienen, wenn Wachstumsfaktoren oder dergleichen eingebunden werden, als wirksame Arzneimittelabgabe-Matrizes mit regulierter Freisetzung.
Der Begriff "wirksame Menge" bezeichnet die benötigte Menge an Zusammensetzung, um den gewünschten Effekt zu erhalten. Somit bezieht sich eine "Gewebewachstum-fördernde Menge" einer einen Wachstumsfaktor enthaltenden Zusammensetzung auf die benötigte Menge an Faktor, um das Gewebewachstum zu einem nachweisbaren Grad zu stimulieren. Gewebe schließt in diesem Zusammenhang Bindegewebe, Knochen, Knorpel, Epidermis und Dermis, Blut und andere Gewebe ein.
Der Begriff "ausreichende Menge", wie hierin verwendet, wird auf die Menge von Träger angewandt, welcher in Kombination mit den Collagen/Polymer-Konjugaten der Erfindung verwendet wird. Eine ausreichende Menge ist diejenige Menge, welche bei Vermischung mit dem Konjugat dieses in die gewünschte physikalische Form bringt, zum Beispiel eine injizierbare Lösung, injizierbare Suspension, ein plastisches oder geschmeidiges Implantat, ein starres Belastungs-tragendes Implantat.
Der Begriff "geeignetes teilchenförmiges Material", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein teilchenförmiges Material, welches im wesentlichen in Wasser unlöslich ist, welches biokompatibel ist, und welches mit dem Collagen/Polymer nicht mischbar ist. Die Teilchen des Materials können fibrillär sein, oder können im Größenbereich von 1 bis 20 um Durchmesser liegen und können perlenartig oder von unregelmäßiger Gestalt sein. Beispielhafte teilchenförmige Materialien schließen, ohne Einschränkung, fibrilläres vernetztes Collagen, Gelatineperlen, vernetzte Collagen-dPEG-Teilchen, Polytetrafluorethylenperlen, Siliconkautschukperlen, Hydrogelperlen, Siliciumcarbidperlen und Glasperlen ein. Im vorliegenden bevorzugte teilchenförmige Materialien sind Hydroxyapatit und Tricalciumphosphat.
Der Begriff "festes Implantat" bezeichnet jegliches feste Objekt, welches zur Einführung und Verwendung innerhalb des Körpers entworfen ist, und schließt Knochen- und Knorpelimplantate (z. B. künstliche Gelenke, Rückhaltenadeln, Schädelplatten aus Metall, Kunststoff und/oder anderen Materialien), Brustimplantate (z. B. Silicongelumschläge, Schaumformen), für langfristige (überhalb etwa drei Tage) Verwendung an einer Stelle beabsichtigte Katheter und Kanülen, künstliche Organe und Gefäße (z. B. künstliche Herzen, Bauchspeicheldrüsen, Nieren, Blutgefäße), Arzneimittelabgabevorrichtungen (einschließlich monolithischer Implantate, Pumpen und Vorrichtungen kontrollierter Freisetzung, wie Alzet®- Minipumpen, Steroidpellets für anabolisches Wachstum oder Empfängnisverhütung), Nähte für dermale oder interne Anwendung, Zahnwurzelhautmembranen, ophthalmische Schilde und Hornhaut-Linsen ein.
Der Begriff "in situ", wie hierin verwendet, bedeutet: am Platz der Verabreichung. Somit werden die injizierbaren Reaktionsgemisch-Zusammensetzungen an einer Stelle, welche der Vergrößerung bedarf, injiziert oder anderweitig angewandt, und an der Injektionsstelle vernetzen gelassen. Geeignete Stellen werden im allgemeinen intradermale oder subkutane Regionen zur Vermehrung des Haut-Trägers, an der Stelle von Knochenbrüchen zur Wundheilung und Knochenreparatur, und innerhalb des Sphinktergewebes zur Sphinkter- Vergrößerung (z. B. zur Wiederherstellung von Kontinenz) sein.
Der Begriff "wäßrige Mischung" von Collagen schließt flüssige Lösungen, Suspension, Dispersionen, Kolloide und dergleichen ein, welche Collagen und Wasser enthalten.
Der Begriff "NFC-Knorpel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Zusammensetzung der Erfindung welche hinsichtlich der physikalischen Konsistenz einem Knorpel ähnelt.
NFC-Knorpel wird aus nicht-fibrillärem Collagen (z. B. Collagen in Lösung) hergestellt und wird mit einem hydrophilen Polymer, insbesondere unter Verwendung von dPEG, quervernetzt. Als Artefakt des Herstellungsverfahrens oder durch den Entwurf, kann NFC- Knorpel 0-20% fibrilläres Collagen enthalten. NFC-Knorpel wird im allgemeinen durch Zugeben von dPEG in saurer Lösung zu einer sauren Lösung von Collagen und stattfinden lassen einer Konjugation vor der Neutralisation hergestellt. Der Begriff "NFC-FC-Knorpel" bezieht sich auf eine zu NFC-Knorpel ähnliche Zusammensetzung, worin der Prozentsatz an fibrillärem Collagen 20-80% beträgt. NFC-FC-Knorpel wird im allgemeinen durch Zusetzen von dPEG in einem neutralisierenden Puffer zu einer sauren Lösung von Collagen hergestellt. Der neutralisierende Puffer verursacht die Collagenfibrillen-Bildung während des Konjugationsvorganges. In ähnlicher Weise bezieht sich "FC-Knorpel" auf eine Zusammensetzung der Erfindung, welche aus fibrillärem Collagen und einem difunktionellen hydrophilen Polymer hergestellt ist. FC-Knorpel kann im allgemeinen unter Verwendung von dPEG und fibrillärem Collagen in neutralen Lösungen/Suspensionen hergestellt werden.

B. Allgemeines Verfahren

B. 1 Herstellung:

Ganz allgemein gehalten, wird ein geeignetes Atelopeptid-Collagen chemisch an ein ausgewähltes synthetisches hydrophiles Polymer oder Polymere gebunden. Geeignete Atelopeptid- Collagene schließen alle Typen ein, vorzugsweise die Typen I, II und III. Das Collagen kann rekonstituiertes fibrilläres Atelopeptid-Collagen, zum Beispiel Zyderm®-Collagenimplantat (ZCI) oder Atelopeptid-Collagen in Lösung (CIS) sein. Eine geeignete lösliche Collagenpräparation kann zum Beispiel aus dem im Handel erhältlichen Vitrogen® 100-Collagen-in-Lösung abgeleitet sein. Verschiedene Formen von Collagen sind im Handel erhältlich oder können durch Verfahren hergestellt werden, welche, zum Beispiel, beschrieben sind in den U. S. - Patenten Nr. 3 949 073; 4 488 911; 4 424 208; 4 582 640; 4 642 117; 4 557 764 und 4 689 399.
Atelopeptid-Collagene enthalten eine Anzahl verfügbarer Amino- und Hydroxylgruppen von Lysinresten, welche verwendet werden können, um das synthetische hydrophile Polymer zu binden. Das Polymer kann unter Verwendung einer "Verknüpfungsgruppe" gebunden werden, zumal die nativen Hydroxyl- oder Aminogruppen in Collagen und in dem Polymer häufig eine Aktivierung erfordern, bevor sie verknüpft werden können. Zum Beispiel kann man Verbindungen, wie Dicarbonsäureanhydride (z. B. Glutar- oder Bernsteinsäureanhydride) anwenden, um ein Polymerderivat (z. B. Succinat) zu bilden, welches danach durch Veresterung mit einer zweckmäßigen Austrittsgruppe, zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid, N,N'-Disuccinimidyloxalat, N,N'-Disuccinimidylcarbonat und dergleichen, aktiviert werden kann; siehe auch Davis, U. S. -Patent Nr. 4 179 337 für zusätzliche Verknüpfungsgruppen. Vorliegend bevorzugte Dicarbonsäureanhydride, welche verwendet werden, um Polymer- Glutarat-Zusammensetzungen zu bilden, schließen Glutarsäureanhydrid, Adipinsäureanhydrid, 1,8-Naphthalindicarbonsäureanhydrid und 1,4,5,8-Naphthalintetracarbonsäuredianhydrid ein.
Das derartig aktivierte Polymer wird dann mit dem Collagen reagieren gelassen, wobei eine Collagen/Polymer-Zusammensetzung der Erfindung gebildet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Monomethyl-polyethylenglykol (mPEG) (MG 5 000) mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt, um mPEG-Glutarat zu bilden. Das Glutaratderivat wird danach mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt, um ein Succinimidylmonomethyl-polyethylenglykolglutarat zu bilden. Der Succinimidylester (mPEG*, bezeichnet die aktivierte PEG-Zwischenstufe) ist danach in der Lage zur Reaktion mit freien Aminogruppen, welche auf Collagen (Lysinreste) vorhanden sind, um ein Collagen/PEG-Konjugat der Erfindung zu bilden, worin ein Ende des PEG-Moleküls frei oder nicht-gebunden ist. Andere Polymere können für das Monomethyl-PEG substituiert werden, wie obenstehend beschrieben. In ähnlicher Weise kann die Kopplungsreaktion durchgeführt werden, wobei ein beliebiges bekanntes Verfahren zur Derivatisierung von Proteinen und synthetischen Polymeren angewandt wird. Die Anzahl von konjugierten verfügbaren Lysinen kann von einem einzelnen Rest bis zu 100% der Lysine variiren, vorzugsweise 10% - 50%, und weiter bevorzugt 20- 30%. Die Anzahl reaktiver Lysinreste kann durch Standardverfahren, zum Beispiel durch Reaktion mit TNBS, ermittelt werden.
Das resultierende Produkt ist eine glatte, formbare, kautschukartige Masse mit einer glänzenden Erscheinung. Es kann benetzt werden, ist aber nicht wasserlöslich. Es kann als eine Suspension bei einer beliebigen zweckmäßigen Konzentration formuliert werden, bevorzugt bei etwa 30-65 mg/ml, und kann durch Injektion durch eine geeignete Spritze implantiert werden. Die Konsistenz der Formulierung kann durch Variieren der verwendeten Flüssigkeitmenge eingestellt werden.
Zur Reparatur von Knochendefekten oder Pseudoarthrose bzw. Nichtzusammenwachsungen geeignete Formulierungen können durch Vorsehen von Hochkonzentrations- Zusammensetzungen von Collagen/Polymer oder durch Vermischung mit geeigneten teilchenförmigen Materialien hergestellt werden. Derartige Collagen-Polymer-teilchenförmige Zusammensetzungen können geschmeidig oder starr sein, was von der Menge der eingebundenen Flüssigkeit abhängt. Formulierungen zur Behandlung von Knochen, die Belastungen ausgesetzt sind, sind vorzugsweise getrocknet und starr und werden im allgemeinen zwischen 45% und 85% teilchenförmiges Mineral, zum Beispiel Hydroxyapatit oder Tricalciumphosphat, umfassen. Die Zugfestigkeit und Ridigität kann weiter durch 5 bis 15 Stunden, vorzugsweise etwa 10 Stunden langes Erwärmen der Zusammensetzung unter Vakuum bei 60-90ºC, vorzugsweise etwa 75ºC, gesteigert werden. Geschmeidige Zusammensetzungen können zur Reparatur von nicht-belasteten Knochen verwendet werden.
Das aktivierte mPEG* kann insgesamt oder teilweise durch difunktionelles aktiviertes PEG (dPEG*, z. B. nicht-methyliertes PEG, welches dann an jedem Ende aktiviert wird) ersetzt werden, wodurch somit eine quervernetzte oder teilweise vernetzte Collagen-Zusammensetzung bereitgestellt wird. Derartige Zusammensetzungen sind jedoch ziemlich verschieden von herkömmlich-vernetzten Collagenzusammensetzungen (wobei z. B. Wärme, Strahlung, Glutaraldehyd, Glykosaminoglykane verwendet werden), da das langkettige synthetische hydrophile Polymer der Zusammensetzung einen im wesentlichen hydrophilen Charakter verleiht. In einer vorliegend bevorzugten Ausführungsform sind 1-20% des mPEG difunktionelles PEG. Der Charakter der Zusammensetzung kann wie gewünscht eingestellt werden, indem die Menge an difunktionellem PEG, welche während des Verfahrens eingeschlossen wird, variiert wird.
In einer anderen vorliegend bevorzugten Ausführungsform wird difunktionelles PEG* (im wesentlichen 100%, bei pH-Wert 7) verwendet, um Collagen zu vernetzen. Bei einer Version wird CIS (3-100 mg/ml, bevorzugt 10-40 mg/ml) mit dPEG* (difunktionelles PEG, an jedem Ende aktiviert durch Zugabe eines Säureanhydrids mit einer Austrittsgruppe, wie Succinimid) mit einem Molekulargewicht von 2 000 bis 20 000 (vorzugsweise 3 400 bis 10 000), das als eine konzentrierte Lösung zu einer Reaktionsgemisch-Endkonzentration von 5-40%, vorzugsweise 10-20%, zugegeben wird, reagieren gelassen. Dies stellt einen 5- bis 10fachen Überschuß von dPEG* gegenüber Collagen auf molarer Basis dar. Die Collagenmoleküle binden ohne mechanisches Mischen oder Bewegen an dPEG* und fallen aus der Lösung aus, wodurch ein knorpelähnliches Collagen/Polymer-Konjugat, das etwa 20-80% fibrilläres Collagen enthält, erzeugt wird. Das Konjugat wird dann mit PBS gewaschen, um jegliches verbleibende nicht-umgesetzte dPEG* zu entfernen, wodurch das Material der Erfindung zur Verfügung gestellt wird. Ein knorpelartiges Collagen/Polymer-Konjugat kann auch durch Mischen von dPEG*-Lösung (pH-Wert 3) mit Collagen in Lösung zwischen zwei Spritzen, bis zur Homogenität, und anschließendes Ausgießen in einen geeigneten Behälter (z. B. eine Petrischale) hergestellt werden. Danach wird eine 20%ige w/v dPEG*-Lösung (pH- Wert 7) zu der nicht-fibrillären Collagen-PEG-Lösung gegeben, was zu einem leicht knorpelartigen fibrillären Collagen/Polymer-Konjugat zu führt. Der resultierende NFC-FC-Konjugat- Knorpel enthält 1-40% fibrilläres Collagen. Die Merkmale des Endproduktes können durch Variieren der anfänglichen Reaktionsbedingungen eingestellt werden. Im allgemeinen stellen erhöhte Collagen- und/oder Polymer-Konzentrationen ein dichteres, weniger poröses Produkt bereit. Durch Variieren des pH-Wertes der Collagenlösung und der dPEG*-Lösung können Zusammensetzungen über einen breiten Bereich des fibrillären Gehalts hergestellt werden. Wenn gewünscht, können die dichteren Formulierungen zu jeglicher gewünschten Gestalt gegossen oder geformt werden, zum Beispiel zu Scheiben oder Membranen, zu Röhren oder Zylindern, zu Strängen oder Seilen und dergleichen.
Ein teilchenförmiges Mikrogelmaterial kann durch Bewegen eines Reaktionsgemisches aus Collagen und dPEG* während der Vernetzung (z. B. durch Rühren oder Durchführen zwischen Spritzen) erzielt werden. Derartige Materialien sind glatte, formbare, kautschukartige Massen mit einem glänzenden Aussehen, jedoch können sie eine höhere Zugfestigkeit auf weisen als Collagen/mPEG-Konjugate oder mit Glutaraldehyd chemisch vernetztes Collagen, das nicht an ein Polymer konjugiert ist. Die injizierbaren Formulierungen (Gele oder Lösungen) können verwendet werden, um Implantate, Katheter, Röhren bzw. Schläuche (z. B. zum Venen-Ersatz), Netzwerke (z. B. zur Gewebeverstärkung) durch Eintauchen zu beschichten. Gele können durch Verringern der Polymerkonzentration oder Verringern der Reaktionszeit hergestellt werden. CIS ist das bevorzugte Augangsmaterial, wenn die gewünschten Eigenschaften hohe Dichte, Starrheit, Viskosität und Durchsichtigkeit sind. Jedoch kann man dafür fibrillläres Collagen (vorzugsweise fibrilläres Atelopeptid-Collagen, wie ZCI) substituieren und Produkte erhalten, die trüber, flexibler und stärker empfänglich für eine Kolonisierung durch Zellen nach der Implantation sind. CIS-basierende Materialien werden vorliegend zur Beschichtung von zu implantierenden Artikeln, wie Kathetern und Belastungs-tragenden Knochenimplantaten, bevorzugt. Auf fibrillärem Collagen basierende Materialien werden für Anwendungen, wie Hautvermehrung, Sphinkter-Vermehrung, Oberflächenwiederherstellung von erodierten Gelenkoberflächen (wie bei rheumatoider Arthritis), Ersetzen von Sehnen und Bändern, und bei der Herstellung von künstlichen Gefäßen (z. B. Venen), bevorzugt.
Zusammensetzungen der Erfindung mit biologischen Wachstumsfaktoren, wie EGF und TGF-β, werden durch Beimischen einer geeigneten Menge des Faktors in die Zusammensetzung oder durch Einbinden des Faktors in das Collagen vor Behandlung mit aktiviertem PEG hergestellt. Durch Einsetzen einer angemessenen Menge an difunktionellem PEG kann ein Ausmaß an Quervernetzung, neben Molekülen, welche aus Collagen bestehen, das durch ein synthetisches hydrophiles Polymer an einen Faktor geknüpft ist, festgelegt werden. Vorzugsweise wird der Faktor zuerst mit einem molaren Überschuß von dPEG* in einer verdünnten Lösung über eine Dauer von 3 bis 4 Stunden umgesetzt. Der Faktor wird vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 ug/ml bis 5 mg/ml bereitgestellt, während das dPEG* vorzugsweise zu einer Endkonzentration zugegeben wird, die einen 30- bis 50fachen molaren Überschuß bereitstellt. Der resultierende konjugierte Faktor wird dann einem wäßrigen Collagengemisch (1 bis 60 mg/ml) bei einem pH-Wert von 7-8 zugegeben und weiter reagieren gelassen. Die resultierende Zusammensetzung wird über Nacht bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Das Pellet wird durch Zentrifugation gesammelt und wird durch heftiges Vortexen mit PBS gewaschen, um nicht-gebundenen Faktor zu entfernen.
Flexible Scheiben oder membranartige Formen des Collagen/Polymer-Konjugates können durch im Fach bekannte Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel U. S. -Patente Nr. 4 600 533; 4 412 947 und 4 242 291. Kurz gesagt, wird eine hohe Konzentration (10-100 mg/ml) von CIS oder fibrillärem Collagen (vorzugsweise fibrilläres Atelopeptid-Collagen, wie ZCI) in einen flachen Scheiben-Behälter gegossen. Eine Lösung von mPEG* (mit einem Molekulargewicht von etwa 5 000) wird zu der ausgegossen Collagenlösung gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das resultierende Collagen/Polymer-Konjugat wird unter Verwendung eines sterilen Spatels aus der Reaktionslösung entfernt und mit PBS gewaschen, um überschüßiges nicht-umgesetztes mPEG* zu entfernen.
Das resultierende Konjugat kann dann unter konstantem Druck komprimiert werden, um eine gleichförmige, flache Scheibe oder Matte zu bilden, welche danach getrocknet wird, um ein membranartiges Implantat der Erfindung zu bilden. Flexiblere membranartige Formen werden durch Verwendung von niedrigeren Collagenkonzentrationen und hohen Polymerkonzentrationen als Ausgangsmaterialien erzielt.
Weniger flexible membranartige Formen werden durch Verwendung einer dPEG*- Lösung anstatt von mPEG* hergestellt. CIS wird, bei Raumtemperatur, mit einer Pufferlösung gemischt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Das resultierende Gel wird unter konstantem Druck kompriniert, getrocknet und durch Waschen entsalzt. Die resultierende Membran wird dann durch Behandlung mit dPEG* quervernetzt, gewaschen, und danach bei geringer Temperatur getrocknet.
Collagen/Polymer-Konjugate können auch in Form von Schwämmen durch Lyophilisieren einer wäßrigen Aufschlämmung der Zusammensetzung nach der Konjugation hergestellt werden.
Alternativ dazu wird CIS oder fibrilläres Collagen (10-100 mg/ml) in einen flachen Scheibenbehälter gegossen. Eine Lösung von dPEG* (22-50% w/v) wird dem gegossenen Collagen zugesetzt. Das Gemisch wird über mehrere Stunden hin bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Kürzere Reaktionszeiten führen zu flexibleren Membranen. Die resultierende Collagen/Polymer-Membran kann wahlweise unter einem Vakuumofen, durch Lyophilisieren oder Lufttrocknung entwässert werden.

B. 2 Anwendung und Verabreichung:

Zusammensetzungen der Erfindung finden eine Vielzahl von Anwendungen. Geschmeidige plastische Zusammensetzungen können als injizierbare Formulierungen hergestellt werden und sind geeignet zur Hautvermehrung, zum Beispiel zum Ausfüllen von Hautfalten und zum Bereitstellen von einem Träger für Haut-Oberflächen. Derartige Zusammensetzungen sind auch nützlich zur Vermehrung von Sphinktergewebe (z. B. zur Wiederherstellung von Kontinenz). In solchen Fällen kann die Formulierung direkt in das Sphinktergewebe injiziert werden, um Masse bzw. Volumen zu erhöhen und den Schließgeweben zu erlauben, einfacher und wirksamer aufeinanderzutreffen. Diese Zusammensetzungen können homogen sein oder können als Suspensionen von kleinen Mikrogel-Collagen/Polymer-Konjugatteilchen oder -perlen hergestellt werden.
Überraschenderweise kann man das Reaktionsgemisch durch Injektion verabreichen, bevor die Vernetzung vervollständigt worden ist. In dieser Ausführungsform wird ein wäßriges Collagengemisch mit einer niedrig-konzentrierten dPEG*-Lösung vereinigt, gemischt, und die Kombination wird injiziert oder angewandt, bevor die Viskosität ausreichend steigt, um die Injektion schwierig zu machen (gewöhnlich etwa 20 Minuten). Das Mischen kann durch Hindurchführen des Gemisches zwischen zwei Spritzen, ausgestattet mit Luer-Sperrkolben, oder durch eine einzelne Spritze mit zweifachen Kompartimenten (z. B. Doppel-Zylinder) bewirkt werden. Die Zusammensetzung vernetzt in situ und kann zusätzlich an das endogene Gewebe quervernetzen, wodurch das Implantat an der Stelle verankert wird. In diesem Verfahren kann man Collagen (vorzugsweise fibrilläres Collagen) bei einer Konzentration von 10-100 mg/ml einsetzen, obwohl 30-80 mg/ml bevorzugt sind, am stärksten bevorzugt werden etwa 33 mg/ml. Die dPEG*-Konzentration wird vorzugsweise auf 0,1 bis 3% eingestellt, obwohl so hohe Konzentrationen wie 30% verwendet werden können, falls gewünscht. Das Gemisch wird direkt in die Stelle, welche der Vermehrung bedarf, injiziert und verursacht im wesentlichen keine nachweisbare Entzündung oder Fremdkörper-Reaktion. Man kann zusätzlich teilchenförmige Materialien in das Collagen-Reaktionsgemisch einschließen, zum Beispiel Hydrogel- oder Collagen/dPEG-Perlen, oder Hydroxyapatit/Tricalciumphosphat- Teilchen, wodurch ein voluminöseres oder rigideres Implantat nach der Vernetzung zur Verfügung gestellt wird.
Zusammensetzungen der Erfindung (insbesondere vernetzte Collagenzusammensetzungen) sind auch nützlich zum Beschichten von Artikeln für Implantation oder eine verhältnismäßig langfristige Verweildauer innerhalb des Körpers. Eine solche Oberflächenbehandlung macht das Objekt nicht-immunogen und vermindert das Auftreten von Fremdkörperreaktionen. Folglich kann man Zusammensetzungen der Erfindung auf Katheter, Kanülen, Knochenprothesen, Knorpelersatz, Brustimplantate, Minipumpen und andere Arzneimittelabgabevorrichtungen und künstliche Organe aufbringen. Die Aufbringung kann durch Eintauchen des Objektes in das Reaktionsgemisch, während die Quervernetzung stattfindet, und trocknen lassen der anhaftenden viskosen Beschichtung bewirkt werden. Man kann das Reaktionsgemisch schütten oder anderweitig aufbringen, wenn das Eintauchen nicht zweckmäßig ist. Alternativ dazu kann man flexible Scheiben oder membranartige Formen von Collagen/Polymer-Konjugat verwenden, um das Objekt damit einzuwickeln, wobei Ecken und Ränder mit dem Reaktionsgemisch verschloßen werden.
In einer anderen Ausführungsform kann das Objekt in ein viskoses Collagen-in-Lösung- Bad, oder in eine fibrilläre Collagenlösung, eingetaucht werden, bis das Objekt vollständig überzogen ist. Die Collagenlösung wird an das Objekt fixiert, indem das Collagen-beschichtete Objekt in ein Bad einer dPEG*-Lösung (pH-Wert 7) getaucht wird, und das Collagen/ Polymer-überzogene Objekt dann trocknen gelassen wird. Alternativ dazu wird das viskose Collagen-in-Lösung mit einer dPEG*-Lösung (pH-Wert 3) gemischt und rasch polymerisiert, wie obenstehend beschrieben. Das Objekt wird in die saure Collagen/Polymer-Lösung eingetaucht und gehärtet, indem das beschichtete Objekt in einen neutralisierenden Puffer getaucht wird, der etwa 20 Gew.-% dPEG* (pH-Wert 7) enthält, was zu einem Collagen/- Polymer-beschichteten Objekt führt.
Zusammensetzungen der Erfindung können in einer Form hergestellt werden, welche dicht und starr genug ist, um Knorpel zu ersetzen. Diese Zusammensetzungen sind nützlich zur Reparatur und Unterstützung von Gewebe, das einen gewißen Grad an Struktur erfordert, zum Beispiel bei der Rekonstruktion von Nase, Ohr, Knie, Kehlkopf, Luftröhrenringen und Gelenkoberflächen. Man kann auch Sehnen-, Bänder- und Blutgefäß-Gewebe unter Verwendung passend geformten knorpelartigen Materials ersetzen. Bei diesen Anwendungen wird das Material im allgemeinen zu der Gestalt gegossen oder geformt: Im Falle von Sehnen und Bändern, kann es zu bevorzugen sein, Filamente zum Weben in Stricke oder Seile zu formen. Im Falle von künstlichen Blutgefäßen kann es vorteilhaft sein, ein Verstärkungs-Netzwerk einzubinden (z. B. Nylon).
Zusammensetzungen der Erfindung, welche Wachstumsfaktoren enthalten, sind besonders geeignet für anhaltende Verabreichung von Faktoren, wie im Fallle der Wundheilungsförderung. Osteoinduktive Faktoren und Cofaktoren (einschließlich TGF-β) können vorteilhafterweise in Zusammensetzungen, welche für Knochenersatz, -vermehrung und/oder Schadenreparatur beabsichtigt sind, eingebunden werden. In der Form einer Membran bereitgestellte Zusammensetzungen können verwendet werden, um transplantierte Organe einzuwickeln oder zu überziehen, um Abstoßung zu unterdrücken und ein verbessertes Gewebewachstum zu induzieren. In ähnlicher Weise kann man Organe für die Transplantation unter Verwendung einer vernetzenden Reaktionsmischung aus Faktor-Polymer-Konjugaten und Collagen eintauchbeschichten. Alternativ dazu kann man antivirale und Anti-Tumor- Faktoren, wie TNF, Interferone, CSFs und TGF-β, für deren pharmazeutische Aktivitäten verabreichen. Die Menge der verwendeten Zusammensetzung wird von der Schwere des zu behandelnden Zustands, der Menge des in die Zusammensetzung eingebundenen Faktors und der gewünschten Abgaberate abhängen. Allerdings können diese Parameter ohne weiteres durch Routine-Experimente ermittelt werden, zum Beispiel durch Herstellen einer Modell- Zusammensetzung unter Befolgen der nachstehenden Beispiele und Testen auf die Abgaberate in einem geeigneten Tiermodell.

C. Beispiele

Die nachstehend angegebenen Beispiele werden als eine weitere Richtlinie für den ausführenden Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet angegeben und sollen keineswegs als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden.

Beispiel 1

(Herstellung von Collagen-PEG)

(A) Monomethyl-PEG 5000 (50 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) wird in 1,2-Dichlorethan (250 ml) gelöst und 3 Tage lang bei Rückfluß mit Glutarsäureanhydnd (5 g) und Pyridin (4 ml) unter Stickstoff erwärmt. Die Lösung wird dann filtriert und das Lösemittel verdampft, und der Rückstand in Wasser (100 ml) gelöst und mit Diethylether (2 · 50 ml) gewaschen. Das resultierende PEG-Glutarat wird aus dem Wasser mit Chloroform (2 · 50 ml) extrahiert, und das Chloroform wird verdampft, um etwa 43 g PEG-Glutarat zu ergeben. Das PEG-Glutarat wird dann bei 37ºC in Dimethylformamid (DMF, 200 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (10%iger molarer Überschuß) wird zugesetzt. Die Lösung wird auf 0ºC abgekühlt, und eine äquivalente Menge von Dicyclohexylcarbodiimid wird in DMF-Lösung (10 ml) zugesetzt. Die Mischung wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach filtriert. Dann wird kaltes Benzol (100 ml) zugesetzt, und das PEG-Succinimidylglutarat (PEG-SG) wird durch Zusetzen von Petroleumether (200 ml) bei 0ºC gefällt. Das Präzipitat wird auf einem gesinterten Glasfilter gesammelt. Das Auflösen in Benzol, gefolgt von Präzipitation mit Petroleumether, wird dreimal wiederholt, um "aktiviertes" PEG (PEG-SG) zur Verfügung zu stellen.
Vitrogen 100®-Collagen in Lösung (400 ml, 1,2 g Collagen, 0,004 mmol) wurde mit 0,2 M Phosphatpuffer (44 ml) gemischt, um den pH-Wert auf 7,4 zu erhöhen. Als nächstes wurde ein dreifacher molarer Überschuß von PEG-SG (6,00 g, 1,2 mmol) in Wasser zur Injektion gelöst (40 ml) und steril-filtriert. Die PEG-SG-Lösung wurde dann der Collagen- Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde etwa 15 Stunden lang bei 17-22ºC stehen gelassen. Die Lösung wurde dann zentrifugiert und das resultierende Pellet (25 g) aus rekonstituierten Fibrillen wurde gesammelt und mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 3 · 400 ml) gewaschen, um restliches PEG zu entfernen. Das resultierende Material besitzt eine feste kohärente Elastizität und kann auf einem Spatel aufgenommen werden (das äquivalente nicht-konjugierte Collagen, Zyderm®-Collagenimplantat, ist fluider). Das resultierende Material kann mit PBS verdünnt werden, um eine Dispersion bereitzustellen, welche 20,5 mg/ml Collagen-PEG aufweist.
(B) In ähnlicher Weise werden durch ein Vorgehen, wie im obenstehenden Teil (A), jedoch unter Substituieren von Polypropylenglykol und POE-POP-Blockpolymeren für Polyethylenglykol, die entsprechenden Collagen-PPG- und Collagen-POE-POP-Zusammensetzungen hergestellt.
(C) Difunktionelles PEG 3400 (34 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) wird in 1,2-Dichlorethan (250 ml) gelöst und bei Rückfluß mit Glutarsäureanhydrid (10 g) und Pyridin (4 ml) unter Stickstoff 3 Tage lang erwärmt. Die Lösung wird dann filtriert und das Lösemittel verdampft, und der Rückstand wird in Wasser (100 ml) gelöst und mit Diethylether (2 · 50 ml) gewaschen. Das resultierende PEG-Diglutarat wird aus dem Wasser mit Chloroform (2 · 50 ml) extrahiert, und das Chloroform wird verdampft, um PEG-Diglutarat zu ergeben. Das PEG- Diglutarat wird dann bei 37ºC in DMF (200 ml) gelöst, und N-Hydroxysuccinimid (10%iger molarer Überschuß) wird zugesetzt. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt, und eine äquivalente Menge von Dicyclohexylcarbodiimid in DMF-Lösung (10 ml) wird zugesetzt. Die Mischung wird 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach filtriert. Dann wird kaltes Benzol (100 ml) zugesetzt, und das PEG-Di(succinimidylglutarat) (dPEG-SG) wird durch Zusetzen von Petroleumether (200 ml) bei 0ºC gefällt. Das Präzipitat wird auf einem gesinterten Glasfilter gesammelt. Das Auflösen in Benzol, gefolgt von Präzipitation mit Petroleumether, wird dreimal wiederholt, um "aktiviertes" dPEG (dPEG*) zur Verfügung zu stellen.
Vitrogen 100®-Collagen in Lösung (400 ml, 1,2 g Collagen, 0,004 mmol) wurde mit 0,2 M Phosphatpuffer (44 ml) gemischt, um den pH-Wert auf 7,4 zu erhöhen. Als nächstes wurde ein dreifacher molarer Überschuß von dPEG* (6,00 g, 1,2 mmol) in Wasser zur Injektion gelöst (40 ml) und steril-filtriert. Die dPEG*-Lösung wurde dann der Collagen- Lösung zugesetzt, bewegt, und die Mischung wurde etwa 15 Stunden lang bei 17-22ºC stehen gelassen. Die Lösung wurde dann zentrifugiert und das resultierende Pellet aus rekonstituierten Fibrillen wurde gesammelt und mit PBS (3 · 400 ml) gewaschen, um restliches dPEG* zu entfernen. Das Pellet wurde dann in eine mit einem Luer-Sperrkolben ausgestattete Spritze, welche mit einer zweiten Spritze verbunden war, eingebracht und wurde bis zur Homogenität zwischen den Spritzen hindurchgeführt. Das resultierende Material ist ein Mikrogel oder eine teilchenförmige Suspension von Zufallsgrößen-Fibrillen in Lösung (Mikrogel-Konjugat). Das Material ist eine glatte, formbare kautschukartige Masse mit einem glänzenden Aussehen.
(D) Herstellung von knorpelartigen Konjugaten:
Etwa 20 Gew.-% dPEG* (pH-Wert 7) wurden zu Collagen in Lösung (33,8 mg/ml) zugesetzt und etwa 16 Stunden lang bei 21ºC inkubiert. Das resultierende Konjugat wurde mit 100 ml PBS 3-5mal während 12 Stunden gewaschen. Das resultierende knorpelartige nichtfibrilläre Collagen/Polymer-Konjugat (NFC-FC-Knorpel) war ein durchsichtiger Feststoff mit kohärenter Elastizität. Das Produkt enthielt etwa 20-80% fibrilläres Collagen.
Eine andere NFC-Knorpel-Zusammensetzung wurde durch Mischen von dPEG*- Lösung (0,6 g, pH-Wert 3) mit Collagen in Lösung (33,8 mg/ml, pH-Wert 2) hergestellt. Das Gemisch wurde zwischen zwei Spritzen, die durch ein Luer-Sperrverbindungsteil verbunden waren, hin- und hergeführt, um eine homogene Lösung zu bilden. Eine Lösung von dPEG* (20% w/v) in einem neutralisierenden Puffer wurde dann zugegeben, was zu einem im wesentlichen nicht-fibrillären Collagen-(NFC)-Knorpelmaterial führte. Das resultierende Produkt enthielt etwa 1-40% fibrilläres Collagen.
Alternativ dazu kann fibrilläres Collagen anstatt von CIS verwendet werden, um ein knorpelartiges fibrilläres Collagen/Polymer-Konjugat (FC-Knorpel) mit einem undurchsichtigen Aussehen und einem hohen Fibrillengehalt herzustellen. Ein derartiger FC-Knorpel ist poröser und permeabler als nicht-fibrilläre Collagen/Polymer-Konjugate.

Beispiel 2

(Charakterisierung)

(A) In Beispiel 1A hergestelltes Collagen-mPEG wurde charakterisiert und mit Zyderm®- Collagen-Implantat (ZCI) und Glutaraldehyd-vernetztem fibrillären Collagen (GAX) verglichen. Extrusion: Dieser Assay ermittelte die erforderliche Kraft, um die Testzusammensetzung durch eine 30-Gauge-Nadel zu extrudieren. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 gezeigt. Wie aus der Graphik der benötigten Kraft (in Newton) gegen die Kolbenbewegung ersichtlich, wurde ZCI gleichmäßig extrudiert, wobei eine Kraft von etwa 20-30 Newton erfoderlich war. GAX wurde nicht gleichmäßig extrudiert, wie gezeigt durch das "Spiking", das in der Kraft-Kurve auftritt. Bei dem Plateau erforderte GAX etwa 10-15 N für die Extrusion. Im Gegensatz dazu zeigte Collagen-mPEG eine sehr niedrige Extrusionskraft (8-10 N) auf, und zwar mit wenig oder keinem Spiking.
Intrusion: Intrusion ist ein Maß der Tendenz einer Zusammensetzung, "fingerartig auszugreifen" oder in ein poröses Bett abzufließen, anstatt in einer kompakten Masse zu verbleiben.
Eine niedrige Intrusion wird bei der Vermehrung von weichem Gewebe bevorzugt, so daß das injizierte Implantat nicht durch die Dermis diffundiert und an der Stelle bleibt.
Eine 1 ml große Spritze, ausgestattet mit einer 30-Gauge-Nadel, wurde zur Hälfte mit Siliciumcarbidteilchen (60 Mesh) gefüllt, welche die humane Dermis simulierten. Die obere Hälfte der Spritze wurde mit 0,5 ml Testzusammensetzung (GAX, ZCI oder Collagen-mPEG) bei 35 mg/ml gefüllt. Dann wurde der Kolben eingesetzt und niedergedrückt. Beim Niederdrücken erschien ZCI an der Nadel, was eine Intrusion durch das Siliciumcarbidbett verdeutlichte. Mit GAX oder Collagen-mPEG der Erfindung gefüllte Spritzen ließen Collagen nicht hindurch, wobei anstelledessen nur Puffer abgegeben wurde, wodurch keine Intrudierbarkeit bzw. Eindringfähigkeit verdeutlicht wurde.
Helizität: Der Anteil jeder Zusammensetzung, der nicht-helikalen Charakter zeigt, wurde unter Anwendung der Empfindlichkeit gegenüber Verdau mit Trypsin gemessen. Die Proben wurden mit der Protease Trypsin behandelt, welche in der Lage ist, nur fragmentierte Anteile des Collagenproteins anzugreifen. Das Ausmaß der Hydrolyse wird durch Fluorescamin-Assay für solubilisierte Peptide gemessen, und die Ergebnisse werden als Prozentsatz an nicht-helikalem Collagen ausgedrückt. Der Prozentsatz an nicht-helikalem Collagen wurde 30 Minuten nach dem Beginn der Verdauzeitperiode gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß ZCI zu 3-10% empfindlich war, GAX zu 1-2% empfindlich war, und Collagen-mPEG zu etwa 1% empfindlich war. Die Empfindlichkeit gegenüber Trypsin kann auch mit der Empfindlichkeit gegenüber endogenen Proteasen im Anschluß an eine Implantation in Zusammenhang gebracht werden.
Collagenase-Empfindlichkeit: Die Empfindlichkeit jeder Zusammensetzung gegenüber Collagenase wurde ebenfalls gemssen. ZCI wurde zu 65,2% verdaut, im Vergleich zu 2, 2% für GAX und 45,8% für Collagen-mPEG.
Phasenübergang: Das Verhalten jeder Zusammensetzung gegenüber der Temperatur wurde unter Verwendung eines Diffential-Raster-Kalorimeters untersucht. Bei Erwärmung zeigte ZCI mehrere Peaks bei etwa 45 und 53ºC. GAX zeigte einen Peak bei 67-70ºC. Collagen-mPEG zeigte einen Peak bei 56-61ºC.
Lysingehalt: Die Anzahl an freien Lysinen pro Mol wurde für jede Zusammensetzung unter Verwendung von TNBS bestimmt, um reaktive &epsi;-Aminogruppen zu quantifizieren. ZCI zeigte etwa 30 Lysine pro (Einzelhelix-)Molekul (K/m), wohingegen GAX 26-27 K/m aufzeigte und Collagen-mPEG 21-26 K/m.
(B) Charakterisierung von vernetzten Collagen/Polymer-Konjugaten:
Ein Collagen-dPEG-Konjugat, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1C, wurde unter Anwendung von Diffential-Raster-Kalorimetrie (DSC) charakterisiert. Dieser Test ist eine Messung der Übergangstemperatur während der Fragmentierung des Collagenmoleküls auf einem mikroskopischem Level. Eine Erniedrigung der Übergangstemperatur zeigte einen Zuwachs der Fragmentation auf eine Weise, ähnlich zu jener, die durch Trypsinempfindlichkeit gemessen wurde.
Das Collagen-dPEG-Konjugat zeigte durch DSC einen einzelnen Denaturations- Übergang bei 56ºC, was ähnlich zu dem typischen Schmelzpunkt des in Beispiel 1A hergestellten Collagen-PEG-Konjugates ist. Zum Vergleich besitzt ZCI eine Schmelztemperatur von 45-53ºC mit mehrfachen Denaturations-Übergängen, und GAX hat eine Schmelztemperatur von 67-70ºC mit einem einzelnen Denaturations-Übergang.
Der in Beispiel 2A beschriebene Extrusionstest konnte nicht angewandt werden, um das Collagen-dPEG-Konjugat zu charakterisieren, weil das Material nicht durch eine 30- Gauge-Nadel extrudierbar war.
Bei Verwendung des in Beispiel 2A beschriebenen Intrusionstestes wurde der Durchtritt von Collagen-dPEG am Siliciumcarbid-Bett vollständig blockiert, was auf eine hohe Vernetzung zwischen den Collagenmolekülen und eine geringe oder gar keine Intrudierbarkeit hindeutet.

Beispiel 3

(Immunogenität)

(A) Nicht-quervernetztes PEGCollagen:

Dieses Experiment würde durchgeführt, um die relative Immunogenität einer Collagen-mPEG- Präparation der Erfindung gegenüber einer im Handel erhältlichen Rindercollagenformulierung, welche im wesentlichen aus dem gleichen Ausgangsmaterial hergestellt worden war und welche eine ähnliche Konsistenz aufweist, aufzuzeigen. Da beide Collagenpräparationen unter Verwendung von Atelopeptid-Collagen (welches nur schwach immunogen ist) hergestellt worden waren, wurden die Präparationen entweder mit kompletten Freundschen Adjuvanz (CFA) oder unvollständigem Freundschen Adjuvanz (IFA) zubereitet, um die Immunantwort zu verbessern. Dies ist ein strenger Test, ausgelegt, um jedwede mögliche Immunreaktion zu verstärken.
Collagen-mPEG wurde wie im obenstehenden Beispiel 1 A hergestellt. Männliche Hartley-Meerschweinchen (11) wurden betäubt, und es wurde durch Herzpunktion Blut für die serologische Präimmunisierungs-Auswertung abgenommen. Fünf Tiere wurden mit zwei 0,1 ml großen intramuskulären Injektionen von Zyderm®-Collagenimplantat (ZCI), emulgiert in CFA (1 : 9), in den linken und rechten Schenkel behandelt. Weitere fünf Tiere wurden auf die gleiche Weise behandelt, wobei Collagen-PEG (35 mg/ml), emulgiert in CFA, verwendet wurde. Ein Tier wurde mit Collagen-PEG in IFA behandelt. Am Tag 14 im Anschluß an die Immunisierung, wurde allen Tieren wiederum durch Herzpunktierung Blut abgenommen, und es wurde Serum für die Antikörpertiter-Bestimmung (unter Verwendung von ELISA) erhalten. Die Serologie wurde erneut am Tag 30 durchgeführt.
Am Tag 30, im Anschluß an die Abnahme von Serumproben, wurde jedes Tier intradermal sowohl mit ZCI als auch Collagen-PEG herausgefordert bzw. stimmuliert (jeweils 0,1 ml, eines auf jeder Flanke). Eine Hypersensitivität vom verzögerten Typ bzw. "Delayed-typehypersensitivity" (DTH) wurde als Maß der Zell-vermittelten Immunität quantifiziert. Die DTH wurde 24, 48 und 72 Stunden nach der Herausforderung durch Messung des Durchmessers einer jeden Quaddel unter Verwendung von Mikrometer-Meßlehren und Notieren des Ausmaßes der Rötung und der Verhärtung ausgewertet. Die Tiere wurden danach mit CO&sub2; getötet, und die Injektionsstellen wurden ausgeschnitten und in neutralem, gepuffertem Formalin für die histologische Untersuchung fixiert.
Die Serologie-Ergebnisse zeigten eine verringerte Immunogenität von Collagen-PEG gegenüber ZCI. Am Tag 14 zeigten 80% der ZCI-geimpften bzw. -immunisierten Tiere "positive" Antikörperantworten (Titer ≥ 160 am Tag 14), wohingegen 0% der Collagen- PEG-geimpften Tiere positive Antworten aufwiesen. Am Tag 30 zeigten alle ZCI-geimpften Tiere hohe Antikörpertiter, wohingegen keines der Collagen-PEG-geimpften Tiere (C-PEG) hohe Titer aufwies. Die Daten sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1: Immunogenität
Die Antworten auf die DTH-Herausforderung zeigten ebenfalls, daß das Collagen-mPEG der Erfindung weniger immunogen ist. Mit ZCI geimpfte und mit ZCI herausgeforderte Meerschweinchen zeigten eine Quaddel, welche bei Messung 1,128 ± 0,058 cm Durchmesser aufwies. Mit Collagen-mPEG geimpfte und mit Collagen-mPEG herausgeforderte Tiere zeigten Quaddeln mit den Maßen 0,768 ± 0,036 cm. Mit ZCI geimpfte und mit Collagen-mPEG herausgeforderte, oder mit Collagen-mPEG geimpfte und mit ZCI herausgeforderte Tiere entwickelten kleinere Quaddeln als die ZCI-geimpften/ZCI-herausgeforderten Quaddeln. Die nach 48 und 72 Stunden gemessenen Antworten waren im wesentlichen diegleichen oder geringer als die 24 Stunden-Antwort für jede Stelle. Die Rötung war im wesentlichen für alle Tiere gleich.
Die histologischen Untersuchungen zeigten, daß beide Materialien eine vergleichbare Intrusion aufzeigten, wobei fingerartig in die Dermis und den subkutanen Raum eingedrungen wurde. Die Stellen der intradermalen Herausforderung mit ZCI in ZCI-geimpften Tieren zeigten die ausgeprägteste entzündliche Antwort, einschließlich einer zellulären Infiltration durch lymphohistiocytische Elemente mit Eosinophilen und gelegentlichen Riesen-Zellen. Zwei der Implantatstellen zeigten eine erosive Entzündung der darüberliegenden Epidemis und eine Schorf-Bildung. Die Stellen der intradermalen Herausforderung mit Collagen-mPEG in ZCI- geimpften Tieren zeigten lediglich eine mäßige assoziierte entzündliche Infiltration, mit einer merklichen Verringerung der akuten Zellen und lymphoiden Elemente. Histiocyten und Riesenzellen waren stärker vorherrschend, und kleideten bei manchen Proben die Implantate aus und kolonisierten selbige in schwerem Maße. Mit Collagen-mPEG geimpfte Tiere zeigten eine nur leichte bis mäßige Reaktion, wobei die ZCI-Herausforderungs-Stellen von einer mäßigen lymphohistiocytischen perivaskulären Infiltration mit einigen wenigen Eosinophilen und Riesenzellen begleitet wurden. Die Collagen-mPEG-Herausforderungs-Stellen wurden typischerweise von einer minimalen Verstreuung lymphoider Zellen nahe dem assoziierten Gefäßsystem begleitet.

(B) Quervernetzte dPEG-Collagen-Konjugate:

Collagen/dPEG-Konjugate wurden wie in Beispiel 1D hergestellt. Die Proben wurden in die dorsale Subkutis und als Schädelabdeckungen in Ratten implantiert. Nach 30 Tagen Implantation in der Subkutis wiesen NFC-Knorpel- und NFC-FC-Knorpelmaterialien eine homogene mikrofibrilläre Struktur auf. Eine milde Kolonisierung durch Bindegewebszellen trat am Rand der NFC-FC-Knorpelproben auf, und eine schwache Kapselbildung war vorhanden. Es war keine Kolonisierung bei dem NFC-Knorpelmaterial aufgetreten und eine schwache Kapselbildung war vorhanden. FC-Knorpel hatte eine sehr fibröse Struktur mit milder aber häufig tiefer Kolonisierung durch Bindegewebszellen und spärlichen Anzahlen von Adipocyten. Kapsel-Spurenmengen waren in begrenzten Bereichen der FC-Knorpelproben vorhanden. Die NFC-Knorpelmaterialien neigen dazu, ihre Präimplantations-Form, mit scharf abgegrenzten Rändern, beizubehalten, wohingegen die NFC-FC-Knorpelproben dazu tendierten, mit der Zeit zu verflachen und abgerundete Profile zu entwickeln.
Bei Implantation als Schädelabdeckungen war die Erscheinung jedes der Materialien ähnlich zu derjenigen in der Subkutis, außer daß die Proben dazu neigten, an den Schädel über die Integration der Kapsel oder des umgebenden losen Bindegewebes mit der Knochenhaut verankert zu werden.
Alle der Proben schienen biokompatibel zu sein, besitzen unterschiedliche Ausmaße der Kolonisierung durch Wirtsgewebe und variierende mechanische Merkmale.

Beispiel 4

(In situ-Vernetzung)

Eine dPEG-Lösung wurde wie im obenstehenden Beispiel 1 C beschrieben hergestellt. Danach wurden die folgenden Proben hergestellt:
(1) 5 mg dPEG in 80 ul Wasser, gemischt mit 0,5 ml fibrillärem Collagen (35 mg/ml), zu einer dPEG-Endkonzentration von 1 Vol.%;
(2) 15 mg dPEG in 80 ul Wasser, gemischt mit 0,5 ml fibrillärem Collagen (35 mg/ml), zu einer dPEG-Endkonzentration von 3 Vol.%;
(3) Vitrogen®100-Collagen in Lösung;
(4) 5 mg dPEG in 80 ul Wasser, gemischt mit 0,5 ml nicht-fibrillärem Collagen (35 mg/ml), zu einer dPEG-Endkonzentration von 1 Vol.%;
(5) 15 mg dPEG in 80 ul Wasser, gemischt mit 0,5 ml nicht-fibrillärem Collagen (35 mg/ml), zu einer dPEG-Endkonzentration von 3 Vol. %;
(6) 5 mg dPEG in 0,5 ml PBS, zu einer dPEG-Endkonzentration von 1 Vol.%; und
(7) GAX.
Die dPEG-Lösungen von Proben 1, 2, 4 und 5 wurden in eine 1 ml große Spritze eingebracht, die mit einem Luer-Sperr-Fitting und -Verbindungsstück ausgestattet und mit einer anderen Spritze verbunden war, welche das Collagenmaterial enthielt. Die Lösungen wurden durch mehrmaliges Hin- und Her-Durchlassen der Flüssigkeiten zwischen den Spritzen gemischt, um das homogene Reaktiongemisch zu bilden.
Das Spritzenverbindungsteil wurde dann entfernt und mit einer 27-Gauge-Nadel ersetzt, und etwa 50 ul des Reaktionsgemisches wurden intradermal in jedes von 20 Meerschweinchen injiziert. Die Proben 3, 6 und 7 wurden in entsprechender Weise durch eine 27-Gauge-Nadel verabreicht. Nach Zeitdauern bis zu 30 Tagen im Anschluß an die Injektion wurden die Behandlungsstellen gewonnen und histologisch untersucht.
Bei 30 Tagen schienen alle der Materialien biokompatibel zu sein. Die Proben 1 und 2 zeigten eine weite Verteilung mit einem intermediären Grad des Ineinandergreifens mit dermalen Collagenfasern. Die Kolonisierung durch Bindegewebszellen war mäßig und eine Spur von Rundzell-Infiltration mit Eosinophilen wurde beobachtet.
Die Proben 3, 4 und S waren hoch verteilt und mit dermalen Collagenfasern fein verzahnt. Die Kolonisierung war mild bis mäßig und Spurenmengen von Rundzell-Infiltration wurden beobachtet.
Die Probe 6 besaß keine nachweisbaren Effekte. Die Probe 7 trat in Form von großen Inseln mit mäßiger Kolonisierung und spurenartigen bis milden Entzündungsspiegeln auf.

Beispiel 5

(Beschichtung von Implantaten)

Ein Collagen-dPEG-Reaktionsgemisch wurde wie im obenstehenden Beispiel 1C beschrieben hergestellt. Ein Titanium-Implantat wurde, etwa 20 Minuten nachdem die Quervernetzung eingeleitet worden war, in das Reaktionsgemisch eingetaucht. Das Implantat wurde dann fertig vernetzen gelassen und über Nacht getrocknet.

Beispiel 6

(Collagen/Polymer-Wachstumsfaktor-Konjugate)

(A) Ein Konjugat mit vernetztem Collagen/dPEG-TGF-β1 wurde wie folgend hergestellt:
Eine Lösung von TGF-β 1 und ¹²&sup5;I-TGF-β 1 (10&sup5; cpm; 25 ul von 1 mg/ml) wurde zu einer Lösung von dPEG* (4 mg) in CH&sub2;Cl&sub2; (100 ul) zugegeben, und die Mischung wurde 12 (Probe #3) oder 35 (Probe #5) Minuten lang bei 17ºC reagieren gelassen. Dazu wurden 2,5 ml Collagenlösung (3 mg/ml nicht-fibrilläres Atelopeptid-Collagen) gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubieren gelassen. Das Pellet, das sich bildete, wurde durch Zentrifugation gesammelt, um CollagenldPEG-TGF-β1 vorzusehen.
(B) Eine auf fibrillärem Atelopeptid-Collagen basierende Zusammensetzung wurde wie im obenstehenden Teil A hergestellt, wobei jedoch die TGF-β1/dPEG*-Reaktionszeit auf 2 Minuten beschränkt wurde, und 7 mg fibrilläres Collagen (innerhalb von 2 Minuten vor der Anwendung aus Collagen in Lösung gefällt) für Collagen in Lösung substituiert wurde.
(C) Eine Zusammensetzung, die dPEG/quervernetztes Collagen und freies TGF-β1 enthielt, wurde wie folgend hergestellt:
Eine Lösung von dPEG* (4 mg) in CH&sub2;Cl&sub2; (100 ul) wurde zu 2,5 ml CIS (3 mg/ml nicht-fibrilläres Atelopeptid-Collagen) gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur inkubieren gelassen. Das Pellet, das sich bildete, wurde gewaschen, um nicht-reagiertes dPEG* zu entfernen, und 25 ug TGF-β1 wurden beigemischt, um Collagen/dPEG + TGF-β1 zur Verfügung zu stellen.
(D) Das Ausmaß der TGF-β1-Bindung wurde wie folgend ermittelt:
Jede in den obenstehenden Teilen A-C hergestellte Zusammensetzung wurde sechsmal mit 0,5 ml Puffer (0,02 M Phosphatpuffer, 0,1% BSA) durch heftiges Vortexen gewaschen, gefolgt von Zentrifugation, um nicht-gebundenes TGF-β1 zu entfernen. Das Pellet und die Überstände wurden bei jedem Waschschritt gesammelt und wurden ausgezählt. Die Fig. 2 zeigt die Freisetzungsrate der Zusammensetzungen von Teil A (offene Kreise) und Teil B (gefüllte Kreise) gegenüber der einfachen Mischung, die in Teil C hergestellt wurde (x'e), wobei die Anzahl freigesetzter Zähleinheiten als eine Funktion des Waschzyklus gezeigt ist. Wie in der Figur gezeigt, wird das TGF-β1 in der einfachen Mischung innerhalb von 6 Waschschritten quantitativ freigesetzt, wohingegen etwa 40% des TGF-β1 in den Zusammensetzungen von Teil B zurückgehalten werden, und 50% in den Zusammensetzungen von Teil A zurückgehalten werden.
(E) Die biologische Aktivität der obenstehend hergestellten Materialien wurde wie folgt geassayt:
Zusammensetzungen, hergestellt gemäß Teil A (CIS-dPEG-TGF-β 1) (TGF-β1/dPEG*- Reaktionszeit von 12 Minuten) und Teil C (CIS-dPEG + TGF-β1), wurden hergestellt, als auch eine Kontrolle, die gemäß Teil C ohne TGF-β1 hergestellt wurde (CIS-dPEG). Die Proben wurden achtmal in PBS/BSA gewaschen, wie beschrieben in Teil D, danach weitere drei Male in fötalem Rinderserum (Gibco) bei 37ºC gewaschen. Dieses Waschprotokoll führte zu einem visuell nachweisbaren Materialverlust, so daß der verbleibende TGF-β1-Gehalt durch Auszählen des verbleibenden ¹²&sup5;I ermittelt wurde. Die TGF-β1-Aktivität wurde dann durch ELISA geassayt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Zurückbehaltung der biologischen Aktivität
Die Daten zeigen, daß das in den Zusammensetzungen der Erfindung zurückgehaltene TGF-β1 in einer im wesentlichen aktiven Form verbleibt.

Beispiel 7

(Formulierungen)

(A) Eine zur Implantation durch Injektion geeignete Formulierung wurde durch Suspendieren von Collagen/PEG in sterilem Wasser zur Injektion bei 35 mg/ml hergestellt. Die Merkmale der resultierenden Formulierung sind im obenstehenden Beispiel 2 beschrieben.
(B) Eine zur Reparatur von Defekten von Knochen, die Belastungen ausgesetzt sind, (z. B. Brüche, Nicht-Zusammenwachsen und dergleichen) nützliche Formulierung kann hergestellt werden, indem Collagen/PEG der Erfindung mit einer geeigneten teilchenförmigen unlöslichen Komponente gemischt wird. Bei der unlöslichen Komponente kann es sich um fibrilläres quervernetztes Collagen, Gelatineperlen, Polytetrafluorethylenperlen, Siliconkautschukperlen, Hydrogelperlen, Siliciumcarbidperlen, Mineralperlen oder Glasperlen, und vorzugsweise um ein Calciummineral, zum Beispiel Hydroxyapatit und/oder Tricalciumphosphat, handeln.
Feste Formulierungen wurden hergestellt, indem Zyderm®II (65 mg/ml Collagen) oder Collagen-mPEG (63 mg/ml) mit teilchenförmigem Hydroxyapatit oder Tricalciumphosphat (HA + TCP) gemischt und an der Luft getrocknet wurden, um einen festen Block zu bilden, der 65 Gew.-% HA enthielt. Wahlweise wurden die Blöcke durch 10 Stunden langes Erwärmen bei 75ºC wärmebehandelt. Die resultierenden Blöcke wurden 12 Stunden lang in 0,13 M Kochsalzlösung vor dem Testen hydratisiert.
Nach einem Stehenlassen wurde beobachtet, daß sich die Zyderm®-HA + TCP (Z- HA)-Zusammensetzungen in drei Phasen aufteilten, wohingegen PEG/Collagen-HA + TCP (PC-HA)-Zusammensetzungen einzelphasig blieben.
Jeder Block wurde um 5% gedehnt, und seine Spannungsrelaxation wurde eine Minute lang nach Loslassen überwacht. Nach diesem Test wurde jeder Block einer konstanten Streckung bei einer Konstante von 1 cm/min bis zum Zerreißen unterzogen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt: Tabelle 3: Mechanische Festigkeit
Alle Kräfte sind in Newton angegeben. Die Dehnung beim Zerreißen (Spannung) ist in Prozent der Streckung angegeben.
Die Daten zeigen, daß Collagen/Polymer HA+TCP-Zusammensetzungen bildet, welche eine wesentlich größere Zugfestigkeit aufzeigen. Daher kann man Implantat-Zusammensetzungen mit Collagen/Polymer herstellen, welche wesentlich fester sind als Zusammensetzungen, welche die gleiche Menge an nicht-konjugiertem Collagen verwenden, oder man kann die eingesetzte Menge an Collagen/Polymer vermindern, um eine Zusammensetzung gleicher Festigkeit zu erzeugen.

Claims

1. Konjugat, umfassend ein nicht-toxisches, nicht zu Entzündungen führendes (bei subkutaner Verabreichung) im wesentlichen wasserlösliches synthetisches hydrophiles Polymermolekül, das kovalent an einen verfügbaren Lysinrest von Atelopeptid-Collagen gebunden ist.

2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das synthetische hydrophile Polymermolekül an 10-50% der verfügbaren Lysinreste des Atelopeptid-Collagens gebunden ist und wobei das Verhältnis von Collagenmolekülen zu synthetischen Polymermolekülen 1 : 1 bis 1 : 20 beträgt.

3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das synthetische Polymermolekül Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 400 bis 20000 ist.

4. Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das synthetische Polymermolekül ein erstes Ende hat, das an einen Lysinrest des Collagens gebunden ist, und ein zweites Ende, das an einen Wachstumsfaktor gebunden ist, der ein Epidermiswachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor-α, transformierender Wachstumsfaktor-β, transformierender Wachstumsfaktor-β1, transformierender Wachstumsfaktor-β2, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-AA, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-AB, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-BB, saurer Fibroblastwachstumsfaktor, basischer Fibroblastwachstumsfaktor, Bindegewebe-aktivierendes Peptid, β- Thromboglobulin, ein insulinartiger Wachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor, ein Interleukin, ein Kolonie-stimulierender Faktor, Erythropoietin, Nervenwachstumsfaktor, ein Interferon oder ein osteogener Faktor ist.

5. Zusammensetzung, geeignet zur Vermehrung von weichem Gewebe, umfassend ein Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Collagen fibrilläres Atelopeptid-Collagen ist, das synthetische Polymer Monomethyl-polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1900 bis 8000 ist und wobei das Monomethyl-polyethylenglykol kovalent an 10-50% der verfügbaren Lysinreste des Collagens gebunden ist.

7. Zusammenetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das synthetische Polymermolekül ein erstes Ende hat, das kovalent an einen Lysinrest des Collagens gebunden ist, und ein zweites Ende, das kovalent an einen Wachstumsfaktor gebunden ist, der Epidermiswachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor-β, ein osteoinduktiver Faktor oder ein hämatopoietischer Faktor ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in Form einer Suspension von Collagen/Polymer-Konjugatteilchen in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der flüssige Träger in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die Zusammensetzung geschmeidig zu machen.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der flüssige Träger in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um die Zusammensetzung injizierbar zu machen.

11. Injizierbare Zusammensetzung zur Vermehrung von weichem Gewebe, wobei die Zusammensetzung umfaßt:

(i) Atelopeptid-Collagen,

(ii) ein nicht-toxisches, nicht zur Entzündungen führendes (bei subkutaner Verabreichung) im wesentlichen wasserlösliches synthetisches hydrophiles Polymer, das an jedem Ende eine reaktionsfähige Gruppe aufweist, die in der Lage ist, in situ mit einem verfügbaren Lysinrest, der auf dem Collagen vorhanden ist, eine kovalente Bindung zu bilden und

(iii) einen flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Polymer Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 400 bis 20000 umfaßt, die reaktionsfähigen Gruppen des Polymers N- Hydroxysuccinimidester sind und wobei die Zusammensetzung 10 bis 100 mg/ml Collagen und 0,1 bis 30% synthetisches hydrophiles Polymer mit reaktionsfähigen Endgruppen enthält.

13. Zusammensetzung zur Reparatur von Knochendefekten, wobei die Zusammensetzung umfaßt:

(i) ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3,

(ii) ein teilchenförmiges Material, und

(iii) einen flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Polymer des Konjugats Monomethyl-polyethylenglykol ist und wobei das teilchenförmige Material fibrilläres vernetztes Collagen, Gelatineperlen, Polytetrafluorethylenperlen, Siliconkautschukperlen, Hydrogelperlen, Siliciumcarbidperlen, Glasperlen, Hydroxyapatitteilchen, Tricalciumphosphatteilchen oder ein Gemisch aus Hydroxyapatit- und Tricalciumphosphatteilchen ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, umfassend ferner einen Wachstumsfaktor, der Epidermiswachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor-α, transformierender Wachstumsfaktorβ, transformierender Wachstumsfaktor-β1, transformierender Wachstumsfaktor-β2, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-AA, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-AB, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-BB, saurer Fibroblastwachstumsfaktor, basischer Fibroblastwachstumsfaktor, ein insulinartiger Wachstumsfaktor, Interleukin, ein Koloniestimulierender Faktor, Erythropoietin, Nervenwachstumsfaktor, ein Interferon oder ein osteogener Faktor ist.

16. Zusammensetzung zur Reparatur von Knochendefekten in Knochen, die Belastungen ausgesetzt sind, umfassend:

(i) ein synthetisches Polymer/Collagen-Konjugat nach Anspruch 1, wobei das synthetische Polymer Monomethyl-polyethylenglykol ist, und

(ii) ein teilchenförmiges Material, das fibrilläres vernetztes Collagen, Gelatineperlen, Polytetrafluorethylenperlen, Siliconkautschukperlen, Hydrogelperlen, Siliciumcarbidperlen, Glasperlen, Hydroxyapatitteilchen, Tricalciumphosphatteilchen oder ein Gemisch aus Hydroxyapatit- und Tricalciumphosphatteilchen ist.

17. Zusammensetzung zum Ersatz oder zur Vermehrung von Knorpeln, umfassend ein synthetisches Polymer/Collagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung eine Dichte von 0,5 bis 1,5 g/cm' aufweist.

18. Festes Implantat, das mit einer Zusammensetzung überzogen ist, umfassend ein synthetisches Polymer/Collagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

19. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Polymer/Collagen-Konjugats nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Umsetzen von Atelopeptid-Collagen in wäßriger Lösung mit einem nicht-toxischen, nicht zu Entzündungen führenden (bei subkutaner Verabreichung) im wesentlichen wasserlöslichen synthetischen hydrophilen Polymer mit einer reaktionsfähigen Gruppe, die in der Lage ist, mit einem verfügbaren Lysinrest des Collagens eine kovalente Bindung zu bilden, umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das synthetische hydrophile Polymer aktiviertes difunktionelles PEG (dPEG*) ist, das eine reaktionsfähige Gruppe an jedem Ende aufweist, die in der Lage ist, mit einem verfügbaren Lysin des Collagens eine kovalente Bindung zu bilden.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Collagen in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 10 bis 100 mg/ml vorhanden ist und wobei das hydrophile Polymer aktiviertes difunktionelles PEG (dPEG*) ist, das eine reaktionsfähige Gruppe an jedem Ende aufweist, die in der Lage ist, mit einem verfügbaren Lysinrest des Collagens eine kovalente Bindung zu bilden, und in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 0,1 bis 30 Gew.-% vorhanden ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Collagen in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 3 bis 100 mg/ml vorhanden ist und wobei das synthetische hydrophile Polymer aktiviertes difunktionelles PEG (dPEG*) ist, das eine reaktionsfähige Gruppe an jedem Ende aufweist, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einem verfügbaren Lysinrest des Collagens zu bilden, und in dem Reaktionsgemisch in einer Konzentration von 5 bis 40 Gew.-% vorhanden ist.

23. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das synthetische hydrophile Polymer Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 400 bis 20000 ist.

24. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vermehrung, zum Ersatz oder zur Reparatur von weichem Gewebe, zur Reparatur oder Behandlung von Knochendefekten, zum Ersatz oder zur Vermehrung von Knorpeln, zum Ersatz oder zur Reparatur von geschädigter Haut, Nervenscheiden oder Blutgefäßen oder zur Wiederherstellung von normalen oder erwünschten Hautkonturen oder zum Ersatz von subkutanem Fett in maxilaren Bereichen, das durch Alterung verlorgengegangen ist.