DE60112908T2

DE60112908T2 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten, nicht hydroxylierten kollagen-polypeptide-fasern und daraus hergestellte fasern

Info

Publication number: DE60112908T2
Application number: DE60112908T
Authority: DE
Inventors: Stephanie Perret; Florence Ruggiero
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 2000-04-10
Filing date: 2001-04-09
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2021-04-10
Also published as: US20030129699A1; WO2001077422A1; FR2807436B1; EP1274888B1; FR2807436A1; EP1274888A1; AU4445301A; CA2405250A1; DE60112908D1; JP2003530491A; US7232886B2; ATE302864T1

Description

BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern und insbesondere rekombinante nichthydroxylierte Kollagenpolypeptidfasern.
Kollagenpolypeptide bilden eine große Familie struktureller Polymere, basierend auf Polypeptidketten, die als Helices assembliert sind, entweder als Heterotrimere oder als Homotrimere, und die in einer bedeutenden Anzahl von Zellen wie z. B. tierische, Säugetier-, humane, Fisch- oder Quallenzellen vorliegen oder hergestellt werden. Bislang wurden ungefähr zwanzig Arten von humanem Kollagen identifiziert, wobei jedes einzelne eine besondere Rolle im humanen Körper spielt.
Im Allgemeinen sind Verfahren zur Herstellung nativer Kollagenfasern, z. B. aus Rinderquellen, gut bekannt. Es ist z. B. bekannt, dass Typ I-Kollagen in tierischen Geweben als Fasern in der extrazellulären Matrix vorliegt und dass sich diese Fasern nach der Extraktion des nativen Kollagens unter geeigneten Bedingungen leicht wieder ausbilden lassen. Das klassische Verfahren im Labor als ein Beispiel zur Bildung von Fasern aus nativem Kollagen in Lösung besteht darin, das native Kollagen in einen salzhaltigen Phosphatpuffer bei pH 7 (PBS) bei 4°C zu geben und dann die Temperatur auf 35°C zu erhöhen. Das native Kollagen polymerisiert dann in gestreifte Fasern, die durch Zentrifugation in einem Pellet angereichert werden können.
Die Stabilität der Helices und sogar der Kollagenpolypeptidfasern selbst wurde herkömmlicherweise derart charakterisiert und identifiziert, dass sie mit dem hohen Grad an Hydroxylierung der Moleküle, hauptsächlich an den Hydroxyprolin-Aminosäureresten, welche in relativ hohen Mengen in der Polypeptidkette vorliegt, in Verbindung steht. Insofern rekombinantes Kollagen betroffen ist, ist das gebildete Kollagenpolypeptid nur hydroxyliert, wenn seine Herstellung in einer Zelle stattfindet, die natives Kollagen produziert, da in diesem Fall die Zelle ebenfalls ein für die Hydroxylierung essentielles biosynthetisches Enzym herstellt, nämlich Prolyl-4-hydroxylase. Es wurde gezeigt, dass bestimmte rekombinante Zellen oder solche, die genetisch modifiziert worden sind und normalerweise keine Gene kodierend für die Herstellung eines nativen Kollagens enthalten, bei physiologischen Temperaturen (Berg, R. A. und Prockrop, D. J., 1973) ohne dieses Enzym, welches für die posttranslationale Hydroxylierung der in der Y-Aminosäureposition des Gly-X-Y-Tripletts der Kollagenkette sich befindenden Proline verantwortlich ist, keine stabilen hydroxylierten Kollagenpolypeptide bilden konnten. Es wurde von Versuchen berichtet, bei denen ein Gen kodierend für die Prolyl-4-hydroxylase während der Expression von Kollagenalpha I- oder alpha II-Ketten in Pichia oder Baculovirus-Zellen co-exprimiert wurde, um zu ermitteln, ob ein homotrimeres rekombinantes und hydroxyliertes Kollagen hergestellt werden konnte.
Es lässt sich feststellen, dass sich daher alle bisherigen Versuche auf die Herstellung des rekombinanten Kollagenpeptids so konform wie möglich zu seinem nativen Äquivalent gerichtet haben, da man glaubte, dass rekombinante nichthydroxylierte Kollagenpolypeptide keine Fasern auf stabile Weise bilden könnten oder dazu veranlasst werden könnten, was sie wiederum dazu befähigt hätte, transformiert und als Biomaterialien in so gut wie der gleichen Weise wie natives Kollagen verwendet zu werden.
Dem Anmelder der vorliegenden Erfindung ist es jedoch gelungen, den zeitaufwändigen und schwierigen Ansatz umfassend die Co-Expression hydroxylierender Enzyme zu vermeiden und entgegen aller erhaltenen Kenntnisse auf dem Gebiet der rekombinanten Kollagenherstellung mittels eines spezifischen Herstellungsverfahrens rekombinante nichthydroxylierte Kollagenpolypeptidfasern herzustellen. Die durch dieses Verfahren erhaltenen Fasern können anschließend entsprechend verschiedener Prozesse transformiert werden, um Produkte zu erhalten, die als Biomaterialien ähnlich wie solche, die für natives Kollagen gefunden wurden, verwendet werden können.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern, dadurch gekennzeichnet, dass die Fibrillogenese unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:

– eine Temperatur zwischen etwa 4°C und etwa 26°C;
– das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird in einer Säure verdünnt;
– das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird bei einer Temperatur, die niedriger ist als die übliche physiologische Temperatur des entsprechenden nativen Kollagens, dialysiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptidfasern, die durch den Prozess des vorstehenden Verfahrens erhalten wurden.
Vorzugsweise ist das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid pflanzlichen Ursprungs. Andere nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptide können ebenfalls in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese rekombinanten Polypeptide können zum Beispiel von Zellen hergestellt werden, die normalerweise kein hydroxyliertes Kollagen herstellen, zum Beispiel nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptide, die von Hefen wie z. B. Pichia sp. oder noch mehr bevorzugt Pichia pastoris oder sogar Saccharomyces sp. wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder sogar von Insektenzellen, wie solche des Baculovirus, oder sogar Bakterienzellen wie z. B. Escherichia coli und ähnliche, hergestellt werden.
Vorzugsweise wird das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid pflanzlichen Ursprungs durch Einführen von einer oder mehreren DNA-Sequenzen, die für das Polypeptid kodieren, in eine Pflanze oder andernfalls in eine Zelle, die normalerweise kein Kollagen produziert, erhalten.
Die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptide umfassen im Allgemeinen mehrere Ketten, zum Beispiel alpha-Ketten von humanem Kollagen. Diese Ketten können in Abhängigkeit von dem rekombinanten Kollagenpolypeptid, dessen Verwendung gewünscht wird, verschiedener Art sein. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinane Kollagenpolypeptid ein Kollagen, welches mindestens eine humane alpha I-Kette umfasst. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das rekombinante Kollagenpolypeptid ein Kollagen, welches mindestens eine humane alpha I-Kette und mindestens eine weitere humane alpha-Kette umfasst. Noch mehr bevorzugt ist das rekombinante Kollagenpolypeptid ein Kollagen, welches mindestens drei humane alpha I-Ketten umfasst.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid in einer Säure bei einer Konzentration von etwa 200 mg/ml verdünnt.
Noch mehr bevorzugt ist die Säure 0,1 M Essigsäure.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Dialyse bei 4°C durchgeführt.
Noch mehr bevorzugt wird die Dialyse gegen einen Monokaliumphosphatpuffer ohne die Zugabe von Salzen durchgeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Dialyse gegen einen 10 mM pH 7 Monokaliumphosphatpuffer für 12 Stunden durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Fasern nichthydroxylierter rekombinanter Kollagenpolypeptide, erhältlich durch Fibrillogenese, die unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:

– eine Temperatur zwischen etwa 4°C und etwa 26°C;
– das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird in einer Säure verdünnt;
– das verdünnte, nichthydroxylierte rekombinante Kollegenpolypeptid wird unterhalb der üblichen physiologischen Temperatur des entsprechenden nativen Kollagens dialysiert.

Vorzugsweise können die Fasern gemäß den vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispielen gewonnen werden.
Vorteilhafterweise und vorzugsweise werden die nach der Dialyse gebildeten Fasern durch Zentrifugation getrennt.
Gemäß einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform der vorhergehenden Ausführungsform kann die Zentrifugation bei 20.000 G für 10 Minuten durchgeführt werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben die nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern einen Durchmesser zwischen etwa 100 nm und etwa 200 nm.
Noch weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Biomaterialien, die aus den gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Fasern gewonnen wurden oder auf ihnen basieren, wobei die Fasern vorzugsweise retikulär sein können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt das Biomaterial in Form eines Schwamms vor.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Biomaterial in Form eines Films oder eines Gels vor. Vorzugsweise und in Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung kann dieser Film oder dieses Gel an menschliches Gewebe anhaften oder nicht.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform weist das Biomaterial eine dreidimensionale Struktur, vorzugsweise in Form eines Rohres, auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das auf den nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern basierende oder hiervon erhaltene Biomaterial durch Kleben, Sprühen, Induzieren, Imprägnieren, Fusionieren oder Extrudieren an oder in eine prothetische Struktur assoziiert. Solche Strukturen sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt, da Kollagen häufig zum Bedecken solcher prothetischen Strukturen verwendet wird, z. B. um post-operative Adhäsionen zu vermeiden oder um eine Auslaufdichtigkeit der Struktur bezüglich der Strömung körperlicher Flüssigkeiten, wie z. B. im vaskulär-zirkulatorischen System, zu gewährleisten. Daher ist die prothetische Struktur in einer bevorzugten Ausführungsform ein gestricktes oder nicht gestricktes Netz oder eine Gefäßprothese und noch mehr bevorzugt eine endovaskulare Prothese wie z. B. ein Stent. Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung eines oder mehrerer bevorzugter Ausführungsbeispiele, beginnend mit einem aus einer rekombinanten oder transgenen Pflanzenzelle erhaltenen nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptid, besser verstanden werden. Die folgende ausführliche Beschreibung wird lediglich als eine nicht-limitierende Illustration der verschiedenen Gegenstände, welche die vorliegende Erfindung umfassen, angeführt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung können nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptidfasern über ein alternatives Verfahren, das keine Dialyse verwendet, unter den folgenden Bedingungen erhalten werden:

– nichthydroxyliertes rekombinantes Kollagenpolypeptid in Säure verdünnen;
– die Lösung aus nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagen mit einem Puffer bei hohem pH ohne den Zusatz von Salzen in Kontakt bringen, wobei die resultierende Endlösung einen neutralen pH und eine Konzentration von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagen aufweist, die niedriger ist als die der anfänglichen Konzentration.

Vorzugsweise wird das Verfahren unterhalb der Denaturierungstemperatur des äquivalenten nativen Kollagenpolypeptids durchgeführt, und noch mehr bevorzugt von 4°C bis 26°C, noch mehr bevorzugt bei etwa 10°C.
Gemäß eines noch mehr bevorzugten Ausführungsbeispiels dieses Verfahrens wird das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid in einer organischen Säure und vorzugsweise in Essigsäure verdünnt. Vorzugsweise wird das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid in der Säure bei einer anfänglichen Konzentration von 400 mg/ml verdünnt.
Gemäß dieses bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung wird die Lösung des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptids mit einem Puffer bei hohem pH in Kontakt gebracht. Vorzugsweise ist der Puffer ein Phosphatpuffer, z. B. Monokaliumphosphatpuffer, und ist am meisten bevorzugt konzentriert, z. B. zweifach konzentriert. Der pH des Puffers ist hoch und liegt vorzugsweise zwischen 11 und 14, noch mehr bevorzugt bei etwa 12 und am meisten bevorzugt bei 12,3. In einem am meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Volumen des Puffers mit einem Volumenäquivalent von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid in Säure in Kontakt gebracht, und die Endkonzentration nach Neutralisierung beträgt 200 mg/ml an nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 stellt das durch ein Transmissionselektronenmikroskop erhaltene Bild der nichthydroxylierten rekombinanten Kollagen-Typ I-Polypeptidfasern dar, die nach Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden;
2 stellt das durch ein Transmissionselektronenmikroskop erhaltene Bild von nativen Kollagen-Typ I-Fasern dar, die durch herkömmliche Fibrillogenese erhalten wurden.
Beispiel
Ein rekombinantes Kollagenpolypeptid wird aus stabil transformierten Tabakpflanzen extrahiert, die eine cDNA enthalten, welche für eine N-Propeptid-deletierte humane alpha 1(I) Kollagenkette codiert. Das Kollagenpolypeptid wird aufgereinigt und liegt nach der Aufreinigung als eine [?1(I)]₃ Tripelhelix vor, in welcher die C-Propeptiddomäne in planta abgespalten wurde. Das rekombinante Kollagenpolypeptid ist in 0,1 M Essigsäure löslich. Eine Aminosäureanalyse des so erhaltenen Polypeptids stellte dar, dass es nicht an den Prolinresten hydroxyliert wurde, was zu einer Verminderung seiner Denaturierungstemperatur auf 30°C anstelle von 41,5°C für eine Rinderkollagen-Kontrollprobe führte.
In Geweben liegt natives Typ I-Kollagen in Form von Fasern in der extrazellulären Matrix vor.
Wenn eine Fibrillogenese in vitro durchgeführt wird, ermöglicht die Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop die Einschätzung des Vorliegens oder der Abwesenheit der Faserbildung.
Die in vitro-Fibrillogenese des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptids wurde mit der von homotrimerem [a1(I)]₃ Rinderkollagen verglichen. Mehrere Experimente wurden durchgeführt, bei denen Puffer, Temperatur und Ionenstärke getestet wurden. Die üblichen Bedingungen für eine Fibrillogenese mussten für das rekombinante Kollagenpolypeptid pflanzlichen Ursprungs, welches nichthydroxyliert ist und eine Denaturierungstemperatur von 30°C aufweist, modifiziert werden. Temperaturen oberhalb von 28 bis 30°C wurden daher ausgeschlossen, und solche im Bereich von 4°C bis 26°C wurden gewählt. Phosphatpuffer in der Gegenwart von Salzen (PBS, 20 mM Monokaliumphosphat mit oder ohne Zugabe von 140 mM Salzen), pH-Variationen von neutral bis basisch und schließlich Kollagenpolypeptid-Konzentrationsvariationen in Lösung (200 mg bis 2 mg/ml) erlaubten keine Faserbildung mit dem nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptid im Gegensatz zu homotrimerem Rinderkollagen, wobei unter diesen Bedingungen nur ein Netzwerk feiner Fibrillen erhalten wurde. Am Ende erwies sich für das aus transformierten Pflanzen erhaltene nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid nur eine einzige Zusammenstellung von Bedingungen als effektiv für die Bildung von Fasern.
Das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wurde in 0,1 M Essigsäure auf 200 mg/ml verdünnt, anschließend bei 4°C gegen einen 10 mM pH 7 Monokaliumphosphatpuffer für 12 Stunden dialysiert. Nach der Zentrifugation bei 20.000 G für 10 Minuten wurden die gebildeten Fasern im Gegensatz zu den Molekülen, die noch in Lösung vorlagen, im Pellet gesammelt. Das erhaltene Pellet wurde in einem Volumen an Dialysepuffer resuspendiert, welches fünffach geringer war als das Volumen des Überstands. Eine Fraktion des Überstands und des Pellets wurde auf ein 6% Acrylamid SDS-Page Elektrophoresegel aufgetragen. Das Gel zeigte, dass das rekombinante Kollagenpolypeptid ebenso wie das native homotrimere Rinderkontrollkollagen hauptsächlich im Pellet vorlag. Nach einer Negativfärbung wurde das im Pellet enthaltene Kollagenpolypeptid unter einem Transmissionselektronenmikroskop beobachtet. Bei dem rekombinanten Kollagenpolypeptid wurde die Anwesenheit von Fasern mit Durchmessern im Bereich von etwa 100 bis etwa 200 nm beobachtet. Das native homotrimere Rinderkollagen war unter diesen Bedingungen zu Fibrillen im Bereich von 10 bis 40 nm Durchmesser polymerisiert, und diese Fibrillen waren nicht gestreift, obwohl natives Kollagen unter Bedingungen höherer Ionenstärke dazu fähig ist.
Die aus nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid gebildeten Fasern wurden gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung in einem Phosphatpuffer ohne die Zugabe von Salzen erhalten, wohingegen die Gegenwart solcher Salze zum Erhalten gestreifter Fasern aus nativen Kollagenen in vitro wichtig ist. Ohne durch jedwede Theorie beschränkt sein zu wollen, scheint es, dass bei den oben beschriebenen Bedingungen die Abwesenheit von Salzen zu einer Erhöhung der elektrostatischen Wechselwirkungen führt und dadurch die Präzipitation der nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptide als gestreifte Fasern ermöglicht wird.
Kollagenstabilität
Es ist wahrscheinlich, dass das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid durch seine fibrilläre Struktur stabilisiert wird. Die Stabilität wurde mittels Trypsinverdau bei unterschiedlichen Temperaturen getestet. Nach einer zwanzigminütigen Inkubation bei einer gegebenen Temperatur wurde das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid mit Trypsin in Kontakt gebracht. Unter Verwendung von Gelelektrophorese wurde das Fortbestehen einer Migrationsbande, die der einer intakten alpha 1(I)-Kette entsprach, zur Bestimmung der Resistenz und dadurch der Abwesenheit oder dem Vorliegen von Denaturierung des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptids verwendet. Die Stabilität des Kollagenpolypeptids bei 37°C wurde ebenfalls im Zeitverlauf getestet.
Retikulation
Um die Stabilität des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptids zu verbessern, wurde letzteres in Form von Fasern retikuliert und die Denaturierungstemperatur erneut getestet. Um dies durchzuführen, wurden mehrere verschiedene Retikulierungsmittel unterschiedlicher Größen (7,7A, 11,4A etc.) getestet, z. B. Disuccinimidglutarat (DSG), welches eines homobifunktionales Molekül von 7,7A ist. Diese Agenzien reagieren mit freien Aminen, insbesondere Lysinen und den N-terminalen Enden von Proteinen. Die zu retikulierende Kollagenpolypeptidlösung wurde bei einer Konzentration kleiner oder gleich 250 mg/ml in eine 0,01 M Essigsäurelösung gegeben. Diese Lösung wurde zweimal in einer PBS-Pufferlösung verdünnt, die zweifach konzentriert worden war. Der pH wurde anschließend auf Neutralisierung der Lösung eingestellt. Dann wurde eine Lösung des Retikulierungsmittels bei einer Konzentration von 5 mM hergestellt. Ein Volumen dieser Lösung wurde bei einer molaren Konzentration, die 50-fach der des Kollagens entsprach, zu der rekombinanten Kollagenpolypeptidlösung gegeben. Die Mischung wurde bei 4°C für 5 bis 20 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe einer final 0,1 M Trislösung gestoppt. Die Retikulation des Kollagenpolypeptids wurde durch Gelelektrophorese mit einem Acrylamidgradienten von 3,5 bis 5% kontrolliert. Die Konversion der migrierenden Bande entsprechend der alpha 1-Kollagenkette in eine Bande, die bei einer Größe von 300 kDa migrierte, demonstrierte die Retikulation des Kollagens.
Gelbildung
Die Bildung eines dichten Gels kann schnell durch sofortige Änderung von pH, Ionenstärke und Temperatur durchgeführt werden. Um dies durchzuführen, wurde eine Lösung aus Kollagenpolypeptid bei einer Konzentration von 1,5 bis 3 mg/ml in Essigsäure mit serumfreiem Kulturmedium, das zweifach konzentriert worden war, gemischt (1:1 vol/vol). Der pH wurde schnell mit Natriumhydroxid auf Neutralisierung eingestellt. Die Mischung wurde bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und die Bedingungen für pH oder Ionenstärke wurden ebenfalls modifiziert, um die Bildung des Gels zu verbessern. Das dadurch erhaltene Gel wurde für die Untersuchung unter dem Transmissionselektronenmikroskop aufbereitet.
Analyse der Fasern
Die aus nichthydroxyliertem rekombinaten Kollagen in einem 10 mM pH 7 Phosphatpuffer mittels Dialyse bei 4°C gebildeten Fasern wurden nach Positivfärbung mit Uranacetat und Tungsten-Phosphorsäure unter einem Transmissionselektronenmikroskop analysiert. Wie aus 1 hervorgeht, wurden sowohl gestreifte als auch nicht-gestreifte Fasern beobachtet. 1 ist eine Darstellung des Bildes, das durch das Transmissionselektronenmikroskop aus den nichthydroxylierten Typ I-Kollagenpolypeptidfasern erhalten wurde, die nach dem Anwenden des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet wurden. Die gestreiften Fasern hatten eine Periodizität von näherungsweise 67 nm entlang der Faserachse, was charakteristisch für die in nativen Kollagen-I-Fasern beobachtete Periodizität ist. 2 stellt das Bild dar, welches aus dem Transmissionselektronenmikroskop von nativen Kollagen-Typ I-Fasern, erhalten durch herkömmliche Fibrillogenese, erhalten wurde. Der Durchmesser der erhaltenen und in 1 dargestellten nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenfasern variierte von etwa 30 bis etwa 550 Nanometern, wobei der mittlere Durchmesser etwa 156 Nanometer betrug.
Die Kinetik der Faserbildung wurde durch Trübungsmessung bei 315 Nanometer ermittelt. Quarzküvetten wurden in ein mit einem Wasserkühlungssystem ausgestatteten Spektrophotometer bei 10°C gestellt. Ein Volumen eines 10 mM 2 × konzentrierten Phosphatpuffers, dessen pH auf 12,3 eingestellt wurde, und ein äquivalentes Volumen einer 10 mM Essigsäurelösung enthaltend 400 mg/ml Kollagen wurden nacheinander in die Küvette gegeben, um einen neutralen pH und eine Endkonzentration von 200 mg/ml zu erzielen. Sobald das Kollagen in die Küvette gegeben wurde, wurde ein rascher Anstieg der Trübung beobachtet. Diese erste Beobachtung war von einer fortschreitenden Zunahme der Trübung gefolgt, bis ein Plateau erreicht wurde. Die erhaltene Kurve stimmte mit solchen Kurven überein, die in Fibrillogeneseexperimenten mit nativem Kollagen I beobachtet wurden. Die Beobachtung der Fasern unter einem Transmissionselektronenmikroskop nach der Färbung am Ende der Kinetikmessungen zeigte die Gegenwart gestreifter Fasern. Es war daher möglich, unter Verwendung dieses Verfahrens als eine Alternative zur Dialyse Fasern aus nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid zu erhalten.
Denaturierungstemperatur
Die Denaturierungstemperatur des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagens in faseriger Form wurde durch Zirkulardichroismus ermittelt. Die Spektren wurden bei 10°C unter Verwendung eines mit einer Temperaturregelungseinheit ausgestatteten CD6 Jobin Y von-Spektropolarimeters gemessen. Die Denaturierungstemperatur der Fasern wurde in 10 mM pH 7 Phosphatpuffer bei einer Konzentration von 700 μg/ml gemessen. Die Kinetik der Denaturierung wurde bei 230 nm gemessen, was dem maximalen Signal entspricht, welches in den Spektren vor der Denaturierung beobachtet wurde. Die Temperatur wurde durch Zunahmen von 1°C alle 5 Minuten erhöht, um die Temperaturstabilisierung in der Messkammer zu ermöglichen. Das molekulare nichthydroxylierte rekombinante Kollagen wies eine Denaturierungstemperatur von 30°C auf (Ruggiero et al, 2000), während sie bei demselben rekombinanten Kollagen in faseriger Form auf 36°C anstieg. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Denaturierungstemperatur von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagen in faseriger Form um 6°C zugenommen hatte. Eine solche Temperaturstabilität ermöglicht die Ausführung der Retikulation, um die Temperaturresistenz der Moleküle weiter zu erhöhen und um den Fasern weitere vorteilhafte mechanische Eigenschaften wie z. B. Kompressionswiderstand und Reißfestigkeit zu verleihen.
Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation
Im Allgemeinen können zwei verschiedene Mechanismen der Wechselwirkung von Blutplättchen mit Kollagen unterschieden werden: Diese Mechanismen sind als Adhäsion und Aggregation bekannt. Der Adhäsionsschritt findet innerhalb der ersten Momente des Kontakts des Blutplättchens mit dem Kollagen statt, aber induziert nicht unbedingt die Aggregation.
Die letztere führt in vivo zur Bildung eines blutstillenden Pfropfens nach Verletzung oder Verwundung.
Der Test zur Blutplättchenadhäsion ist ein kolorimetrischer Test, wie beschrieben von (Bellavite et al, 1994). Blut eines gesunden freiwilligen Spenders wurde für 12 Minuten bei 200 g zentrifugiert und der Überstand, welcher der Plättchen-reichen Plasma (PRP)-Fraktion entsprach, abgenommen. Die Blutplättchen wurden anschließend zum Entfernen von Plasmaproteinen gewaschen, und dann wurde ein gerinnungshemmendes Mittel, z B. enthaltend Zitronensäure, Zitrat und Dextrose (CACD), dem Plättchen-reichen Plasma in einem Verhältnis von 1 Volumen CACD auf 10 Volumen PRP zugegeben, und 1 μ1/ml PGE, (Prostaglandin E1 Stammlösung bei 100 μg/ml) wurde ebenfalls zur Hemmung der Aggregation zugegeben und die Mischung für 7 Minuten bei 2.600 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Blutplättchen in Jarmieson's Puffer (5,5 mM Dextrose, 128 mM NaCl, 4,26 mM Na₂HPO₄, 7,46 mM NaH₂PO₄, 4,77 mM Trinatriumzitrat 2H₂O, 2,35 mM Zitronensäure [H₂O], 0,35% BSA und 1 μl/ml PGE₁, auf das Ausgangsvolumen von PRP angeglichen, resuspendiert. Die Suspension wurde erneut für 7 Minuten bei 800 g zentrifugiert und das Pellet in Adhäsionspuffer, der z. B. aus TBS, 5 mM Glukose, 0,5% BSA, pH 7,4 besteht) aufgenommen. Die Anzahl der Blutplättchen wurde auf ungefähr 10⁸ Plättchen/Milliliter im Adhäskonspuffer angepasst und für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fünf Minuten vor der Verwendung wurden 2 mM MG²⁺ Ionen der Suspension zugefügt.
Für den Adhäsionstest wurden 100 Mikroliter rekombinanter Kollagenfasern bei einer Konzentration von 50 μg/ml in 10 mM pH 7 Phosphatpuffer für 60 Minuten bei Raumtemperatur an die Mulden einer Immulon 2-Platte umfassend 96 Wells adsorbiert. Jedes Experiment wurde in Dreifachansätzen durchgeführt. Die Mulden wurden anschließend mit 50 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) in TBS für 30 Minuten abgesättigt und dann dreimal mit 100 μl Adhäsionspuffer gewaschen. 50 Mikroliter der Blutplättchensuspension wurden jeder Mulde zugegeben, und dann wurde die Platte für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die nicht angehefteten Blutplättchen wurden dann entfernt und die Mulden dreimal mit 200 μl Adhäsionspuffer gewaschen. 150 Mikroliter Lysepuffer (0,1 M Zitrat, pH 5,4, 0,1% Triton X100, 5 mM p-Nitrophenylphosphat (1,31 mg/ml) wurden jeder Mulde zugegeben und für 60 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl 2 M NaOH beendet und die Platte bei 405 nm gelesen.
Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass das nichthydroxylierte rekombinante Kollagen, das bei einer Konzentration von 100 μg/ml in faseriger Form adsorbiert war, eine signifikante Adhäsion an die Blutplättchen im Vergleich zu Kontrollfasern, die aus homotrimerem Typ I-Rinderkollagen gebildet waren, aufweist. Es schien aus diesen Ergebnissen hervorzugehen, dass die Blutplättchen nicht zur Erkennung des nichthydroxylierten rekombinanten Kollagens in der Lage waren und daher nicht an das Letztere adhärierten. Diese Eigenschaft ist z. B. bei Materialien nützlich, bei denen die Adhäsion nicht benötigt wird oder als Nachteil angesehen wird oder zu schädlichen Nebeneffekten führt, z. B. in der Bauchchirurgie, wo im Anschluss an das Anbringen von Prothesen, insbesondere Eingeweidebruch-Prothesen, die Trennung der Gewebe erwünscht ist. Die Eigenschaft kann daher zur Verwendung gebracht werden, um Biomaterialien, insbesondere Prothesen, wie z. B. Eingeweidebruch-Prothesen oder jegliche andere prothetische Vorrichtung, zu bilden, die aus solchem kollagenen Material gebildet werden könnten, darauf basieren könnten oder damit beschichtet sein könnten.
Die aggregierenden Eigenschaften der nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptide in faseriger Form wurden ebenfalls untersucht. Die Untersuchung wurde mittels eines Aggregometers bei einer geregelten Temperatur von 20°C und mit dem wie zuvor beschrieben erhaltenen PRP durchgeführt. Eine als Plättchen-armes Plasma (Platelet Poor Plasma, PPP) bekannte Kontrollplasmafraktion wurde ebenfalls verwendet und entspricht dem durch das Zentrifugieren von PRP für 5 Minuten bei 8.000 g erhaltenen Überstand. Nach Zugabe der Probe bei einer Konzentration zwischen etwa 50 bis etwa 100 μg/ml zu 400 μl PRP wurde der Aggregationstest für 12 Minuten unter magnetischem Rühren bei 900 rpm durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagen in faseriger Form bei den oben angegebenen Konzentrationen nach 12 Minuten keine Aggregation induziert. Im Gegensatz zu diesen Befunden ist eine Konzentration von 50 μg/ml heterotrimerer Rinderkollagen-I-Fasern zur Induktion der Plättchenaggregation in wenigen Minuten fähig. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das nichthydroxylierte rekombinante Kollagen nicht zur Induktion der Plättchenaggregation in der Lage ist. Ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass diese Ergebnisse möglicherweise durch die Abwesenheit von GPO- Sequenzen erklärt werden können, welche normalerweise von dem durch die Blutplättchen exprimierten GPVI-Rezeptor spezifisch erkannt werden und für die Plättchenaggregation, wie in Knight et al, 1999 beschrieben, verantwortlich sind. Diese Beobachtungen haben insofern wichtige Konsequenzen für die nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenfasern der vorliegenden Erfindung, als dass es möglich ist, die Fasern zur Bildung von Biomaterialien zu verwenden, welche die Probleme der Aggregation, die bei anderen Kollagen-basierten oder -beschichteten Produkten wie z. B. Endoprothesen oder anderen intrakorporellen Implantaten gut beschrieben sind, vermeiden. Folglich können Vorrichtungen, welche die kollagenen Polypeptidfasern der vorliegenden Erfindung enthalten oder daraus gebildet wurden, die Notwendigkeit der Verwendung von gerinnungshemmenden Mitteln in Verbindung mit solchen Prothesen signifikant vermindern oder sogar umgehen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern, wobei die Fibrillogenese unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird: – eine Temperatur zwischen 4°C und 26°C; – das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird in einer Säure verdünnt; – das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird bei einer Temperatur, die niedriger ist als die übliche physiologische Temperatur des entsprechenden nativen Kollagens, dialysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid pflanzlichen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid pflanzlichen Ursprungs durch Einführen von einer oder mehreren DNA-Sequenzen, die für das Polypeptid kodieren, in eine Pflanze erhalten wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Kollagenpolypeptid ein Kollagen ist, welches mindestens eine humane alpha I-Kette umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid ein Kollagen ist, welches mindestens eine humane alpha I-Kette und mindestens eine weitere humane alpha-Kette umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid ein Kollagen ist, welches mindestens drei humane alpha I-Ketten umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid in einer Säure bei einer Konzentration von ungefähr 200 mg/ml verdünnt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Säure 0,1 M Essigsäure ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Dialyse bei 4°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Dialyse gegen einen Monokaliumphosphatpuffer ohne die Zugabe von Salzen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Dialyse gegen einen 10 mM pH 7 Monokaliumphosphatpuffer für zwölf Stunden durchgeführt wird.
Nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptidfasern, erhältlich durch Fibrillogenese durchgeführt unter den folgenden Bedingungen: – eine Temperatur zwischen 4°C und 26°C; – das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird in einer Säure verdünnt; – das verdünnte nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird unter der üblichen physiologischen Temperatur des entsprechenden nativen Kollagens dialysiert.
Fasern nach Anspruch 12, wobei die Fasern unter den in einem der Ansprüche 2 bis 11 angegebenen Bedingungen erhältlich sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder Fasern nach einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei die nach der Dialyse gebildeten Fasern durch Zentrifugation getrennt werden.
Verfahren oder Fasern nach Anspruch 14, wobei die Zentrifugation bei 20.000 G für zehn Minuten durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern, wobei die Fibrillogenese unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird: – eine Temperatur zwischen 4°C und 26°C; – das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid wird in einer Säure verdünnt; – In-Kontakt-Bringen der nichthydroxylierten rekombinanten Kollagenlösung mit einem Puffer bei hohem pH, ohne die Zugabe von Salzen, wobei die resultierende Endlösung einen neutralen pH und eine Konzentration von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagen, die niedriger ist als die anfängliche Konzentration, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Temperatur ungefähr 10°C ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid in einer organischen Säure und vorzugsweise in Essigsäure verdünnt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das nichthydroxylierte rekombinante Kollagenpolypeptid in der Säure bei einer anfänglichen Konzentration von 400 mg/ml verdünnt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die Lösung von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid mit einem Puffer bei hohem pH in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Puffer ein Phosphatpuffer und vorzugsweise ein Monokaliumphosphatpuffer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei der Puffer konzentriert und vorzugsweise zweifach konzentriert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei der pH des Puffers hoch und vorzugsweise zwischen 11 und 14, besonders bevorzugt ungefähr 12 und am meisten bevorzugt 12,3 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei ein Volumen des Puffers mit einem Volumenäquivalent von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid in Säure in Kontakt gebracht wird und die Endkonzentration nach Neutralisation 200 mg/ml von nichthydroxyliertem rekombinanten Kollagenpolypeptid beträgt.
Fasern von Kollagenpolypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Fasern einen Durchmesser im Bereich von 30 nm bis 550 nm und vorzugsweise von ungefähr 100 nm bis ungefähr 200 nm und besonders bevorzugt einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 156 nm haben.
Biomaterial auf der Grundlage von rekombinanten Kollagenpolypeptidfasern nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder 25, wobei die Fasern retikuliert sind.
Biomaterial nach Anspruch 26, wobei das Biomaterial in Form eines Schwammes vorliegt.
Biomaterial nach Anspruch 26, wobei das Biomaterial in Form eines Films oder eines Gels vorliegt.
Biomaterial nach Anspruch 28, wobei der Film oder das Gel an menschliches Gewebe anhaftet.
Biomaterial nach Anspruch 28, wobei der Film oder das Gel nicht an menschliches Gewebe anhaftet.
Biomaterial nach Anspruch 26, wobei das Biomaterial eine dreidimensionale Struktur, vorzugsweise in Form eines Rohres aufweist.
Biomaterial nach Anspruch 26, wobei das Biomaterial durch Kleben, Sprühen, Induzieren, Impägnieren, Fusionieren oder Extrudieren an eine prothetische Struktur assoziiert ist.
Biomaterial nach Anspruch 32, wobei die prothetische Struktur ein gestricktes oder nichtgestricktes Netz ist.
Biomaterial nach Anspruch 32, wobei die prothetische Struktur eine Gefäßprothese ist.
Biomaterial nach Anspruch 32, wobei die prothetische Struktur eine endovaskulare Prothese und vorzugsweise ein Stent ist.