DE69115181T2 - Polysaccharid enthaltende Zusammensetzung oder Polysaccharid mit heparinoidaler Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Antikoagulans welche dieses als aktives Ingredienz enthält. - Google Patents
Polysaccharid enthaltende Zusammensetzung oder Polysaccharid mit heparinoidaler Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Antikoagulans welche dieses als aktives Ingredienz enthält.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit heparinoider Aktivität, welches aus von zur Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehörenden Grünalgen erhalten wird, ein Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids und ein das Polysaccharid als aktiven Bestandteil enthaltendes Antikoagulans.
- Substanzen mit heparinoider Aktivität zeigen eine die Koagulation von Blut inhibierende Wirkung oder eine klärende Wirkung auf Lipid in Blut. Deshalb werden diese Substanzen für Heilmittel von verschiedenen Krankheiten verwendet. Ms solche heparinoide Aktivität besitzenden Substanzen waren bisher Heparin, sulaüerte Polysaccharide wie das Natriumsalz von Dextransulfat und dergleichen bekannt.
- Diese konventionellen, heparinoide Aktivität besitzenden Substanzen haben jedoch Nachteile. Heparin hat z.B. Probleme darin, daß es (1) aus inneren Organen höherer Tiere etc. extrahiert und gereinigt werden muß und dementsprechend die Herstellung schwierig ist und (2) das erhaltene Heparin eine uneinheitliche Aktivität aufweist; und das Natriumsalz von Dextransulfat weist z.B. Probleme bezäglich der Herstellung und der schwachen heparinoiden Aktivität auf Deshalb war es wünschenswert, eine neuartige Substanz zu entwickeln und zur Verfügung zu stellen, die eine effektive heparinoide Aktivität besitzt.
- Inzwischen ist gut bekannt, daß das aus Braunalgen erhaltene Fucoidansulfat ein hauptsächlich aus L-Fucose zusammengesetztes Polysaccharidsulfat ist, das heparinoide Aktivität aufweist. Ein starke heparinoide Aktivität besitzendes Rhamnansulfat, das aus dem Genus Monostroma zugehörigen Grünalgen erhalten wird, wurde durch auf obigem Wissen basierenden Untersuchungen erhalten, und eine Patentanmeldung wurde dafür eingereicht (japanische Patentveröffentlichung Nr. 235301/1988).
- Aus der nicht vorveröffentlichten WO-A-91/07 946 ist die Verwendung von Algenextrakten - z.B. Codium - zur Bereitung pharmazeutischer, kosmetischer, lebensmitteltechnischer oder landwirschaftlicher Zusammensetzungen bekannt.
- Japan und einige andere Länder sind vollständig vom Meer umgeben, und Algen wie Grünalgen und dergleichen sind reichlich im Meer vorhanden. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein von dem erwähnten Rhamnansulfat verschiedenes Polysaccharid zur Verfügung zu stellen, das starke heparinoide Aktivität besitzt und aus Grünalgen erhalten wird, und ebenso, die Grünalgen effektiv zu nutzen.
- Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids zur Verfügung zu stellen, ohne die oben erwähnten Probleme zu verursachen, die beim Prozeß der Herstellung von Heparin oder Natriumdextransulat vorliegen, und ebenso, eine nützliche Anwendung des Polysaccharids zur Verfügung zu stellen.
- Gemäß vorliegender Erfindung wird ebenso ein Polysaccharid mit heparinoider Aktivität und den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften zur Verfügung gestellt:
- (a) Farbe und Form: ein farbloses bis schwach hellgelbes Pulver
- (b) Löslichkeit:
- - leicht in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich
- - löslich in 0 bis 6 N Chlorwasserstoffäure, Schwefelsäure und Salpetersäure
- - löslich in 0 bis 20%igem Ethylalkohol
- - löslich in wäßriger 0 bis 3 N Natriumhydroxidlösung
- - unlöslich in Benzol und Cyclohexan
- (c) Zusammensetzung:
- ein hauptsächlich aus L-Arabinofuranose bestehendes Homopolysaccharid
- (d) Schwefelsäureestergehalt:
- 10 bis 25 %, bezogen auf das Polysaccharidtrockengewicht
- (e) IR-Absorptionsspektrum: gezeigt in Fig. 1
- (f) ¹H-NMR-Spektrum(400MHz): gezeigtinFig.2
- (g) Spezifische Drehung: [α]D&sub2;&sub5; = -15,0 bis +15,0
- Gemäß vorliegender Erfindung wird ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids mit heparinoider Aktivität zur Verfügung gestellt, welches das Unterziehen von zur Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehörenden Grünalgen einer Extraktion mit Wasser und das anschließende Unterziehen des Extraktes mit einer fraktionierten Präzipitation unter Verwendung von verdünntem Kaliumchlorid zur Reinigung des Extrakts umfaßt.
- Gemäß vorliegender Erfindung wird ebenso ein oben erwähntes Polysaccharid mit heparinoider Aktivität als aktiven Bestandteil enthaltendes Antikoagulans zur Verfügung gestellt.
- Die Fig. 1 repräsentiert einen das IR-Absorptionsspektrum des Polysaccharids zeigenden Graphen.
- Die Fig. 2 repräsentiert einen das ¹H NMR-Absorptionsspektrum (400 MHz) des Polysaccharids zeigenden Graphen.
- Die Fig. 3 repräsentiert einen Graph, der ein im Reinigungsschritt durch Ionenaustauschchromatographie des wasserextrahierten Polysaccharidgemisches erhaltenes Elutionsprofil zeigt.
- Die Fig. 4 repräsentiert einen Graph, der ein im Reinigungsschritt durch Ionenaustauschchromatographie der K-Fraktion erhaltenes Elutionsprofil zeigt.
- Die in der Herstellung des heparinoide Ativität besitzenden Polysaccharides bezüglich vorliegender Erfindung verwendeten Grünalgen sind solche, die zu Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehören, und bevorzugterweise Codium latum. Die zu Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehörenden Grünalgen wie Codium latum werden bequemerweise durch Trocknen nach dem Sammeln verwendet.
- Übrigens ist Codium latum taxonomisch verschieden von Monostroma nitidum, aus dem Rhanmansulfat extrahiert wird.
- Zur Herstellung des heparinoide Ativität besitzenden Polysaccharides bezüglich vorliegender Erfindung aus Grünalgen, die zu Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehören, wie Codium latum und dergleichen wird zuerst Codium latum oder dergleichen bevorzugterweise in einer getrockneten Form in z.B. Wasser eine zur Quellung angemessene Zeitspanne lang eingeweicht, und die Mischung mit einem Mischer oder dergleichen gerührt, um die gequollenen Algen zu desintegrieren, und dann z.B. einer Filtration durch ein Stofftuch unterworfen, um einen Kaltwasserextrakt zu erhalten. Der Kaltwasserextrakt wird gegen ffießendes Wasser dialysiert, das Dialysat zentrifugiert und der Überstand gefriergetrocknet, um ein wasserextrahiertes Rohpolysaccharid zu erhalten.
- Ebenso ist es möglich, dem oben erhaltenen Extraktionsrückstand Wasser zuzusetzen, die Mischung zu erhitzen, die Mischung unter Verwendung eines Stofftuchs unter Erhalt eines Heißwasserextraktes zu filtrieren, den Heißwasserextrakt einer Dialyse und Zentrifugation zu unterziehen und den überstand gefrierzutrocknen, um ein heißwasserextrahiertes Rohpolysaccharid zu erhalten.
- Die oben genannte Rohpolysaccharidzusammensetzung kann durch das Hindurchführen der Zusammensetzung durch eine DEAE-Cellulosesäule (z.B. Whatman DE 52, OH-Typ) unter Verwendung von Wasser oder einer wäßrigen Natriumchloridlösung als Elutionsmittel gereinigt werden. In diesem Fall ist die Ionenstärke von Natriumchlorid in der wäßrigen Natriumchloridlösung z.B. 0,5 bis 3,0 M, und die Elution wird ausgeführt durch Variation der Ionenstärke in dem Bereich schrittweise oder mittels eines Konzentrations-Gradienten.
- Die so erhaltene Polysaccharidzusammensetzung besitzt geringfügig schwankende heparinoide Aktivität, abhängig vom Grad der Reinigung etc., aber die heparinoide Aktivität beträgt ungefähr 1,1 bis 6,0 im Hinblick auf die spezifische Aktivität, wenn die die Blutkoagulation inhibierende Aktivität von Standardheparin als 1 genommen wird.
- Die heparinoide Aktivität wird wie folgt gemessen.
- Einer Rinderthrombin enthakende Salzlösung physiologischer Konzentration wird eine fötales Kalberserum enthaltende Salzlosung physiologischer Konzentration zugesetzt. Dazu wird eine Barbitalpufferlosung (pH 7,0) gegeben, gemischt und dann die Mischung unter Verwendung eines Heparincofaktors auf ein Temperaturgleichgewicht gebracht. Der Mischung wird eine Fibrinogen enthaltende Salzlosungphysiologischer Konzentration zugesetzt und die Zeitspanne (T&sub1; sec) vom Augenblick dieser Zugabe bis zur Bildung von Fibrin bestimmt.
- Getrennt dazu wird eine eine Substanz mit heparinoider Aktivität enthaltende Barbitalpufferlösung (pH 7,0) der obengenannt erwähnten, Rinderthrombin enthaltenden Salzlösung physiologischer Konzentration und fötales Kälberserum enthaltenden Salzlösung physiologischer Konzentration zugesetzt. Der Mischung wird eine Fibrinogen enthaltende Salzlösung physiologischer Konzentration zugesetzt und die Zeitspanne (T&sub2; sec) vom Augenblick dieser Zugabe bis zur Bildung von Fibrin bestimmt.
- Die Zeitdifferenz ([T&sub2;-T&sub1;] sec) wird als ein Indikator der die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität genommen [hier künftig als ATA bezeichnet (Anti-Thrombin-Aktivität)].
- Das obengenannt extrahierte Rohpolysaccharid wird gereinigt, um ein Polysaccharid gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Diese Reinigung kann erreicht werden durch eine Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule wie in der Herstellung der Polysaccharidzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, aber wird in Hinsicht auf das einfache Verfäliren und der Aktivität des erhaltenen Polysaccharids bevorzugterweise erreicht durch fraktionierte Fällung mit verdünntem Kaliumchlorid. Die Konzentration des verdünnten Kaliumchlorids in der fraktionierten Fällung ist z.B. ungefähr 0,2 M.
- Das Rohpolysaccharid kann ebenso gereinigt werden durch Ausführen der obengenannten fraktionierten Fällung mit verdünntem Kaliumchlorid und dann Ausihhren einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule.
- Das so erhaltene Polysaccharid mit heparinoider Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung ist charakterisiert durch die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
- (a) Farbe und Form: ein farbloses bis schwach hellgelbes Pulver
- (b) Löslichkeit:
- - leicht in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich
- - löslich in 0 bis 6 N Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure
- - löslich in 0 bis 20%igem Ethylalkohol
- - löslich in wäßriger 0 bis 3 N Natriumhydroxidlösung
- - unlöslich in Benzol und Cyclohexan
- (c) Zusammensetzung:
- ein hauptsächlich aus L-Arabinofuranose bestehendes Homopolysaccharid
- Die Zusammensetzung wurde durch das ¹H-NMR-Spektrum, IR-Absorptionsspektrum und Gas- Flüssigchromatographie des Hydrolysates des vorliegenden Polysaccharides und durch den Schmelzpunkt des Diphenylhydrazonderivates des Hydrolysats identifiziert.
- (d) Schwefelsäureestergehalt:
- 10 bis 25 %, bezogen auf das Polysaccharidtrockengewicht
- Dieser Gehalt wurde bestimmt durch Messung des IR-Absorptionsspektrums des Polysaccharides und Berechnen der Absorptionsfläche im Bereich um 1.240 cm&supmin;¹ unter Verwendung der mit Chondroitinsulfat A erhaltenen Kalibrierungsfunktion und ebenso, in Kombination damit, mittels Anwendung der Kolorimetrie unter Verwendung eines Rhodizonatreagens.
- (e) IR-Absorptionsspektrum: gezeigt in Fig. 1
- (f) ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz): gezeigt in Fig. 2
- (g) Spezifische Drehung: [α]D&sub2;&sub5; = -15,0 bis +15,0
- Das mittels einem Gelfiltrationsverfahren nach der Entsulfatierung bezüglich seines Molekulargewichts gemessene Polysaccharid der vorliegenden Erfindung besaß ein Molekulargewicht von 150 000 bis 300 000.
- Weiterhin besaß das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung die heparinoide Aktivität von ungefahr 6,0 bis 15,0 bezüglich der spezifischen Aktivität, wenn die die Blutkoagulation inhibierende Aktivität von Standardheparin als 1 genommen wird.
- Das Antikoagulans der vorliegenden Erfindung ist dadurch charakterisiert, daß es das obengenannte Polysaccharid der vorliegenden Erfindung als aktiven Bestandteil enthält. Das Antikoagulans der vorliegenden Erfindung kann ebenso wie die konventionellen Heparinarzneistoffe in eine Arznei geeigneter Form wie ein Pulver, eine Salbe oder dergleichen überführt und verabreicht werden.
- Die vorliegende Erfindung ist hier nachfolgend im genaueren durch Beispiele beschrieben.
- Codium latum wurde auf der Izu-Halbinsel in Japan am Strand von Shirama gesammelt. Sie wurde zur Entfernung von Verunreinigungen gründlich im Seewasser gewaschen und in einem Zimmer luftgetrocknet, um als Material Verwendung zu finden.
- Das luftgetrocknete Material wurde in ungefähr fünf Gewichtsteilen destilliertem Wasser eine Stunde lang eingeweicht. Die Mischung wurde mit einem Mischer gerührt, um das Material zu desintegrieren, und dann bei Raumtemperatur zwei Stunden lang stehengelassen. Die Mischung wurde durch ein Stofftuch gefiltert, um einen Kaltwasserextrakt zu erhalten. Der Kaltwasserextrakt wurde drei Tage lang gegen fließendes Wasser dialysiert, das Dialysat zentrifugiert und der Überstand gefriergetrocknet, um ein kaltwasserextrahiertes Polysaccharid, d.h. eine Polysaccharidzusammensetzung zu erhalten.
- Die gleiche Menge destilliertes Wasser wurde dem Extraktionsrückstand zugesetzt. Die Mischung wurde auf auf 100ºC für 1 Stunde erhitzt und dann durch ein Stofftuch gefikert, um einen Heißwasserextrakt zu erhalten. Der Heißwasserextrakt wurde drei Tage lang dialysiert, das Dialysat zentrifugiert und der Überstand gefriergetrocknet, um ein heißwasserextrahiertes Polysaccharid, d.h. eine Polysaccharidzusammensetzung, zu erhalten.
- Die die Blutkoagulation inhibierende Aktivität wurde als anti-Thrombin-Aktivität (ATA) in einem in-vitro-System gemessen, dem ein Heparincofaktor zugesetzt worden war.
- Als Heparinkofaktor wurde 1 ml einer Rinderthrombin (ein Produkt von Oriental Yeast) enthaltenden Salzlösung physiologischer Konzentration zu 1 ml einer 1% fötales Kälberserum (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries Ltd.) enthaltenden Salzlösung physiologischer Konzentration zugegeben. Dazu wurden 2 ml einer 20 mM Barbitalpufferlösung (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries Ltd., pH 7,0) gegeben und eine Vermischung durchgeführt. Die Mischung wurde 90 Minuten lang in ein Wasserbad der Temperatur von 37ºC eingetaucht und ins Temperaturgleichgewicht gebracht.
- Zu 0,3 ml der Mischung wurden 1 ml einer 1% Fibrinogen (ein Produkt von Japan Chemical Research) enthaltenden Salzlösung physiologischer Konzentration zugesetzt und die Zeitspanne (T&sub1; sec) vom Augenblick dieser Zugabe bis zur Bildung von Fibrin bestimmt.
- Getrennt davon wurde in einem System, dem 2 ml einer Heparin oder eine Substanz mit heparinoider Aktivität enthaltenden 20 mM Barbitalpufferlösung (ein Produkt von Wako Pure Chemical Industries Ltd., pH 7,0) zugegeben wurden, die Zeit (T&sub2; sec) bis zur Bildung von Fibrin bestimmt.
- Die Zeitdifferenz ([T&sub2;-T&sub1;] sec) wurde berechnet und als ATA-Wert gesetzt, der ein Indikator der die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität ist. Übrigens wurde als Heparin ein in dem Standardtest der Pharmacopoea of Japan verwendetes Standardprodukt verwendet; als die ermittelte Zeit bis zur Bildung von Fibrin wurde ein Mittelwert von fünf oder mehr Messungen genommen; und der ATA-Wert wurde unter Verwendung von 6 ug/ml einer Versuchsprobe erhalten.
- Die beide wie obenstehend in 1. erhaltenen kaltwasserextrahierten und heißwasserextrahierten Polysaccharide wurden jeweils auf ihre die Blutkoagulation inhibierende Aktivität nach obenstehendem Verfahren untersucht. Als Ergebnis besaß das kaltwasserextrahierte Polysaccharid eine höhere Aktivität in Vergleich zum heißwasserextrahierten Polysaccharid, und sein ATA-Wert betrug 2,2, wenn der des Heparins als 1 gesetzt wurde.
- Sie wurde erreicht durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer DEAE- Cellulosesäule.
- 1 g des kaltwasserextrahierten Polysaccharids wurde in ungefahr 500 ml Wasser gelöst. Die Mischung wurde einer Zentrifugation unterzogen. Der unlösliche Rückstand wurde entfernt und der flüssige Überstand auf die oben erwähnte Säule aufgetragen. Dann wurde destilliertes Wasser hindurchgeleitet, um die nicht durch das Gel adsorbierten Komponenten zu entfernen. Die Elution mit wäßriger Natriumchloridlösung wurde erreicht durch schrittweisen Wechsel der Ionenstärke in der Reihenfolge 0,5 M, 1,0 M 2,0 M und 3,0 M.
- Die mit dem obenstehend angegebenen Verfahren erhaltenen Fraktionen wurden dialysiert zentrifiigiert und gemäß dem oben in 2. erwähnten Verfahren auf ihre die Blutkoagulation inhibierende Aktivität untersucht. Die mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,5 M erhaltene Fraktion ergab die stärkste Aktivität (2,2 bis 3,0 bezüglich des ATA-Wertes wenn die des Heparins als 1 genommen wurde). Daraufhin wurde diese Fraktion erneut einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen und dann eine Elution mit wäßriger Natriumchloridlösung durch gradientenweise Änderung der Konzentration der Lösung durchgeführt, um ein wie in Fig. 3 gezeigtes Elutionsprofil zu erhalten.
- Jede der erhaltenen Fraktionen wurde gemäß dem oben in 2. erwähnten Verfahren auf ihre die Blutkoagulation inhibierende Aktivität untersucht. Die in Fig. 3 gezeigte Fraktion E ergab die stärkste Aktivität. Die Aktivität des in dieser Fraktion E enthaltenen Polysaccharids der vorliegenden Erfindung betrug 5,6 bezüglich des ATA-Wertes, wenn der des Standard-Heparins als 1 genommen wurde.
- Jedes der in jedem der obengenannten Schrrite erhaltenen Polysaccharide wurde mit 2 N Schwefelsäure hydrolysiert, gefolgt von einer Analyse durch Gaschromatographie. Die jedes Polysaccharid bildenden Monosaccharide wurden als große Mengen von L-Arabinoluranose und geringe Mengen an D-Galactose durch Vergleich mit ihren jeweiligen Standardprodukten bestimmt. Ebenso wurde bestätigt, daß in den in jedem Schritt erhaltenen Polysacchariden die anteilige Menge an D-Galactose abnahm und die anteilige Menge an L-Arabinofuranose mit fortschreitender Reinigung zunahm.
- Dies wurde erzielt durch eine fraktionierte Fällung unter Verwendung von verdünntem Kaliumchlorid. Verdünntes Kaliumchlorid wurde dem kaltwasserextrahierten Polysaccharid zugegeben; die Mischung wurde einer Zentrifugation unterzogen; der verbleibende Niederschlag zeigte einen Anstieg in seiner die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität, aber der flüssige Überstand zeigte keine die Blutkoagulation inhibierende Aktivität; deshalb wurde eine fraktionierte Fällung unter Verwendung von verdünntem Kaliumchlorid angewendet.
- Mit verschiedenen Kaliumchloridkonzentrationen erhakene Fraktionen der Niederschläge wurden auf ihre die Blutkoagulation inhibierende Aktivität untersucht. Als Ergebnis zeigten die Fraktionen der Niederschläge, die erhalten wurden, wenn die verdünnte Kaliumchloridlösung so zugegeben wurde, daß Enkonzentrationen von 0,2 M bis 3,0 M erhalten wurden, eine hohe Aktivität, und insbesonders zeigte die Fraktion des Niederschlags, die erhalten wurde, wenn die verdünnte Kaliumchloridlösung so zugegeben wurde, daß eine Enkonzentration von 0,2 M erhalten wurde, die höchste Aktivität. Die Aktivität des in der Fraktion des Niederschlags enthaltenen, vorliegenden Polysaccharids variierte abhängig von der Endkonzentration der verdünnten Kaliumchloridlösung, aber betrug 6,5 bis 9,6 bezüglich der ATA, wenn die des Standard-Heparins als 1 genommen wurde.
- Im folgenden wird hier diese das Polysaccharid der Erfindung enthaltende Fraktion als "K- Fraktion" bezeichnet.
- Eine einzige Wanderungszone wurde an der Anodenseite beobachtet, was darauf hinwies, daß nach der Reinigung ein einziges Homopolysaccharid übriggeblieben war.
- Deshalb ist das in der K-Fraktion enthaltene Polysaccharid das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung.
- Es wurde ein wie in Fig. 1 gezeigtes Spektrum erhalten, in dem die für Schwefelsäureester charakteristische Absorption durch S=O-Streckschwlngungen bei 1.240 cm&supmin;¹ zu sehen war. Unter Verwendung dieses Spektrums wurde der Gehalt an Sulfatgruppen auf ungefahr 20% bestimmt.
- So kann das vorliegende Polysaccharid als ein Arabinansulfat bezeichnet werden.
- Ein wie in Fig. 2 gezeigtes Spektrum wurde erhalten.
- In dem Spektrum ist ein Signal eines anomeren Protons im Bereich um 5,5 ppm zu sehen, was darauf hinweist, daß das Polysaccharid eine α-L-Konfiguraüon besitzt.
- [α]D&sub2;&sub5; betrug +2,4.
- Das Hydrolysat wurde in ein Trifluoracetylalditolderivat überführt und gaschromatographisch unter Verwendung einer mit 2% fluoriertem Silizium beladenen Säule (2 mm ∅ x 100 cm, Säulentemperatur: 105ºC, Träger: Stickstoffgas, Flußrate: 60 ml/min) analysiert. Ein einziges Maximum war nach der Retentionszeit von 5,7 Minuten zu sehen, und diese Retentionszeit war identisch mit der fiir das Trifluoracetylalditolderivat von α-L-Arabinofuranose beobachteten.
- Das 1,1-Diphenylhydrazonderivat des obengenannten Hydrolysates wurde synthetisiert und sein Schmelzpunkt gemessen. Die Messung ergab 183-185ºC. Während das 1,1-Diphenylhydrazonderivat von L-Arabinofuranose einen Schmelzpunkt von 183-185ºC besitzt, hat das Derivat von D-Arabinose einen Schmelzpunkt von 189-193ºC. Darüber hinaus besitzt die Mischung des Derivates des Hydrolysates mit dem Derivat von L-Arabinofuranose einen Schmelzpunkt von 183- 185ºC, und die Mischung des Derivates des Hydrolysates mit dem Derivat von D-Arabinose zeigte eine Schmelzpunktserniedrigung. Dementsprechend wurde das die K-Fraktion bildende Monosaccharid als L-Arabinofuranose bestimmt.
- Weiterhin stimmt das ¹H-NMR-Absorptionsspektrum des Hydrolysates mit dem Spektrum einer Standardprobe von L-Arabinofuranose überein.
- Das in der in 4-1 obenstehend erhaltenen K-Fraktion enthaltene Polysaccharid wurde einer Desulfafterung und dann einer kompletten Methylierung unterworfen. Komplett methyliertes Polysaccharid wurde einer Hydrolyse, gefolgt von Acetylierung unterworfen und das erhaltene teilmethylierte Alditolacetat einer Gaschromatographie unterzogen. Als Ergebnis wurden zwei Maxima beobachtet, und deren Hauptanteil wurde durch GC-MS als 2,5-Di-O-methylarabinitol erkannt, mithin bestand es aus einem Furanosering, und das Polysaccharid war ein geradekettiges Polysaccharid, bestehend aus einer α-L-1,3-Bindung.
- 4-5. Messung des Molekulargewichts
- Das Molekulargewicht wurde nach der Desulfatierung mittels eines Gelfiltrationsverfahrens gemessen [Füllung: Toyopearl HW-65 (Handelsbezeichnung), mobile Phase: Wasser, Molekulargewichtsstandard: Pullulan (Handelsbezeichnung)]. Es betrug ungefähr 270 000.
- Die obenstehend in 4-1. erhaltene K-Fraktion wurde einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Toyopearl (ein Produkt von TOYO SODA MAG. CO., LTD) unterzogen. Dann wurde die Elution durch wäßrige Natriumchloridlösung unter gradientenweiser Änderung der Ionenkonzentration erreicht. Als Ergebnis wurde ein wie in Fig. 4 gezeigtes Elutionsprofil erhalten.
- Jede der erhaltenen Fraktionen wurde auf ihre die Blutkoagulation inhibierende Aktivität gemäß dem in 2. erwähnten Verfahren überprtüt. Die in Fig 4. gezeigte Fraktion II ergab die stärkste Aktivität.
- Die Aktivität des in der Fraktion II enthaltenen Polysaccharids betrug ungefähr 12,6 bezüglich der ATA, wenn die des Standard-Heparins als I genommen wurde.
- Wie obenstehend beschrieben, kann die vorliegende Erfindung ein von Rhamnansulfat (erhalten aus dem Genus Monostroma zugehörigen Grünalgen) verschiedenes Polysaccharid zur Vertügung stellen, welches aus von zur Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehörenden Grünalgen (z.B. Codium latum) erhalten wird und welches starke heparinoide Wirkung besitzt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht darüberhinaus die effektive Verwendung besagter Grünaige.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung des Polysaccharids ist frei von einem Problem der Schwankuug der Produktqualität aufgrund nicht-einheitlicher Sulfatierung, wie sie in der herkömmlichen Herstellung von Heparin oder Natriumdextransulfat zu beobachten ist, es ist einfach durchzuführen und kostengunstig. Das vorliegende mit besagtem Verfahren hergestellte Polysaccharid mit heparinoider Aktivität ist brauchbar als ein Antikoagulans.
Claims (6)
1. Polysaccharid mit einer die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität und den folgenden
physikalischen und chemischen Eigenschaften:
(a) Farbe und Form: ein farbioses bis schwach hellgelbes Pulver
(b) Löslichkeit:
- leicht in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich
- löslich in 0 bis 6 N Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure
- löslich in 0 bis 20%igem Ethylalkohol
- löslich in wäßriger 0 bis 3 N Natriumhydroxidlösung
- unlöslich in Benzol und Cyclohexan
(c) Zusammensetzung:
ein hauptsächlich aus L-Arabinofüranose bestehendes Homopolysaccharid
(d) Schwefelsäureestergehalt:
10 bis 25 %, bezogen auf das Polysaccharidtrockengewicht
(e) IR-Absorptionsspektrum: gezeigt in Fig. 1
(f) ¹H-NMR-Absorptionsspektrum (400 MHz): gezeigt in Fig. 2
(g) Spezifische Drehung: [α]D&sub2;&sub5; = -15,0 bis +15,0
2. Polysaccharid mit einer die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität nach Anspruch 1,
worin die die Blutkoagulation inhibierende Aktivität 6,0 bis 15,0 beträgt, wenn die die
Blutkoagulation ihhibierende Aktivität von Standard-Heparin als 1 genommen wird.
3. Polysaccharid mit einer die Blutkoagulation inhibierenden Aktivität nach Anspruch 1 oder
2, welches ein Molekulargewicht von 150 000 bis 300 000 besitzt, bestimmt mittels dem
Gelfiltrationsverfahren nach der Entsulfatierung.
4. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids nach Anspruch 1 bis 3, welches das
Unterziehen von zur Familie Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales)
gehörenden Grünalgen einer Extraktion mit Wasser und das anschließende Unterziehen
des Extraktes einer fraktionierten Präzipitation unter Verwendung von verdünntem
Kaliumchlorid umfaßt.
5. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids nach Anspruch 4, wobei die zur Familie
Codiaceae der Ordnung Chlorosiphonales (Codiales) gehörende Grünalge Codium latum
ist.
6. Antikoagulant, das als einen aktiven Bestandteil das Polysaccharid von Anspruch 1 umfaßt.
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