PT99671B - Processo para a preparacao de heparosanos-n,o-sulfatados e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE HEPAROSANOS-N,O-SULFATADOS, E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo:

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de novos heparosanos-N,0-sulfatados, e de composições contendo de 70 a 100% dos referidos heparosanos-N,0-sulfatados, os quais são constituídos por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula I:

na qual E representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas do referido heparosano-N,0-sulfatado, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um grupo sulfato e, facultativamente, um átomo de hidrogénio; G representa um átomo de

-ί*. ζ hidrogénio e um grupo sulfato; e os sais ? ffarmaceuticamente aceitáveis dos referidos heparosanos-N,0-sulfatados.

referido processo consiste na seguinte sequência de passos: a) cultura de uma estirpe de Escherichia coli (K5), b) isolamento e purificação - precedido ou não de uma purificação preliminar - do N-acetil-heparosano formado, para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um N-acetil-heparosano, c) desacetilação parcial desta composição de N-acetil-heparosano para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um heparosano, d) quer Ν,Ο-sulfatação parcial desta composição de heparosano, quer Ν,Ο-sulfatação parcial desta composição de heparosano seguida de um passo de N-sulfatação total, quer uma N-sulfatação total ou parcial seguida de um passo de O-sulfatação total ou parcial, e facultativamente um ou vários passos de fraccionamento das massas moleculares efectuados no fim dos passos a) , b) , c) ou d) .

presente invento tem por objecto novos heparosanos-N,O-sulfatados, as composições de heparosanos-N,O-sulfatados que contêm estes novos heparosanos-N,O-sulfatados e as composições farmacêuticas que têm como ingrediente activo os novos heparosanos-N, O-sulfatados.

É conhecido que os glicosaminoglicanos são produtos suseeptíveis de ser obtidos por extraeção de tecidos animais. Alguns destes glicosaminoglicanos possuem propriedades anticoagulantes e antitrombóticas muito interessantes. Produtos típicos desta família são a heparina, os seus fragmentos e os seus derivados, assim como o heparano-sulfato e o dermatano-sulfato, que têm entretanto a desvantagem, devido à sua origem, de serem muito dispendiosos.

Em particular, é conhecido que o dermatano-sulfato é uma família de polímeros de grau de polimerização variável, formados de unidades repetidas constituídas por um grupo ácido urónico (iduronilo ou glucuronilo) e por um grupo 4-acetilsulfo-galactosaminilo (H. W. Stuhlsatz The Methodology of Connective Tissue Research, (1976), 137-146). O dermatano-sulfato natural tem uma massa molecular relativa compreendida entre 20 000 e 40 000 [ou uma massa molecular compreendida entre 20 000 Da (dalton) e 40 000 Da (dalton)]. Este produto é particularmente interessante como anticoagulante e antitrombótico (F. Fernandez et al., British Journal of Haematology, (1986), 64, 309-317).

É por outro lado conhecido (I. Bjork e U. Lindahl, Molecular and Cellular Biochemistry, (1982), Dr. W. Junk Publishers - Países Baixos) que a coagulação sanguínea é um fenómeno fisiológico complexo, cujo mecanismo pode ser esquematizado e resumido da seguinte maneira:

Activação de contacto

V

Factor XII -> Factor Xlla

V

Factor XI -> Factor XIa

V

Factor IX -> Factor IXa* • Factor tecidual * ^VIIa

Factor X -> Factor Xa <- Factor X

V

Protrombina II

-> Trombina lia

Fribrinogéneo -> Fibrina

XlIIa

Certos estímulos, tais como a activação de contacto e os factores teciduais, desencadeiam a activação sucessiva de uma série de factores de coagulação presentes no plasma sanguíneo, sendo estes anotados pelos algarismos romanos no esquema anterior e designando a presença do asterisco a forma activada (asterisco presente) ou não activada (asterisco ausente) de um dado factor de coagulação.

Qualquer que seja a presença do estímulo, os passos finais são idênticos: 0 factor Xa activa o factor II (igualmente chamado protrombina), ο qual sob a sua forma activada (factor Ila, igualmente chamado trombina) provoca a proteólise do fibrinogéneo solúvel com libertação da fibrina insolúvel, principal constituinte do coágulo sanguíneo.

Nas condições fisiológicas normais, proteínas reguladoras tais como a antitrombina III (ATUI) e o co-factor II da heparina (HCII) estão igualmente presentes no plasma.

A antitrombina III exerce uma actividade inibidora sobre o conjunto dos factores de coagulação anotados por um «j{g asterisco ( ) no esquema anterior. Esta inibição é amplificada de maneira muito forte em presença de heparina ou de oligossacáridos de síntese do tipo heparínico (D. H. Atha et al., Biochemistry, (1985), 24, 6723-6729).

co-factor II da heparina não exerce uma actividade inibidora senão sobre o factor Ila (trombina), o qual catalisa o último passo da coagulação. Esta actividade é amplificada de modo importante na presença de heparina ou de dermatano-sulfato [D. M. Tollefsen, J. Biol. Chem., (1983), 258, 6713-6716].

ou do factor Ila constitui um uma actividade anticoagulante e dois factores intervêm nos dois os quais são independentes do

A inibição do factor Xa meio privilegiado para se obter antitrombótica, visto que estes últimos passos da coagulação, estímulo desencadeador.

Para se obter apenas a inibição do factor Ila, uma possibilidade particularmente interessante consiste em pôr â prova a especificidade do co-factor II da heparina e em procurar a amplificação da sua actividade inibidora. 0 dermatano-sulfato é o produto conhecido que possui a actividade amplificadora deste tipo mais potente.

\',.r

Conhece-se igualmente que a constituição da cadeia heparínica principal se faz em dois passos. Num primeiro passo, a heparina é biossintetizada a partir de um proteoglicano precursor, cuja parte polissacarídica é constituída por uma família de polímeros de grau de polimerização variável formados de unidades repetidas 1,4-B-glucuronil-D-a-N-acetil-l,4-glicosamil (unidades dissacarídicas) de massa molecular relativa 379. Esta parte polissacarídica é habitualmente chamada N-acetil-heparosano [J. Navia, Anal. Biochem., (1983), 135, 134-140], Este primeiro passo de biossíntese é o único momento em que se pode verdadeiramente falar de uma porção dissacarídica porque o segundo passo da biossíntese vai modificar este esqueleto simples de uma maneira profunda (L'hêparine, fabrication, structure, propriétés, analyses, J. P. Duelos, (1984), pp 81-83, Masson Ed. França).

Com efeito, a heparina natural, resultado da biossíntese é um polissacãrido constituído por moléculas de ácido glucurónico e de ácido idurõnico (ácidos urónicos), facultativamente sulfatado na posição 2, associado a moléculas de glicosamina, facultativamente sulfatada na posição 6 e sulfatada ou acetilada sobre a amina na posição 2.

A estrutura da heparina pode representada pela fórmula (i) seguinte:

ser estatisticamente

em que

A representa H e S0₃~,

B representa S0₃~ ^e COCH₃ e n é um número inteiro compreendido entre 20 e 30, o que corresponde a uma massa molecular relativa de 12 000 a 18 000 (EP-A-0 116 801).

As expressões ”H e SC>₃ e SC>₃ e COCH₃ ⁿ, tais que respectivamente utilizadas para os substituintes A e B, indicam que nas 20 a 30 unidades dissacarídicas anteriores A representa em certos casos hidrogénio e noutros casos um grupo S0₃~ e, de modo análogo, B representa na maioria dos casos um grupo S0₃ e, noutros casos, um grupo acetilo.

Do mesmo modo, a ligação significa que o grupo COO , nas 20 a 30 unidades sacarídicas anteriores, tem em certos casos a configuração (ii):

-

Ο (ϋ) (trata-se do ácido glucurónico-D) e na maioria das n unidades a configuração (iii) •0

COOH . \ (iii) (trata-se do ácido idurõnico-L).

Por conseguinte, a heparina e os fragmentos de heparina, como os que se obtêm por diferentes métodos de despolimerização, são macromoléculas que contêm tantas unidades de ácido glucurónico como unidades de ácido idurónico.

Certos métodos de despolimerização permitem obter fragmentos de heparina que têm uma massa molecular relativa compreendida entre 2000 e 9000 e um grau de sulfatação superior a pelo menos 20 % ao da heparina de partida. Tais heparinas super-sulfatadas são descritas no pedido de patente EP-A-0 116 8 01 e possuem para as unidades urónicas as duas estruturas (ii) e (iii) anteriormente mencionadas.

É também conhecido que certas bactérias da espécie

Escherichia coli produzem um polissacárido capsular, habitualmente chamado antígeno K5, que é uma família de polímeros constituída por unidades repetidas 1,4-B-glucuronil-D-a-N-acetil-l,4-glucuronil-D, (W. F. Vann et al., Eur. J. Biochem, (1981), 116,

359-364).

Este polissacárido, da mesma natureza química que a parte polissacarídica do proteoglicano precursor da heparina, será aqui chamado N-acetil-heparosano. Este produto possui uma . . 5 6 massa molecular relativa compreendida entre 10 e 2-10 e, ao nível das unidades ácido urónico, uma estrutura muito regular composta unicamente de ácido glucurónico-D (W. F. Vann et al., Eur. J. Biochem, (1981), 116, 359-364 e pedido de patente

EP-A-0 333 243).

pedido de patente EP-A-0 333 243 descreve o polissacãrido K5 O-sulfatado assim como alguns dos seus fragmentos compostos respectivamente de 4, 6 ou 8 unidades açúcares, igualmente O-sulfatadas. Estes produtos têm uma actividade antiangiogênica e antitumoral, com uma aproximação favorável destas actividades em relação às propriedades anticoagulantes. Este documento descreve igualmente fragmentos de N-acetil-heparosano compostos respectivamente de 4, 6, 8 ou 10 unidades açúcares.

pedido de patente EP-A-0 333 243 descreve também a preparação de um pentassacarídeo que tem a estrutura N-acetil-heparosano-O-sulfatado, por síntese química total.

Encontrou-se agora que os heparosanos-N,O-sulfatados de massa molecular relativa variável compreendida entre 1500 e

-X,

000 possuem uma actividade anticoagulante face â heparina co-factor II e uma actividade anti-Xa muito elevada.

Os heparosanos-N,0-sulfatados, objecto do presente invento, distinguem-se portanto dos outros produtos já descritos na literatura, pela sua estrutura original, particularmente o seu grau de sulfatação (sulfatação também sobre o grupo amina da glicosamina) e as suas propriedades farmacológicas. Eles possuem, entre outras propriedades farmacológicas, uma actividade anticoagulante face à heparina co-factor II (HCII) mais forte que a do dermatano-sulfato e eles têm características farmacocinéticas muito interessantes. Com efeito, os produtos do invento que são produtos obtidos por hemi-síntese química, possuem as actividades farmacológicas dos glicosaminoglicanos, correntemente utilizados nas terapêuticas, particularmente as da heparina, e podem ser úteis para a regulação da coagulação e podem, mais particularmente, encontrar as suas aplicações como antitrombóticos.

O presente invento tem por objecto heparosanos-N,0-sulfatados constituídos por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula I:

na qual

X

E representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um grupo sulfato e, facultativamente, um átomo de hidrogénio,

G representa um átomo de hidrogénio e um grupo sulfato, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos heparosanos-N,o-sulfatados.

grau de sulfatação dos heparosanos-N,O-sulfatados, expresso como a razão sulfato/carboxilo, está compreendido de preferência entre 1,5 e 3,0.

invento diz respeito também a uma composição de heparosano-N,O-sulfatado que contém pelo menos 70 %, numa base ponderai, de um heparosano-N,O-sulfatado anteriormente descrito e objecto do presente invento, de preferência contendo pelo menos 90 %, numa base ponderai, de um heparosano-N,O-sulfatado objecto do presente invento.

Os heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, podem ser constituídos por cadeias polissacarídicas idênticas de massa molecular relativa bem definida, estando esta massa molecular relativa situada num intervalo entre 1500 e 15 000. Eles podem também ser constituídos por uma mistura de cadeias de massas moleculares relativas variáveis, estando estas massas moleculares relativas situadas num intervalo entre 1500 e 15 000. A dispersão das massas moleculares destas cadeias pode ser mais ou menos importante. Com efeito, os heparosanos-N,0-sulfatados, objecto do presente invento, podem ser constituídos por cadeias que têm entre elas uma diferença de massa molecular relativa no máximo de cerca de 13 500 ou, pelo contrário, somente

por cadeias que têm entre elas uma diferença de massa molecular relativa de cerca de 300, o que corresponde a uma unidade de estrutura urónica (ácido glucurónico-D ou seus derivados) ou de estrutura glucosamina. É também evidente que em função da constituição de.cada heparosano-N,O-sulfatado, a massa molecular relativa das cadeias existentes, seja a massa molecular relativa mais baixa, seja a massa molecular relativa mais alta, pode corresponder a qualquer valor compreendido entre 1500 e 15 000.

A expressão G representa um átomo de hidrogénio e um grupo sulfato utilizada anteriormente indica que G na unidade dissacarídica representa para certas posições um átomo de hidrogénio e nas outras restantes um grupo sulfato. Da mesma maneira, E representa em certas unidades dissacarídicas um grupo acetilo e, nas restantes unidades, um grupo sulfato ou, facultativamente, um átomo de hidrogénio. As unidades dissacarídicas dos heparosanos-N,O-sulfatados não são, por conseguinte, todas idênticas.

A formula I representa uma estrutura repetitiva dissacarídica formada por uma unidade glicosamina e uma unidade ácido glucurónico-D. As referidas unidades podem estar invertidas, mais particularmente, se se considera que a estrutura dissacarídica de fórmula I é repetida n vezes, que a unidade não redutora pode ser indiferentemente quer glicosamina, tal como representada na fórmula I com um grupo hidroxi na posição 4, estando esta unidade glicosamina sulfatada ou não, quer um ácido glucurónico-D que contém facultativamente uma dupla ligação na posição C4-C5 e estando sulfatada ou não. A unidade redutora pode ser, indiferentemente, ou um ácido glucurónico-D, tal como representado na fórmula I, substituído com um hidrogénio sobre o oxigénio anomérico, quer uma glicosamina, quer uma estrutura 2,5-anidromano, tal como obtida após uma despolimerização nitrosa (2,5-anidro-manose-D) seguida, facultativamente, por uma oxidação (ácido 2,5-anidro-manóico-D) ou por uma redução (2,5-anidro-manitol-D).

Os produtos preferidos são aqueles em que as duas extremidades, redutora e não redutora das cadeias dos heparosanos-N,O-sulfatados objecto do presente invento, são unidades urónicas sulfatadas ou não, são glicosamina sulfatada ou não, N-acetilglicosamina sulfatada ou não, ou unidades que têm uma estrutura 2,5-anidromano.

Preferem-se os heparosanos-N,O-sulfatados constituídos por cadeias cujas duas extremidades, redutora e não redutora, são unidades urónicas sulfatadas ou não e de N-acetilglicosamina, sulfatada ou não.

presente invento tem igualmente por objecto um processo de preparação de uma composição que compreende desde 70 % até 100 % de um heparosano-N,O-sulfatado, objecto do presente invento, caracterizado por compreender a seguinte sequência de passos:

- passo a: cultura de uma estirpe de Escherichia coli (K5), para formar um N-acetil-heparosano,

- passo b: isolamento e purificação do N-acetil-heparosano formado para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um N-acetil-heparosano constituído por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II:

ch₂oh

COOH

passo c: desacetilação parcial desta composição de N-acetil-heparosano para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um heparosano constituído por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III;

ch₂oh

COOH

NHR' (III) na qual R' representa, em 0 até 80 % das unidades dissacarídicas, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um átomo de hidrogénio, passo d: - quer Ν,Ο-sulfatação parcial desta composição de heparosano,

- quer Ν,Ο-sulfatação parcial desta composição de heparosano seguida de um passo de N-sulfatação total, quer uma N-sulfatação total ou parcial seguida de um passo de O-sulfatação total ou parcial, e compreende, facultativamente, um ou vários passos de fraccionamento das massas moleculares efectuados no fim dos passos a, b, c ou d.

Para a preparação de uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um heparosano-N,0-sulfatado, objecto do presente invento e de acordo com o processo do invento, utiliza-se de maneira preferencial como estirpe de Escherichia coli (K5), a estirpe Escherichia coli SEBR 3282. Esta estirpe ê uma estirpe derivada da estirpe Bi 8337-41 (010:K5:H4) ATCC 23506 [descrita particularmente por D. S. Gupta et al., FEMS Microbiology Letters, (1982), 14, 75-78 e W. Vann, Eur. J. Biochem., (1981), 116, 359-364].

A estirpe Escherichia coli SEBR 3282 responde positivamente ao teste de holótipo para o bactereófago K5 específico de acordo com o método de B. Kaiser et al. [J. Clin. Microbiol., (1984), 19, 2, 264-266]. Trata-se portanto sem, dúvida, de uma estirpe Escherichia coli (K5). Esta estirpe foi registada no CNCM do Institut Pasteur, Paris, França, sob ο N2 1-1013. Pode-se também utilizar um mutante, seja espontâneo seja induzido desta estirpe, como também doutras estirpes de Escherichia coli (K5) aprpriadas, por exemplo a estirpe Bi 626-42 (012:KSNM) ATCC 23508.

O meio de cultura utilizado é de preferência um meio rico em matéria azotada, por exemplo um meio rico em extracto de levedura e em hidrolisato de caseína, meio pouco dispendioso, que possui uma quantidade importante de aminoácidos.

A cultura da estirpe de Escherichia coli (K5) é continuada de preferência pelo menos durante duas horas depois da paragem do crescimento da biomassa.

O isolamento e a purificação do N-acetil-heparosano, para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um N-acetil-heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II, são realizados por um processo que compreende pelo menos um passo de precipitação e um passo de cromatografia de permuta iónica. Este passo é realizado utilizando de preferência uma colónia Q-Sepharose ou uma colónia · equivalente. A precipitação é efectuada por um solvente orgânico apropriado, e particularmente por um álcool, de preferência o etanol. Neste processo o N-acetil-heparosano pode estar sob a forma de sal, de preferência sob a forma de sal de sódio.

A título de exemplo, pode-se esquematizar o processo preferido de isolamento e de purificação como se segue:

- passo a₁: precipitação por etanol,

- passo b^: diãlise,

- passo c^: precipitação por etanol, seguida por desidratação e secagem,

- passo d^: purificação por cromatografia de permuta aniónica,

- passo e₁: precipitação por etanol do eluato obtido pelo passo d_lZ desidratação, secagem e trituração.

No que respeita aos passos a^, b.^, ο_χ, a ordem pela qual eles são efectuados pouco importa. Um dos passos a^ ou c^ pode ser suprimido.

Ο passo e^, a precipitação por etanol, não é indispensável. É possível isolar o N-acetil-heparosano por outros métodos, como por exemplo evaporação sob vazio do eluato obtido no passo d^.

isolamento e a purificação do N-acetil-heparosano, para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um N-acetil-heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000 podem também ser efectuados da seguinte maneira:

- passo

- passo

- passo c^z^:

- passo

- passo

- passo diãlise, purificação em meio ácido, eliminação das impurezas insolúveis em soluções aquosas de pH 3,5 e pH 1,8, precipitação por etanol, seguida por desidratação e secagem, hidrólise alcalina e diãlise, purificação por cromatografia de permuta aniónica, purificação por cromatografia de exclusão.

Este processo de isolamento e de purificação é também um processo preferido do invento.

A hidrólise alcalina é efectuada com uma solução de NaOH, a uma temperatura compreendida entre 30 e 80 °C.

Aplicando os processos de isolamento e de purificação, pode-se utilizar como produto de partida, quer a suspensão obtida no fim da cultura, e neste caso é necessária uma filtração prévia, quer um produto que jã foi submetido a uma purificação preliminar efectuada de acordo com um processo que compreende os seguintes passos:

- passo a^:	centrifugação da suspensão obtida no fim da cultura
- passo b’^:	colocação em contacto do sobrenadante com uma
	solução alcalina,
- passo c”^:	pré-filtração,
- passo d'^:	concentração sobre membrana de limiar de corte
	determinado, que permite uma separação em função da
	massa molecular relativa,
- passo e^:	diálise.
O	passo ei não é indispensável.

Como solução alcalina, pode-se utilizar uma solução de NaOH 0,1 N.

De maneira preferencial, procede-se a uma purificação preliminar do produto obtido no termo da cultura, de acordo com o método descrito anteriormente.

A cultura das estirpes de Escherichia coli (K5) e os processos de isolamento e de purificações, assim como o passo de purificação preliminar, anteriormente mencionados, permitem obter composições de N-acetil-heparosanos que contêm desde 70 % até 100 % de um N-acetil-heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II:

Com efeito, graças aos processos de isolamento e de purificação anteriormente descritos e ao passo de purificação preliminar, é possível obter composições de N-acetil-heparosanos que contêm desde 80 % até 100 % de um N-acetil-heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000.

Os N-acetil-heparosanos constituídos por uma mistura de cadeias de massas moleculares relativas entre 1500 e 15 000 são produtos novos e constituem também o objecto do presente invento.

As duas extremidades, redutora e não redutora dos novos N-acetil-heparosanos tais como os que se obtêm de acordo com o processo acima descrito e utilizando a estirpe de Escherichia coli SEBR 3282, ou uma outra estirpe apropriada como anteriormente indicado, são de unidades urónicas ou de N-acetilglicosamina.

Na maioria das cadeias a extremidade não redutora é uma unidade urõnica de fórmula (a) :

O enriquecimento facultativo da composição obtida em N-acetil-heparosano constituída por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II, pode ser efectuada em graus diversos e, particularmente, até ao isolamento do referido N-acetil-heparosano. 0 enriquecimento é realizado

pondo-se em prática técnicas clássicas de fraccionamento das massas moleculares tais como a cromatográfia de permeação gel e a ultrafiltração (A. A. Horner, Biochem. J., (1989), 262, 953-958; G. Pyler et al., J. Biol. Chem. (1988), 263, 11, 55197-5201 e U. Lindahl et al., J. Biol. Chem. (1984), 259, 20, 12368-12376). Pode-se também utilizar o método de fraccionamento etanólico (Pedido de Patente EP-A-0 287 477). Este último método de fraccionamento é particularmente apreciado de entre outros métodos possíveis.

Os N-acetil-heparosanos anteriormente descritos são utilizados como intermediários para a preparação de heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, mas também para a preparação de outros derivados.

Para preparar os heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, pode-se também utilizar outros N-acetil-heparosanos conhecidos, como por exemplo os N-acetil-heparosanos constituídos principalmente por cadeias polissacarídicas que têm todas o mesmo número de unidades dissacarídicas, tais como os descritos no Pedido de Patente EP-A-0 333 243 e, particularmente, constituídos por 6, 8 ou 10 unidades açúcares, fracções de N-acetil-heparosanos constituídos por cadeias que contêm em média 10 unidades polissacarídicas (Gupta et al., FEMS Microbiology Letters, (1983), 16, 13-17) ou de N-acetil-heparosanos de elevada massa molecular relativa que podem ser em seguida despolimerizados de acordo com métodos utilizados para preparar as heparinas de baixo massa molecular.

Com efeito, os heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, podem ser preparados por outros processos a partir do polissacárido (K5) conhecido, tendo uma alta massa molecular. Neste caso, um passo de despolimerização é necessário.

Esta despolimerização pode ser efectuada antes da desacetilação do N-acetil-heparosano de alta massa molecular, depois da desacetilação, depois da N-sulfatação ou ainda depois da N,O-sulfatação.

Como foi anteriormente mencionado, a despolimerização pode ser efectuada de acordo com os métodos descritos na literatura para preparar as heparinas de baixo peso molecular, por exemplo, por despolimerização com periodato, por radicais livres, por eliminação beta ou por acção do ácido nitroso (Pedidos de Patente ou Patentes EP-0 040 144, EP-0 037 319, EP-0 121 067). Estes métodos são dados a título de exemplo e não são limitativos. Pode ser utilizado qualquer outro método de despolimerização de glicosaminoglicanos.

Quando os heparosanos-N,O-sulfatados são preparados por despolimerização, a partir de um N-acetil-heparosano de alta massa molecular (previamente desacetilado e facultativamente N-sulfatado) e submetendo-o à acção do ácido nitroso, a unidade redutora dos heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, pode ter uma estrutura 2,5-anidromano e, particularmente, de 2,5-anidro-manose-D. A despolimerização por acção do ácido nitroso pode ser efectuada após o passo da N-desacetilação ou da N-sulfatação. Quando este passo é seguido de uma oxidação ou de uma redução, obtêm-se heparosanos-N,O-sulfatados que possuem na unidade redutora uma estrutura, respectivâmente, de ácido 2,5-anidro-manóico-D ou de 2,5-anidro-manitol-D.

A desacetilação parcial das composições que que contêm desde 70 % até 100 % de N-acetil-heparosano, que conduz à obtenção de composições que que contêm desde 70 % até 100 % e mesmo desde 80 % até 100 % de um heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III, indicada anteriormente, é realizada por um tratamento com um agente de desacetilação.

Como agentes de desacetilação, podem-se mencionar o pentassulfureto de fósforo, o fluoroborato de trietiloxónio, a soda ou a hidrazina, sendo particularmente apreciados estes dois últimos agentes. Podem-se também utilizar ácidos minerais fortes, tais como o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico, etc.. A duração da reacção depende· das condições operatórias escolhidas e, particularmente, da temperatura e da concentração do agente de desacetilação no meio reaccional.

O enriquecimento da composição do heparosano em heparosano caracterizado por ser constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000,- caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III, é realizado pondo-se em prática técnicas clássicas de fraccionamento das massas moleculares anteriormente mencionadas (cromatografia de permeação gel, ultraf iltração e fraccionamento enólico) . Neste caso, obtêm-se composições que contêm desde 90 % até 100 %, numa base ponderai, de um heparosano constituído por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III.

Para a preparação de heparosanos constituídos por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, é também possível utilizar N-acetil-heparosanos de alto peso molecular. Os heparosanos de alto peso molecular obtidos apôs desacetilação podem ser despolimerizados. ,-pelos métodos já descritos para a preparação de heparinas de baixo peso molecular e já mencionados nesta memória. Os produtos de despolimerização podem ser em seguida submetidos a um fraccionamento a fim de se obterem os heparosanos preferidos do invento.

Os heparosanos caracterizados por serem constituídos por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III:

na qual R' representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um átomo de hidrogénio, são produtos novos e, a este título, também fazem parte do invento.

Os heparosanos preferidos do invento são heparosanos caracterizados por serem constituídos por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III na qual o grupo acetilo (R') estã presente a uma taxa inferior ou igual a 60 %.

As composições de heparosano que contêm pelo menos 70 %, numa base ponderai, de um heparosano tal como o descrito anteriormente, fazem também parte do presente invento.

Estes heparosanos e as composições de' heparosano são intermediários úteis para a preparação de heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, mas podem também ser utilizados para a preparação de outros produtos, por exemplo produtos que sofram uma epimerização, como consequência, ao nível da unidade de ácido glucurõnico-D.

Antes do passo da Ν,Ο-sulfatação parcial, os heparosanos podem ser transformados num sal de base orgânica ou num sal de amónio quaternário. Para a formação do sal de amónio quaternário dos heparosanos, utiliza-se de maneira preferencial o tetrabutilamónio.

passo da Ν,Ο-sulfatação parcial realizado de acordo com o processo descrito na Patente Francesa N2 2 584 728 de 10-11-87 (correspondente ao pedido de patente FR-85.10787) é efectuado num solvente aprótico polar, tal como a dimetilformamida, o dimetilsulfóxido, a hexametilfosfotriamida ou o acetonitrilo ou uma mistura destes solventes, com a ajuda por exemplo de um complexo de anidrido sulfúrico (trióxido de enxofre: SO₃) com uma base orgânica, tal como a trimetilamina, a trietilamina ou a piridina. Ela pode também ser efectuada pelo acido clorossulfónico em solução em piridina, utiliza-se de preferência o complexo de enxofre-piridina.

É também possível utilizar outros agentes de sulfatação, nomeadamente os que são relatados por Ε. E. Gilbert em Chemical Review, (1962), 62, 549-589. A reaeção de Ν,Ο-sulfatação é, em geral, efectuada a uma temperatura compreendida entre 0 °C e 100 °C, de preferência entre 10 °C e 50 °C, duração entre as 6 h e as 14 h.

com uma

Aquando do processo de preparação, no termo da reacção de Ν,Ο-sulfatação parcial, a composição do heparosano-N,O-sulfatado que contêm desde 70 % até 100 % do heparosano-N,0-sulfatado, objecto do presente invento, é precipitada por adição de cloreto de sódio até à obtenção de uma solução 0,3 3 M em cloreto de sódio, depois de uma quantidade adequada de etanol. O precipitado formado é recolhido numa solução de cloreto de sódio 0,5 M. Esta solução é, em seguida, neutralizada. Após a adição de uma quantidade adequada de etanol, o precipitado formado é isolado, recolhido com água ultrapurifiçada, dialisado contra esta, liofilizado e seco.

O passo de Ν,Ο-sulfatação, assim como os passos de purificação da composição do heparosano-N,O-sulfatado descritos no parágrafo anterior, podem ser repetidos uma ou várias vezes. 0 processo de purificação é dado a título de exemplo e não exclui processos equivalentes.

Este passo de Ν,Ο-sulfatação é, de preferência, seguido de um passo de N-sulfatação total realizado em geral num solvente aquoso, vantajosamente de pH básico, com um agente de sulfatação, tal como um complexo de anidrido sulfúrico com uma base orgânica, por exemplo a trimetilamina.

No fim do passo de N-sulfatação total, a composição do heparosano-N,0-sulfatado é precipitada por adição de cloreto de sódio, até à obtenção de uma solução 0,5 M em cloreto de sódio, e etanol. 0 precipitado formado é em seguida reposto em solução numa solução de cloreto de sódio 0,5 M, reprecipitado por etanol, depois recolhido em água ultrapurifiçada, dialisado contra esta, liofilizado e seco.

enriquecimento da composição do heparosano-N,O-sulfatado em heparosano-N,O-sulfatado é realizado pondo em prática técnicas clássicas de fraccionamento de massas moleculares, já mencionadas. É interessante efectuar este enriquecimento.

Os heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, e as composições de heparosano-N,O-sulfatado que contêm pelo menos 70 % dum novo heparosano-N, O-sulf atado, objecto do presente invento, são vantajosamente obtidos por um processo que compreende uma reacção final de N-sulfatação. E representa então, para as estruturas repetidas na fórmula (I) , o grupo acetilo e o grupo sulfato.

É também possível obter heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, procedendo desde logo a uma N-sulfatação seguida de uma O-sulf atação. Esta variante do processo é utilizada de modo preferencial.

A N-sulfatação é realizada com a ajuda de um complexo de triõxido de enxofre com uma base orgânica tal como a trimetilamina, a trietilamina ou a piridina. Ela pode também ser efectuada pelo ácido clorossulfónico em solução am piridina. Utiliza-se vantajosamente o complexo de triõxido de enxofre com a trimetilamina e a reacção da N-sulfatação é realizada a uma temperatura compreendida entre 20 e 80 °C em meio aquoso alcalino. No termo da reacção de N-sulfatação, o produto assim obtido é precipitado por adição de uma quantidade adequada de etanol. O precipitado formado é recolhido em água ultrapurifiçada, dialisado contra esta, liofilizado e seco. O processo de purificação é é dado a título de exemplo e não exclui processos equivalentes. Os passos de purificação podem ser repetidos várias vezes.

De acordo com o processo do invento, -antes do passo de

N-sulfatação, o heparosano-N-sulfatado é transformado de preferência num sal de base orgânica ou num sal de amónio quaternário.

Para a formação do sal de amónio quaternário utiliza-se preferivelmente o tetrabutilamónio.

A reacção de O-sulfatação é realizada em formamida, ou noutro solvente quimicamente equivalente, com a ajuda, por exemplo, de um complexo de trióxido de enxofre com uma base orgânica tal como a trimetilamina, a trietilamina ou a piridina. Utiliza-se de preferência um complexo de trióxido de enxofre-piridina. A reacção de O-sulfatação é, em geral, efectuda a uma temperatura compreendida entre 10 e 50 °C.

O heparosano-N,0-sulfatado é, em seguida, precipitado por adição num meio de reacção de cloreto de sódio até à obtenção de uma solução de cloreto de sódio 0,33 M, depois de uma pequena quantidade adequada de etanol, como nos casos de Ν,Ο-sulfatação. Procede-se em seguida a uma purificação da composição do heparosano-N,0-sulfatado. Os diferentes passos foram já descritos de maneira detalhada anteriormente (precipitação por etanol, diálise, etc.).

De acordo com o invento, o heparosano-N,0-sulfatado preferido comporta pelo menos 90 %, numa base ponderai, de cadeias de massa molecular relativa inferior a 11 000. Aprecia-se que este heparosano-N,0-sulfatado contenha menos de 0,2 jitmol/mg de grupo amino (NH₂).

grupo acetilo está de preferência presente a uma taxa inferior ou igual a 60 % e aprecia-se que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, esteja compreendido entre 1,5 e 3,0.

Os produtos preferidos do invento são ^:os heparosanos-N,O-sulfatados constituídos por cadeias que têm uma massa molecular relativa média desde cerca de 4000 até 7000 e que têm um grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, compreendido entre 1,7 e 3, como também os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 80 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 20 %) e que são constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 5000 e 7000, em que o grau de sulfatação se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5, ou ainda os heparosanos-N,O-sulfatados que são constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 10 000 e 12 000, N-desacetilados a cerca de 80 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 20 %) e que têm um grau de sulfatação compreendido entre 1,8 e 2,5, ou ainda os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 40 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 60 %) e que são constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 6000 e 8000, em que o grau de sulfatação se encontra compreendido entre 2,0 e 2,8.

Os heparosanos-N,O-sulfatados preferidos do invento são mais especialmente:

- os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 80 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 20 %), que são constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 2300 e 7200, e que têm um grau de sulfatação compreendido entre 1,8 e 2,5,

os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 80 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 20 %), que são constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 3300 e 7700, e que têm um grau de sulfatação compreendido entre 1,8 e 2,5, os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 80 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 20 %), que são constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 6900 e 13 500, e que têm um grau de sulfatação compreendido entre 1,8 e 2,5, os heparosanos-N,O-sulfatados N-desacetilados a cerca de 40 % (taxa do grupo acetilo presente a cerca de 60 %), que são constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 4000 e 10 300, e que têm um grau de sulfatação compreendido entre 2,0 e 2,8.

Como sais dos heparosanos-N,O-sulfatados entendem-se todos os sais farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais são obtidos pelos métodos clássicos descritos particularmente para a preparação dos sais da heparina (Patente US 4 168 377).

O processo de obtenção dos heparosanos-N,O-sulfatados anteriormente descrito assim como os métodos de purificação permitem a obtenção de heparosanos-N,O-sulfatados sob a forma de sal de sódio. A partir deste sais, podem-se obter, aplicando os métodos utilizados para preparar os diferentes sais de heparina ou de heparina não salifiçada [L'héparine, fabrication, structure, propriétés, analyses, J. P. Duelos, (1984), pp 81-83,

Masson Ed. - França], quer outros sais de hèpárosãnos-N,O-sulfatados, quer heparosanos-N,O-sulfatados não salifiçados.

Os heparosanos-N,O-sulfatados, objecto do presente invento, possuem propriedades farmacológicas e bioquímicas interessantes e inteiramente surpreendentes em relação aos ensinamentos da técnica anterior.

Partieularmente, contrariamente aos produtos sulfatados do antígeno K5 descrito na Patente EP-A-0 333 243, que tem uma actividade antiangiogénica e antitumoral, com uma relação favorável destas actividades em relação às propriedades anticoagulantes, os heparosanos-N,O-sulfatados do presente invento possuem uma boa actividade reguladora da coagulação. Esta actividade é muito superior à do dermatano-sulfato sobre os diferentes parâmetros da coagulação e ela pode de preferência ser comparada à da heparina.

Mais partieularmente, a actividade anti-IIa, ATUI ou HCII dependente, de produtos representativos do invento foram determinadas de acordo com os métodos descritos por D. Dupouy et al. em Thrombosis and Haemostasis, (1988), 60, 2, 236-239, para o co-factor II da heparina (HCII) e por M. L. Larsen et al. em Thrombosis Research, (1978), 13, 2, 285-288 para a antitrombina (ATUI) .

Nos dois casos, o teste consiste em medir in vitro o efeito inibidor do produto estudado sobre a trombina purificada (Factor lia) , em presença de HCII ou ATUI purificados na dosagem da actividade amidolítica da trombina, face a um substrato cromogéneo. Como possui a actividade anti-IIa HCII dependente mais forte, como o dermatano-sulfato, preparado de acordo com o método descrito por H. W. Stuhlsatz et al. em The Methodology of

Connective Tissue Research, (1976), 137-146, é utilizado como produto de referência no teste de medida desta actividade, sendo o resultado expresso em mg de dermatano-sulfato (DS) equivalentes em actividade a 1 mg do produto estudado (mg DS equiv/mg) .

A actividade anti-Xa (título Yin-Wessler) dos referidos produtos representativos do invento foi medida pelo método descrito por E. T. Yi, et al. em J. Lab. Clin. Med. (1973), 81, 2, 298-310, enquanto a sua actividade anticoagulante global foi medida de acordo com o teste APTT descrito por R. R. Proctor e em Am. J. Clin. Path. (1961), 36, 212-219.

Todos os produtos testados mostraram uma actividade anti-HCII dependente nitidamente superior à do dermatano-sulfato. A actividade anti-IIa ATUI dependente e o título de Yin-Wessler, ainda que inferiores às das heparinas, revelaram-se superiores às do dermatano-sulf ato. O seu título em APTT ê desde cerca de 2 até cerca de 20 vezes superior à do dermatano-sulf ato e que pode chegar até 60 % da da heparina.

Os heparosanos-N,O-sulfatados do invento apresentam portanto uma especificidade de acção e uma actividade anticoagulante particularmente interessantes. A fraca massa molecular deste produtos dá-lhes, por outro lado, propriedades farmacocinéticas também muito interessantes.

Os heparosanos-N,O-sulfatados do presente invento são muito pouco tóxicos; a sua toxicidade é perfeitamente compatível com a sua utilização como medicamento.

O invento estende-se, por conseguinte, também às composições farmacêuticas que compreendem como ingrediente activo um heparosano-N,O-sulfatado, objecto do presente invento, um dos seus sais ou uma composição de heparosano-N,O-sulfatado que contém pelo menos 70 % deste heparosano-N,O-sulfatado ou nm dos seus sais, em associação com um ou vários veículos farmacêuticos apropriados.

Estas composições farmacêuticas são particularmente úteis para o tratamento, a título preventivo ou curativo, de distúrbios da parede vascular, tais como a aterosclerose e a arteriosclerose e de estados de hipercoagulabilidade observados, por exemplo, a seguir a operações cirúrgicas, de desenvolvimento de tumores ou de desregulamentos da coagulação induzidos por activadores bacterianos, virais ou enzimáticos.

A posologia pode - variar largamente em função da idade, do peso e do estado de saúde do paciente, da natureza e da severidade da afecção assim como da via de administração.

Esta posologia compreende a admnistraçáo de uma ou várias doses desde cerca de 1 mg até 1 g por dia, de preferência desde cerca de 5 mg até 500 mg por dia, por exemplo, da ordem dos 200 g por dia por via intravenosa, ou por via subcutânea, em administrações descontínuas ou a intervalos regulares, ou de uma dose diária da ordem dos 200 mg até 1000 mg por dia por via oral.

Estas doses podem ser naturalmente ajustadas para cada paciente em função dos resultados observados e das análises de sangue efectuadas anteriormente.

O invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem.

N-ACETIL-HEPAROSANOS

Exemplo l

Preparação de run N-acetíl-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular (Processo I)

1) Cultura de uma estirpe bacteriana de Escherichia coli (K5) e separação de um filtrado que contém N-acetil-heparosano

Semeiam-se 400 mL do meio B, de composição precisada no Quadro I seguinte, com a estirpe Escherichia coli SEBR 3282 (registada no CNCM do Institut Pasteur, Paris, França, sob ο N2 1-1013) e incuba-se sob agitação durante 2 h a 37 °C.

A pré-cultura obtida é em seguida transferida para um fermentador de 18,5 L que contém 11 L do meio A, de composição precisada no Quadro I seguinte, e incuba-se durante 4 h a 37 °C e pH = 7,4, sendo a pressão parcial em oxigénio mantida em 40 mmHg por regulação de injecção de ar (até 2 0 L/min) e agitação. Adiciona-se em seguida glicose introduzindo de maneira contínua uma solução estéril que contém 600 g/L de glicose à razão de 250 mL/h durante 8 h.

Prossegue-se a cultura nas mesmas condições de temperatura, de pH e de pressão parcial de oxigénio durante 10 h após a paragem da adição de glicose. A observação da DO (lambda = 600 nm) do meio de cultura permite afirmar que não há crescimento da biomassa durante as últimas 12 horas de cultura.

Arrefece-se então o caldo de cultura para 25 °C, em seguida filtra-se através de uma membrana de porosidade 0,22 gm.

Obtém-se assim cerca de 12 L de filtrado que contém N-acetil-he parosano.

QUADRO I

Composição e preparação do meio A e-do meio B

MEIO A

O meio A é preparado pela reunião das três soluções estéreis seguintes:

360	mg
280	mg
6,7	mg
1270	mg
500	mg
5000	mg
000	mg
000	mg
1	mL
ado :eur.	por
1,38)	e
' meio	em

7H 0 2H?0 6h|o

Solução NSj

Em 700 mL de água ultrapurifiçada dissolver por ordem: Complexante: Ν'[Tris-(hidroximetil)mgtil]glicina (Tricina comercializada por Flukaj

FeSO CaCl?,

MgCi;_z

Hidrolisato de caseína (fonte principal de ácidos aminados) HY CASE SF _R (comercializado por Sheffield;............_R '25

Extracto de levedura (comercializado por Difco^K) 18 000 Solução de oligoelementos (cf Quadro II seguinte)

Agente antiespumente Struktol J673 (comercializado Schill et Seilacher ): algumas gotas por pipeta de Pasteur.

Ajustar o pH para 7,4 com uma solução de KOH (d completar até 850 mL com ãgua ultrapurifiçada. Colocar o autoclave durante 45 min a 120 ’C.

Solução NS2

Em cerca de 40 mL de ãgua ultrapurif içada, dissolver 5 g de Κ ΗΡΟ, e depois ajustar até 50 mL com o mesmo solvente. Filtrar a solução obtida através de um filtro de porosidade 0,2 /zm.

Solução N93

Dissolver 20,7 g de glicose numa quantidade adequada de água ultrapurifiçada e ajustar o volume até 100 mL com o mesmo solvente. Colocar em autoclave durante 30 min a 110 °C.

MEIO B

A preparação do meio B é idêntica à do meio A, com a diferença de que convém adicionar mais 20 g de tampão pH = 7,2 (ácido 3-morfolinopropanossulfónico) depois da adição do agente antiespumante.

QUADRO II

Preparaçao da solução de oligoelementos utilizada na preparação do meio A e do meio B

Em 800 mL de água ultrapurifiçada dissolver por ordem:

^H3^BO3 ........

Na MoO., 2HO CoCl , 6H O ., CUSO^, 5H?O ZnSCC, 7H,0 .. A1C1*, 6H₂O

500	mg
1930	mg
11 850	mg
25	mg
2000	mg
2410	mg

Adicionar 100 mL de ácido clorídrico de densidade 1,19 e completar até 1000 mL com água ultrapurifiçada.

2) Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular

Passo a - Precipitação etanólica

Adiciona-se ao filtrado cerca de 48 L de etanol a 95 % (v/v) e deixa-se a mistura precipitar e decantar a 4 °C durante 8 horas. Elimina-se o sobrenadante por bombagem, depois centrifuga-se e recolhe-se o resíduo de centrifugação ou sedimento da centrifugação em cerca de 1 L de água ultrapurifiçada.

Passo b - Diálise

Dialisa-se durante 24 h a solução -obtida no passo anterior colocada num recipiente cilíndrico NOJAX 40 que tem uma membrana na base de celulose de porosidade 24 angstrom, contra água ultrapurifiçada (1 volume de solução/6 volumes de água, renovados após 2 h, 8 h e 16 h) . Esta operação permite eliminar pequenas moléculas presentes no meio de cultura/ tais como sais, açúcares, ácidos aminados, oligonucleótidos e oligopeptideos.

Passo c - Precipitação, desidratação e secagem

Adiciona-se a 1 volume da solução dialisada, 0,5 M de NaCl e 4 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado durante 5 min â temperatura ambiente. Centrifuga-se a 5000 g durante 20 min. Recolhem-se os bolos de centrifugação em etanol, agita-se a suspensão obtida e deixa-se repousar durante 1 h à temperatura ambiente. Repetem-se as operações de centrifugação e colocação em suspensão. Centrifuga-se de novo a 5000 g durante 20 min. Secam-se os resíduos de centrifugação obtidos numa estufa sob vazio a 40 °C durante 24 h.

Passo d - Trituração em pó

Os bolos de centrifugação secos são triturados com a ajuda de um almofariz em condições anidras.

Passo e - Cromatograf ia de permuta aniónica

Recolhem-se os resíduos de centrifugação moídos num tampão designado por tampão D, de composição Tris-HCl 20 mM pH = 7,5, à razão de 100 mL/g. A solução obtida é cromatografada sobre uma coluna permutadora aniónica forte que compreende uma matriz de agarose reticulada com grupos amónio quaternários (”Q-Sepharose fast flow” de Pharmacia), previamente equilibrada com o tampão D, à razão de 50 mL de gel por 1 g de pó. Lava-se o gel com uma quantidade suficiente de tampão D para o regresso à linha de base da detecção UV a 214 nm, depois com uma solução de piperazina 2 5 mM cujo pH tenha sido ajustado a 3,5. Elue-se com uma solução de pH = 3,5 que tem uma composição: NaCl 0,5 M e piperazina 25 mM. 0 eluato é neutralizado com ‘a ajuda de uma solução de NaOH 5 N.

Passo d - Precipitação, desidratação, secagem e trituração

Repetem-se as operações descritas nos passos c e d anteriores, sem a adição de cloreto de sódio.

N-acetil-heparosano obtido no fim do passo f é designado por lote A.

Uma variante do processo de purificação consiste em realizar sucessivamente os‘passos a, c, b, d, e e f. 0 N-acetil-heparosano assim obtido é designado por lote B.

3) Caracterização do N-acetil-heparosano obtido no fim dos diferentes passos de purificação

Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros RMN de protão e de carbono C são comparados aos do N-acetil-heparosano descritos por W. E. Vann (Eur. J. Biochem., (1981), 116, 59-364).

estudo dos espectros obtidos com o N-acetil-heparosano do lote A e do lote B confirma a identidade química do produto ao N-acetil-heparosano descrito por W. E. Vann. Trata-se de cadeias de polímeros contituídas por estruturas repetidas de 1,4-B-glucuronil-D-a-N-acetil-l,4-glicosaminil-D.

Determinação da repartição das massas moleculares por cromatografia de exclusão

A repartição das massas moleculares é determinada por

HPLC de exclusão nas seguintes condições:

Λ

Coluna constituída por grânulos de silício de diâmetro 10 gm e de porosidade 250 angstrom. Eluente: solução aquosa de sulfato de sódio 0,5 M.

*

Débito: 1 mL/mxn.

Λ

Detecção UV com lambda = 205 nm.

A

A padronização e efectuada com a ajuda de uma gama de oligossacarídeos derivados da heparina, com as seguintes massas moleculares relativas: 1324,

1883, 2436,-3411, 3996, 4535, 4995, 5365, 6150,

6671, 7542, 8655, 10 088, 11 561, 12 950, 14 809,

387 e 22 674.

Tendo em conta esta gama de padrões, apenas as massas moleculares relativas compreendidas entre 934 e 56 703 são tomadas em conta. Admite-se que a densidade óptica detectada é proporcional à quantidade de N-acetil-heparosano. Todavia, a precisão do método diminui de maneira exponencial para as altas massas moleculares e, particularmente, superiores a 20 000.

O perfil de eluição da cromatografia de exclusão do lote A é representado na figura 1. Verifica-se pelo exame da figura 1, que a distribuição é polidispersa e que ela compreende um pico maioritário a cerca de 4700. Uma fracção ponderai pelo menos igual a 70 % do lote A possui uma massa compreendida entre 1700 e 8000.

Um cromatograma muito semelhante é obtido aquando da análise do lote B. O pico maioritário da distribuição situa-se a cerca de 5000. Uma fracção ponderai de pelo menos igual a 70 % do lote B possui uma massa compreendida entre 1500 e 8000.

Observação da repartição das massas moleculares por electroforese sobre gel de poliacrilamida

Submetem-se estas amostras a analisar, assim como um marcador de fim de migração que compreende azul de bromofenol, a uma electroforese em tampão Tris-borato num gel de poliacrilamida a 15 % obtido por polimerização de uma mistura 29/1 de acrilamida e de N,N^,-metileno-bis-acrilamida. A migração é efectuada sob 40 mA durante cerca de 4 h sobre um gel de 18 cm de comprimento até à saída do marcador de fim de migração. O gel é então colorido de azul, depois prata, de acordo com a técnica de S. Pelkonen et al. [J. Bact._z (1983), 170, -6, 2646] específica para os polissacáridos ácidos.

Esta análise por electroforese foi efectuada sobre o produto parcialmente purificado obtido no fim do passo a e o produto purificado, lote A ou lote B, no fim do passo final, com o objectivo de verificar a ausência de modificação importante da repartição das massas moleculares do N-acetil-heparosano no decurso da purificação.

A observação dos perfis obtidos para o produto parcialmente purificado obtido no fim do passo a e o produto purificado no passo final (lote A ou lote B), não põe em evidências diferenças importantes (presença de bandas de intensidade comparável às mesmas distâncias de migração) . Não há portanto modificação importante da repartição das massas moleculares do N-acetil-heparosano no decurso da sua purificação.

•F Λ

Dosagem dos ácidos urónicos

A quantidade de ácido urónico por unidade de massa do produto purificado (lote A ou lote B) , obtido no fim do passo final, foi determinada por colorimetria de acordo com o método descrito por T. Bitter [Analytical Biochemistry, (1962) , 4, 330-334]. Este método de dosagem tem como base a reacção dos glicosaminoglicanos com o carbazole em meio ácido a quente, que provoca uma coloração rosa proporcional à quantidade de ãcido urónico libertado.

Para o lote A, o produto parcialmente purificado obtido no fim do passo d e o produto purificado obtido no fim do passo final f têm respectivamente uma taxa de ácido urónico de 1,3 e 2,1 /zmol/mg.

Para o lote B, o produto purificado obtido no fim do passo final tem igualmente uma taxa de ácido urónico de 2,1 jLimol/mg.

Esnectrofotometria no domínio do ultravioleta e do visível

O produto purificado (lote A) é dissolvido em água ultrapurifucada e a solução obtida (c = 1 mg/mL) é colocada numa cuba de 1 cm de trajecto óptico. O seu espectro de absorção é registado entre 200 e 600 nm.

O espectro obtido permite afirmar, em particular sobre a base da absorção a 256 nm, que o lote A contêm menos de 1 % de ADN.

Dosagem das proteínas totais sistema protein assay comercializado por BIORAD é utilizado para dosear as proteínas totais. 0 método de dosagem estã baseado no facto de que o comprimento de onda do máximo de absorvência de uma solução ácida de azul brilhante de Coomassie g-250 passa de 465 nm para 595 nm, quando as proteínas acabam de aí se fixar [Reisner et al., Anal. Biochem., (1975), 64, 509].

A taxa de proteínas totais do lote A é inferior a

1,5 %.

Dosagem dos grupos amino livres (NH₂)

Esta dosagem foi efectuada de acordo com o método descrito por Zensaku Yosizawa et al., em Biochemica et Biophysica Acta, (1967), 141, 358-365.

O parâmetro taxa de NH^ (expresso em μπιοΐ/mg) é um indicador das quantidades de unidades 1,4-B-glucuronil-D-a-N-acetil-1,4-glicosaminil-D desacetiladas e dos contaminantes que contêm um agrupamento amino livre.

O lote A e o lote B têm cada um uma taxa de NH^ de 0,05 μιηοΐ/mg. A razão NH₂/ácido glucurónico = 0,05/2,1 é inferior a 2,5 %. Há por conseguinte (em mol) para 100 unidades l,4-B-glucuronil-D-a-N-acetil-l,4-glicosaminil menos de 2,5 unidades dissacarídicas deste tipo desacetiladas.

Exemplo 2

Preparação de um N-aceti-heparosano.maioritariamente de baixa massa molecular (Processo II)

1) Cultura da estirpe bacteriana Escherichia coli (K5) e separação de um filtrado que contém N-acetil-heparosano

A cultura da estirpe Escherichia coli SEBR 3282 e a separação de um filtrado que contém N-acetil-heparosano foram realizadas de acordo com o método descrito no Exemplo 1.

2) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular

Passo a - Diãlise

375 mL de filtrado são submetidos a uma diãlise de acordo com o processo descrito no Exemplo 1, [2) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo b]. Após diãlise obtém-se cerca de 1020 mL de solução purificada.

J

Passo b - Purificação em meio ácido

Adiciona-se à solução dialisada uma quantidade adequada de uma solução de HC1 5 N para se obter um pH = 3,5. Elimina-se por centrifugação o precipitado formado, depois acidifica-se a solução com o mesmo ácido (HCl 5 N) para se obter um pH — 1,8.

Pode formar-se um precipitado, que serã eliminado por centrifugação. Neutraliza-se em seguida a solução com a ajuda de uma solução de NaOH 5 N.

Passo c - Precipitação, desidratação e secagem

Adiciona-se à solução neutralizada uma quantidade adequada de cloreto de sódio para se ter uma solução 0,5 M em NaCl, e depois adiciona-se 4 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado durante 5 min à temperatura ambiente. Centrifuga-se a 5000 g durante 20 min. Recolhem-se os bolos de centrifugação em etanol, agita-se a suspensão obtida e deixa-se repousar durante 1 h à temperatura ambiente. Repetem-se as operações de centrifugação e colocação em suspensão. Centrifuga-se de novo a 5000 g durante 20 min. Secam-se os resíduos de centrifugação obtidos numa estufa sob vazio a 40 °C durante 24 h.

Passo d - Hidrólise alcalina e diálise produto obtido no passo anterior, após secagem, é posto em solução a 2,5 % (p/v) numa solução de NaOH 0,25 N. Mantém-se a solução assim obtida durante. 2 horas a 50 °C, Neutraliza-se em seguida com a ajuda de uma solução de HCl 5 N e submete-se em seguida a solução que contém o polissacárido a uma diálise de acordo com o método descrito no Exemplo 1, [2) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo b].

Após diálise, obtêm-se cerca de 990 mL de solução.

Passo e - Cromatografia de permuta aniónica

À solução dialisada adicionam-se quantidades adequadas de piperazina, de EDTA e de Triton X-100 (Prolab^R) para ter respectivamente concentrações de 25 mM em piperazina, 2 mM em EDTA e 0,2 % (v/v) em Triton X-100. 0 pH é em seguida ajustado para 3,5 com a ajuda de uma solução de HCl 5 N. Deposita-se esta solução sobre uma coluna Q-Sepharose Fast Flow de 400 mL, equilibrada num tampão de piperazina que contém 25 mM de piperazina, 2 mM de EDTA e 0,2 mM de Triton X-100 (PH = 3,5). Lava-se com o tampão piperazina, elui-se com uma solução de NaCl 0,5 M, depois precipita-se com 4 volumes de etanol. Seca-se sob vazio a 40 °c. Obtém-se assim cerca de 9,85 g de N-acetil-heparosano.

Passo f - Cromatografia de exclusão g do produto obtido na fase anterior são postos em solução em 60 mL de uma solução tampão de composição tris-HCl 20 mM pH = 7,5 e NaCl 1 M, depois passados sobre uma coluna de 200 mL de octil-Sepharose previamente equilibrada com o mesmo tampão. À fracção não retida adiciona-se 4 volumes de etanol. Lava-se o precipitado formado e seca-se a 40 °C sob vazio.

Obtém-se assim 3,90 g de N-acetil-heparosano.

3) Caracterização do N-acetil-heparosano obtido no fim dos diferentes passos de purificação

Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN)

O estudo dos espectros RMN de protão e de carbono C obtidos com o N-acetil-heparosano confirma a identidade química do produto ao N-acetil-heparosano descrito por W. E. Vann (Eur. J. Biochem., (1981), 116, 59-364).

Determinação da repartição das massas moleculares por cromatocrraf ia de exclusão

A repartição das massas moleculares é determinada por

HPLC de exclusão de acordo com o método utilizado para a determinação da repartição das massas moleculares de N-acetil-heparosanos descritos no Exemplo 1. Uma fracção ponderai de pelo menos igual a 86 % das cadeias que constituem o lote resultante do Exemplo 2 possui uma massa molecular compreendida entre 1500 e 15 000.

Dosacrem dos ácidos urónicos

O N-acetil-heparosano resultante do passo e tem uma taxa de ácido urónico de 1,94 μιηοΐ/mg.

Espectrofotometria no domínio do ultravioleta e do visível

O espectro obtido permite afirmar que o N-acetil-heparosano obtido contém menos do que 1 % de ADN.

Dosagem das proteínas totais

A taxa de proteínas totais deste lote de N-acetil-heparosano é inferior a 1 %.

Dosagem dos grupos amino livres (NH-)

A taxa de NH₂ é inferior a 0,1 Mmol/mg.

·<

Exemplo 3

Preparação de um N-aceti-heparosano-maioritariamente de baixa massa molecular (Processo III)

1) Cultura da estirpe Escherichia coli (K5)

A cultura da estirpe Escherichia coli SEBR 3282 foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Obtém-se cerca de 12 L de cultura que contém N-acetil-heparosano.

J

2) Purificação preliminar

Passo a - Centrifugação

No fim da cultura, centrifuga-se a suspensão obtida (12 L) a 8000 rpm (ou seja entre 11 000 e 14 000 g) durante 20 min.

Passo b - Colocação em contacto com uma solução alcalina

Após a centrifugação, o resíduo é eliminado e o sobrenadante é posto em contacto com uma solução de NaOH 0,1 N durante cerca de 1 hora.

Passo c - Pré-filtração

A solução obtida no passo anterior é submetida a uma pré-filtração sobre um filtro 3M série 300 em polipropileno.

Passo d - Concentração sobre membrana de limiar de corte determinado filtrado obtido no passo c ê concentrado sobre cartucho de fibras cruzadas Amicon , limiar de corte de 10 000 Da ou equivalente. Obtém-se assim uma solução enriquecida em N-acetil-heparosano de baixa massa molecular.

Passo e - Diálise

Dialisa-se a solução enriquecida em N-acetil-heparosano de baixa massa molecular contra a água ultrapurifiçada sempre R sobre o sistema Amicon , a um factor de diluição muito elevado (>10 000).

3) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular ·

Procede-se como está indicado no Exemplo 1 [2) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo c - Passo - f] e obtém-se um N-aceti-heparosano que tem características semelhantes âs do lote A, ou como está indicado no Exemplo 2 [2) Isolamento e purificação de um N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo a - Passo - f].

HEPAROSANOS-N,O-SULFATADOS

Exemplo 4

Modificações químicas do N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular resultante do Exemplo

1) Modificações químicas do lote B

Passo a - Desacetilação parcial

Dissolve-se 500 mg do lote B em 10 mL de solução de NaOH 1 N. Leva-se a solução a 50 °C e deixa-se reagir a esta temperatura durante 8 h sob agitação. Neutraliza-se então a solução com uma solução de HCl 2 N, dialisa-se contra ãgua ultrapurifiçada e depois liofiliza-se.

Passo b - Formação do sal de tetrabutilamónio

O liofilisato anterior é recolhido em 20 mL de água ultrapurifiçada. A solução obtida é enviada para uma coluna permutadora iónica à base de poliestireno reticulado por divinilp benzeno (Dowex 50 W 8 de Dow Chemical ) , previamente condicionada em meio ácido, de maneira a regenerar a forma ácida do produto. A solução é então misturada com 0,4 mL de uma solução a 40 % de tetrabutilamónio. Liofiliza-se.

Passo c - N,O-sulfatação parcial

Dissolve-se 421 mg do sal obtido no passo anterior em .X mL de dimetilformamida e adiciona-se 3,71 g de complexo trióxido de enxofre-piridina (comercializada por Aldrich sob a ref. S755-6). Deixa-se reagir sob agitação durante 6 h à temperatura ambiente. A um volume do meio reaccional adiciona-se cloreto de sódio até â obtenção de uma solução de concentração 0,33 M em cloreto de sódio e depois 2 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado. Centrifuga-se e elimina-se o sobrenadante. 0 resíduo de centrifugação é recolhido numa solução de NaCl 0,5 M, gue se neutraliza. Adiciona-se em seguida 2 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado, centrifuga-se e recolhe-se o resíduo de centrifugação com água ultrapurifiçada. Dialisa-se contra a água ultrapurifiçada e liofiliza-se.

Repete-se o conjunto das operações descritas no parágrafo anterior.

liofilizado obtido apresenta as seguintes características :

taxa de ácido urónico: 1,11 μιηοΐ/mg taxa de NH_ livre: 0,01 μπιοΐ/mg

Λ taxa de sulfatação: 2,64 por unidade dissacarídica

As taxas de ácido urónico e de NH^ são medidas como se descreveu no Exemplo 1.

A taxa de sulfatação, igualmente chamada razão sulfato/carboxilo, ê o número médio de grupos sulfato por grupo carboxilo; ela é medida pelo método condutimétrico de dosagem do grupo sulfato e do grupo carboxilo descrito por B. Casu et al., em Carbohidrate Research, (1975), 39, 168-176.

2) Modificações químicas do lote A

O lote A é dividido em três fracções alíquotas, chamadas lote Al, lote A2 e lote A3.

Passo a - Desacetilação parcial e filtração gel

Os lotes Al, A2 e A3 foram tratados como se descreveu no passo a, para o lote B anterior, com a diferença de que apenas o lote Al é dialisado e liofilizado. Os lotes Al, A2 e A3 são em seguida fraccionados por filtração gel (igualmente chamada cromatografia de permeação gel ou cromatografia de exclusão), nas seguintes condições:

Suporte de grânulos de diâmetros 25-75 μιη à base de alildextrano reticulado com Ν,Ν'-metileno-bis-acrilamida R (Sephacryl S 300 HR comercializada por Pharmacia ). Eluente utilizado: solução de NaCl 0,5 M.

Realizam-se as misturas das fracções que correspondem a um K de 0,46 a 1 para o heparosano resultante do lote Al, de av

0,43 a 1 para o heparosano resultante do lote A2 e de 0,43 a 0,64 para o heparosano resultante do lote A3. Estas fracções são chamadas de aqui em diante heparosanos filtrados em gel.

K é um coeficiente habitualmente utilizado em av cromatografia de exclusão, e permite reproduzir o fraccionamento por cromatografia de exclusão. É definido pela fórmula:

av

V - V. e t

O t na qual: νθ = volume de eluição da fracção considerada

V = volume de exclusão o = volume total do gel.

A repartição das massas moleculares do heparosano resultante do lote Al imediatamente depois da desacetilação parcial, assim como dos heparosanos filtrados em gel resultantes dos lotes Al, A2 e A3, é determinada por cromatografia de exclusão de acordo com a técnica descrita no Exemplo 1.

Os perfis de eluição obtidos antes e depois da filtração gel para o heparosano resultante do lote Al estão representados respectivamente nas figuras 2 e 3. Certos resultados deduzidos dos perfis de eluição -estão reunidos no quadro II seguinte, no qual PM_q representa a massa molecular tal que uma fracção ponderai de 1 % do produto tenha uma massa molecular superior a ΡΜθ, PM^ representa a massa molecular tal que uma fracção ponderai de 10 % do produto tenha uma massa molecular superior a PM , PM₃ representa a massa molecular tal que uma fracção ponderai de 10 % do produto tenha uma massa molecular inferior a PM₃, PM^ representa a massa molecular correspondente ao mãximo de ábsorção.

QUADRO III

Repartição das massas moleculares do heparosano, resultante do lote Al (não filtrado em gel) e de heparosanos filtrados em gel resultantes dos lotes Al, A2 e A3

	PM o	PM	pm2	pm3
Heparosano não filtrado em gel resultante do lote Al	41400	9600	4400	1400
Heparosano filtrado em gel resultante do lote Al	10700	6900	4400	1600
Heparosano filtrado em gel resultante do lote A2	12700	7000	4500	1500
Heparosano filtrado em gel resultante do lote A3	10300	6900	4500	1500

Verifica-se, comparando as figuras 2 e 3, que a filtração gel permite eliminar a fracção minoritária de alta massa molecular do heparosano.

Este resultado aparece claramente no Quadro III onde se verifica uma forte diminuição de PM_q a seguir à operação de filtração gel. O heparosano de cada um dos lotes contém pelo menos 90 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas inferiores a 7000.

Os heparosanos filtrados em gel resultantes dos lotes Al e A2 são em seguida tratados como se descreveu no Exemplo 1 (2) Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo c] .

O heparosano filtrado em gel resultante do lote A3 não é precipitado mas é dialisado contra água ultrapurifiçada.

As taxas de ácido urónico e dos grupos amino livres são medidas como se descreveu no Exemplo 1.

Os resultados obtidos são reunidos no Quadro IV seguinte. A taxa de acetilo residual foi avaliada considerando que há tantos qrupos glucuronilo como grupos glicosaminilo.

A taxa de desacetilação foi calculada como sendo igual à razão da taxa de grupos amino livres sobre a taxa de ácido urónico.

Espectro de ressonância magnética nuclear

O estudo do espectro de ressonância magnética nuclear de protão obtido pelo heparosano filtrado em gel resultante do lote A3 permitiu concluir que o produto possui a estrutura esperada.

A taxa de desacetilação calculada por integração verificou-se ser igual a 44 %. Este valor é vizinho do calculado utilizando a razão da taxa de grupos amino livres sobre a taxa de ácido urónico (41 %).

QUADRO IV

Características dos heparosanos filtrados em gel resultantes dos lotes Al, A2 e A3

	Taxa de ãc. urónico doseado (μιηοΐ/mg)	Taxa de nh2 doseado (/xmol/mg)	Taxa acetilo residual calculado (μΐϊΐοΐ/mg)	Taxa de desacetilação
Heparosano filtrado em gel resultante do lote Al	2,3	1,10	1,20	48 %
Heparosano filtrado em gel resultante do lote A2	2,4	1,00	1,40	42 %
Heparosano filtrado em gel resultante do lote A3	2,6	1,05	1,55	41 %

Passo b - N,O-sulfatação parcial

Tratam-se os heparosanos filtrados em gel resultantes dos lotes Al, A2 e A3 desacetilados da maneira descrita anteriormente para o lote B (Passo c - N, O-sulf atação parcial), com a diferença de que não se repetem as operações descritas no primeiro parágrafo.

Para os heparosanos resultantes do lote A3, depois da primeira precipitação, o resíduo é recolhido em água ultrapurificada, dialisado contra água ultrapurifiçada e deixado em solução.

As características dos produtos N,O-sulfatados estão reunidas no Quadro V seguinte.

QUADRO V

Características dos heparosanos-N,O-sulfatados resultantes dos lotes Al, A2 e A3 obtidos da reacção de N,O-sulfatação parcial

	Taxa de NH^ (Mmol/mg)	Taxa de sulfatação (razão sulfato/carboxilo)
Heparosano-N,O-sulfatado resultante do lote Al	0,10	1,9
Heparosano-N,O-sulfatado resultante do lote A2	0,1	1,9
Heparosano-N,O-sulfatado resultante do lote A3	0,10	1,8

Verifica-se que depois da reacção de N,O-sulfatação a taxa de NH₂ residual (0,10 gmol/mg) é superior à dos N-acetil-heparosanos purificados (0,05 μιηοΐ/mg) . A sulf atação não é portanto completa sobre o átomo de azoto.

Passo c - N-sulfatação total

Mistura-se num volume de 20 mL de ãgua ultrapurifiçada por grama de produto Ν,Ο-suLfatado empenhado, 1 parte ponderai de produto Ν,Ο-sulfatado, 1 parte ponderai de complexo triõxido de enxofre-trimetilamina e deixa-se reagir a 55 °C sob agitação durante 20 h. Dilui-se em seguida a mistura reaccional (factor de diluição 10), depois ajusta-se a conditividade da solução obtida à de uma solução de cloreto de sódio 0,5 M. Em seguida realizam-se uma precipitação por adição de 2 volumes de etanol, uma centrifugação seguida de uma recolha dos resíduos por uma solução de NaCl 0,5 M, depois uma segunda precipitação por adição de 2 volumes de etanol. Após recolha em ãgua ultrapurifiçada e diálise contra água ultrapurifiçada, os produtos .são liofilizados e secos a 40 °C sob vazio.

Espectro de ressonância magnética nuclear

O estudo do espectro de ressonância magnética nuclear 13 de C do heparosano-N,O-sulfatado. resultante do lote A3 mostra que, para este composto, o álcool na posição 6 do grupo glicosaminilo está inteiramente sob a forma de éster sulfúrico.

Certas earacterísticas dos heparosanos-N,O-sulfatados obtidos, determinadas de acordo com os métodos descritos anteriormente, são reunidas no Quadro VI seguinte.

QUADRO VI earacterísticas dos produtos obtidos como resultado da N-sulfatação total para os lotes Al, A2 e A3

	Taxa de ácido urónico (/xmol/mg)	Taxa de nh2 (/xmol/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Heparosano-N,0-sulfatado resultante do lote Al	1,20	0,02	48 %	2,2
Heparosano-N,O-sulfatado resultante do lote Ά2	1,30	0,02	42 %	2,2
Heparosano-N,O-sulfatado resultante do lote A3	1,35	0,02	41 %	2,1

Verifica-se que a taxa de NH₂ residual (0,02 /zmol/mg) é baixa e inferior à do N-acetil-heparosano purificado (0,05 ^mol/mg para o lote A e lote B) assim como à do_; heparosano-N,0-sulfatado obtido como resultado da Ν,Ο-sulfatação parcial (indicada no Quadro V). Isto demonstra o carácter total da reacção de N-sulfatação.

A repartição dos pesos moleculares dos produtos obtidos após a N-sulfatação é analisada pela tãcnica descrita no Exemplo

1.

perfil de eluição obtido para o produto resultante do lote Al é representado na figura 4. Perfis de eluição muito semelhantes são obtidos para os produtos resultantes dos lotes A2 e A3.

Certos resultados deduzidos dos perfis de eluição são reunidos no quadro VII. A definição de PM_q, ΡΜ_χ, PM₂ e PM₃ é idêntica à indicada para o Quadro III.

QUADRO VII

Repartição das massas moleculares dos produtos obtidos como resultado da N-sulfatação total para os lotes Al, A2 e A3

	PM o	PM	pm2	pm3
Lote Al	14700	9000	5700	2600
Lote A2	17500	10000	5800	3400
Lote A3	11600	7600	5000	1800

O heparosano-N,O-sulfatado de cada um dos lotes contêm pelo menos 90 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas inferiores a 10 000.

Com efeito, os lotes Al, A2 e A3 contém 80 % de cadeias de massas moleculares relativas respectivamente compreendidas entre 2600 e 9000, 3400 e 10 000, e 1800 e 7600.

Exemplo 5

Modificações químicas do N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular resultante do Exemplo 2

- Preparação de heparosanos-N,O-sulfatados, derivados

N-desacetilados a 80 %

O N-acetil-heparosano utilizado foi preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 2. A taxa de ácido urónico deste produto é de 2,12 μιηοΐ/mg. A determinação da repartição das massas moleculares foi efectuada por cromatografia de exclusão, de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Uma fracção ponderai pelo menos igual a 87,5 % possui cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000. 0 pico maioritãrio da distribuição situa-se a cerca de 4900. Este lote de N-acetil-heparosano é designado por lote C.

Passo a - Desacetilação parcial

Dissolve-se 2,5 g do lote C em 50 mL de uma solução de NaOH 2 N. Leva-se a solução até 50 °C e deixa-se reagir a esta temperatura durante 8 horas sob agitação. Ajusta-se o pH para 8 com a ajuda de uma solução de HCl 2 N, dialisa-se contra ãgua ultrapurifiçada e depois liofiliza-se.

Obtém-se desta maneira 1,96 g de produto.

Taxa de N-desacetilacão

A dosagem dos grupos amino livres '(NH₂) indica que o

N-acetil-heparosano foi N-desacetilado a 80 %.

Passo b - N-sulfatação liofilisato anterior é recolhido em 70 mL de água e adiciona-se 2,5 g de Na^CO^ e 2,5 g de complexo trióxido de enxofre-trimetilamina. Deixa-se reagir durante 20 horas a 55 °C.

Leva-se a condutividade da solução reaccional à de uma solução de cloreto de sódio 0,5 N por adição de água desmineralizada. Precipita-se por 4 volumes de etanol. Centrifuga-se. Dissolve-se de novo o precipitado numa solução de NaCl 0,5 M. Precipita-se por 4 volumes de etanol. Centrifuga-se.

Recolhe-se o resíduo de centrifugação em água ultrapurificada, dialisa-se contra esta solução de acordo com o processo já descrito (Exemplo 1) e liofiliza-se.

Obtém-se cerca de 2 g de produto.

Passo c - Formação do sal de tetrabutilamónio

O liofilisato obtido no passo anterior é transformado em sal de tetrabutilamónio de acordo com o processo já descrito no Exemplo 4 [1) Modificações químicas do lote B, Passo b].

Obtém-se 2,7 g de sal.

Passo d - O-sulfatação

Dissolve-se 2,680 g do sal obtido nó passo anterior em 196 mL de formamida e adiciona-se 11,27 g de complexo trióxido de enxofre-piridina. Deixa-se reagir sob agitação durante 6 horas a 30 °C. Adiciona-se 1 volume de uma solução de NaCl 2 M para 5 volumes de solução reaccional e ajusta-se o pH com a ajuda de uma solução de NaOH. Peprecipita-se com 2 volumes de etanol, centrifuga-se e redissolve-se o resíduo numa solução de NaCl 0,5 M. Adiciona-se em seguida 2 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado, centrifuga-se e recolhe-se o resíduo da centrifugação com 80 mL de água ultrapurifiçada. Adiciona-se 20 mL de uma solução de NaCl 2 M, depois 4 volumes de etanol. Deixa-se formar ó precipitado e centrifuga-se.

Passo e - Filtração gel

O produto obtido no passo d é recolhido em água ultrapurificada, depois é fraccionado por filtração gel de acordo com as condições descritas no Exemplo 4 [2) Modificações químicas do lote A, Passo a]. Determinam-se as massas moleculares relativas das cadeias que constituem a composição do heparosano-N,O-sulfatado por cromatografia de exclusão, de acordo com o método Reagrupam-se, por um lado, as fracções que têm massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 12 000 [Solução C(A)] e, por outro lado, as fracções que contêm heparosanos-N,O-sulfatados constituídos por cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 2000 e 30 000 [Solução C(M)].

descrito no Exemplo 1. que contêm as cadeias

À solução C(A) adiciona-se 4 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado; centrifuga-se e recolhe-se o

resíduo de centrifugação com água ultrapurifiçada. Dialisa-se contra água ultrapurifiçada e liofiliza-se.

Obtêm-se 1,8 g de produto.

O heparosano-N,O-sulfatado assim obtido é chamado lote

Cl.

Certas caracteristicas deste heparosano-N,O-sulfatado, determinadas de acordo com os métodos descritos anteriormente, são reunidas no Quadro VIII seguinte.

QUADRO VIII

Caracteristicas do produto correspondente ao Cl

	Taxa de ácido urónico (μπιοΐ/mg)	Taxa de nh2 (μιηοΐ/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Lote Cl	1,6	0,013	S0 %	1,9

A repartição do peso molecular do produto foi avaliada pela técnica descrita no Exemplo 1. Certos resultados deduzidos do perfil de eluição são reunidos no quadro IX.

QUADRO IX

Repartição das massas moleculares do produto correspondente ao lote Cl

	PM o	PM	pm2	pm3
Lote Cl	9600	7200	5621	2367

A definição de PM_q, PM.^, PM₂ e PM₃ é idêntica à indicada para o Quadro III.

heparosano-N,O-sulfatado do lote Cl contém pelo menos 95 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000.

Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão 13 e de carbono C são obtidos com heparosano-N,O-sulfatado do lote Cl (espectros realizados sobre AMX 500, solvente D₂0).

O estudo dos espectros, de ressonância magnética nuclear 13 de protão e de carbono C confirma a estrutura esperada para o produto. Trata-se efectivamente de um heparosano-N,O-sulfatado.

O estudo da razão da intensidade dos protões dos açúcares sobre os protões dos acetilos do espectro de protão, conduz a propor-se uma taxa de desacetilação de 84 %. Este valor é vizinho do calculado utilizando a razão da taxa de grupos amino livres sobre a taxa de ácido urõnico (80 %).

espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13

C confirma particularmente que a glicosamina está N-sulfatada quase totalmente. 0 ácido glucurónico-D não esta sulfatado nas posições 2 e 3.

Passo f - Filtração gel

À solução C(M), adiciona-se 4 volumes de etanol. Deixa-se formar o precipitado, centrifuga-se, recolhe-se resíduo com água ultrapurifiçada, dialisa-se e liofiliza-se.

liofilizado ê em seguida dissolvido numa solução de

NaCl 0,5 M e fraccionado por filtração gel de acordo com as condições definidas no Passo e.

Reagrupam-se, por um lado, as fracções que contêm cadeias que têm massas moleculares relativas compreendidas entre 1300 e 21 000 [Solução C(B)] e, por outro lado, as fracções que contêm cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 14 000 e 37 000 [Solução C(C)].

Estas duas soluções são tratadas como se indicou anteriormente para a solução C(A) e obtém-se apôs liofilização pela solução C(B), o lote C2, e pela solução C(C), o lote C3.

O Quadro X indica alguns resultados deduzidos dos perfis de eluição para os produtos do lote C2 e do lote C3.

QUADRO X

Repartição das massas moleculares do produto correspondentes aos lotes C2 e C3

	PM o	PM1	pm2	pm3
Lote	C2	14600	9600	7597	5950
Lote	C3	28656	17320	10512	7975

A definição de ΡΜθ, PM^, PM₂ e PM^ é idêntica à indicada para o Quadro III.

O heparosano-N,O-sulfatado correspondente ao lote C2 contém cerca de 99 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000, e o heparosano-N,O-sulfatado correspondente ao lote C3 contém cerca de 73 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000.

Exemplo 6

Modificações químicas do N-aceti-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular resultante do Exemplo 2 - Preparação de um heparosano-N,O-sulfatado; derivado

N-desacetilado a 40 %, que tem uma taxa de sulfatacão de 2,6

N-acetil-heparosano utilizado como matéria prima foi preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 2. A taxa de ácido urónico deste produto é de 1,96 ptmol/mg. Este lote é designado por lote D.

Passo a - Desacetilação parcial

Dissolve-se 3,7 g do lote D em 74 mL de NaOH 1 N e trata-se de acordo com o processo descrito no Exemplo 5, Passo a. A desacetilação é efectuada sob azoto.'

Após liofilização obtém-se 2,91 g de produto.

Taxa de N-desacetilacão

A dosagem dos grupos amino livres (NH^) do produto obtido após liofilização indica que o N-acetil-heparosano foi desacetilado a 40 I.

Passo b - N-sulfatação produto obtido no passo anterior foi tratado com

3,7 g do complexo trióxido de enxofre-trimetilamina, em presença de 3,7 g de Na₂CO₃ e de acordo com o processo descrito no Exemplo

5, Passo b.

Obtém-se assim cerca de 3 g de um heparosano-N,O-sulfatado.

Passo c - Formação do sal de tetrabutilamónio

Cerca de 2 g do heparosano-N,O-sulfatado obtido no passo anterior são transformados de acordo com o método descrito no Exemplo 5, Passo c, em sal de tetrabutilamónio.

Obtêm-se 2,99 g de liofilizato.

Passo d - O-sulfatação

Faz-se reagir 2,98 g do sal obtido no passo anterior com 14 g de complexo trióxido de enxofre-trimetilamina, de acordo com o método descrito no Exemplo 5, Passo d, e depois procede-se âs precipitações e purificações descritas no mesmo Exemplo 5, Passo d.

Obtém-se 2,8 g de liofilizato.

Passo e - Filtração gel produto obtido no passo anterior é fraccionado por filtração gel utilizando o método e o material descritos no Exemplo 4 [2) Modificações químicas do lote A, Passo a].

A repartição das massas moleculares das fracções do heparosano-N,O-sulfatado é determinada por eromatografia de exclusão de acordo com a técnica descrita no Exemplo 1. Isolam-se as fracções constituídas por heparosanos-N,O-sulfatados cuja maioria das cadeias possui uma massa molecular compreendida entre

1500 e 15 000.

Estas fracções são em seguida concentradas e submetidas a uma diálise contra ãgua purificada. Realiza-se em seguida uma precipitação adicionando 5 volumes de etanol, centrifuga-se, dissolve-se o precipitado numa solução de NaCl 0,5 M e repete-se a operação de precipitação.

O produto purificado assim obtido é submetido a um segundo fraccionamento utilizando o protocolo mencionado no início deste passo. A repartição das massas moleculares das fracções é determinada por cromatografia de exclusão de acordo com o método já descrito. Recolhem-se as fracções que contêm os produtos que têm massas moleculares compreendidas entre 4000 e 8000.

As fracções são submetidas a uma diálise e depois os produtos são precipitados por adição de etanol. 0 precipitado é recuperado e dissolvido numa solução de NaCl 0,5 Μ. A solução assim obtida é dialisada contra ãgua purificada e depois é liofilizada.

Obtém-se assim cerca de 1 g de um heparosano-N,0-sulfatado designado por lote Dl.

As caracteristicas e a repartição das massas moleculares deste heparosano-N,O-sulfatado são indicadas, respectivamente, nos quadros XI e XII.

ί 4

QUADRO XI

Características do produto correspondente ao lote Dl

	Taxa de ácido urónico (gmol/mg)	Taxa de NH2 (gmol/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Lote Dl	1,53	0,01	40 %	2,60

QUADRO XII

Repartição das massas moleculares do produto correspondente ao lote Dl

	PM o	PM.J.	pm2	PM3
Lote Dl	15430	10305	6850	4047

A definição de ΡΜθ, ΡΜ_χ, PM₂ e PM₃ é idêntica à indicada para o Quadro III.

O heparosano-N,O-sulfatado do lote Dl contém 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 4047 e 10 305 e cerca de 98,5 %, numa base ponderai, destas cadeias têm uma massa molecular relativa compreendida entre 1500 e 14 600. A figura 5 representa o perfil de eluição obtido para este heparosano-N,O-sulfatado.

Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão 13 e de carbono C são obtidos com heparosano-N,O-sulfatado do lote Dl (espectros realizados sobre AMX 500, solvente D₂0).

estudo dos espectros de ressonância magnética nuclear 13 de protão e de carbono C confirma a estrutura esperada para o produto. Trata-se efectivamente de um heparosano-N,O-sulfatado.

O espectros de ressonância magnética nuclear do carbono 13 c confirma particularmente que nenhum grupo amino da porção glicosamina está sob a forma amino livre (NH ). A glicosamina está inteiramente sulfatada na posição 6 e, pelo contrário, nenhum dos grupos hidroxi do ácido glucurónico está sulfatado.

Exemplo 7

tariamente de	baixa	massa molecular	resultante do
Exemplo 2
- Preparação de	um heparosano-N,O-sulfatado: derivado
N-desacetilado	a 40 %,	que tem uma taxa	de sulfatação

de 3

Como matéria prima utiliza-se um lote de N-acetil-heparosano preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 2. Este lote ê designado por lote E, e tem uma taxa de ácido urónico deste produto é de 2 ^mol/mg.

A repartição da massa molecular deste N-acetil-heparosano fracções do heparosano-N,O-sulfatado foi avaliada pela técnica descrita no Exemplo 1. Este N-acetil-heparosano contém cerca de 75 %, numa base ponderai, de cadeias compreendidas entre 1500 e 15000, e a massa molecular relativa média destas cadeias é de cerca de 10 900. A massa molecular relativa da espécie maioritãria é de 5135.

Passo a - Desacetilação parcial

N-acetil-heparosano foi N-desacetilado a 40 % de acordo com o protocolo mencionado no Exemplo 6 (Passo a). Para efectuar esta N-desacetilação, utiliza-se 2,5 g de matéria prima que se dissolve em 50 mL de NaOH 1 N. No fim da reacção, o pH do meio reaccional é ajustado a 6 com a ajuda de HC1 e depois concentrado.

Taxa de desacetilação

A dosagem dos grupos amino livres (NH₂) indica que o N-acetil-heparosano foi N-desacetilado a 40 %.

Passo b - Filtração gel

Utiliza-se uma coluna de Sephacryl S 3 00 HR (5 cm x 100 cm) equilibrada em NaCl 0,5 M.

A repartição das massas moleculares do heparosano-N,0-sulfatado contido nas diferentes fraeções é determinada por cromatografia de exclusão. Reagrupam-se as fraeções que contêm cadeias que têm uma massa molecular relativa compreendida entre 6000 e 20 000, concentra-se em Rotavapor, precipita-se por 4 volumes de etanol e seca-se o precipitado formado.

Obtêm-se assim cerca de 1 g de produto.

Passo c - Formação do sal de tetrabutilamónio e N,O-sulfatação parcial

Para formar o sal de tetrabutilamónio, utiliza-se

300 mg do produto obtido no passo anterior e aplica-se o processo descrito no Exemplo 4 [1) Modificações químicas do lote B, Passo b]. Obtém-se 490 mg de sal que se dissolve em 30 mL de formamida. Procede-se em seguida a uma N,O-sulfatação parcial de acordo com o processo descrito no Exemplo 4 [l) Modificações químicas do lote B, Passo c - primeiro parágrafo].

A partir de 490 mg de sal que se faz reagir com 2,25 g de complexo trióxido de enxofre-piridina, obtém-se 406 mg de heparosano-N,O-sulfatado.

Passo d - N-sulfatação total e filtração gel

372 mg do produto obtido no passo anterior são dissolvidos em 15 mL de uma solução de Na^CO^ a 5 % e tratados com 372 mg do complexo trióxido de enxofre-trimetilamina, de acordo com o processo descrito no Exemplo 4 [1) Modificações químicas do lote A, Passo c].

O produto obtido após N-sulfatação total é em seguida fraccionado por filtração gel utilizando uma coluna de Sephacryl S 300 HR (2,5 cm x 100 cm) e aplicando o protocolo jã descrito.

As fracções que têm uma massa molecular relativa compreendida entre 6000 e 20 000 são reagrupadas, concentradas em Rotavapor, dialisadas extensivamente contra água ultrapurifiçada fria e liofilizadas.

Obtém-se assim 260 mg de designado por lote El.

um heparosano-N,O-sulfatado

As características deste produto são reunidas no Quadro

XIII.

Quadro XIV indica a repartição das massas moleculares relativas das cadeias que constituem o lote El.

Este heparosano-N,O-sulfatado contém cerca de 75 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000 e cerca de 65 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 7700 e 15 000.

QUADRO XIII

Características do produto correspondente ao lote El

	Taxa de acido urónico (Mmol/mg)	Taxa de nh2 (μιηοΐ/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Lote El	1,35	0,01	40 %	3

QUADRO XIV

Repartição das massas moleculares do produto correspondente ao lote El

	PM O	PM	pm2	pm3
Lote El	31238	19671	12029	7748

A definição de PM_q, PM^, PM₂ e PM^ ê idêntica à indicada para o Quadro III.

Exemplo 8

Preparação de dois lotes de um heparosano-N,o-sulfatado: derivados N-desacetilados a 80 %, que têm uma taxa de sulfatação de 2,25 e 2,4

A matéria prima utilizada, lote F, é um lote de N-acetil-heparosano preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 2.

A determinação da repartição das massas moleculares das cadeias que constituem este composto foi realizada por cromatografia de exclusão de acordo com o processo descrito no Exemplo

1.

O exame do perfil permite verificar que o lote F contém 92 %, numa base ponderai, de cadeias cuja massa molecular relativa esta compreendida entre 1500 e 15 000.

O pico maioritãrio está situado a cerca de 4800. Uma fracção ponderai do lote F pelo menos igual a 80 % possui uma massa molecular relativa compreendida entre 2400 e 10 000.

A taxa de ácido urónico deste produto é de 2,4 ^mol/mg.

Passo a - Desacetilação parcial

Procede-se como se descreveu para o Exemplo 5, Passo a, utilizando 2,5 g do lote F e 50 mL. de NaOH 2 N.

Obtém-se 1,6 g de produto N-desacetilado a 80 %.

A percentagem da N-desacetilação foi avaliada pela dosagem dos grupos amino livres.

Passos b e c - N-sulfatação e formação do sal de tetrabutilamónio

Estes dois passos são idênticos aos Passos b e c descritos no Exemplo 5.

Obtém-se 4,7 g do sal de tetrabutilamõnio.

Passo d - O-sulfatação

Dissolve-se 2,9 g do sal obtido acima em 290 mL de formamida e adiciona-se 17,4 g de complexo triõxido de enxofre-piridina.

Procede-se como se descreveu no Passo d do Exemplo 5.

O resíduo obtido após a segunda centrifugação é dissolvido em ãgua ultrapurifiçada, depois dialisa-se contra ãgua ultrapurifiçada e liofiliza-se.

Obtém-se assim 3,68 g de produto.

Passo e - Filtração gel

O produto obtido no passo anterior é posto em solução numa solução de NaCl 0,5 M e depois é depositado numa coluna Sephacryl S 300 HR equilibrada por NaCl 0,5 Μ. O efluente é recolhido por um colector de fracções.

As fracções que têm uma massa molecular relativa compreendida entre 1400 e 10 000 são reagrupadas e concentradas num Rotavapor. Precipita-se por 4 volumes de etanol, centrifuga-se, recolhe-se o precipitado em ãgua ultrapurifiçada, dialisa-se a solução assim obtida extensivamente contra água ultrapurifiçada, liofiliza-se e seca-se.

Obtém-se assim 1,6 g de um heparosano-N,O-sulfatado designado por lote Fl.

As fracções correspondentes às massas moleculares relativas compreendidas entre 5000 e 35 000 são reunidas, concentradas no Rotavapor e à solução assim obtida adiciona-se 4 volumes de etanol, centrifuga-se, récolhe-se o precipitado em água, dialisa-se a solução assim obtida contra água ultrapurificada e liofiliza-se. 0 liofilizato é submetido a um novo fraccionamento de acordo com o método indicado no início deste passo.

A repartição das massas moleculares das diferentes fracções é determinada por cromatografia de exclusão de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Reagrupam-se as fracções que contêm heparosanos-N,O-sulfatados relativa compreendida entre 2000 volumes de etanol, centrifuga-se que têm uma massa molecular e 26 000, precipita-se por 4 e redissolve-se o resíduo em água destilada, dialisa-se e liofiliza-se.

Obtêm-se assim cerca de 0,6 g de um heparosano-N,0-sulfatado designado por lote F2.

As características dos lotes Fl e F2 são indicadas no Quadro XV. Resultados deduzidos dos perfis de euição estão reunidos no Quadros XVI.

QUADRO XV

Características dos heparosanos-N,O-sulfatados correspondentes aos lotes Fl e F2

	Taxa de ácido urónico (μπιοΐ/mg)	Taxa de nh2 (jLimol/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Lote Fl	1,58	<0,01	80 %	2,4
Lote F2	1,58	<0,01	80 %	2,25

QUADRO XVI

Repartição das massas moleculares dos produtos correspondentes aos lotes Fl e F2

	PM o	Ρϊ·^	pm2	pm3
Lote Fl	10700	7700	5800 '	3300
Lote F2	24400	16325	8600	6900

A definição de PM_q, ΡΜ_χ, PM₂ e PM₃ é idêntica à indicada para o Quadro III.

J

O heparosano-N,O-sulfatado do lote Fl contém cerca de 99 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 1500 e 15 000 e o do lote F2 contém cerca de 84,6 %, numa base ponderai, de cadeias têm uma massa molecular relativa compreendida entre 1500 e 15 000 e cerca de %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 6900 e 13 500.

Espectro de ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão 13 _ . · e de carbono C sao obtidos com heparosano-N,O-sulfatado do lote F1 (espectros realizados sobre AMX 500, solvente D₂O)·

O estudo do espectro de protão e, particularmente, da razão da intensidade dos protões dos açúcares sobre os protões desacetilados conduz a que se proponha cerca de 20 % de porções glicosamina N-acetilada.

espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13

C confirma que a porção glicosamina está muito N-sulfatada. O ácido glucurônico, na maioria das estruturas dissacarídicas, não está O-sulfatado nas posições 2 e 3.

PREPARAÇÕES

Preparação A

Preparação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular (Processo I)

1) Cultura de uma estirpe Escherichia coli (K5) e separação de um filtrado que contêm N-acetil-heparosano

Semeiam-se 400 mL do meio D, de composição precisada no Quadro XVII seguinte, com a estirpe Escherichia coli SEBR 3282 e incuba-se sob agitação durante 2 h a 37 °C.

A pré-cultura obtida é em seguida transferida para um fermentador de 18,5 L que contém 11 L do meio C, de composição

precisada no Quadro XVII seguinte, e incuba-se· durante 6h30 min a 37 °C e pH = 7,2, sendo a pressão parcial em oxigénio mantida em 40 mmEíg por regulação de injecção de ar (até 20 L/min) e agitação. Adiciona-se em seguida glicerol introduzindo de maneira contínua uma solução estéril gue contém 500 g/L de glicerol à razão de 18 g/h durante 16 a 17 h.

Prossegue-se a cultura nas mesmas condições de temperatura, de pH e de pressão parcial de oxigénio até ao consumo quase total do glicerol. A observação da DO (lambda = 600 nm) da suspensão de cultura após o termo da adição de glicerol, mostra um estado estacionário ou de lise ligeira até à paragem da cultura às 28-30 h de idade em fermentador.

Arrefece-se então o caldo de cultura para 25 °C, em seguida filtra-se através de uma membrana de porosidade 0,22 gm. Obtém-se assim cerca de 12 L de filtrado que contém N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular.

QUADRO XVII

Composição e preparação do meio C e do meio D

MEIO C

Em 900 mL de água ultrapurifiçada dissolver por ordem: NTA (ãcido nitrilotriacético) .................... 1000 mg ?2^HPO4 ........................................... ⁷⁹⁰

Ácido glutâmico .................................. 11 ooo mg

MgCl-, 6H-0 ...................................... 500 mg

K,so; ............................................ 450 mg

FeSO^, 7HO ...................................... 18 mg

CaCl\ 2H²0 ...................................... 2 mg

NaCl²............................................. 500 mg

KC1 .............................................. 5000 mg

Solução de oligoelementos (cf Quadro II, Exemplo 1) 1 mL

Glicerol ......................................... 10 000 mg

Ajustar o pH para 7,2 com uma solução concentrada de KOH (d = 1,38) e completar até 1000 mL com água ultrapurifiçada. Efectuar uma filtração esterilizante sobre membrana de 0,2 μια.

Solução de glicerol

Dissolver 50 g de glicerol numa quantidade adequada de água ultrapurifiçada e ajustar o volume até 1000 mL com o mesmo solvente. Efectuar uma filtração esterilizante sobre membrana de 0,2 μκι.

O agente antiespumente empregue no decurso da fermentação é o Struktol J673 (Schill et Seilacher ).

MEIO D

A preparação do meio D é idêntica à do meio C, com a diferença de que convém adicionar tampão (pH = 7,2): ácido 3-morfolinopropanossulfónico após a adição do agente antiespumante.

2) Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular

O N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular foi isolado e purificado de acordo com o processo descrito no Exemplo 2 [2) Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular, Passo a

- Passo f].

3) Caracterização do N-acetil-heparosano obtido

J

Determinação da reparticao das massas moleculares por cromatografia de exclusão

Tendo em conta os padrões actualmente utilizados, a repartição das massas moleculares foi avaliada de maneira aproximada .

N-acetil-heparosano obtido para esta preparação é constituído por cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 20 000 e 500 000, e a massa relativa média situa-se a cerca de 100 000-200 000.

Dosagem dos ácidos urónicos

A taxa de ácido urónico do produto purificado resultante do passo final é de 2,2 gmol/mg.

Espectrofotometria no domínio do ultravioleta e do visível

O espectro obtido permite afirmar que este lote contêm menos de 0,5 % de ADN.

Dosagem das proteínas totais

A taxa de proteínas totais ê inferior a 0,5

Ό «

Dosagem dos grupos amino livres (NH^)^:

A taxa de NH^ é inferior a 0,1 ^mol/mg.

Preparação B

Preparação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular (Processo II)

1) Cultura da estirpe Escherichia coli (K5)

A cultura da estirpe Escherichia coli SEBR 3282 foi realizada de acordo com o método descrito na Preparação A. Obtém-se cerca de 12 L de cultura que contém N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular.

2) Purificação preliminar

Procede-se como se encontra descrito no Exemplo 3 [2)

Purificação preliminar] utilizando no Passo d um cartucho de p

fibras cruzadas Amicon , limiar de corte de 30 000 Da ou equivalente.

3) Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de alta massa molecular

Procede-se como se encontra indicado no Exemplo 3 [3)

Isolamento e purificação de um N-acetil-heparosano maioritariamente de baixa massa molecular] .

Preparação C

Modificações químicas do N-aceti-heparosano maioritariamente de alta massa molecular resultante da Preparação A químicas, preparado

Como matéria utiliza-se um de acordo com prima para as diferentes modificações N-acetil-heparosano designado por lote G1 o processo descrito na Preparação A.

/xmol/mg

A taxa de ácido urónico deste produto é de 2,41 Passo a - Desacetilação parcial

Dissolve-se 1,9 g do lote G1 em 38,5 mL de NaOH 2 N. Leva-se a solução até 50 °C e deixa-se reagir a esta temperatura durante 8 horas sob azoto.

Ajusta-se em seguida o pH para 8,25 por adição de HCl 2 N. Dialisa-se contra água ultrapurificada e depois liofiliza-se.

Obtém-se assim 2,48 g de produto.

Taxa de N-desacetilacão

A dosagem dos grupos amino livres N-acetil-heparosano foi N-desacetilado a 80 % (NH₂) indica que

Passo b - N-sulfatação

Dissolve-se 2,44 g do produto obtido no passo anterior e

em 57 mL de água ultrapurifiçada e adiciona-se 1,9 g de Na CO 2 3

1,9 g de complexo trióxido de enxofre-trimetilamina e leva-se até 55 °C durante 20 horas. Ajusta-se em seguida a condutividade da solução reaccional à de uma solução de cloreto de sódio 0,5 M por adição de ãgua desmineralizada e precipita-se por 4 volumes de etanol. Centrifuga-se, recolhe-se o resíduo com uma solução de NaCl 0,5 M, precipita-se por 4 volumes de etanol e centrifuga-se.

Dissolve-se o resíduo de centrifugação em ãgua ultrapurificada e dialisa-se com água ultrapurifiçada de acordo com o processo descrito no Exemplo 1 e depois liofiliza-se.

Obtém-se assim 1,809 g de heparosano-N,O-sulfatado.

Passo c - Formação do sal de tetrabutilamónio

Dissolve-se 800 mg do produto preparado no . passo anterior em 100 mL de água. Coloca-se esta solução numa coluna permutadora iónica Dowex 50 W 8 e procede-se de acordo com o processo já descrito no Exemplo 4 [1) Modificações químicas do lote B, Passo b].

Após liofilização obtém-se cerca de 1,3 g de sal.

Passo d - O-sulfatação

Dissolve-se o sal obtido acima em 80 mL de formamida, adiciona-se 5,6 g de complexo trióxido de enxofre-piridina. Deixa-se reagir durante 6 horas a 30 °C e depois adiciona-se 16 mL de NaCl 2 M. Leva-se a pH =7 e precipita-se por 2 volumes de etanol. Recolhe-se o precipitado com uma solução de NaCl 0,5 M, reprecipita-se com 2 volumes de etanol, dialisa-se contra ãgua ultrapurifiçada e concentra-se no Rotavapor.

Passo e - Filtração gel

A solução concentrada obtida no passo anterior é fraccionada por filtração utilizando uma coluna Sephacryl S 300

HR e utilizando como eluente uma solução de NaCl 0,5 M.

Isolam-se as fracções que correspondem a massas moleculares relativas compreendidas entre 10 000 e 500 000.

Adiciona-se 2 volumes de etanol e depois concentra-se. Ajusta-se em seguida a condutividade à de uma solução de NaCl 0,5 M adicionando água.

Repete-se o fraccionamento por filtração gel e recolhem-se as fracções que contêm um heparosano-N,O-sulfatado constituído por cadeias que têm massas moleculares relativas médias compreendidas entre 100 000 e 200 000, assim como fracções que contêm um heparosano-N,O-sulfatado constituído por cadeias que têm massas moleculares relativas médias compreendidas entre cerca de 50 000 e cerca de 12 000.

A cada uma das três fracções, adiciona-se 5 volumes de etanol, sendo submetidas a uma diálise contra água ultrapurificada e submetem-se as soluções obtidas após diálise a uma liofilização.

Obtêm-se assim três lotes de heparosanos-N,O-sulfatados:

o lote G1 é um heparosano-N,O-sulfatado constituído por cadeias que têm uma massa molecular relativa média compreendida entre 100 000 e 200 000. Isola-se 0,140 g deste resíduo.

lote G2 é um heparosano-N,O-sulfatado .constituído por cadeias que têm uma massa molecular relativa média cerca de 50 000. Isola-se 0,350 g deste heparosano-N,O-sulfatado.

- O lote G3 é um heparosano-N,O-sulfatado constituído por ) cadeias que têm uma massa molecular relativa média cerca de 12 000. Isola-se cerca de 0,100 g deste último lote.

As características dos três -sulfatado descritos neste exemplo são lotes de heparosano-N,0reunidas no Quadro XVIII.

QUADRO XVIII

Características dos heparosanos-N,O-sulfatados correspondentes aos lotes Gl_z G2 e G3

	Taxa de ácido urónico (gmol/mg)	Taxa de nh2 (gmol/mg)	Taxa de desacetilação	Taxa de sulfatação (razão sulfato/ /carboxilo
Lote G1	1,48	<0,01	80 %	2,6
Lote G2	1,45	<0,01	80 %	2,6
Lote G2	1,45	<0,01	80 %	2,6

t L

Claims (3)

1. I^a. - Processo de preparação de .uma composição que compreende desde 70 % até 100 % de um hepatosano-N,o-sulfatado constituído por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula I:

   REIVINDICAÇÕES na qual

   - E representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um grupo sulfato e, facultativamente, um átomo de hidrogénio,

   G representa um átomo de hidrogénio e um grupo sulfato, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados.

   caracterizado por compreender a seguinte sequência de passos:

   - passo a: cultura de uma estirpe de Escherichia coli (K5),

   - passo b: isolamento e purificação - precedido ou não de uma purificação preliminar - do N-acetil-heparosano formado para se obter uma composição que contém desde 70 até 100 % de um

   N-acetil-heparosano constituído por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II:

   ch₂oh

   COOH (II)

   - passo c: desacetilação parcial desta composição de N-acetil-heparosano para se obter uma composição que contém desde 70 % até 100 % de um heparosano constituído por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e

   15 000, caracterizadas por de fórmula III:

   uma estrutura dissacarídica repetida ch₂oh

   COOH

   NHR

   OH (ΙΠ) na qual R' representa, em 0 até 80 % das unidades dissacarídicas, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes um átomo de hidrogénio,

   - passo d: quer N,O-sulfatação parcial desta composição de heparosano, quer N,O-sulfatação parcial desta composição de hepa88 rosano seguida de um passo de N-sulfatação total, quer uma N-sulfatação total ou parcial seguida de um passo de O-sulfatação total ou parcial, e facultativamente um ou vários passos de fraccionamento das massas moleculares efectuados no fim dos passos a, b, c ou d.
2. 2a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estirpe de Escherichia coli (K5) ser a estirpe SEBR 3282 (registada no CNCM do Institut Pasteur, Paris, França, sob ο N2 1-1013) ou um mutante desta estirpe, seja espontâneo seja induzido.

   33. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cultura da estirpe de Escherichia coli (K5) ser continuada pelo menos duas horas depois da paragem do crescimento da biomassa.

   43. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o isolamento e a purificação do N-acetil-heparosano compreenderem pelo menos úm passo de precipitação alcoólica e pelo menos um passo de cromatografia de permuta iónica.

   53. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o isolamento e a purificação do N-acetil-heparosano serem realizados com a ajuda de um processo que compreende a seguinte sequência de passos:

   - passo a : precipitação por etanol,

   - passo b₁: diãlise,

   - passo c^: precipitação por etanol, seguida por desidratação e secagem,

   - passo d^: purificação por cromatografia de permuta aniónica,

   - passo β_χ: precipitação por etanol do eluato obtido pelo passo ά_χ/ desidratação, secagem e trituração, no qual um dos passos β_χ até σ_χ pode ser suprimido.

   6â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o isolamento e a purificação do N-acetil-heparosano serem realizados com a ajuda de um processo que compreende a seguinte sequência de passos:

   - passo a'_x:

   - passo b'_x:

   - passo ο'_χ:

   - passo ά'_χ:

   - passo β^ζχ:

   - passo f'_x:

   diãlise, purificação em meio ácido, eliminação das impurezas insolúveis em soluções aquosas de pH 3,5 e pH 1,8, precipitação por etanol, seguida por desidratação e secagem, hidrólise alcalina e diãlise, purificação por cromatografia de permuta aniónica, purificação por cromatografia de exclusão.

   7§.

   terizado por

   - Processo de acordo com a reivindicação 1, caraco N-acetil-heparosano obtido da cultura de uma estirpe de Escherichia coli (K5) ser submetido antes do isolamento e da purificação a uma purificação preliminar realizada com a ajuda de passos:

   um processo que compreende a seguinte sequência de

   - passo a_x: centrifugação da suspensão obtida no fim da cultura

   - passo b”^: colocação em contacto do sobrenadante com uma solução alcalina,

   - passo σ_χ: pré-filtração,

   - passo ά”_χ: concentração sobre membrana de limiar de corte determinado,

   - passo β_χ: diãlise, no qual o passo e’^ pode ser suprimido.

   8ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de Ν,Ο-sulfatação parcial ser seguido por uma N-sulfatação total realizado por um complexo de anidrido sulfúrico com uma base orgânica, num solvente aquoso de pH básico.

   9a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de N-sulfatação total ser seguido por um fraccionamento das massa moleculares.

   10â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem heparosanos-N,O-sulfatados constituídos por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula I:

   na qual

   E representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um grupo sulfato e, facultativamente, um átomo de hidrogénio,

   G representa um átomo de hidrogénio e um grupo sulfato, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados.

   lis. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por E representar um grupo acetilo e um grupo sulfato.

   123. - Processo para a preparação de heparosanos-N,O-sulfatados de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado por o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, estar compreendido entre 1,5 e 3,0.

   133. - Processo para -a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por cadeias ou por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula I:

   na qual

   E representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas dos referidos heparosanos-N,O-sulfatados, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um grupo sulfato e, facultativamente, um átomo de hidrogénio,

   A

   G representa um átomo de hidrogénio e um grupo sulfato, estando o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, compreendido entre 1,5 e 3,0, sendo as duas extremidades, redutora e não redutora das cadeias dos referidos heparosanos-N,o-sulfatados de unidades urónicas sulfatadas ou não, de glicosamina sulfatada ou não, ou de N-acetilglicosamina sulfatada ou não, e dos sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos heparosa nos-N,O-sulfatados.

   14â. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 13, caracterizado por o grupo acetilo estar presente a uma taxa inferior ou igual a 60 %.

   15 ^â. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 14, caracterizado por os referidos heparosanos-N,o-sulfatados comportarem pelo menos 90 %, numa base ponderai, de cadeias de massa molecular relativa inferior a 11 000.

   16â. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados compreenderem menos 0,2 jumol/mg de grupo amino (NH₂).

   17a. - processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 14, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por cadeias de massa molecular relativa média desde cerca de 4000 até 7000 e que têm um grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, compreendido entre 1,7 e
3. 3.

   18a. - processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 5000 e 7000, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 20 %.

   19s. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 10 000 e 12 000, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 20 %.

   20â. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 6000 e 8000, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 2,0 e 2,8 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 60 %.

   21â.

   -sulfatados de

   - Processo para a preparação de heparosanos-N,0acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem ;constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 2300 e 7200, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 20 %.

   22a. - Processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 3300 e 7700, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 20 %.

   233. - processo para a preparação de heparosanos-N,0-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 70 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 6900 e 13 500, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 1,8 e 2,5 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 20 %.

   243. - Processo para a preparação de heparosanos-N,O-sulfatados de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por os referidos heparosanos-N,O-sulfatados serem constituídos por pelo menos 80 %, numa base ponderai, de cadeias de massas moleculares relativas compreendidas entre 4000 e 10 300, em que o grau de sulfatação, expresso como a razão sulfato/carboxilo, se encontra compreendido entre 2,0 e 2,8 e em que o grupo acetilo está presente a uma taxa inferior ou igual a 60 %.

   25^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, utilizável para a regulação da coagulação, caracterizado por se incluir na referida composição como ingrediente activo um heparosano-N,0-sulfatado, obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 até 24, em associação ou em mistura com um excipiente inerte farmaceuticamente aceitável.

   26^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, utilizável para a regulação da coagulação, caracterizado por se incluir na referida composição como ingrediente activo uma composição de heparosano-N,0-sulfatado, obtida de acordo com as reivindicações 1 a 9 em associação ou em mistura com um excipiente inerte farmaceuticamente aceitável.

   27^a. - Estirpe, caracterizada por ser uma estirpe de Escherichia coli (K5) SEBR 3282 registada no CNCM do Institut Pasteur, Paris, França, sob o Ns 1-1013.

   28^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caraeterizado por se obterem N-acetil-heparosanos, que são constituídos por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula II:

   -X 2

   -V sendo as duas extremidades, redutora-W.vftãô' redutora do referido N-acetil-heparosano de unidades urõnicas ou de N-acetilglicosamina.

   29â. - Processo para a preparação de um N-Acetil-heparosano de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por na maioria das cadeias a extremidade não redutora ser uma unidade urónica de fórmula (a):

   30â. - Processo para a preparação de um composição de N-acetil-heparosano, caracterizado por se incluirna referida composição pelo menos 70 %, numa base ponderai, de um N-acetil-heparosano, obtido de acordo com a reivindicação 28.

   31â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obterem heparosanos que são constituídos por uma mistura de cadeias de massa molecular relativa entre 1500 e 15 000, caracterizadas por uma estrutura dissacarídica repetida de fórmula III:

   na qual R' representa, em 0 a 80 % das unidades dissacarídicas, um grupo acetilo e, nas unidades dissacarídicas restantes, um átomo de hidrogénio.

   32a. - Processo para a preparação de heparosanos de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o grupo acetilo estar presente a uma taxa inferior ou igual a 60 %.

   33^a. - Processo para a preparação de uma composição de heparosano caracterizada por se incluir na referida composição pelo menos 70 %, numa base ponderai, de um heparosano de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 e 32.