RU2175552C1 - Способ получения антикоагулянта из сапропеля - Google Patents
Способ получения антикоагулянта из сапропеля Download PDFInfo
- Publication number
- RU2175552C1 RU2175552C1 RU2000106473A RU2000106473A RU2175552C1 RU 2175552 C1 RU2175552 C1 RU 2175552C1 RU 2000106473 A RU2000106473 A RU 2000106473A RU 2000106473 A RU2000106473 A RU 2000106473A RU 2175552 C1 RU2175552 C1 RU 2175552C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sapropel
- anticoagulant
- fraction
- concentrated
- extract
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и биохимии. Из сапропеля получают экстракт с помощью трехкратного объема 0,1 М раствора аммиака. Экстракт экспонируют при -15°С в течение 24 ч. После размораживания при комнатной температуре декантируют надосадок и концентрируют упариванием под вакуумом. Концентрированную фракцию центрифугируют и диализуют. Недиализующуюся фракцию обрабатывают сульфатом аммония при 100% степени насыщения и выпавший осадок удаляют. Очищенную фракцию обессоливают 96%-ным этиловым спиртом. Затем подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50. Порции элюента объединяют и высушивают. Изобретение позволяет повысить чистоту продукта. 1 табл.
Description
Способ относится к биохимии, точнее к способам выделения биологически активных веществ из природного сырья, и может быть использован научно-исследовательскими учреждениями биологического профиля.
Известны способы получения экстрактов с антикоагулянтной активностью из растительного сырья, характеризующиеся использованием дорогостоящих реагентов и ограниченностью сырьевой базы.
Так, известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью из растительного сырья (Чирятьев Е.А. и соавт. Авт. св. "Способ выделения антикоагулянта из травы медуницы мягчайшей" N 1622981, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 22 сентября 1990 г.). Сущность способа заключается в том, что высушенную траву медуницы мягчайшей экстрагируют 0,01 н раствором аммиака, подвергая полученный экстракт диализу через целлофан Т-100 против дистиллированной воды, диализирующую жидкость подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ - Тойопале HW - 50 в ступенчатом градиенте хлорида натрия в аммонийно - ацетатном буфере с pH 7,6-7,8, а фракции содержащие, антикоагулянт, объединяют, обессоливают на геле Тойопала HW-50, объединяют фракции, содержащие антикоагулянт, и удаляют воду выпариванием, получая целевой продукт в виде концентрированного водного экстракта.
Приведенный выше способ мы рассматриваем в качестве аналога заявляемого способа. Его недостатки - ограниченность сырьевой базы, гетерогенность получаемого целевого продукта и связанная с этим сложность стандартизации целевого продукта.
Известен способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью, из сапропеля (Чирятьев Е.А. и соавт. Патент на изобретение "Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью" N 2101023 зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 10 января 1998 г), который мы рассматриваем в качестве прототипа предлагаемого изобретения.
Сущность способа прототипа заключается в том, что нативный сапропель настаивают с 3-кратным объемом 0,05 М раствора аммиака в течение 2-3 ч при постоянном перемешивании, настой отстаивают в течение суток при комнатной температуре и собирают надосадок, порции надосадка объединяют и упаривают на водяной бане или с помощью ротационного испарителя в 80-100 раз, концентрат центрифугируют (15 мин, 3000- 4000 g), надосадок выдерживают при температуре -15oC в течение 24 ч после размораживания при комнатной температуре центрифугируют (15 мин, 3000-4000 g), супернатант диализуют против дистиллированной воды через целлофан Т-100 в соотношении 1:200 в течение 12 ч, недиализующуюся часть надосадка выпаривают досуха на ротационном испарителе. Полученный сухой порошок является целевым продуктом.
Недостатком способа является гетерогенность и токсичность целевого продукта, обусловленная содержанием помимо антикоагулянта значительного количества гуминовых веществ, обладающих собственным биологическим действием, в том числе антиоксидантным (Комиссаров И.Д., Климова А.А. Влияние гуминовых кислот на биокаталитические процессы // В кн.: Гуминовые препараты: Тюменский сельскохозяйственный институт. Научные труды, том XIV. - Тюмень, 1971. - С. 225-242), генотоксическим (Ribas G., Carbonell Е., Creus A., Xamena N., Marcos R. Genotoxicity of humic acid in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide. // Environmental And Molecular Mutagenesis. -1997 - Vol.29, N.3.- P.272-276) и способностью активировать гемостаз (Yang H.L., Hseu Y.C., Lu F.J., Tsai H. D. Humic acid reduces protein-C-activating cofactor activity of thrombomodulin of human umbilical vein endothelial cells.// British Journal Of Haematology. -1998 -Vol. 101, N 1. - P. 16-23).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель изобретения - получение гомогенного целевого продукта без примеси гуминовых веществ.
Цель изобретения - получение гомогенного целевого продукта без примеси гуминовых веществ.
Технический результат изобретения заключается в следующем:
1. Для освобождения целевого продукта от гуминовых веществ используется высаливание с помощью сульфата аммония при степени насыщения экстракта до 100%;
2. В том, что при гель-фильтрации целевого продукта обнаруживаются два гомогенных носителя антикоагулянтной активности, отличающиеся как по своим физико-химическим характеристикам, так и по механизму действия.
1. Для освобождения целевого продукта от гуминовых веществ используется высаливание с помощью сульфата аммония при степени насыщения экстракта до 100%;
2. В том, что при гель-фильтрации целевого продукта обнаруживаются два гомогенных носителя антикоагулянтной активности, отличающиеся как по своим физико-химическим характеристикам, так и по механизму действия.
Существенные признаки изобретения заключаются в следующем:
1. Нативный сапропель экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака;
2. Аммиачный экстракт подвергают вымораживанию при -15oC в течение 24 часов. После размораживания и отстаивания в течение 6 часов надосадок декантируют и концентрируют на ротационном испарителе под вакуумом;
3. Концентрированную фракцию центрифугируют и диализуют через целлофан Т-100 против дистиллированной воды;
4. Полученную концентрированную фракцию сапропеля обрабатывают сульфатом аммония, выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием;
5. Фракцию, освобожденную от гуминовых веществ, обессоливают этанолом, а затем подвергают гель-фильтрациии на колонке Sephadex G-50, собирают элюент, находят порции элюента, содержащие антикоагулянт;
6. Фракции, содержащие антикоагулянт, объединяют и высушивают выпариванием на кипящей водяной бане до получения сухого порошка. Полученный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. За единицу активности (ЕА) принимали количество порошка, которое после растворения в 0,14 М растворе натрия хлорида в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля, содержится 6500-8000 ЕА.
1. Нативный сапропель экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака;
2. Аммиачный экстракт подвергают вымораживанию при -15oC в течение 24 часов. После размораживания и отстаивания в течение 6 часов надосадок декантируют и концентрируют на ротационном испарителе под вакуумом;
3. Концентрированную фракцию центрифугируют и диализуют через целлофан Т-100 против дистиллированной воды;
4. Полученную концентрированную фракцию сапропеля обрабатывают сульфатом аммония, выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием;
5. Фракцию, освобожденную от гуминовых веществ, обессоливают этанолом, а затем подвергают гель-фильтрациии на колонке Sephadex G-50, собирают элюент, находят порции элюента, содержащие антикоагулянт;
6. Фракции, содержащие антикоагулянт, объединяют и высушивают выпариванием на кипящей водяной бане до получения сухого порошка. Полученный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. За единицу активности (ЕА) принимали количество порошка, которое после растворения в 0,14 М растворе натрия хлорида в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля, содержится 6500-8000 ЕА.
Положительный эффект заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом заключается в получении гомогенного целевого продукта и отсутствии в нем посторонних примесей.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. 1 кг сапропеля (800 мл) экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака и экстрагируют при постоянном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт отстаивают в течение 24 ч и декантируют надосадок.
1. 1 кг сапропеля (800 мл) экстрагируют 3-кратным объемом 0,1 н раствора аммиака и экстрагируют при постоянном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт отстаивают в течение 24 ч и декантируют надосадок.
2. Супернатант подвергают вымораживанию при -15oC в течение 24 ч. После размораживания и отстаивания в течение 6 часов надосадок декантируют и концентрируют на ротационном испарителе под вакуумом в 40 раз при температуре 45-50oC.
3. Концентрированную фракцию центрифугируют (7000 g, 30 мин) и диализуют через целлофан Т-100 против дистиллированной воды в соотношении 1:150, дважды меняя воду через 12 и 24 ч.
4. Полученную концентрированную фракцию сапропеля титруют 0,1 н раствором аммиака до pH 7,3-7,5 и вносят сульфат аммония, создавая 50% степень насыщения.
5. Выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием (4000g, 30 мин), а надосадок концентрируют на водяной бане до появления кристаллов сульфата аммония, создавая 100% степень насыщения раствора. Вновь выпавший осадок гуминовых веществ удаляют центрифугированием (4000g, 30 мин).
6. Фракцию, освобожденную от гуминовых веществ, смешивают с 96% этанолом в соотношении 1:1 и экспонируют при -4oC в течение 30 минут. Выпавший осадок сульфата аммония удаляют фильтрацией под вакуумом, надосадок концентрируют на водяной бане до появления кристаллов соли и повторяют вышеописанную операцию. Полученную водно-спиртовую смесь выпаривают на водяной бане досуха и остаток растворяют в 96% этаноле и выдерживают на холоду (-4oC, 30 минт), выпавшую в осадок соль удаляют фильтрацией, этанол отгоняют, а сухой остаток растворяют в дистиллированной воде.
7. Раствор, содержащий антикоагулянт, подвергают гель-фильтрациии на колонке Sephadex G-50 (10х300 мм, проток - 1 мл/мин), собирают элюент, в качестве которого используется дистиллированная вода, порциями по 2 мл. Находят порции элюата, содержащие антикоагулянт, объединяют и высушивают выпариванием на кипящей водяной бане до получения сухого порошка.
8. Полученный порошок является целевым продуктом, растворимым в 0,14 М растворе натрия хлорида и обладающим антикоагулянтной активностью. За единицу активности (ЕА) принимали количество порошка, которое после растворения в 0,14 М растворе натрия хлорида в 2 раза удлиняет время свертывания равного объема рекальцифицированной плазмы человека. В продукте, полученном из 1 кг нативного сапропеля, содержится 6500-8000 ЕА.
Приведенная ниже таблица характеризует заявляемый способ в сравнении со способом-прототипом.
Таким образом, целевой продукт, полученный с помощью заявляемого способа, получен в гомогенном виде без примеси посторонних биологически активных веществ. Выход целевого продукта в заявляемом способе составляет в среднем 80% от способа прототипа.
Получаемый гомогенный целевой продукт содержит индивидуальный антикоагулянт пептидной природы, внутривенное введение которого в терапевтической дозе сопровождается снижением свертывающей активности крови на 16-18 ч, что позволяет использовать целевой продукт как материал для проведения доклинических испытаний, а сам заявляемый способ может служить основой для создания регламента лабораторного производства антикоагулянта прямого действия.
Claims (1)
- Способ получения антикоагулянта из сапропеля путем экстракции сапропеля раствором аммиака, выдерживания экстракта в течение суток при -15oC, очистки надосадочной жидкости диализом и высушивания продукта, отличающийся тем, что после очистки диализом проводят высаливание примесей сульфатом аммония, создавая 100% степень насыщения раствора, выпавший осадок отделяют, из оставшейся фракции удаляют сульфат аммония замещением растворителя 96%-ным этиловым спиртом, выпавший осадок удаляют, этиловый спирт отгоняют, сухой остаток растворяют в очищенной воде и подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000106473A RU2175552C1 (ru) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | Способ получения антикоагулянта из сапропеля |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2000106473A RU2175552C1 (ru) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | Способ получения антикоагулянта из сапропеля |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2175552C1 true RU2175552C1 (ru) | 2001-11-10 |
Family
ID=20231920
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000106473A RU2175552C1 (ru) | 2000-03-16 | 2000-03-16 | Способ получения антикоагулянта из сапропеля |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2175552C1 (ru) |
-
2000
- 2000-03-16 RU RU2000106473A patent/RU2175552C1/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR910009342B1 (ko) | 생물학적 활성 추출물의 제조방법 | |
JPS62209101A (ja) | エキナセアプルプレアまたはエキナセアアングステイフオリアの細胞培養物からの免疫刺激作用性ポリサツカライド、その製造方法及びこれを含む製剤 | |
CN108610274B (zh) | 一组环γ-聚谷氨酸系列分子及其制备方法和应用 | |
CN109527270A (zh) | 水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法 | |
ES2207248T3 (es) | Componentes de bajo peso molecular del cartilago de tiburon, procesos de obtencion y usos terapeuticos de los mismos. | |
EP0030812B1 (en) | A process for preparing substances having interferon inducing activity and interferon inducers | |
US4457917A (en) | Peptide, process for its preparation and pharmaceutical composition containing same | |
CN101020715A (zh) | 鹿茸神经生长因子(deer ngf)提取及其制备方法 | |
CA2035948A1 (en) | Polysaccharides with immunomodulating properties from astragalus membranaceus and pharmaceutical compositions containing them | |
RU2175552C1 (ru) | Способ получения антикоагулянта из сапропеля | |
US3394120A (en) | Process of extracting protein from mistletoe and resultant product | |
CN101948439B (zh) | 鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法及在医药上的应用 | |
CN109400669B (zh) | 核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用 | |
CN112457377A (zh) | 美洲大蠊多肽及其应用 | |
JP4480204B2 (ja) | カワリハラタケの抗腫瘍性画分 | |
JPS60178820A (ja) | 抗腫瘍活性物質の製造方法 | |
KR20000016714A (ko) | 식물성 추출물, 그의 제조 방법 및 사람 및 수의용 의약에서의그의 응용 | |
RU2412995C1 (ru) | Способ получения ингибитора коллагеназы с противоопухолевым действием из гепатопанкреаса камчатского краба | |
JPS6216428A (ja) | ヒメヒオウギズイセンから得られる生物活性物質及びその製法 | |
RU2038087C1 (ru) | Способ получения вещества из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека | |
JPH03505200A (ja) | 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用物質を含む製剤の製造方法 | |
RU2311455C2 (ru) | Способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота | |
RU2101023C1 (ru) | Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью | |
JPS6372629A (ja) | 霊芝から生理活性エキスを製造する方法 | |
RU2105563C1 (ru) | Способ получения лечебно-профилактического средства из топинамбура, обладающего антистрессорной, адаптогенной, иммуностимулирующей, антитоксической, мембранстабилизирующей, антиоксидантной видами биологической активности |