JPS6372629A

JPS6372629A - 霊芝から生理活性エキスを製造する方法

Info

Publication number: JPS6372629A
Application number: JP61219979A
Authority: JP
Inventors: Michitoku Kubo; 道徳久保; Mari Nogami; 野上　真里; Yoshio Matsuo; 松生　好雄; Masaoki Takahashi; 正興高橋
Original assignee: KYORITSU YAKUHIN KOGYO KK
Current assignee: KYORITSU YAKUHIN KOGYO KK
Priority date: 1986-09-17
Filing date: 1986-09-17
Publication date: 1988-04-02
Also published as: JPH0351689B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、１芝から糖蛋白結合体含有の生理活性エキス
を製造する方法、殊に、抗アレルギー性作用を有する成
分を効率的に取得する方法に関するものである。

従来の技術霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ）は、漢方
医学において、古くから虚労、咳漱、失眼などに応用さ
れて来た漢薬の一種である。近年霊芝に関する多くの研
究から、臨床的には、慢性気管支炎、狭心症、高脂血症
、高血圧症、神経衰弱による不眠症、急性ウィルス性肝
炎、網膜色素変性、自律神経失調症、白血球減少の治療
に一定の効果のあることが知られている。

また霊芝は、抗アレルギー作用、マクロファージ活性化
作用、抗腫瘍作用、血圧降下作用、血糖降下作用、抗高
脂血症作用、抗血栓症作用などの薬理活性を有すること
が文献上報告されている。

しかしながら、霊芝の有効成分については、多糖体にマ
ウスのＳａｒｃｏｍａ　１８０固型ガンに対する延命効
果があること［水野ら、日本農芸化学会誌、Ｕ、８７１
　（１９８４）］　、　　）リリテインに属するガルデ
ノリック酸類にラットの肥満細胞からのヒスタミン放出
抑制作用があること［Ｋｏｈｄａら、Ｃｈｅｗ。

Ｐｈａｒｉ＋、　Ｂｕｌｌ、、　３３．１３８７　（１
９８５）　］が知られているにすぎない。

一方、臨床的、薬理的に多様な作用を示すといわれる霊
芝も、市場には多くの種類があり、実際にはその形態、
産地によって臨床的、薬理的に異なる効果を示すといわ
れており、臨床応用に当っては、野生品、栽培量を問わ
ず産地、形態を吟味する必要性が喚起されている（近畿
大学薬学部久保研究室編、“霊芝”、三−書房、東京、
１９８５年）。

本発明者らは、すでに霊芝の品質を明確にするため実験
的抗アレルギー作用を指標にした各地産霊芝の薬効検定
を実施した結果、奈良県山域で発見し、栽培化に成功し
た霊芝の水抽出エキスに、各種実験的アレルギーに対し
て強い抑制作用のあることを見出しており、本発明者ら
はこれを「鉄量１号霊芝」と名付けている。

従って、各地産霊芝の中から有効成分を効率的に取り出
すことができれば、気管炎喘息、アレルギー性鼻炎、ア
トピー性皮膚炎、ジンマ疹、薬剤アレルギーなどの各種
アレルギー疾患の治療剤と−しての利用が期待される。

殊に、原料となる霊芝として、本発明者らが見つけた上
述の「鉄量１号霊芝」を用いれば、実用化が可能になる
ことが期待できる。

霊芝から有効成分を抽出分離する方法として、従来よく
知られている熱水による抽出法のほかに、次のような方
法が提案されている。

すなわち、特開昭６０−３４９１４号公報には、霊芝の
熱水抽出物をさらにアセトンなどの含酸素系溶媒で抽出
する方法が記載されている。

また特開昭６０−２２２４２３号公゛報には、霊芝の砕
片を熱水で抽出した後濃縮し、同じく霊芝の砕片をエタ
ノール水溶液を用いて抽出した後濃縮し、両濃縮液を混
合して粉末化する方法が記載されている。

発明が解決しようとする問題点しかしながら、霊芝の水抽出エキスには、抗アレルギー
作用を示す物質以外に多くの不要夾雑物が存在すること
から、各地産の霊芝を原料として用いて水抽出を行って
も満足できる結果は得られず、たとえ本発明者らが見つ
けた上述の「鉄量１号霊芝」を原料霊芝として用いても
、なおアレルギー疾患治療剤として使用可能な実用レベ
ルにまでは至らない。

また、上述の特開昭６０−３４９１４号公報や特開昭６
０−２２２４２３号公報に記載の抽出法によっても、抗
アレルギー作用を示す物質の濃縮分離という点では不満
足な結果しか得られない。

このように霊芝抽出物のアレルギー疾患治療剤としての
利用を考えた場合、より高純度に有効物質を含有するエ
キスの製出が強く望まれる。

本発明は、霊芝中の抗アレルギー作用を発現する有効物
質の追究とそれを高純度に含有するエキスの効率的製法
につき鋭意研究を進めた結果、到達したものである。

問題点を解決するための手段本発明は、「霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕ
ｍ）から糖蛋白含有の生理活性エキスを製造するにあた
り、霊芝の子実体を水で抽出する工程（Ａ）、前工程（Ａ）
の抽出液を透析または限外濾過する工程（Ｂ）、および
、前工程（Ｂ）の内液をクロマトグラフィーにより分離す
るか、あるいは、前工程（Ｂ）の内液と親水性有機溶剤
とを混合し、析出した沈澱を分離する工程（Ｃ）を実施することを特徴とする霊芝から生理活性二キスを
製造する方法、」をその要旨とするものである。

本発明によれば、霊芝中の抗アレルギー作用を発現する
有効物質である糖蛋白結合体を高純度に含有するエキス
を簡便かつ収率よく得ることができる。

以下本発明の詳細な説明する。

鳳μ 本発明において原料となる霊芝は、産地の相違により所
望する薬効も異なり、また栽培霊芝であっても栽培条件
によって有効物質の含有量が変動し、結果的に得られる
エキスの品質および収率が一定しないなどの問題を生じ
ることから、有効物質の糖蛋白結合一体を多量に含む高
品質の霊芝を選択する必要がある。

徒って原料霊芝としては、各地産の種々の霊芝が用いら
れるけれども、先に述べたように、本発明者らが奈良県
山域で採集した野生霊芝の菌種を用いて、原木栽培法に
より栽培化し、量産化に成功した品質安定型の霊芝（八
女１号と命名）を原料として用いることが特に望ましい
。

工１し工りつ一工程（Ａ）は、霊芝の子実体を水で抽出する工程からな
る。

抽出に供する霊芝の乾燥子実体は、そのままで、あるい
は直径２ｍｍ＋前後に刻んだ状態で、水抽出処理に付す
る。

抽出に用いる水と子実体の重量比は特に限定はないが、
後の処理を考慮すると５：１〜１０：１の範囲から選ぶ
ことが好ましい。

抽出温度は３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃が適
当である。抽出温度が高すぎると有効成分である糖蛋白
結合体組成中の蛋白質が変性を受けて難溶性となり、収
率が低下する。一方抽出温度が低すぎると抽出効率が悪
くなり、抽出操作に余分な時間がかかって生産性が悪く
なる。抽出には１〜３時間を要する。

二！し工」つ一工程（Ｂ）は、前工程（Ａ）で得た抽出液を透析または
限外濾過する工程からなる。

透析は通常行われる方法でよく、たとえばヴイスキング
■セルロースチューブ２０／　３２型（アメリカ、つ゛
イスキング社製）等の透析チューブを用いることができ
る。

限外濾過も通常行われる方法でよく、例えばグイフィル
ター（［株］Ｇ−ＯＳＴ　（アメリカ、バイオエンジニ
アリング社販売）等の限外濾過膜を用いることができる
。

工Ｊ＝工Ｓつ一工程（Ｃ）は、次の■または■のいずれかの工程からな
る。

■　前工程（Ｂ）の内液をクロマトグラフィーにより分
離する工程、（以下、工程（Ｃ１）という） ■　前工程ＣＢ）の内液と親水性有機溶剤とを混合し、
析出した沈澱を分離する工程、（以下。

工程（Ｃ２）という、） ■工程（ＣＩ）得られた内液から、有効成分である糖蛋白結合体を高純
度に含有する生理活性エキスを得るには、内液を凍結乾
燥した後、ゲル濾過剤を担体とするカラムクロマトグラ
フィーの方法を用いればよい。

ゲル濾過剤としては、たとえば、セファデックス（榎Ｇ
−１００−Ｇ−２００（スウェーデン、ファルマシア社
製）、セファロース■２Ｂ〜６Ｂ　　（同社製）、バイ
オゲル■Ｐ−３０〜Ｐ−３００（アメリカ、バイオラド
・ラボラトリーズ社製）等があげられる。

溶出のための溶媒としては、水が最も好ましい。

溶出液を常法通り凍結乾燥することにより該エキスを得
ることができる。

■工程（Ｃ２）得られた内液から、有効成分である糖蛋白結合体を高純
度に含有する生理活性エキスを得るためのもう一つの方
法としては、内液と親水性有機溶剤とを混合し、析出し
た沈澱を分離する方法があげられる。

親水性有機溶剤としては、アルコール、ケトン、エステ
ルまたはエーテル系溶剤から選ばれた少なくとも１種の
溶剤が適当であり、特にエタノール、メタノール、アセ
トンなどが使用される。

内液と親水性有機溶剤との混合割合は、後者の割合が両
者の合計量の４０〜８０　マハ％、好ましくは４５〜７
５　マハ％になるように選択する。このように混合割合
を選ぶことにより、効率的に目的成分が沈澱する。

生じた沈殿を適当な溶剤、たとえばアセトンで洗浄した
後、減圧乾燥することにより、目的とするエキスを得る
ことができる。

本工程（Ｃ２）による方法は、前述の工程（Ｃ１）によ
る方法に比し、エキス中の糖蛋白結合体含有量は低いが
、全体としての収率は高く、また大量に処理にできるの
で、工業的にはより優れている方法であるということが
できる。

支主上本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有生理活性
エキスの安全性を試験すべく、ｃｔｃｔｙ系マウス（体
重２４〜２５ｇ、１群７匹）に実施例１による〜生理活
性エキスを１週問わたり経口投与して毒性症状を観察し
た。その結果、ＬＤｒｏ値は１０００＋＊ｇ／に８以上
で、安全性が高いことが確認された。

且途本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有生理活性
エキスは、すぐれた抗アレルギー作用を有するので、抗
アレルギー剤として特に有用である。そのほか従来法の
ところで述べたような種々の薬理活性も併せ有するので
、他の薬剤としての用途も期待できる。

作　　　用本発明者らは、上記本発明の方法によって取得される生
理活性エキス中の抗アレルギー作用を発現する有効物質
が、分子量１５，０００〜２０，０００の糖と蛋白質の
結合体であることを見出している。

このものが糖と蛋白質の結合体であることは、糖蛋白結
合体を含むエキスをＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー処理して糖と蛋白質を分離させることによ
り、抗アレルギー作用が消失してしまうこと勾ら確認さ
れた。

本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有生理活性
エキスの生理活性については、実施例の後に詳述する。

実　　施　　例実施例１霊芝の乾燥子実体１ｋｇを粉砕機（ハンマークラッシャ
ーニホウライ鉄工）で粗砕し、水７文中、６０℃で時々
攪拌しながら２時間抽出した後、吸引濾過し、濾液を第
１抽出液とした。濾過残渣を６０℃の温水４文で時々攪
拌しながら１時間抽出した後、吸引濾過し、濾液を第２
抽出液とした。

第１、第２抽出液を合し、液量が約７文になるまで減圧
儂縮した。この濃縮液をヴイスキングセルロースチュー
ブ（２０／３２型）に入れ、流水下に２昼夜透析した後
、透析チューブ内の液を集め、これを遠心分離して上澄
液と沈澱を分けた。この上澄液を噴霧乾燥し、粗エキス
７０ｇを得た。

この粗エキス１ｇを水５１に溶かし、これをセファデッ
クスＧ１００を充填したカラム（φ３．６Ｘ　５０ｃｍ
）に添加し、水１００ｈｌで溶出し、ＺＩｌｌずつ分画
し、５０番から１００番までの区分を合せて凍結乾燥し
、以上の操作を数回くり返して褐色の生理活性エキス粉
末５０ｇを得た。

この生理活性エキス粉末の組成は下記のとおりであり、
有効物質の糖蛋白結合体を比較的高率に含有するもので
あった。

総蛋白質　　　　　　５８．２　％糖　　　分　　　　　　　　３５．３　　＄脂　　　肪
　　　　　　　　　Ｏｚ織繊維　０．１　％灰　　　分　　　　　　　　　　０．２　を水　　　分
　　　　　　　　　　４．２　χまた、本エキス中の糖
蛋白結合体を構成する蛋白質部分のアミノ酸組成は次の
とおりであった。

アスパラギン酸　　　２．５０　％スレオニン　　　　　１．４０２セリン　　　　　　１．３５篤グルタミン酸　　　　２．２０　！プロリン　　　　　　０．８５　％グリシン　　　　　　１．４２駕アラニン　　　　　　１．１０　％シスチン　　　　　　Ｏｚバリン　　　　　　０．８７　％メチオニン　　　　　Ｏｚインロイシン　　　　０．８０　％ロイシン　　　　　　０．８０　％チロシン　　　　　　０．３５　％フェニルアラニン　　０．＄３　％リジン　　　　　　　０．８０　％ヒスチジン　　　　　０．５０χ アルギニン　　　　　０．９０　％トリプトファン　　　０．５０　％実施例２霊芝の乾燥子実体５００ｇを水５文中に、６０℃で時々
攪拌しながら３時間放置した後、加圧濾過し、１液を第
１抽出液とした。この濾過残渣を６０℃の温水５文で時
々攪拌しながら１時間数２した後、加圧濾過し、濾液を
第２抽出液とした。

第１、第２抽出液を合し、液量が３文になるまで減圧濃
縮した。この濃縮液をヴイスキングセルロースチューブ
（２０／３２型）に入れ、流水下に２昼夜透析した後、
透析チューブ内の液を集め、これを遠心分離して上澄液
と沈殿を分けた。

この上澄液を９９％エタノール５文中に常法で激しく攪
拌しながら１０分間かけて除々に加え、そのまま３０分
間攪拌を続けた後、生じた沈殿を減圧濾過により濾取し
、この沈澱を９９％アルコールで洗浄し、８０℃以下で
減圧乾燥して褐色の生理活性エキス粉末１．５ｇを得た
。

総蛋白質　　　　　５６．５駕糖　　　分　　　　　　　　３６．３　　％脂　　　肪
　　　　　　　　　Ｏｚ織繊維Ｏｚ灰　　　分　　　　　　　　Ｏ０目水　　　分　　　　　　　　　３．９　ｚまた、木工キ
ス中の糖蛋白結合体を構成する蛋白質部分のアミノ醜組
成は次のとおりであった。

アスパラギン酸　　２．２０駕スレオニン　　　　　１．３０　％セリン　　　　　　１．３１χ グルタミン酸　　　　２．１５　％プロリン　　　　　　０．８５　％グリシン　　　　　１．３１　％。

アラニン　　　　　　１．０３　％シスチン　　　　　Ｏｚバリン　　　　　　０．８４　％メチオニン　　　　　Ｏｔインロイシン　　　０．５５　％ロイシン　　　　　０．７７　％チロシン　　　　　０．３４％フェニルアラニン　０．５８駕リジン　　　　　　０．７５　％ヒスチジン　　　　０．４０　％アルギニン　　　　　０．７３　％トリプトファン　　０．３３　％試　　験　　例実施例１で得られた糖蛋白結合体含有生理活性エキスに
つき、その生理活性（抗アレルギー作用など）と安全性
の確認の試験を行った。（なお実施例２のエキスもほぼ
同様の結果が得られる。）（１）ラット腹腔肥満細胞か
らのヒスタミン遊離抑制作用Ｕｖｎａｓらの方法［Ｅ！Ｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、
、　１８．５１２（１９５９）］に準じて分離調製した
ラット腹腔肥満細胞を、フォスフェートバッファー生Ｊ
ｌ液ＣＰＢＳ）に２．９Ｘ　１０　　Ｃｅ１ｌｓ／ｍｌ
となるように遊離させ、被検物質およびヒスタミン遊離
物質［Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０あるいは卵白アルブ
ミン液（ＥＷＡ）］　とともに３７℃、１０分間インキ
ュベートした後、ＰＨ３中および細胞中のヒスタミン含
量を５ｈａｒｅらの方法［Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、
　Ｅｘｐ、　Ｔｂｅｒ、、　１２７．１８２（１ｆ３５
９）］に準じて蛍光法で測定した。

ヒスタミン遊離率は細胞の総ヒスタミン量に対するＰＢ
Ｓ中のヒスタミン含量の百分率として算出し、次式によ
り被検体中のヒスタミン遊離抑制率を求めた。

Ａ：被検体存在下のヒスタミン遊離率Ｂ：被検体非存在下のヒスタミン遊離率Ｃ：自発遊離率なお対照薬として、グイソデュウム　クロモブライケー
ト（Ｄ　Ｓ　ＣＧ）を用いた。

結果を第１表に示す。

第　　１　　表第１表から明らかなように、本発明の方法により得られ
る生理活性エキスは、ラット腹腔肥満細胞からのヒスタ
ミン遊離抑制作用を有する。

（２）モルモット受身皮膚アナフラキシー反応に対する
効果）Ｉａｒｔｌｅｙ系雄性モル％　（１７ト（体重２５０
〜３００　ｇ）の背部皮内に、注出らの方法［アレルギ
ー、互。

８４０　（１９７３）１で調整した抗ＥＷＡ家兎血清を
注射し、感作した。４時間後ＥＷＡ２ｍｇを含む１％工
ヴアンスブルー溶液を静脈内投与し、３０分後に背部皮
膚の青染部の漏出色素量を、Ｋａｔａｙａｍａらの方法
［旧ｃｒｏｂｉｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２２．８
９　（１９７８）コに準じて測定した。

なお、被検体はＥＷＡ静注の１時間前に経口投与した。

結果を第２表に示す。

第２表洋本　５％の危険率でコントロール群に比べて有位差あ
り。

（３）ラット受身皮膚アナフラキシー反応Ｗｉｓｔａｒ
系雄性ラット（体重１５０〜１８０　ｇ）の背部皮内に
５ｔｏｔｌａｎｄらの方法［Ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｐｂｙ
ｓｉｏｌ。

Ｐｈａｒ＋５ａｃｏ１．、５２．１１１４　（１９７４
）１に準じて調整し、４０倍に希釈した抗ＥＷＡラット
血清を注射し、４８時間後ＥＷＡ１０ｍｇを含む１％工
ヴアンスブルー液を注射した。３０分後に背部皮膚青染
部の漏出色素量を測定した。被検体はＥＷＡ静注の１時
間前に経口投与した。

結果を第３表に示す。

第　　３　　表洋本　５％の危険率でコントロール群に比べて有位差あ
り。

木本　１％の危険率でコントロール群に比べて有位差あ
り。

（４）モルモット実験的喘息に対する効果注出らの方法
［Ｊａｐ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、　３０．５
５９（１！３８０）］に準じて行った。

Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット（体重２５０〜３００
　ｇ）に抗ペンデルベニシロイルポビン　γ−グロブリ
ン（ＢＰＯ−ＢＧＧ）・ＩｇＥ血清の０．２５ｍ１１モ
ルモットを心臓内に投与して受動的に感作させ、４８　
時間後、５００　ｇ　ｇ／ｋｇ　　のペンデルベニシロ
イルボビンシーラムアルブミン（ＢＰＯ−ＢＳＡ）を静
脈内投与し、呼気性の喘息発作を誘起した。

呼吸波の測定は、気管カニユーレより、トランジューサ
を介してひずみ圧力ポンプに入力して行った。被検体は
ＢＰＯ−ＢＳＡ投与２０分前に経口投与した。

結果を第４表に示す。

（５）免疫溶血反応に対する抑制効果森うノ方法［薬学雑誌、　　９５．１４７７　（１９７
５）］　ニ準じて、新鮮ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の免
疫溶血反応を検定した。

ゼラチンベロナールバッファーで調整した１０％５ＲＢ
Ｃ浮遊液に、被検体、抗５ＲＢＣ家兎血清、補体（モル
モット新鮮血清）を順に加え。

３７℃、９０分間インキュベートした。氷冷後、上清の
５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、　０．１％炭酸ソ
ーダ液を加えた場合の吸光度を完全溶血とし、これに対
する吸光度比を溶血率として求めた。

結果を第５表に示す。

第　　５　　表注＊　５％の危険率でコントロール群に比べて有位差あ
り。

木本　１％ノ危険率でコントロール群に比へて有位差あ
り。

（６）糸球体腎炎に対する効果入校らの方法［目薬理詰、　　？８．４９１　（１９８
１）］に準じて行った。

ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）で予備免疫したＤｏｎ
ｒ７ｕ系雄性ラット（体重１５０ｇ前後）に、ＢＳＡの
１ｍ８／ラツトを隔日に８週間静注し、糸球体腎炎惹起
した。被検体を３０日間経口投与し、尿中蛋白排潰量、
腎糸球体組織像及び総頚動脈圧を測定した。

結果を第６表に示す。

（７）ピクリルクロライドによる接触性皮膚炎に対する
効果Ａｓｈｅｒｓｏｎらの方法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　
１５．４０５（１９Ｅ１８）］に準じて行った。

ｄｄＹ系雄性マウス（体重２５ｇ前後）の腹部に、７％
ピクリルクロライド（Ｐ　Ｃ）のエタノール溶液０．１
ｍｌを塗布して感作し、さらに７日後に両耳朶に１％Ｐ
Ｃオリーブ油溶液を０．０２＋ｓｌづつ塗布して、マウ
ス接触性皮膚炎を誘発した。被検体を誘発直前および１
６時間後に経口投与し、誘発２４時間後の耳朶の厚さお
よび誘発直前の耳朶の厚さの差を腫脹度（Ｘ　１０’　
ａｍ）として計測し、次式により腫脹抑制率を求めた。

抑制率（％）＝　（１−−）Ｘ１００Ａ：被検体投与群平均腫脹度Ｂ：コントロール群平均腫脹度結果を第７表に示す、なお対照薬としてはプレドニゾロ
ンを用いた。

第　　７　　表第７表から明らかなように、生理活性エキス。

ピクリルクロライドによる接触性皮膚炎抑制作ｆ”Ｔを
有する。

発明の効果本発明の方法によれば、霊芝の子実体の水油Ｗ物のうち
の不要夾雑物が除かれ、抗アレルギー刊作用を有する成
分（塘蛋白結合体）を高純度に含有するエキスが得られ
る上、このエキスは安全トドが高いものである。従って
本発明の方法により取得される目的物は、抗アレルギー
剤として特に有用である。

しかもこの有効成分を効率的に取得することができるの
で、医薬品としての量産化にとどまらず、服用しやすい
かたちに加工ができるという利点がある。

よって、本発明は工業的に極めて価値あるものである。

Claims

【特許請求の範囲】１、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　Ｌｕｃｉｄｕｍ）から
糖蛋白含有の生理活性エキスを製造するにあたり、霊芝の子実体を水で抽出する工程（Ａ）、前工程（Ａ）の抽出液を透析または限外濾過する工程（
Ｂ）、および、前工程（Ｂ）の内液をクロマトグラフィーにより分離す
るか、あるいは、前工程（Ｂ）の内液と親水性有機溶剤
とを混合し、析出した沈澱を分離する工程（Ｃ）を実施することを特徴とする霊芝から生理活性エキスを
製造する方法。２、工程（Ａ）における抽出温度が３０〜８０℃である
特許請求の範囲第１項記載の方法。３、工程（Ｃ）における親水性有機溶剤が、アルコール
、ケトン、エステルまたはエーテル系溶剤から選ばれた
少なくとも１種の溶剤である特許請求の範囲第１項記載
の方法。４、工程（Ｃ）における親水性有機溶剤の混合割合が、
内液と親水性有機溶剤の合計量の４０〜８０ｖ／ｖ％で
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。