CN117209625A - 一种清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，该方法包含：将交联透明质酸钠凝胶微粒与磷酸缓冲盐溶液混合，于65 80℃的温度下搅拌，停止搅拌，静置沉降分层，取上层液进行抽滤处理，得到清洗后的交联透明质酸钠凝胶；当温度＜70℃，重复上述步骤至少5次；当温度≥70℃，重复上述步骤至少2次。本发明解决了现有技术不仅清洗时间较长、成本较高，而且残留的交联剂还会引起长期超敏反应的问题。本发明不仅不使用有机溶剂，还能缩短90％以上的清洗时间，高效降低交联剂的残留量，有效提升凝胶产品的质量，适于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种清洗凝胶中交联剂的方法，具体涉及一种清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法。
背景技术
透明质酸是一种线性的天然多糖，是细胞外基质的主要成分之一，主要存在于脊椎动物的滑液及上皮和结缔组织中。高分子量的透明质酸表现出许多独特的物理化学和机械性能，如调节炎症，吸湿性和润滑。尽管天然透明质酸具有独特的生物学特性，但其在皮肤中的停留时间较短，半衰期约为2-4天，通过内源性透明质酸酶和活性氧类的作用断裂糖苷键而迅速降解。此外，透明质酸的弹性差，无法提供支撑力，限制了其作为填充物的直接使用。因此，现有技术通过化学修饰和交联来改变透明质酸链的结构，从而获得具有较长停留时间和增强粘弹性的透明质酸凝胶。与天然透明质酸相比，交联透明质酸在机械和化学方面更加稳定，具有更好的粘弹性特性，同时保持了原材料的生物相容性，并且仍然具有可吸收性。在合成透明质酸凝胶中，使用交联剂是透明质酸的最广泛使用的方法。
根据交联程度和交联方式的不同，交联透明质酸的种类也不同。最常用的交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，它在透明质酸分子之间形成化学键。交联度越高，凝胶的粘度和内聚性就越高。然而，过高的交联度也会降低凝胶的生物相容性和可生物降解性。因此，找到交联和天然性之间的最佳平衡对于创造安全有效的交联透明质酸产品是必要的。
按照交联透明质酸钠凝胶组成来分，可分为单相和双相。单相透明质酸钠凝胶填充剂被称为纯交联或非微粒透明质酸钠凝胶。相比之下，双相填充剂由悬浮在非交联透明质酸钠中的稳定交联透明质酸钠凝胶微粒组成。交联透明质酸钠凝胶微粒的制备通常采用不锈钢筛网制粒或采用均质机进行均质制粒，从而形成具有一定粒径的交联透明质酸钠凝胶。现有文献1(专利号为CN113736103A)在常温下使用乙醇对透明质酸凝胶交联剂进行清洗；文献2(专利号为CN103923328B)在常温下使用丙酮对透明质酸凝胶交联剂进行清洗。目前比较常规的方法是用乙醇、丙酮等有机溶剂或含乙醇的PBS溶液和PBS溶液进行交替清洗，存在清洗时间长、成本高，不能高效去除交联剂和有机溶剂，而且残留的交联剂会引起长期超敏反应的问题，一定程度上制约了交联透明质酸钠凝胶微粒在注射整形领域的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，解决了现有技术不仅清洗时间较长、成本较高，而且残留的交联剂还会引起长期超敏反应的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，该方法包含：
将交联透明质酸钠凝胶微粒与磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)混合，于65 80℃的温度下搅拌(使交联透明质酸钠凝胶微粒悬浮后)，停止搅拌，静置沉降分层，取上层液进行抽滤处理，得到清洗后的交联透明质酸钠凝胶；
当温度≥70℃，重复上述步骤至少2次。
优选地，所述交联透明质酸钠凝胶微粒的粒径为300 400μm。
优选地，所述温度为70℃。
优选地，所述搅拌的时间为0.5 3h。
优选地，所述搅拌的时间为1h。
优选地，所述交联透明质酸钠凝胶微粒的质量与磷酸缓冲盐溶液的总质量比小于1∶10。
优选地，所述交联透明质酸钠凝胶微粒中的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
本发明还提供了一种如所述的方法得到的交联透明质酸钠凝胶，所述交联透明质酸钠凝胶中交联剂的含量＜2μg/g。
本发明的一种清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，解决了现有技术不仅清洗时间较长、成本较高，而且残留的交联剂还会引起长期超敏反应的问题，具有以下优点：
1、本发明仅使用PBS溶液清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂，当清洗温度为70℃，清洗时间为1h，清洗次数≥3次时，BDDE的残留量均低于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求，不会引起超敏反应。
2、本发明的清洗方法易操作、成本低、环境友好，与现有技术相比，本发明不仅不使用有机溶剂(仅使用PBS溶液)，还能缩短90％以上的清洗时间，高效降低交联剂的残留量，有效提升凝胶产品的质量，适于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明使用PBS溶液清洗的温度和BDDE残留量的关系图。
图2为本发明于70℃使用PBS溶液清洗的时间和BDDE残留量的关系图。
图3为本发明清洗使用不同的溶剂和BDDE残留量的关系图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实施例所用的交联透明质酸钠凝胶微粒采用以下方法制备：
(1)配置浓度为10wt％的透明质酸钠碱液，透明质酸钠分子量为150 300万分子量，将交联剂滴加到透明质酸钠碱液中搅拌均匀，得到混合溶液；
(2)将得到的混合溶液在水浴条件下，先于45℃反应3小时后，再于37℃反应10小时；
(3)反应结束后，向混合溶液中加入PBS溶液(混合溶液与PBS溶液的质量比为1∶50)进行均质化处理及清洗，真空干燥后获得交联透明质酸钠凝胶微粒。
PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)中含有8.5～9.0mg/ml的NaCl溶液、0.03～0.04mg/ml的NaH2PO4溶液、0.30～0.40mg/ml的Na2HPO4溶液，其余为注射用水，pH为为6.95。
交联剂选自1,2,7,8-二环氧辛烷、聚乙二醇、乙二酸二酰肼、二乙烯基砜和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)中的任意一种。
实施例1
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，该方法包含：
(1)将使用BDDE作为交联剂制得的交联透明质酸钠凝胶微粒2.0g用800目不锈钢筛网筛选，得到符合目标粒径的交联透明质酸钠凝胶微粒(不锈钢筛网筛选的作用是筛掉游离水，微粒粒径均为350±50μm)；
(2)将符合目标粒径的交联透明质酸钠凝胶微粒转移至容器中，加入100gPBS溶液，在水浴温度为70℃的条件下进行搅拌清洗1h(使交联透明质酸钠凝胶微粒均匀悬浮)后，停止搅拌静置沉降，待分层后，取上层悬液抽滤处理后得到清洗后的交联透明质酸钠凝胶，采用气相色谱法检测清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量；
(3)将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量如表1所示。
表1实施例1于70℃下使用PBS溶液每次清洗1h后检测BDDE的残留量
由表1中的检测结果得知，当清洗次数≥3次时，BDDE的残留量低于行业标准《YY/T0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。
实施例2
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，将交联透明质酸钠凝胶微粒的质量改为4.0g；
在步骤(2)中，PBS溶液的质量改为200g；
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)4次。
实施例3
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，将交联透明质酸钠凝胶微粒的质量改为6.0g，不锈钢筛网的目数改为600目；
在步骤(2)中，PBS溶液的质量改为300g；
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。
实施例23中每次清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量与实施例1的相同。
实施例4
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(2)中，在水浴温度为70℃的条件下进行搅拌清洗的时间依次改为2h、3h。
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量如表2所示。
表2实施例4于70℃下使用PBS溶液每次清洗2h或3h后检测BDDE的残留量(μg/g)
由表2的检测结果得知：清洗次数≥3次时，每次清洗的时间为2h或3h，对应的BDDE的残留量均低于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。
实施例5
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(2)中，100g的PBS溶液改为100g的30％乙醇PBS混合液(无水乙醇和所配PBS溶液质量比为3∶7)；水浴温度改为20℃。
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量如表3所示。
表3实施例5于20℃下使用30％乙醇的PBS溶液每次清洗1h后检测BDDE的残留量
由表3的检测结果得知：清洗次数为10次时，BDDE的残留量仍为77μg/g，远高于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。
实施例6
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(2)中，水浴温度依次改为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和80℃。
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量如表4所示。
表4实施例6在不同温度下使用PBS溶液每次清洗1h后检测BDDE的残留量(μg/g)
由表4的检测结果得知：在清洗温度≤50℃下，清洗次数为10次时，BDDE的残留量均高于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求；在清洗温度为60℃下，清洗次数≥6次时，BDDE的残留量才低于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求；在清洗温度为80℃下，清洗次数≥3次时，BDDE的残留量才低于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。
实施例7
一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法与实施例1基本相同，区别在于：
在步骤(2)中，搅拌清洗的时间为0.5h，其他操作与实施例相同；
在步骤(3)中，将检测完的交联透明质酸钠凝胶重复步骤(2)的操作(清洗抽滤检测)9次。清洗后的交联透明质酸钠凝胶中BDDE的残留量如表1所示。
表5实施例7于70℃下使用PBS溶液每次清洗0.5h后检测BDDE的残留量
由表5中的检测结果得知，当清洗次数≥6次时，BDDE的残留量低于行业标准《YY/T0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。
实验例1分析清洗时间、温度和溶剂等对BDDE残留量的影响
1、清洗的温度
根据实施例1、6的清洗方法，探究清洗的温度对BDDE残留量的影响，所用溶剂均为PBS溶液，清洗次数均为1 10次，每次清洗的时间为1h。具体的检测结果如图1所示。
如图1所示，本发明使用PBS溶液清洗的温度和BDDE残留量的关系图。由图1可见清洗温度越高，BDDE残留量越少，而过高的温度可能会导致交联透明质酸的降解。本发明在实际操作中发现，脱水后的交联透明质酸颗粒在100℃放置10小时以上时会由白色变为黄色。因此清洗温度为70℃比较合适。
2、清洗的时间
根据实施例1、4的清洗方法，探究每次清洗的时间对BDDE残留量的影响，所用溶剂均为PBS溶液，清洗温度均为70℃，清洗次数均为1 10次，具体的检测结果如图2所示。
如图2所示，本发明于70℃使用PBS溶液清洗的时间和BDDE残留量的关系图。由图2可见，于70℃，在每次清洗的时间为1h、2h或3h下，BDDE的残留量无显著性差异；当清洗次数≤2次时，BDDE的残留量明显降低，当清洗次数≥3次时，BDDE的残留量均低于行业标准《YY/T 0962-2021整形手术用交联透明质酸钠凝胶》中2μg/g的要求。因此本发明的清洗方法只需于70℃下每次的清洗时间为1h、清洗的次数≥3次时，凝胶中的BDDE与加入的PBS溶液可以完成完全交换。
3、清洗的溶剂
根据实施例1、5和6的清洗方法，探究不同的清洗溶剂对BDDE残留量的影响。具体的条件为：实施例1、6的清洗溶剂均为PBS溶液，实施例5的清洗溶剂为30％乙醇的PBS溶液，实施例5、6的清洗温度为20℃，实施例1的清洗温度为70℃，清洗次数均为1 10次，每次清洗的时间为1h。具体的检测结果如图3所示。
如图3所示，本发明清洗使用不同的溶剂和BDDE残留量的关系图。由图3可见，清洗次数均为1 10次时，在20℃下使用30％乙醇的PBS溶液清洗的效果比PBS溶液较好一些，但是与70℃下使用PBS溶液清洗的效果相比，70℃下交联剂BDDE的残留量大幅小于20℃下BDDE的残留量，其原因在于：首先高温加速了分子间运动，交联剂BDDE可以更快地从凝胶中脱出；其次交联剂BDDE在70℃下会加速水解。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (7)
1.一种不含有机溶剂清洗交联透明质酸钠凝胶微粒中交联剂的方法，其特征在于，该方法包含：
将交联透明质酸钠凝胶微粒与磷酸缓冲盐溶液混合，于6580℃的温度下搅拌，停止搅拌，静置沉降分层，取上层液进行抽滤处理，得到清洗后的交联透明质酸钠凝胶；
当温度＜70℃，重复上述步骤至少5次；当温度≥70℃，重复上述步骤至少2次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶微粒的粒径为300400μm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述温度为70℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述搅拌的时间为1 3h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述搅拌的时间为1h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶微粒的质量与磷酸缓冲盐溶液的总质量比小于1∶10。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联透明质酸钠凝胶微粒中的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
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