CN105324398A - 用于生产化学修饰的肝素的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产具有约4.6至约6.9kDa的平均分子量和小于约10IU/mg的抗因子Xa活性的肝素衍生物的方法，其包括氧化未分级肝素、解聚和还原所产生的末端基团的步骤。

Description

用于生产化学修饰的肝素的新方法
技术领域
本发明涉及新方法。特别地，其涉及用于制备化学修饰的葡糖胺聚糖(glycosaminoglycan)(例如化学修饰的肝素)的新方法。
背景技术
本说明书中对明显在先出版的文献的列举或讨论不应必须理解为承认该文献是现有技术的一部分或是公知常识。
肝素是多分散的、天然存在的抑制凝血的多糖，血栓形成经由所述凝血过程发生。肝素由不同长度和分子量的无支链多糖链组成。分子量从5000至超过40,000道尔顿的链构成了医药级肝素。
通常，天然来源(例如猪肠或牛肺组织)的肝素可以在治疗上施用以预防和治疗血栓形成。然而，未分级肝素(unfractionatedheparin)的作用是难以预料的。因此，在用未分级肝素治疗血栓形成期间，必须非常密切地监测凝血参数以防止过强或过弱抗凝血。
众多品牌的肝素和低分子量肝素(LMWH)(例如达肝素(dalteparin)和依诺肝素)可以用于依赖于其抗凝血活性的治疗方法。大量体外和动物实验研究，甚至临床试验都表明，肝素及其衍生物具有与其抗凝血作用相关的那些特性之外的有益特性。然而，由于与抗凝血作用相关的出血风险，现有的肝素和LMWH不适合用于治疗其它医学病症。
已证明LMWH达肝素减少接受预防深静脉血栓形成的女性中的滞产(protractedlabour)。该机制被认为涉及达肝素诱导的增加的白介素水平，导致有利的炎症反应，其促进子宫颈成熟。此外，已证明达肝素增加子宫的收缩力(ActaObstetriciaetGynecologica,2010；89:147-150)。然而，出于一些原因，肝素和LMWH不适合用于预防或治疗这样的疾病。
首先，肝素和LMWH具有显著的、众所周知的抗凝血作用，由于出血风险，限制其在妊娠晚期及分娩过程中使用(无论是预防还是急性使用)。例如，当给予硬膜外麻醉时(在分娩时经常采取的措施)，严格禁止使用达肝素。
第二，肝素(以及在一定程度上LMWH)已与肝素诱导的血小板减少联系起来，所述血小板减少是可以发生在任何暴露于肝素的病人中的严重的免疫介导药物反应。其是由肝素依赖性抗体引起的潜在破坏性血栓形成前(pro-thrombotic)疾病，所述肝素依赖性抗体是在病人使用肝素五天或以上之后，或者如果病人之前已经有肝素暴露而发展起来的。
肝素长期治疗的另一种可能的不良影响是，其可能会诱导骨骼脱矿质(demineralization)，并造成骨质疏松。
已经有许多尝试，以消除或降低肝素或低分子量肝素的抗凝血活性，以提供低抗凝血肝素(LAH)，其目的在于从肝素链的抗凝血作用之外的其它潜在临床作用中获益，而不具有与肝素有关的不良作用的风险(主要是出血)。然而，对于这种类型的肝素的临床经验有限，至今没有这样的产品被允许用于临床。
肝素主要通过高亲和力结合并活化丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗凝血酶(AT)，而发挥其抗凝血活性。AT作为血液凝固的重要生理抑制剂，通过与激活的凝血因子形成稳定的络合物而中和这些因子。特定的五糖(pentasaccharide)与肝素的多糖链的结合引起AT的构象变化，这极大地提高了抑制凝血因子的速率，从而减弱血液凝固和血凝块的形成。
欧洲专利申请EP1059304公开了酶促降解的或氧化的肝素，得到具有低抗凝血作用的产品，其具有9至13kDa的平均分子量，其被推荐用于神经变性疾病的治疗。
美国专利4,990,502阐明了一种处理天然肝素的方法以裂解负责抗凝血作用的五糖残基，以及随后的解聚，其得到低抗凝血、平均分子量5.8至7.0kDa的低分子量肝素。然而，在US4,990,502中，使用耗时的方法(例如约15小时的渗析)以终止氧化过程。这样的过程可以影响最终产品的分子量分布，并产生不利的结构变体(structuralvariant)，所述结构变体可以通过1HNMR观察到。
控制多糖链的分子量和长度对于获得期望的化合物生物效应是至关重要的。长链肝素皮下给药后的生物利用度低，肝素诱导的血小板减少症(HIT)诱导的可能性也与链长度正相关。为了降低这些临床上不期望的性质，肝素衍生物不应该是全长度的。某些分子量的肝素链可以通过标准肝素的分级(fractionation)而获得。然而，通过分级方法例如凝胶过滤、醇沉淀和离子交换色谱生产中等或低分子量肝素衍生物与原材料的显著浪费有关，因为丢弃了高分子量肝素。
如本文所公开，可以使用包括氧化未分级肝素、解聚以及还原所得的末端基团这些步骤的方法，制备具有低抗凝血活性的肝素衍生物，这些衍生物用于减少滞产持续时间。
特别地，我们意外地发现，可以通过控制氧化和还原步骤之间经过的时间，将使用这些方法制备肝素衍生物期间产生的不需要的结构修饰的水平最小化。进一步，我们发现，可以通过监测解聚步骤的进展(或者参考之前进行的方法)并相应地调节解聚步骤的持续时间，控制所得肝素衍生物的平均分子量。
国际(PCT)申请号PCT/SE2012/051433(以WO2013/095279公布)公开了用于制备未分级肝素的衍生物的方法，包括氧化、解聚和末端基团的还原，这些衍生物具有低抗凝血活性，并用于减少滞产持续时间。然而，这个国际申请并未涉及监测解聚步骤的进展以控制所得肝素衍生物的平均分子量。
发明内容
在本发明的第一方面中，提供用于制备具有约4.6至约6.9kDa的平均分子量和小于约10IU/mg的抗因子Xa活性的肝素衍生物的方法，其包括以下连续步骤：
(i)通过加入氧化剂氧化未分级肝素的酸性水溶液；
(ii)通过使步骤(i)的产物与碱形成碱性溶液解聚氧化的肝素；
(iii)将来自步骤(ii)的所述溶液维持在碱性pH中持续所需要的一段时间以提供具有上述范围内的分子量的解聚的肝素；以及
(iv)通过将氢化物还原剂加入至获得自步骤(iii)的溶液中还原所述解聚的肝素的末端醛基，
其中控制步骤(i)结束和步骤(iv)开始之间的一段时间以使残余氧化剂的作用最小化；以及
其中通过分析所述溶液，或者参考之前进行的基本上相同的步骤(iii)，确定步骤(iii)中所述的一段时间。
本领域技术人员将理解，可以将如本文所描述的本发明的任何实施方案与任何一个或更多个其他实施方案相组合，以提供本发明的进一步的实施方案。本文所描述的全部这些实施方案的组合都是特别考虑的。因此，对本发明的任何方面的引用将包括对其任何实施方案或其实施方案的组合的引用。
如本文所使用，术语“约”可以指与指定的值相差10％(特别地，在5％以内，例如在1％以内)的值。在每次出现时，本发明的实施方案包括在其中术语“约”被删除的那些。
本领域技术人员将理解，对步骤是“连续的”的引用表明它们以所示的顺序依次进行。在特别的实施方案中，步骤可以以直接顺序进行，例如没有介于中间的步骤。因此，在特别的实施方案中，可以将本发明第一方面中定义的方法称作由本发明第一方面(或其任何实施方案，或其实施方案的组合)中提到的连续步骤“组成”。
在特别的实施方案中，可以在单一反应容器中进行本发明第一方面中定义的方法(所谓的“一锅”法)。
肝素衍生物
本发明第一方面中定义的方法允许使用现行低分子量肝素国际标准，生产具有约4.6至约6.9kDa的平均分子量(Mw)和小于约10IU/mg的抗因子Xa活性的肝素衍生物。
为了避免疑义，本领域技术人员将理解，本文所提到的术语“平均分子量”是指重均分子量。
可以使用本领域技术人员已知的技术测定肝素衍生物的平均分子量。例如，可以通过使用高效液相色谱(HPLC)(例如凝胶渗透色谱HPLC(GPC-HPLC))分析获得自本发明第一方面中定义的方法的肝素衍生物的样品，测定平均分子量。
特别地，可以按照Mulloy等人改进的用于低分子量肝素的凝胶渗透色谱的欧洲药典程序(专论0828)(“MolecularWeightMeasurementsofLowMolecularWeightHeparinsbyGelPermeationChromatography”,Thrombos.Haemostas.77,1997,668-674)进行分子量分析，其中利用低分子量肝素国际分子量标准(InternationalMolecularWeightStandardforLow-Molecular-WeightHeparin)校准色谱系统。
在特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法制备的肝素衍生物具有约5.0至约6.0kDa的平均分子量(如约5.2至约5.9kDa，例如约5.3至约5.8kDa或者，可替代地，约5.7至约6.3kDa)。
通过本发明第一方面中定义的方法制备的特别的肝素衍生物包括具有约5.8kDa、约5.6kDa或约5.3kDa的平均分子量的那些。
在特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法制备的肝素衍生物包含具有如下表1所示的累积分子量分布的多糖。
表1
在特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物可以由分子组成，至少70％的所述分子具有大于约3kDa的分子量。
本发明第一方面中定义的方法允许具有低抗凝血性质的肝素衍生物的生产。
本领域技术人员将理解，肝素等的抗凝血活性是由于高亲和力结合并活化丝氨酸蛋白酶抑制剂，抗凝血酶(AT)导致。活化的AT反过来起作用以与各种凝血因子形成稳定的络合物，从而中和其作用。因此，可以通过测定这些凝血因子的活性来量化抗凝血性质。
本领域技术人员将理解，可以通过测定凝血因子Xa和IIa的活性，测量通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物的抗凝血活性。
在特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物具有小于10IU/mg的抗因子Xa和抗因子IIa活性。
在更特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物可以具有小于5IU/mg的抗因子Xa活性和/或小于5IU/mg的抗因子IIa活性。例如，通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物可以具有小于5IU/mg的抗因子Xa活性和小于5IU/mg的抗因子IIa活性。
在更特别的实施方案中，通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物可以具有小于1IU/mg的抗因子Xa活性和/或小于1IU/mg的抗因子IIa活性。
可以根据用于低分子量肝素的欧洲药典程序(专论0828)进行抗凝血活性、抗因子IIa和抗因子Xa的测定，其中使用低分子量肝素国际活性标准(InternationalActivityStandardforLow-Molecular-WeightHeparin)校准系统。
在特别的实施方案中，通过本领域已知的分析方法测量，使用本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物可能不具有可检测到的抗凝血活性。
本领域技术人员将意识到，本发明第一方面中定义的方法允许存在于未分级肝素中的残余物被氧化、解聚和还原，其反过来提供由修饰的残余物组成且具有低分子量的肝素衍生物。
在特别的实施方案中，存在于肝素衍生物中的多糖链基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列(例如，≤1％的存在于肝素衍生物中的多糖链包含所述化学完整的糖序列，如通过NMR可检测到)。
在进一步的实施方案中，在肝素衍生物中主要出现的二糖如下式I所示。
其中
并且n为2至20的整数。
如本文所使用，术语“主要出现的”可以理解为是指在大多数(即大于50％，例如大于60％或者，特别地，大于80％)例子中出现的各自的特征(respectivefeature)。
在进一步的实施方案中，多糖链具有2至20(式I中的n)个二糖单元，对应于1.2至12kDa之间的分子量。
本领域技术人员还将理解，本发明第一方面中定义的方法允许肝素衍生物的生产，其中存在于未分级肝素中的硫酸根基团被保留。
在特别的实施方案中，提供制备肝素衍生物的方法，其中存在至少约70％(如至少约80％，例如至少约90％)的硫酸根基团。
如本文所描述，本发明第一方面中定义的方法允许具有低水平的不需要的结构修饰的肝素衍生物的生产，其中不需要的结构修饰是由于残余氧化剂的作用导致。
如本文所使用，术语“残余氧化剂”可以指在步骤(i)结束之后存在于方法中的一种或更多种物质，其能够进一步氧化获得自该步骤的肝素衍生物。
已经发现，这些物质的存在导致肝素衍生物中不需要的结构修饰。特别地，已经发现，这些不需要的结构修饰是由于肝素衍生物的非特异性解聚，即由碱性β消除介导的那些(即在如本文定义的步骤(ii)中)之外的解聚导致。
这些非特异性解聚过程可能导致分子量缺乏可预测性且具有不良稳定性的肝素衍生物的形成，并且可能导致变色(其在储存时可能会增加)。
特别地，如本文所指的不需要的结构修饰可以以存在未确认的经化学修饰的肝素残余物为特征。例如，这些未确认的经化学修饰的肝素残余物可以以肝素衍生物1HNMR谱的5.0ppm至6.5ppm区域中的信号为特征。更特别地，这些未确认的经化学修饰的肝素残余物可以以在多糖的单糖单元的C4-C5位存在双键为特征，其可以通过肝素衍生物1HNMR谱中在约5.0和约6.5ppm(例如在约5.95ppm和约6.15ppm)之间的信号来确认。
在特别的实施方案中，提供制备肝素衍生物的方法，所述肝素衍生物在相应的1HNMR谱的5.0ppm至6.5ppm区域中具有信号，所述信号相对于未分级肝素1HNMR谱在5.42ppm的信号具有≤约4％(例如≤约3％，如≤约2.5％)的强度(％比例)。
在更特别的实施方案中，提供制备肝素衍生物的方法，所述肝素衍生物在相应的1HNMR谱中在5.95ppm和6.15ppm具有信号，所述信号相对于未分级肝素1HNMR谱在5.42ppm的信号具有≤约4％(例如≤约3％，如≤约1％)的强度(％比例)。
在进一步的实施方案中，提供使用本发明第一方面中定义的方法可获得的肝素衍生物(例如在本发明第一方面中所定义)。
氧化
本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(i)通过加入氧化剂氧化未分级肝素的酸性水溶液。
如本文所使用，术语“水溶液”是指在水中的溶液。特别地，对未分级肝素的水溶液的引用可以指在水中的溶液，其中至少90％(特别地，至少95％，如至少99％)的肝素是溶解的。更特别地，其可以指通过目测观察不含未溶解的肝素的溶液。
如本文所使用关于本发明第一方面的方法的步骤(i)，对酸性溶液的引用将被理解是指具有低于7(例如低于约6)的pH的溶液。特别地，其可以指具有约3至约6(例如约3.5至约6，如约4.5至约5.5)的pH的溶液。
本领域技术人员将理解，可以在加入氧化剂之前或之后(例如之前)调节水溶液的pH。
在特别的实施方案中，维持溶液的pH直至氧化结束(即如本文所定义的步骤(i)结束)。
本领域技术人员将理解，可以通过加入合适的酸，如合适的强酸(例如具有小于约5，如约1至约5的pKa值的无机酸或有机酸，如无机酸)调节和/或维持水溶液的pH。
在特别的实施方案中，可以将溶液的pH调节至并维持在约4.5至约5.5，例如约5。
在特别的实施方案中，溶液中肝素的浓度为肝素重量比水体积约10至约20％(例如约15％)。
本领域技术人员将理解，对氧化剂的引用意在指能够氧化未分级肝素的试剂。特别地，本领域技术人员将理解，对氧化剂的引用可以指能够氧化裂解未分级肝素中的邻二醇(即产生相应的醛部分)的试剂。
为了避免疑义，对通过加入氧化剂氧化未分级肝素的酸性水溶液(即如本文所定义的步骤(i)中所指)的引用可以指，通过加入能够裂解未分级肝素中的邻二醇部分的氧化剂氧化未分级肝素的酸性水溶液。
在特别的实施方案中，氧化剂可能为合适的高碘酸盐(如偏高碘酸钠)或高锰酸盐(如高锰酸钾)。在更特别的实施方案中，氧化剂为偏高碘酸钠。
本领域技术人员将意识到，可以将氧化剂(如偏高碘酸钠)一次加入、分步加入或连续加入至水溶液中。此外，可以将氧化剂作为固体或作为溶液(例如水溶液)加入。
在特别的实施方案中，加入的氧化剂(如偏高碘酸钠)的量为以存在于溶液中的肝素的量计约15至约35％重量(例如以存在于溶液中的肝素的量计约25％重量)。
在特别的实施方案中，可以在降低的温度进行本发明第一方面的方法的步骤(i)。
如本文所使用，本领域技术人员将理解，术语“降低的温度”是指低于环境(室内)温度的温度，即低于约25℃(例如低于约20℃)。可以在加入氧化剂之前，或紧随其后，调节溶液的初始温度。
在特别的实施方案中，可以在反应的最后两小时，将本发明第一方面的方法的步骤(i)的温度降低至约5℃。
在更特别的实施方案中，可以在低于室温但高于约10℃的温度(例如在约13℃至约17℃的温度)进行本发明第一方面的方法的步骤(i)。
在更特别的实施方案中，可以在约13℃至约17℃的温度，然后在反应的最后约两小时冷却至约5℃的温度进行本发明第一方面的方法的步骤(i)。
在特别的实施方案中，可以将本发明第一方面的方法的步骤(i)避光。
在特别的实施方案中，将本发明第一方面的方法的步骤(i)进行足以允许肝素完全氧化的持续时间(即一段时间)，该段时间可以为约18至约26小时(例如，约18至约24小时)。
如本文所使用，对实现完全氧化的引用可以指获得氧化的衍生物，其中至少约90％(例如至少约95％，如至少约99％)的非硫酸化的(non-sulphated)邻二醇部分(例如在肝素的艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸残基中)已被转化为相应的醛，例如通过GPC-HPLC和NMR所测定。
本领域技术人员将理解，可以通过调节温度和反应的持续时间控制本发明第一方面的方法的步骤(i)的进展。
本领域技术人员将理解，可以通过分析取自溶液的样品(例如使用GPC-HPLC)跟踪本发明第一方面的方法的步骤(i)的进展，并相应地调节步骤(i)所需要的一段时间。特别地，可以跟踪本发明第一方面的方法的步骤(i)，并调节持续时间以使解聚最小化(如通过平均分子量的降低所确认)。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面中定义的方法的步骤(i)需要通过将偏高碘酸钠加入至获得自步骤(i)的溶液中氧化所述肝素，然后将获得的溶液维持在约4.5至约5.5的pH，并任选地维持在降低的温度，持续约18至约26小时的一段时间。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(i)在约4.5至约5.5的pH并在降低的温度，通过加入偏高碘酸钠氧化未分级肝素的水溶液。
解聚
本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(ii)通过使步骤(i)的产物与碱形成碱性溶液解聚氧化的肝素；以及
(iii)将来自步骤(ii)的所述溶液维持在碱性pH中持续所需要的一段时间以提供具有上述范围内的分子量(即如在本发明第一方面中所定义)的解聚的肝素，
其中通过分析所述溶液，或者参考之前进行的基本上相同的步骤(iii)确定步骤(iii)中所述的一段时间。
本领域技术人员将理解，在本发明第一方面中定义的方法的步骤(ii)和步骤(iii)中，通过碱性β消除实现获得自步骤(i)的氧化的肝素的解聚。
如本文所使用关于本发明第一方面中定义的方法的步骤(ii)和(iii)，对形成碱性溶液的引用将被理解是指将溶液的pH调节到约8至约13。特别地，重要的是，将溶液的pH保持在低于约13。
可以通过加入合适的碱，例如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠)或碱金属碳酸盐(例如碳酸钠)调节和/或维持溶液的pH。
在特别的实施方案中，例如通过加入碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠)，将溶液的pH调节到约10.5至约11.5，所述碱金属氢氧化物可以为水溶液(例如1至4摩尔的溶液)的形式。
本领域技术人员将理解，可以在降低的温度调节溶液的pH。在特别的实施方案中，在本发明第一方面的方法的步骤(ii)中，当溶液在约5℃至约10℃的温度时调节溶液的pH。
本领域技术人员将理解，可以通过调节本发明第一方面的方法的步骤(iii)中的温度控制解聚反应的进展。例如，可以将溶液维持在约5℃至约25℃(例如在约5℃至约10℃)的温度。
本领域技术人员将意识到，解聚步骤中获得的平均分子量将决定通过本发明第一方面中定义的方法生产的肝素衍生物的平均分子量。因此，将溶液维持在所需要的pH(并且，任选地，在所需要的温度)持续所需要的一段时间以提供具有在上述范围(即约4.6至约6.9kDa)内的所需要的分子量的解聚的肝素。
本领域技术人员将理解，获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间将取决于在本发明第一方面的方法的步骤(ii)和(iii)中所使用的条件。在如本文上面所述的条件下，一段时间通常最多将为约四小时。
如本文所指，可以通过使用本领域技术人员已知的技术分析溶液，以测定获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间。特别地，可以通过从反应混合物中取样，并使用各种基于色谱的技术(例如GPC-HPLC)分析那些样品，以监测解聚的肝素衍生物的平均分子量。
因此，对获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间的引用可以指，为了分析溶液以确定解聚的肝素衍生物具有所需要的分子量所需要的一段时间。
在特别的实施方案中，反复地使用GPC-HPLC分析(例如间隔约30分钟)进行溶液的分析。可以使用如本文描述的技术，例如按照Mulloy等人改进的用于低分子量肝素的凝胶渗透色谱的欧洲药典程序(专论0828)(“MolecularWeightMeasurementsofLowMolecularWeightHeparinsbyGelPermeationChromatography”,Thrombos.Haemostas.77,1997,668-674)进行这种分析，其中利用低分子量肝素国际分子量标准校准色谱系统。
可替代地，可以参考之前进行的基本上相同的步骤(iii)确定获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间。
如本文所使用，对基本上相同的步骤(iii)的引用将被理解是指相应于本发明方法的步骤(iii)的之前进行的工艺步骤(即反应)，该工艺步骤使用与本发明第一方面的方法的步骤(iii)基本上相同的反应物并在基本上相同的条件进行。
如本文所使用，对基本上相同的条件的引用将被理解是指相对于在本发明第一方面的方法的步骤(iii)中使用的那些条件，具有10％以内的变动(例如具有5％以内的变动，如具有1％以内的变动)的条件(如pH、反应物的浓度和温度)。
如本文所使用，对基本上相同的反应物的引用将包括对使用由本发明第一方面的方法的步骤(i)和(ii)获得的基本上相同的肝素衍生物的引用。
本领域技术人员将意识到，对使用基本上相同的肝素衍生物的之前进行的步骤(iii)的引用可以指在基本上相同的步骤(i)和(ii)之后进行的步骤(iii)。
如本文所使用，对基本上相同的步骤(i)和(ii)的引用将以同样的方式理解为对基本上相同的步骤(iii)的引用。
特别地，对基本上相同的步骤(i)的引用将指以基本上相同的未分级肝素为起始的之前进行的步骤(i)。
如本文所使用，对基本上相同的未分级肝素的引用可以指获得自与在本发明第一方面的方法中使用的肝素相同供应商的未分级肝素。特别地，对基本上相同的未分级肝素的引用可以指取自与在本发明第一方面的方法中使用的肝素同一批次的未分级肝素。
如本文所使用对于基本上相同的步骤(i)、(ii)和(iii)，对基本上相同的反应物的引用还将包括对使用氧化剂和/或还原剂的引用，所述氧化剂和/或还原剂在化学上相同于、或功能上等同于在本发明第一方面的方法中使用的反应物。
本领域技术人员将理解，获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间可以看作与在如本文所指的基本上相同的步骤(iii)中获得特定的平均分子量所需要的时间大致相同，或者与它的推测大致相同。
一旦为了获得具有所需要的平均分子量的解聚的肝素衍生物所需要的一段时间已过去，就可以终止解聚反应。在特别的实施方案中，可以通过形成酸性溶液终止解聚反应。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面的方法进一步包括(即在步骤(iii)和(iv)之间)以下步骤：
(iiia)使获得自步骤(iii)的溶液与酸形成酸性溶液。
如本文所使用关于本发明第一方面的方法的步骤(iii)(以及关于涉及步骤(iiia)的其实施方案)，对形成酸性溶液的引用是指通过加入如本文之前定义的合适的酸(例如HCl，如4摩尔的HCl溶液)，调节pH至低于7(如约4至约6.5，例如约5.5至约6.5)。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(ii)通过使步骤(i)的产物与碱形成具有约8至约13(例如约10.5至约11.5)的pH的溶液解聚氧化的肝素；以及
(iii)将来自步骤(ii)的所述溶液维持在碱性pH中持续所需要的一段时间以提供具有上述范围内的分子量(即如在本发明第一方面中所定义)的解聚的肝素；以及
(iiia)使获得自步骤(iii)的溶液与酸形成具有约5.5至约6.5的pH的溶液，
其中通过分析所述溶液，或者参考基本上相同的步骤(iii)确定步骤(iii)中的所述的一段时间。
还原
本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(iv)通过将氢化物还原剂加入至获得自步骤(iii)的溶液中还原所述解聚的肝素的末端醛基。
本领域技术人员将理解，在包括步骤(iiia)的本发明第一方面的方法的实施方案中，步骤(iv)可以指通过将氢化物还原剂加入至获得自步骤(iiia)的溶液中还原所述解聚的肝素的末端醛基。
本领域技术人员将意识到，末端醛基作为之前解聚步骤，即步骤(ii)至(iii)(或者视情况步骤(ii)至(iiia))的产物而形成。
氢化物还原剂的加入允许还原末端醛基，以形成相应的伯醇。还原剂的加入还允许还原(并因此中和)步骤(i)中使用的残余的氧化剂(例如残余的偏高碘酸钠或其衍生物)。这种残余的氧化剂可以以高碘酸盐(和/或碘酸盐)物质(其可以被还原为反应性较低碘和碘化物物质)的形式存在于溶液中。
氢化物还原剂的加入还可以具有提高溶液pH(例如到约9(例如约10)至约11)的作用。
在通过加入酸终止之前的解聚步骤的实施方案中，氢化物还原剂的加入还将与所述酸反应并将其中和。在这样的实施方案中，本领域技术人员将理解，可能需要额外的氢化物还原剂以允许这样的反应。
在特别的实施方案中，氢化物还原剂为硼氢化物。在更特别的实施方案中，氢化物还原剂为硼氢化钠。
在特别的实施方案中，加入的氢化物还原剂(如硼氢化钠)的量足以允许末端醛基和残余氧化物质的完全还原。
本领域技术人员将意识到，可以基于在方法中使用的肝素的量和其解聚程度，以及所使用的氧化剂的量，计算末端醛基和残余氧化物质的完全还原所需要的氢化物的量。
本领域技术人员将理解，可以在降低的温度将氢化物(如硼氢化钠)加入至溶液中(例如为了抵消反应的放热性质)。在特别的实施方案中，在约5℃至约17℃的温度将氢化物加入至溶液中。
本领域技术人员将意识到，可以将氢化物(如硼氢化钠)一次加入、连续加入或分步加入(即通过几个较小的份加入)至水溶液中。此外，可以将氢化物作为固体或作为溶液(例如碱稳定化(alkalistabilised)的水溶液，如硼氢化钠的碱稳定化的水溶液)加入。
加入氢化物之后，任选在降低的温度(例如在约5℃至约17℃)，将反应维持足以使末端醛基完全还原为伯醇的一段时间。例如，可以将溶液维持约4至约24小时(例如约14至约20小时)的一段时间。
如本文所使用，对末端醛基的完全还原的引用可以指获得基本上不含醛部分的肝素衍生物，例如通过(例如13C)NMR分析确定，所述肝素衍生物中≤1％的醛基保持未还原。
一旦还原末端醛基所需要的一段时间已过去，就可以淬灭还原反应。如本文所使用关于还原反应(即如本文所定义的步骤(iv))，本领域技术人员将理解，对淬灭反应的引用是指通过中和残余的还原剂终止还原反应。
可以使用本领域技术人员已知的技术，例如通过加入水或者，特别地，酸的水溶液(例如本文所定义的强酸的水溶液，如1至4摩尔的HCl溶液)淬灭还原反应。
在特别的实施方案中，可以通过降低pH以形成酸性溶液(例如通过加入如本文所定义的强酸的水溶液，如1至4摩尔的HCl溶液)淬灭还原反应(即如本文所定义的步骤(iv))。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面的方法进一步包括(即在步骤(iv)之后)以下步骤：
(iva)通过降低pH以形成酸性溶液淬灭还原反应。
如本文所使用关于淬灭还原反应(例如关于步骤(iva)，如适用)，对降低pH至酸性溶液的引用是指降低pH至低于7。
在特别的实施方案中，通过降低pH到约2至约6(例如约3至约5)淬灭反应。在更特别的实施方案中，通过降低pH至约4淬灭反应。
在特别的实施方案中，通过降低pH至酸性溶液(例如至约4的pH)，并维持溶液的pH持续大于约30分钟(例如约45至约60分钟)淬灭反应。
因此，在特别的实施方案中，本发明第一方面中定义的方法包括以下步骤：
(iv)通过将硼氢化钠加入至获得自步骤(iii)的溶液中还原所述解聚的肝素的末端醛基；以及
(iva)通过降低pH以形成酸性溶液淬灭还原反应。
产物的回收
本领域技术人员将理解，本发明的方法可以进一步包括一个或更多个步骤，用于回收以及，如果需要，用于纯化肝素衍生物。
例如，本领域技术人员将理解，在本发明的方法包括以下步骤的情况下：
(iva)通过降低pH至酸性溶液淬灭还原反应，
肝素衍生物的回收可能需要将溶液调节至中性pH(即约7)。
因此，在特别的实施方案中，当本发明第一方面中定义的方法包括如本文所定义的步骤(iva)的情况下，所述方法任选地进一步包括(即在步骤(iva)之后)以下步骤：
(ivb)将获得自步骤(iva)的溶液的pH调节至约中性。
可以通过加入合适的碱，例如碱金属(例如，氢氧化钠水溶液)或者，特别地，碱金属碳酸盐(例如，碳酸钠水溶液)调节溶液的pH。
在特别的实施方案中，本发明第一方面的方法进一步包括(即在步骤(iv)或者，如适用，步骤(iva)或(ivb)之后)以下步骤：
(v)从获得自步骤(iv)(或者，如适用，步骤(iva)或(ivb))的溶液中回收肝素衍生物。
如本文所使用，本领域技术人员将理解，对回收肝素衍生物的引用是指从获得自本发明第一方面的方法的溶液中，分离至少部分通过该方法生产的肝素衍生物。
可以使用本领域技术人员已知的技术实现肝素衍生物的回收。这些技术可以包括，特别地，从溶液中沉淀肝素衍生物，其可以通过调节溶液的极性(例如通过加入极性溶剂，如乙醇)实现。
从溶液中回收肝素衍生物的步骤可以包括(或与之组合)用于进一步纯化产物，例如，通过去除杂质和/或不需要的结构修饰的过程。
因此，在特别的实施方案中，如果实施本发明第一方面中定义的方法的步骤(v)，其可以包括一个或更多个用于纯化产物的过程。
本领域技术人员将理解，可以使用本领域技术人员已知的技术实现肝素衍生物的进一步纯化。例如，这样的过程可以包括色谱技术、过滤、杂质的螯合(sequestration)、离心和/或干燥过程。
使不需要的结构修饰最小化
本发明第一方面中定义的方法需要控制步骤(i)结束和步骤(iv)开始之间的一段时间，以使残余氧化剂的作用最小化。
如本文所讨论，残余的氧化物质可以存在于本发明第一方面中定义的方法的步骤(i)获得的溶液中，然后在步骤(iv)中通过加入还原剂淬灭所述物质。特别地，已经发现，这些氧化物质的存在导致了肝素衍生物的非特异性解聚，即通过碱性β消除实现的那些(即在步骤(iii)中)之外的解聚，这种解聚导致了肝素衍生物中不需要的结构修饰。
因此，本发明第一方面中定义的方法可能需要控制步骤(i)结束和步骤(iv)开始之间的一段时间，以使残余氧化剂的作用最小化，并使肝素衍生物中产生的不需要的结构修饰的水平最小化。
特别地，对控制步骤(i)结束和步骤(iv)开始之间的一段时间的引用可以指控制所述的一段时间，以使肝素衍生物中存在的不需要的结构修饰最小化，所述结构修饰以肝素衍生物1HNMR谱的5.0ppm至6.5ppm区域(特别地，在5.95ppm和6.15ppm)中的信号为特征。
在特别的实施方案中，提供制备肝素衍生物的方法，所述肝素衍生物在相应的1HNMR谱的5.0ppm至6.5ppm区域中具有信号，所述信号相对于未分级肝素1HNMR谱在5.42ppm的信号具有≤约4％(例如≤约3％)的强度(比例％)。
在更特别的实施方案中，提供制备肝素衍生物的方法，所述肝素衍生物在相应的1HNMR谱中在5.95ppm和6.15ppm具有信号，所述信号每个相对于未分级肝素1HNMR谱在5.42ppm的信号具有≤约4％(例如≤约3％)的强度(比例％)。
在特别的实施方案中，本发明第一方面中定义的方法包括使步骤(i)结束和步骤(iii)开始之间的一段时间最小化。
本领域技术人员将理解，为了使肝素衍生物中不需要的结构修饰的水平最小化，能接受的步骤(i)结束和步骤(iii)开始之间的一段时间的最大值将取决于某些因素，例如在这段时间中溶液的温度，以及溶液中反应物(如肝素及其得到的衍生物)的浓度。
在更特别的实施方案中，步骤(i)结束和步骤(iii)开始之间的一段时间最大为6小时(例如约2至约6小时的一段时间)。
药物组合物
如本文所讨论，使用本发明第一方面中定义的方法制备的肝素衍生物可用于医学。特别地，含有这些衍生物的药物组合物可以使用获得自本发明第一方面的方法的肝素衍生物来制备，该组合物可用于施用患者以减少滞产。
因此，在本发明的第二方面中，提供用于制备药物组合物的方法(即包含如本发明第一方面所定义制备的肝素衍生物的药物组合物)，其包括以下步骤：
(a)使用如本发明第一方面中定义的方法制备肝素衍生物；以及
(b)将获得自步骤(a)的肝素衍生物与一种或更多种药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂组合。
在特别的实施方案中，可以以小瓶、预填充注射器、静脉内(IV)溶液或用于皮下注射的制剂的形式，提供本发明第二方面中定义的药物组合物。
本发明第一方面中定义的方法可能具有的优点是，其提供具有低抗凝血活性的低分子量肝素衍生物，由于在工艺步骤间保留的残余氧化物质的作用导致，该衍生物具有低程度的不需要的结构修饰。这是通过控制工艺步骤以确保在氧化步骤结束之后在尽可能短的时间内采用还原条件而实现的。
本发明第一方面中定义的方法还可能具有的优点是，由于残余氧化剂已被去除，所得的肝素衍生物的分子量是更加可预测的。这是因为已经发现，残余氧化物质(即氧化步骤结束后得到的残余于肝素衍生物中的氧化物质，所述氧化步骤在本文中称为步骤(i))的存在导致肝素衍生物的非特异性解聚，即通过碱性β消除实现的那些(即在本文中称为步骤(ii))之外的解聚。
本发明第一方面中定义的方法还可能具有的优点是，通过分析解聚步骤(即在本文中称为步骤(ii))中的溶液，或者参考对之前已进行的基本上相同的解聚过程的分析，本领域技术人员可以实现对肝素衍生物分子量的更好的控制，无须顾及起始材料的变化(例如当使用不同批次的未分级肝素时)。
附图说明
图1显示了在本文提供的实施例2a中，随着时间推移所获得的解聚肝素的分子量的图表。
具体实施方式
实施例
可以通过以下实施例进一步阐明本发明。
实施例1
可以使用以下一般方法进行如本文所描述的方法。
葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的去除(deletion)
将约3000克肝素(欧洲药典和美国药典(USP)质量的粘膜肝素)溶解于纯化水中，以获得10-20％w/v的溶液。将该溶液的pH调节至4.5-5.5。然后，将偏高碘酸钠(NaIO4)加入至生产溶液(processsolution)中，高碘酸盐的量为肝素重量的15-30％(目标25％)。将pH再次调节至4.5-5.5。将反应器避光。维持13-17℃(例如约15℃)的温度，在连续搅拌下，使生产溶液反应18-26小时，在最后的两个小时中将温度降至5℃。
通过碱性β消除过程的多糖链的解聚
当温度维持在5-10℃时，加入NaOH溶液直至获得10.5-11.5的pH。从而引发解聚反应，由于中和了OH-离子，所述解聚反应导致pH的缓慢降低。因此，通过加入NaOH或Na2CO3溶液，将pH小心地提高并严格控制在10.5-11.5的范围内。与此同时，启动过程中控制(in-processcontrol)，以通过反复的GPC-HPLC分析跟踪解聚的程度。反应进行长达4小时，或者进行至获得最佳分子量时。优选5.7-6.3kDa的目标分子量范围。可以使用表(参见实施例2)或图表(参见图1)，以预测获得优选分子量范围所需要的反应时间。
通过缓慢加入4MHCl终止反应直至获得5.5-6.5的pH。
通过用TSK2000和TSK3000SW串联柱进行的GPC-HPLC测定分子量，使用LMWH第一国际标准(1stinternationalstandardforLMWH)校准。使用折射率监测洗脱液的浓度。
碘化合物还原至碘化物和碘，通过将多糖的末端醛基转化为相应的醇将产物 稳定化
当温度维持在5-17℃时，然后分批加入130-200克的硼氢化钠，这是为了避免放热反应引起的过热，pH将升高到9(例如10)至11。反应继续进行14-20小时。这段反应时间之后，缓慢加入稀酸以调节pH值至4，这使得残余的硼氢化钠降解。在维持pH4持续45-60分钟之后，用稀NaOH溶液将溶液的pH调节至7。
还原的产物的沉淀和含碘化合物的初步去除
在5-25℃的温度，在小心搅拌下，将乙醇(95-99.5％)经过0.5-1小时加入至反应混合物中。添加的乙醇的体积在1-2体积乙醇/生产溶液体积的范围内。然后使氧化的肝素沉淀并沉积(sediment)15-20小时，然后将母液倒出并弃去。然后，将沉积物溶解于纯化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/L的浓度。
产物的纯化
然后，将一体积的生产溶液加入至1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)中，随后在<20℃，以>2000G离心20-30分钟，之后将上清液倒出并弃去。
然后，将离心获得的糊状产物溶解于纯化水中以获得10-20％w/v的产物浓度。然后加入NaCl以获得0.20-0.35mol/升的浓度。进一步，每体积生产溶液中加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)，其从溶液中沉淀出产物。随后在<20℃，以>2000G离心20-30分钟，之后将上清液倒出并弃去。
然后，向残余的糊状物中加入纯化水以溶解。现在的产物浓度在10-20％w/v的范围内。现将产物溶液的pH调节至6.5-7.5。然后将溶液过滤以去除任何微粒。然后，向一体积的生产溶液中加入1.5-2.5体积的乙醇(95-99.5％)。随后在<20℃，以>2000G离心20-30分钟，然后将上清液倒出并弃去。
沉淀糊状物的尺寸和含水量的降低
然后，向反应器中装入2升体积的乙醇。在搅拌乙醇的同时，加入沉淀糊状物。机械搅拌使糊状物固化，并用乙醇替换存在的水，得到均匀的颗粒混悬液。在1-2小时后停止搅拌，之后使颗粒沉积，然后将母液倒出。这个过程重复两次。在聚丙烯(PP)滤布上分离沉淀。这个过程重复两次。去除过量的液体后，将颗粒过筛以获得较小的且尺寸均匀的颗粒。
真空干燥和筛分
将产物均匀分装到两个预先称重的托盘上，并置于真空箱中。用真空泵减压，记录实际达到的压力，并将托盘加热至35-40℃，持续记录温度。此时，在维持干燥器内低压的同时，使氮气流通过干燥器。2-3天后，从干燥箱中移出托盘并称量其重量。然后，干燥继续进行额外的24小时，此后取出托盘并称重。进行这个过程以监测干燥的进展。当获得稳定的重量时，即没有发现进一步的挥发，视为干燥完成。将干燥产物分装入覆盖有层压塑料/铝箔的双层塑料袋中。在20-25℃的温度，在干燥的地方进行储存。
实施例2
在以下一般条件，使用两个不同批次的未分级肝素(在本文中称为批次A和批次B)，在三组条件(实施例2a、2b和2c)下进行方法。
葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸(残基)的氧化，抗凝血活性的去除
将约25克肝素溶解于纯化水中以获得15％w/v的溶液。然后，将6.25克偏高碘酸钠(NaIO4)加入至生产溶液中，并将pH调节至4.9-5.0。将反应器避光。维持15℃的温度，在连续搅拌下，使生产溶液反应22小时，之后在最后的两个小时中将温度降至5℃。总反应时间为24小时。
通过碱性β消除过程的多糖链的解聚
将温度维持在5-10℃的同时，加入NaOH溶液直至获得11-11.5的pH。在250分钟之内，连续监测pH并将其调节至实施例2a、2b和2c(如下)所指示的pH。通过缓慢加入4MHCl终止反应直至获得5.5-6.5的pH。调节pH所需要的时间大约为15分钟。
在反应期间，在指定的时间点采集十一个样品。立即用15mM磷酸盐缓冲液稀释样品，并调节pH至7以终止正在进行的反应。如下所讨论，然后使样品接受通过GPC-HPLC进行的分子量分析。为每种方法创建表格(见下文)。通过用TSK2000和TSK3000SW串联柱进行的GPC-HPLC测定分子量，使用LMWH第一国际标准校准(如本文所讨论)。使用折射率监测洗脱液的浓度。
还原碘化合物至碘化物和碘，通过将多糖的末端醛基转化为相应的醇将产物 稳定化
维持温度在5-15℃的同时，然后在30分钟内分批加入1.75克的硼氢化钠，这是为了避免放热反应引起的过热，pH将升高至10。在硼氢化钠加入完成之后，从溶液中取样，并分析分子量。结果证实，分子量保持不变。反应继续进行20小时。这段反应时间之后，加入稀酸直至获得4-4.5的pH，这使得残余的硼氢化钠降解。注意到氢气泡的形成，这证实了最初加入的NaBH4已经超出所需的量。在维持pH4持续45-60分钟之后，用稀NaOH溶液将溶液的pH调节至7。
还原的产物的沉淀和含碘化合物的初步去除
在5-25℃的温度，在小心搅拌下，将乙醇(95-99.5％)经过0.5-1小时加入至反应混合物中。加入的乙醇的体积为1.5体积乙醇/生产溶液体积。产物从溶液中沉淀，并以约5000G离心20分钟将其分离。然后将母液倒出。之后，将糊状产物溶解于纯化水中以获得15-30％w/v的生产溶液。加入NaCl以获得生产溶液中0.15-0.30mol/升的浓度。然后，加入乙醇，2体积乙醇/生产溶液体积。产物从溶液中沉淀，并以约>2000G离心20分钟将其分离。再次将母液倒出。
然后，向残余的糊状物中加入纯化水以溶解。现在的产物浓度在15-30％w/v的范围内。将产物溶液的pH调节至6.5-7.5，然后将溶液过滤以去除任何微粒。然后，向一体积的生产溶液中加入2体积的乙醇(95-99.5％)。随后在<20℃，以>2000G离心20-30分钟，之后将上清液倒出并弃去。然后，通过重复两次加入和倒出乙醇并手工研磨糊状物，使糊状物脱水。
真空干燥和研磨
然后，将脱水的糊状物转移到连接至真空干燥器的玻璃烧瓶中。之后在38-40℃的温度真空干燥。在约48小时的干燥后终止干燥。然后进行研磨，之后将最终产物分装于密封玻璃小瓶中。
解聚步骤的分析
通过用TSK2000和TSK3000SW串联柱进行的GPC-HPLC分析解聚步骤的进展，使用LMWH第一国际标准校准(使用如本文所描述的技术)。使用折射率监测洗脱液的浓度。
下面实施例2a至2c各自中提供的表格显示了在各自的反应条件下，获得特定的平均分子量所用的时间。实施例2a列出的时间还显示于作为图1提供的图表中。
实施例2a
使用批次A的肝素，实施例2a于11的pH在解聚反应中反应。
样品 Mw(kDa) 时间(min)
1 12.6 0
2 8.5 15
3 7.7 30
4 7.3 45
5 7.0 60
6 6.8 73
7 6.7 84
8 6.2 127
9 6.1 152
10 5.9 210
11 5.8 248
实施例2b
使用批次A的肝素，实施例2b于11.5的pH在解聚反应中反应。
实施例2c
使用批次B的肝素，实施例2c于11的pH在解聚反应中反应。
样品 Mw(kDa) 时间(min)
1 10.4 0
2 8.5 15
3 7.6 30
4 6.6 45
5 6.8 59
6 6.7 69
7 6.5 83
8 5.9 131
9 6.0 152
10 5.7 210
11 5.6 248
实施例3
下表显示了使用实施例2中所列的过程获得的肝素衍生物的1HNMR分析结果，遵循如欧洲药典中所列的欧洲药品与卫生保健质量管理局(EuropeanDirectoratefortheQualityofMedicines&Healthcare,EDQM)，专论7。
实施例4
可以通过常规的无菌工艺将根据本文提供的任何一个实施例的方法获得的产物制成药物组合物。
特别地，可以通过形成具有6-8的pH，含有150mg/mL的活性产物和15mM磷酸钠的溶液制备药物组合物。这样获得的药物产品主要旨在用于皮下施用，但也适用于静脉内施用。

Claims (21)

1.一种用于制备具有约4.6至约6.9kDa的平均分子量和小于约10IU/mg的抗因子Xa活性的肝素衍生物的方法，其包括以下连续步骤：
(i)通过加入氧化剂氧化未分级肝素的酸性水溶液；
(ii)通过使步骤(i)的产物与碱形成碱性溶液解聚氧化的肝素；
(iii)将来自步骤(ii)的所述溶液维持在碱性pH中持续所需要的一段时间以提供具有上述范围内的分子量的解聚的肝素；以及
(iv)通过将氢化物还原剂加入至获得自步骤(iii)的溶液中还原所述解聚的肝素的末端醛基，
其中控制步骤(i)结束和步骤(iv)开始之间的一段时间以使残余氧化剂的作用最小化；以及
其中通过分析所述溶液，或者参考之前进行的基本上相同的步骤(iii)，确定步骤(iii)中所述的一段时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中肝素衍生物具有
-如下式I所示的主要出现的二糖，
其中
并且n为2至20的整数；以及
-在1HNMR谱5.0ppm至6.5ppm区域中的信号，所述信号相对于未分级肝素1HNMR谱在5.42ppm的信号具有小于或等于约4％的强度(比例％)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在肝素衍生物中，多糖链具有2至20(式I中的n)个二糖单元，对应于1.2和12kDa之间的分子量。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在肝素衍生物中，至少70％的分子具有大于约3kDa的分子量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肝素衍生物包含具有如表1所示的累积分子量分布的多糖：
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在肝素衍生物中，在约5.95ppm和约6.15ppm存在信号。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肝素衍生物进一步具有小于10IU/mg的抗因子IIa活性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肝素衍生物具有小于5IU/mg的抗因子Xa活性和/或小于5IU/mg的抗因子IIa活性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在肝素衍生物中，存在于肝素衍生物中的多糖链基本上不含调节抗凝血作用的化学完整的糖序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在肝素衍生物中，在起始的未分级肝素材料中至少约90％的非硫酸化的邻二醇部分已被转化。
11.根据权利要求10所述的方法，其中非硫酸化的邻二醇部分包含肝素的艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸的残基。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)中使用的氧化剂为偏高碘酸钠。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)需要在约4.5至约5.5的pH并在降低的温度，通过加入偏高碘酸钠氧化未分级肝素的水溶液。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(ii)需要通过使步骤(i)的产物与碱形成具有约8至约13的pH的溶液解聚氧化的肝素。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iii)需要将来自步骤(ii)的所述溶液维持在碱性pH中持续所需要的一段时间以提供具有权利要求1或2中定义的范围内的分子量的解聚的肝素。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(iiia)使获得自步骤(iii)的溶液与酸形成具有约5.5至约6.5的pH的溶液。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中使用的还原剂为硼氢化钠。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(iva)通过降低pH以形成酸性溶液淬灭还原反应；以及，任选地，
(ivb)将来自步骤(iva)的溶液的pH调节至约中性。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
(v)从获得自步骤(iv)(或者，如适用，步骤(iva)或(ivb))的溶液中回收肝素衍生物。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(i)结束和步骤(iii)开始之间的一段时间最大为6小时。
21.一种用于制备包含如权利要求1至11中任一项所定义的肝素衍生物的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用如权利要求1至20中任一项所述的方法制备肝素衍生物；以及
(b)将获得自步骤(a)的肝素衍生物与一种或更多种药学上可接受的佐剂、赋形剂或稀释剂组合。
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