ES2646337T3 - Nuevos procedimientos de producción de heparinas químicamente modificadas - Google Patents

Nuevos procedimientos de producción de heparinas químicamente modificadas Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de preparación de un derivado de heparina que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,9 kDa y una actividad anti-factor Xa inferior a aproximadamente 10 UI/mg, y en el que el derivado de heparina tiene un disacárido que se produce predominantemente tal como se muestra en la fórmula I siguiente**Fórmula** en la que**Fórmula** y n es un número entero de 2 a 20, correspondiente a pesos moleculares entre 1,2 y 12 kDa, y en el que el derivado de heparina tiene señales en la región de 5,0 ppm a 6,5 ppm de un espectro de RMN 1H con una intensidad (proporción en %) inferior o igual a aproximadamente un 4 % relativa a la señal a 5,42 ppm del espectro de RMN 1H de la heparina no fraccionada, que comprende las etapas consecutivas de: (i) oxidar una solución acuosa ácida de heparina no fraccionada mediante la adición de un agente oxidante; (ii) despolimerizar la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un álcali para formar una solución alcalina; (iii) mantener dicha solución de la etapa (ii) a un pH alcalino durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada con un peso molecular dentro del intervalo anteriormente mencionado; y (iv) reducir los grupos terminales aldehído de dicha heparina despolimerizada mediante la adición de un agente reductor de hidruro a la solución obtenida en la etapa (iii); en el que el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) está controlado a fin de minimizar el efecto de los agentes oxidantes residuales; y en el que dicho periodo de tiempo de la etapa (iii) se determina mediante análisis de dicha solución o por referencia a una etapa (iii) sustancialmente idéntica llevada a cabo previamente.

Description

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DESCRIPCION
Nuevos procedimientos de produccion de heparinas qmmicamente modificadas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a nuevos procedimientos. En particular, se refiere a nuevos procedimientos para la preparacion de glucosaminoglucanos qmmicamente modificados, tales como heparina qmmicamente modificada.
Antecedentes
El listado o discusion de un documento publicado aparentemente con anterioridad en esta memoria descriptiva no debe tomarse necesariamente como el reconocimiento de que el documento es parte del estado de la tecnica o del conocimiento comun general.
La heparina es un polisacarido natural polidisperso que inhibe la coagulacion, el proceso a traves del cual se produce la trombosis. La heparina consiste en cadenas de polisacarido no ramificadas de longitudes y pesos moleculares diversos. Cadenas de peso molecular de 5000 hasta mas de 40 000 daltons constituyen la heparina de calidad farmaceutica.
La heparina, que proviene normalmente de fuentes naturales tales como tejido de intestino porcino o de pulmon bovino, se puede administrar terapeuticamente para la prevencion y el tratamiento de la trombosis. Sin embargo, los efectos de la heparina no fraccionada pueden ser difmiles de predecir. Por tanto, durante el tratamiento de la trombosis con heparina no fraccionada, se deben controlar muy de cerca los parametros de coagulacion a fin de evitar una hipercoagulacion o una hipocoagulacion.
Numerosas marcas de heparinas y heparinas de bajo peso molecular (LMWH), tales como dalteparina o enoxaparina, estan disponibles para los tratamientos que dependen de su actividad anticoagulante. Un gran numero de investigaciones experimentales in vitro y en animales, e incluso ensayos clmicos, indican que la heparina y sus derivados tienen otras propiedades beneficiosas distintas a las relacionadas con su efecto anticoagulante. Sin embargo, las heparinas y las LMWH existentes no son adecuadas para el tratamiento de otras afecciones medicas debido al riesgo de hemorragia asociado al efecto anticoagulante.
La LMWH dalteparina se ha demostrado que reduce el parto prolongado en mujeres que han recibido profilaxis para la trombosis venosa profunda. El mecanismo se cree que implica el aumento de los niveles de interleucinas inducido por la dalteparina lo que da como resultado una reaccion inflamatoria favorable que promueve la maduracion del cuello del utero. Asimismo, se ha demostrado que la dalteparina aumenta la contractilidad del utero (Acta Obstefricia et Gynecologica, 2010; 89:147-150). No obstante, la heparina y las LMWH no son adecuadas para prevenir o tratar tales enfermedades por una serie de razones.
En primer lugar, la heparina y las LMWH tienen efectos anticoagulantes significativos bien conocidos que limitan su uso al final del embarazo y durante el parto, tanto para uso profilactico como agudo, debido al riesgo de hemorragia. Por ejemplo, el uso de dalteparina esta estrictamente contraindicado cuando se administra anestesia epidural, una medida que se toma con frecuencia durante el nacimiento del nino.
En segundo lugar, la heparina, y hasta cierto grado las LMWH, se han asociado a la trombocitopenia inducida por heparina, una reaccion farmacologica grave mediada por el sistema inmunitario que se puede producir en cualquier paciente expuesto a la heparina. Es una enfermedad protrombotica potencialmente devastadora causada por anticuerpos dependientes de heparina que se desarrolla despues de que un paciente haya sido expuesto a la heparina durante cinco o mas dfas, o si el paciente ha tenido una exposicion previa a la heparina.
Otro posible efecto indeseable del tratamiento a largo plazo con heparina es que puede inducir la desmineralizacion de los huesos y causar osteoporosis.
Se han realizado muchos intentos para erradicar o reducir la actividad anticoagulante de heparinas o de heparinas de bajo peso molecular a fin de proporcionar heparinas con baja actividad anticoagulante (LAH) que estan dirigidos a obtener beneficios de otros potenciales efectos clmicos de las cadenas de heparina distintos del efecto anticoagulante, sin conllevar el riesgo de efectos indeseados asociados a la heparina, principalmente hemorragias. Sin embargo, hay una limitada experiencia clmica de este tipo de heparinas y hasta el momento tales productos no han sido autorizados para uso clmico.
La heparina ejerce su actividad anticoagulante principalmente a traves de las uniones de alta afinidad al inhibidor de la serina proteinasa, la antitrombina (AT), y la activacion del mismo. La AT, un importante inhibidor fisiologico de la coagulacion sangumea, neutraliza los factores de coagulacion activados formando un complejo estable con estos factores. La union de un pentasacarido espedfico con las cadenas de polisacarido de la heparina produce un cambio conformacional en la AT que potencia de forma espectacular la tasa de inhibicion de los factores de coagulacion, atenuando asf la coagulacion sangumea y la formacion de coagulos de sangre.
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La solicitud de patente europea EP 1 059 304 desvela una heparina oxidada o degradada enzimaticamente que da como resultado un producto con una baja actividad anticoagulante, que tiene un peso molecular promedio de 9 a 13 kDa, y que se sugiere para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. La patente de Estados Unidos US 4 990 502 demuestra una forma para tratar la heparina nativa a fin de escindir los restos pentasacarido responsables del efecto anticoagulante y una despolimerizacion posterior que da como resultado una heparina de bajo peso molecular y de baja actividad anticoagulante con un peso molecular promedio de 5,8 a 7,0 kDa. No obstante, en el documento US 4 990 502 se usan procedimientos que requieren mucho tiempo, tal como una dialisis durante aproximadamente 15 horas, para finalizar el proceso de oxidacion. Tales procedimientos pueden influir en la distribucion de pesos moleculares del producto final y dar lugar a variantes estructurales desfavorables, como puede observarse mediante RMN 1H.
El control del peso molecular y de la longitud de las cadenas de polisacarido es crucial para obtener el efecto biologico deseado del compuesto. La biodisponibilidad de heparinas de cadena larga tras su dosificacion subcutanea es baja y la posibilidad de induccion de una trombocitopenia inducida por heparina (HIT) esta tambien correlacionada positivamente con las longitudes de cadena. Para reducir estas propiedades clmicamente indeseadas el derivado de heparina no ha ser de longitud completa. Se pueden obtener cadenas de heparina de determinado peso molecular mediante fraccionamiento de la heparina convencional. Sin embargo, la produccion de derivados de heparina de peso molecular intermedio o bajo mediante procedimientos de fraccionamiento tales como filtracion en gel, precipitacion con alcohol y cromatograffa de intercambio ionico, esta asociada a un desperdicio significativo de materia prima, ya que se desechan heparinas de elevado peso molecular.
Tal como se divulga en el presente documento, se pueden preparar derivados de heparina con baja actividad anticoagulante usando un procedimiento que comprende las etapas de oxidacion de heparina no fraccionada, despolimerizacion y reduccion de los grupos terminales resultantes, siendo estos derivados utiles para reducir la duracion del parto prolongado.
En particular, los presentes autores han descubierto de forma inesperada que se pueden minimizar los niveles de modificaciones estructurales no deseadas que se producen durante la preparacion de derivados de heparina usando tales procedimientos mediante el control del tiempo transcurrido entre las etapas de oxidacion y de reduccion. Asimismo, los presentes autores han descubierto que el peso molecular promedio del derivado de heparina resultante se puede controlar mediante la monitorizacion del progreso de la etapa de despolimerizacion (o por referencia a un procedimiento llevado a cabo previamente) y el ajuste correspondiente de la duracion de la etapa de despolimerizacion.
La solicitud internacional (PCT) con numero PCT/SE2012/051433 (publicada como WO 2013/095279) desvela un procedimiento para la preparacion de derivados de heparina no fraccionada que comprende oxidacion, despolimerizacion y reduccion de grupos terminales, derivados que tienen una baja actividad anticoagulante y que son utiles para reducir la duracion del parto prolongado. Sin embargo, esta solicitud internacional no se refiere a la monitorizacion del progreso de la etapa de despolimerizacion a fin de controlar el peso molecular promedio del derivado de heparina resultante.
Descripcion de la invencion
En un primer aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para la preparacion de un derivado de heparina que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,9 kDa y que tiene una actividad anti-factor Xa inferior a aproximadamente 10 Ul/mg, que comprende las etapas consecutivas de:
(i) oxidar una solucion acuosa acida de heparina no fraccionada mediante la adicion de un agente oxidante;
(ii) despolimerizar la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un alcali para formar una solucion alcalina;
(iii) mantener dicha solucion de la etapa (ii) a un pH alcalino durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada con un peso molecular dentro del intervalo anteriormente mencionado; y
(iv) reducir los grupos terminales aldehudo de dicha heparina despolimerizada mediante la adicion de un agente reductor de hidruro a la solucion obtenida en la etapa (iii);
en el que el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) esta controlado a fin de minimizar el efecto de los agentes oxidantes residuales; y
en el que dicho periodo de tiempo de la etapa (iii) se determina mediante analisis de dicha solucion o por referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica llevada a cabo previamente.
El experto en la materia comprendera que cualquier realizacion de la invencion tal como se describe en el presente documento se puede combinar con una o mas de otras realizaciones a fin de proporcionar una realizacion adicional de la invencion. Todas estas combinaciones de realizaciones descritas en el presente documento se contemplan espedficamente. Asf pues, las referencias a cualquier aspecto de la invencion incluiran las referencias a cualquier realizacion, o combinacion de realizaciones, de la misma.
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Tal como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" puede referirse a un valor que esta a un 10% (particularmente a un 5%, tal como a un 1 %) del valor especificado. Cada vez que estan presentes, las realizaciones de la invencion incluyen aquellas en la que el termino "aproximadamente" se ha eliminado.
El experto en la materia comprendera que la referencia a las etapas que son "consecutivas" indica que estas se llevan a cabo secuencialmente en el orden mostrado. En una realizacion particular, las etapas se pueden llevar a cabo en una secuencia directa, por ejemplo sin etapas intermedias. Por tanto, en una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion se puede referir a que "consiste en" las etapas consecutivas tal como se ha hecho referencia en el primer aspecto de la invencion (o cualquier realizacion, o combinacion de realizaciones, de la misma).
En una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion se puede llevar a cabo en un unico vaso de reaccion (un procedimiento denominado "en un solo recipiente").
El derivado de heparina
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion permite la produccion de un derivado de heparina que tiene un peso molecular promedio (Mw) de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,9 kDa y una actividad antifactor Xa inferior a aproximadamente 10 Ul/mg, usando las actuales normas internacionales para heparinas de bajo peso molecular.
Para despejar cualquier duda, el experto en la materia comprendera que el termino "peso molecular promedio", tal como se hace referencia en el presente documento, se refiere al peso molecular promedio en peso.
El peso molecular promedio del derivado de heparina se puede determinar usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, el peso molecular promedio se puede determinar mediante analisis de una muestra del derivado de heparina obtenido mediante el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion usando cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC), tal como cromatograffa HPLC de permeacion en gel (GPC- HPLC).
En particular, el analisis del peso molecular se puede realizar de acuerdo con el procedimiento de la Farmacopea Europea para la cromatograffa de permeacion en gel de heparina de bajo peso molecular (monograffa 0828), modificado por Mulloy y col. ("Molecular Weight Measurements of Low Molecular Weight Heparins by Gel Permeation Chromatography", Thrombos. Haemostas. 77, 1997, 668-674), en el que el sistema cromatografico se calibra utilizando la norma internacional sobre peso molecular para heparina de bajo peso molecular.
En una realizacion particular, el derivado de heparina preparado mediante el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 kDa (tal como de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 5,9 kDa, por ejemplo, de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 5,8 kDa o, de modo alternativo, de aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,3 kDa).
Derivados de heparina particulares preparados mediante el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion incluyen aquellos que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 5,8 kDa aproximadamente 5,6 kDa o aproximadamente 5,3 kDa.
En una realizacion particular, el derivado de heparina preparado mediante el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende polisacaridos con una distribucion de pesos moleculares acumulados tal como se indica en la siguiente tabla 1.
Tabla 1
Peso molecular, kDa
Peso acumulado, %
> 10
4-15
> 8
10-25
> 6
22-45
> 3
> 70
En una realizacion particular, el derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede consistir en moleculas al menos un 70 % de las cuales tiene un peso molecular superior a aproximadamente 3 kDa.
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion permite la produccion de derivados de heparina que tienen propiedades de baja actividad anticoagulante.
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El experto en la materia comprendera que la actividad anticoagulante de la heparina y similares proviene de la union de alta afinidad al inhibidor de la serina proteinasa, la antitrombina (AT), y la activacion del mismo. La AT activada actua a su vez formando complejos estables con varios factores de coagulacion y neutralizando, por tanto, su efecto. Asf pues, es posible cuantificar las propiedades anticoagulantes determinando la actividad de estos factores de coagulacion.
El experto en la materia comprendera que la actividad anticoagulante del derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion se puede medir determinando la actividad de los factores de coagulacion Xa y Ila.
En una realizacion particular, el derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion tiene una actividad anti-factor Xa y anti-factor IIa inferior a 10 Ul/mg.
En una realizacion mas particular, el derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener una actividad anti-factor Xa inferior a 5 Ul/mg y/o una actividad anti-factor Ila inferior a 5 Ul/mg. Por ejemplo, el derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener una actividad anti-factor Xa inferior a 5 Ul/mg y una actividad anti-factor Ila inferior a 5 Ul/mg.
En una realizacion mas particular, el derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener una actividad anti-factor Xa inferior a 1 Ul/mg y/o una actividad anti-factor lla inferior a 1 Ul/mg.
La determinacion de la actividad anticoagulante anti-factor lla y anti-factor Xa se puede realizar de acuerdo con el procedimiento de la Farmacopea Europea para la heparina de bajo peso molecular (monograffa 0828), en la que la norma internacional sobre actividad para heparina de bajo peso molecular se usa para calibrar el sistema.
En una realizacion particular, los derivados de heparina producidos usando el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion pueden tener una actividad anticoagulante no detectable, tal como se mide mediante procedimientos analfticos conocidos en la tecnica.
El experto en la materia apreciara que el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion permite que los restos presentes en una heparina no fraccionada sea oxidados, despolimerizados y reducidos, lo que, a su vez, proporciona un derivado de heparina que consiste en restos modificados y que tiene un bajo peso molecular.
En una realizacion particular, las cadenas de polisacarido presentes en el derivado de heparina carecen esencialmente de secuencias sacarido qmmicamente intactas que participan en el efecto anticoagulante (por ejemplo, < un 1 % de las cadenas de polisacarido presentes en el derivado de heparina comprende dichas secuencias sacarido qmmicamente intactas, tal como se puede detectar mediante RMN).
En una realizacion adicional, el disacarido que se produce predominantemente en el derivado de heparina es como el mostrado en la formula l a continuacion
en la que
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y n es un numero entero de 2 a 20.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "que se produce predominantemente" puede entenderse que se refiere a la caractenstica respectiva que se produce en la mayona (es decir, superior a un 50 %, por ejemplo superior a un 60 % o, particularmente, superior a un 80 %) de los casos.
En una realizacion adicional, las cadenas de polisacarido tienen de 2 a 20 (n en la formula I) unidades de disacarido correspondientes a pesos moleculares entre 1,2 y 12 kDa.
El experto en la materia comprendera tambien que el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion permite la produccion de un derivado de heparina en el que se conservan los grupos sulfato presentes en la heparina no fraccionada.
En una realizacion particular, se proporciona un procedimiento para la preparacion de un derivado de heparina en el que al menos aproximadamente un 70 % (tal como al menos aproximadamente un 80 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 90 %) de los grupos sulfatos estan presentes.
Tal como se describe en el presente documento, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion permite la produccion de un derivado de heparina que tiene un bajo nivel de modificaciones estructurales no deseadas, modificaciones estructurales que resultan de la accion de agentes oxidantes residuales. Tal como se usa en el presente documento, el termino "agentes oxidantes residuales" puede referirse a una o mas especies presentes en el procedimiento tras el final de la etapa (i) que son capaces de oxidar adicionalmente el derivado de heparina obtenido en esa etapa.
La presencia de estas especies se ha descubierto que lleva a modificaciones estructurales no deseadas en el derivado de heparina. En particular, estas modificaciones estructurales no deseadas se ha descubierto que resultan de una despolimerizacion no espedfica del derivado de heparina, es decir, una despolimerizacion distinta a la mediada por una beta eliminacion alcalina (es decir, en la etapa (ii) tal como se ha definido en el presente documento).
Tales procedimientos de despolimerizacion no espedfica pueden llevar a la formacion de un derivado de heparina que tiene una falta de predictibilidad en cuanto a su peso molecular y una baja estabilidad, y puede llevar a una descoloracion (que puede aumentar durante el almacenamiento).
En particular, las modificaciones estructurales no deseadas a las que se hace referencia en el presente documento pueden estar caracterizadas por la presencia de restos de heparina qmmicamente modificados no identificados. Por ejemplo, estos restos de heparina qmmicamente modificados no identificados pueden estar caracterizados por senales en la region de 5,0 ppm a 6,5 ppm del espectro de RMN 1H del derivado de heparina. Mas en particular, tales restos de heparina qmmicamente modificados no identificados pueden estar caracterizados por la presencia de un doble enlace en la posicion C4-C5 de una unidad de monosacarido del polisacarido, que se puede identificar por las senales en el espectro de RMN 1H del derivado de heparina a aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,5 ppm (es decir, a aproximadamente 5,95 ppm y aproximadamente 6,15 ppm).
En una realizacion particular, se proporciona un procedimiento para preparar un derivado de heparina que tiene senales en la region de 5,0 ppm a 6,5 ppm del espectro de RMN 1H correspondiente con una intensidad (proporcion en %) de < aproximadamente un 4 % (por ejemplo, < aproximadamente un 3 %, tal como < aproximadamente un 2,5 %) relativa a la senal a 5,42 ppm del espectro de RMN 1H de la heparina no fraccionada.
En una realizacion mas particular, se proporciona un procedimiento para preparar un derivado de heparina que tiene senales a 5,95 ppm y 6,15 ppm del espectro de RMN 1H correspondiente con una intensidad (proporcion en %) de < aproximadamente un 4 % (por ejemplo, < aproximadamente un 3 %, tal como < aproximadamente un 1 %) relativa a la senal a 5,42 ppm del espectro de RMN 1H de la heparina no fraccionada.
En una realizacion adicional, se proporciona un derivado de heparina (por ejemplo, tal como se ha definido con respecto al primer aspecto de la invencion) obtenible usando un procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion.
Oxidacion
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende la etapa de:
(i) oxidar una solucion acuosa acida de heparina no fraccionada mediante la adicion de un agente oxidante.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "solucion acuosa" se refiere a una solucion en agua. En particular, la referencia a una solucion acuosa de heparina no fraccionada puede referirse a una solucion en agua en la que al menos un 90 % (particularmente al menos un 95 %, tal como al menos un 99 %) de la heparina esta disuelta. Mas en particular, puede referirse a una solucion que contiene heparina no disuelta tal como se observa mediante inspeccion visual.
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Tal como se usa en el presente documento con respecto a la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion, la referencia a una solucion acuosa acida se ha de entender que significa una solucion que tiene un pH inferior a 7 (por ejemplo, inferior a aproximadamente 6). En particular, puede referirse a una solucion que tiene un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 6 (por ejemplo, de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 6, tal como de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5).
El experto en la materia comprendera que el pH de la solucion acuosa se puede ajustar antes o despues (por ejemplo, antes) de la adicion del agente oxidante.
En una realizacion particular, el pH de la solucion se mantiene hasta el final de la oxidacion (es decir, el final de la etapa (i) tal como se ha definido en el presente documento).
El experto en la materia comprendera que el pH de la solucion acuosa se puede ajustar y/o mantener mediante la adicion de un acido adecuado, tal como un acido fuerte adecuado (por ejemplo, un acido mineral u organico, tal como un acido mineral, que tiene un valor de pKa inferior a aproximadamente 5, tal como de aproximadamente 1 a aproximadamente 5).
En una realizacion particular, el pH de la solucion se puede ajustar y mantener a un valor de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5, tal como a aproximadamente 5.
En una realizacion particular, la concentracion de la heparina en solucion es de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 20 % (por ejemplo de aproximadamente un 15 %) en peso de heparina por volumen de agua.
El experto en la materia comprendera que la referencia a un agente oxidante pretende referirse a un agente que es capaz de oxidar la heparina no fraccionada. En particular, el experto en la materia comprendera que la referencia a un agente oxidante puede referirse a un agente capaz de una ruptura oxidativa de dioles vecinales en la heparina no fraccionada, es decir, para dar como resultado los correspondientes restos aldehfdo.
Para despejar cualquier duda, la referencia a la oxidacion de una solucion acuosa acida de heparina no fraccionada mediante la adicion de un agente oxidante (es decir, tal como se hace referencia en la etapa (i) definida en el presente documento) puede referirse a la oxidacion de una solucion acuosa acida de heparina no fraccionada mediante la adicion de un agente oxidante capaz de romper restos diol vecinales en la misma.
En una realizacion particular, el agente de oxidacion puede ser un peryodato (tal como metaperyodato sodico) o un permanganato (tal como permanganato potasico) adecuado. En una realizacion mas particular, el agente oxidante es metaperyodato sodico.
El experto en la materia comprendera que el agente oxidante, tal como metaperyodato sodico, se puede anadir a la solucion acuosa en una porcion, en etapas o de modo continuo. Asimismo, el agente oxidante se puede anadir en forma de un solido o de una solucion (por ejemplo, una solucion acuosa).
En una realizacion particular, la cantidad de agente oxidante, tal como metaperyodato sodico, anadida sera de aproximadamente un 15 a aproximadamente un 35 % en peso de la cantidad de heparina presente en la solucion (por ejemplo, de aproximadamente un 25 % en peso de la cantidad de heparina presente en la solucion).
En una realizacion particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede llevar a cabo a temperatura reducida.
Tal como se usa en el presente documento, el experto en la materia comprendera que la expresion "temperatura reducida" se refiere a una temperatura que es inferior a la temperatura ambiente, es decir, inferior a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, inferior a aproximadamente 20 °C). La temperatura inicial de la solucion se puede ajustar antes o inmediatamente despues de la adicion del agente oxidante.
En una realizacion particular, la temperatura de la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede reducir a aproximadamente 5 °C durante las dos ultimas horas de la reaccion.
En una realizacion mas particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede llevar a cabo a una temperatura inferior a la temperatura ambiente pero superior a aproximadamente 10 °C, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 13 °C a aproximadamente 17 °C.
En una realizacion mas particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 13 °C a aproximadamente 17 °C y despues se puede enfriar a una temperatura de aproximadamente 5 °C durante aproximadamente las dos ultimas horas de la reaccion.
En una realizacion particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede proteger de la luz.
En una realizacion particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se lleva a cabo con una duracion (es decir, durante un periodo de tiempo) suficiente para permitir la oxidacion completa de la heparina,
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periodo que puede ser de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 26 horas (por ejemplo, de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 24 horas).
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a conseguir la oxidacion completa puede referirse a obtener un derivado oxidado en el que al menos aproximadamente un 90 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 95 %, tal como al menos aproximadamente un 99 %) de los restos diol vecinales no sulfatados (por ejemplo, en los restos de acido iduronico y glucuronico de la heparina) se han convertido en los correspondientes aldehfdos, por ejemplo, tal como se determina mediante GPC-HPLC y RMN.
El experto en la materia comprendera que el progreso de la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede controlar ajustando la temperatura y la duracion de la reaccion.
El experto en la materia comprendera que el progreso de la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede seguir mediante analisis de muestras tomadas de la solucion, por ejemplo, usando GPC-HPLC, y el periodo de tiempo requerido con respecto a la etapa (i) ajustado acordemente. En particular, la etapa (i) del procedimiento del primer aspecto de la invencion se puede seguir y la duracion se puede ajustar a fin de minimizar la despolimerizacion (identificada por una reduccion del peso molecular promedio).
Asf, en una realizacion particular, la etapa (i) del procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion requiere oxidar dicha heparina mediante la adicion de metaperyodato sodico a la solucion obtenida en la etapa (i), y mantener despues la solucion resultante a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5, y opcionalmente a temperatura reducida, durante un periodo de aproximadamente 18 horas a aproximadamente 26 horas.
Asf, en una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende la etapa de:
(i) oxidar una solucion acuosa de heparina no fraccionada mediante la adicion de metaperyodato sodico, a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5 y a temperatura reducida.
Despolimerizacion
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende las etapas de:
(ii) despolimerizar la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un alcali para formar una solucion alcalina; y
(iii) mantener dicha solucion de la etapa (ii) a un pH alcalino durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada con un peso molecular dentro del intervalo mencionado anteriormente (es decir, tal como se define en el primer aspecto de la invencion),
en el que dicho periodo de tiempo de la etapa (iii) se determina mediante analisis de dicha solucion o por referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica llevada a cabo previamente.
El experto en la materia comprendera que en las etapas (ii) y (ii) del procedimiento, tal como se define en el primer aspecto de la invencion, la despolimerizacion de la heparina oxidada obtenida en la etapa (i) se consigue mediante beta eliminacion alcalina.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a las etapas (ii) y (iii) del procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion, la referencia a la formacion de una solucion alcalina se entendera que se refiere a ajustar el pH de la solucion de aproximadamente 8 a aproximadamente 13. En particular, es importante que el pH de la solucion se mantenga por debajo de aproximadamente 13.
El pH de la solucion se puede ajustar y/o mantener mediante la adicion de una base adecuada, por ejemplo, un hidroxido de metal alcalino (por ejemplo, hidroxido sodico) o un carbonato de metal alcalino (por ejemplo, carbonato sodico).
En una realizacion particular, el pH de la solucion se ajusta de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5, por ejemplo, mediante la adicion de un hidroxido de metal alcalino (tal como hidroxido sodico), que puede estar en forma de una solucion acuosa (por ejemplo, una solucion 1 a 4 molar).
El experto en la materia comprendera que el pH de la solucion se puede ajustar a temperatura reducida. En una realizacion particular, en la etapa (ii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion, el pH de la solucion se ajusta mientras que la solucion esta a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C.
El experto en la materia comprendera que el progreso de la reaccion de despolimerizacion se puede controlar ajustando la temperatura en la etapa (iii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion. Por ejemplo, la solucion se puede mantener a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 10 °C).
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El experto en la materia apreciara que el peso molecular promedio obtenido en la etapa de despolimerizacion determinara el peso molecular promedio del derivado de heparina producido por el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion. Asf, la solucion se mantiene al pH requerido (y, opcionalmente, a la temperatura requerida) durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada que tiene el peso molecular requerido dentro del intervalo mencionado anteriormente (es decir, de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,9 kDa).
El experto en la materia comprendera que el periodo de tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido dependera de las condiciones usadas en las etapas (ii) y (iii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion. En las condiciones descritas anteriormente, el periodo de tiempo sera normalmente un maximo de aproximadamente cuatro horas.
Tal como se refiere en el presente documento, el periodo de tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido se puede determinar mediante analisis de la solucion usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia. En particular, el peso molecular promedio del derivado de heparina despolimerizada se puede monitorizar tomando muestras de la mezcla de reaccion y analizando estas muestras mediante el uso de diversas tecnicas basadas en cromatograffa (tales como GPC- HPLC).
Asf, la referencia al periodo de tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido se puede referir al periodo de tiempo requerido para analizar la solucion a fin de confirmar que el derivado de heparina despolimerizada tiene el peso molecular requerido.
En una realizacion particular, el analisis de la solucion se lleva a cabo usando analisis de GPC-HPLC repetidos (por ejemplo a intervalos de aproximadamente 30 minutos). Tales analisis se pueden realizar usando tecnicas como las descritas en el presente documento, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento de la Farmacopea Europea para la cromatograffa de permeacion en gel de heparina de bajo peso molecular (monograffa 0828), modificado por Mulloy y col. ("Molecular Weight Measurements of Low Molecular Weight Heparins by Gel Permeation Chromatography", Thrombos. Haemostas. 77, 1997, 668-674), en el que el sistema cromatografico se calibra utilizando la norma internacional sobre peso molecular para heparina de bajo peso molecular.
De modo alternativo, el periodo de tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido se puede determinar por referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica llevada a cabo previamente.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica se entendera que se refiere a una etapa (es decir, una reaccion) del procedimiento llevada a cabo previamente correspondiente a la etapa (iii) del procedimiento de la invencion, etapa del procedimiento que se llevo a cabo usando reactivos sustancialmente identicos y en condiciones sustancialmente identicas a los de la etapa (iii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a las condiciones sustancialmente identicas se entendera que se refiere a condiciones (tales como pH, concentracion de los reactivos y temperatura) que estan dentro de una variacion del 10 % (por ejemplo una variacion del 5 %, tal como una variacion del 1 %) de las usadas en la presente etapa (iii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a los reactivos sustancialmente identicos incluira una referencia al uso de un derivado de heparina sustancialmente identico tal como se obtiene de las etapas (i) y (ii) del procedimiento del primer aspecto de la invencion.
El experto en la materia apreciara que la referencia a la etapa (iii) llevada a cabo previamente usando un derivado de heparina sustancialmente identico puede referirse a una etapa (iii) que se ha llevado a cabo siguiendo unas etapas (i) y (ii) sustancialmente identicas.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a unas etapas (i) y (ii) sustancialmente identicas se entendera de la misma manera que la referencia a la etapa (iii) sustancialmente identica.
En particular, la referencia a una etapa (i) sustancialmente identica se referira a una etapa (i) llevada a cabo previamente partiendo de una heparina no fraccionada sustancialmente identica.
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a una heparina no fraccionada sustancialmente identica puede referirse a una heparina no fraccionada obtenida del mismo proveedor que el de la heparina usada en el presente procedimiento del primer aspecto de la invencion. En particular, la referencia a una heparina no fraccionada sustancialmente identica puede referirse a una heparina no fraccionada extrafda del mismo lote que el de la heparina usada en el presente procedimiento del primer aspecto de la invencion.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a las etapas (i), (ii) y (iii) sustancialmente identicas, la referencia a los reactivos sustancialmente identicos incluira tambien una referencia al uso de agentes oxidantes y/o
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reductores que son qmmicamente los mismos, o funcionalmente equivalentes a los mismos, que los reactivos usados en el presente procedimiento del primer aspecto de la invencion.
El experto en la materia comprendera que el periodo de tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido se puede considerar que es aproximadamente el mismo, o aproximadamente el mismo que una extrapolacion de este, que el tiempo requerido para obtener un peso molecular promedio particular en la etapa (iii) sustancialmente identica a la que se hace referencia en el presente documento.
Una vez transcurrido el tiempo requerido para obtener un derivado de heparina despolimerizada que tiene el peso molecular promedio requerido, se puede finalizar la reaccion de despolimerizacion. En una realizacion particular, la reaccion de despolimerizacion se puede finalizar formando una solucion acida.
Asf, en una realizacion particular, el procedimiento del primer aspecto de la invencion comprende adicionalmente (es decir, entre las etapas (iii) y (iv)) la etapa de:
(iiia) someter la solucion obtenida en la etapa (iii) a un acido para formar una solucion acida.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a la etapa (iii) del procedimiento del primer aspecto de las invenciones (y con respecto a la realizacion del mismo referente a la etapa (iiia)), la referencia a formar una solucion acida se refiere a ajustar el pH a un valor inferior a 7 (tal como de aproximadamente 4 a aproximadamente 6,5, por ejemplo, de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5), mediante la adicion de un acido adecuado tal como se ha definido anteriormente en el presente documento (por ejemplo, HCl, tal como una solucion 4 molar de HCl).
Asf, en una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende las etapas de:
(ii) despolimerizar la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un alcali para formar una solucion que tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 13 (por ejemplo de aproximadamente 10,5 a aproximadamente 11,5); y
(iii) mantener dicha solucion de la etapa (ii) a un pH alcalino durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada con un peso molecular dentro del intervalo mencionado anteriormente (es decir, tal como se define en el primer aspecto de la invencion); y
(iiia) someter la solucion obtenida en la etapa (iii) a un acido para formar una solucion que tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5,
en el que dicho periodo de tiempo de la etapa (iii) se determina mediante analisis de dicha solucion, o por referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica.
Reduccion
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende la etapa de:
(iv) reducir los grupos terminales aldehndo de dicha heparina despolimerizada mediante la adicion de un agente reductor de hidruro a la solucion obtenida en la etapa (iii).
El experto en la materia comprendera que, en las realizaciones del procedimiento del primer aspecto de la invencion que incluyen la etapa (iiia), la etapa (iv) puede referirse a reducir grupos terminales aldehfdo de dicha heparina despolimerizada mediante la adicion de un agente reductor de hidruro a la solucion obtenida en la etapa (iiia).
El experto en la materia apreciara que los grupos terminales aldehfdo se forman como producto de la etapa de despolimerizacion previa, es decir, las etapas (ii) a (iii) (o etapas (ii) a (iiia), cuando sea apropiado).
La adicion del agente reductor de hidruro permite la reduccion de los grupos terminales aldehfdo para formar los correspondientes alcoholes primarios. La adicion del agente reductor de hidruro permite tambien la reduccion (y por tanto la neutralizacion) del agente oxidante residual usado en la etapa (i), por ejemplo, metaperyodato sodico residual o derivados del mismo. Este agente oxidante residual puede estar presente en solucion en forma de especies peryodato (y/o yodato), las cuales se pueden reducir a especies yodo y yoduro menos reactivas.
La adicion de un agente reductor de hidruro puede tener tambien el efecto de aumentar el pH de la solucion (por ejemplo, de aproximadamente 9 (por ejemplo aproximadamente 10) a aproximadamente 11).
En realizaciones en las que la etapa de despolimerizacion previa se finaliza con la adicion de un acido, la adicion del agente reductor de hidruro reaccionara tambien con dicho acido y lo neutralizara. En tales realizaciones, el experto en la materia comprendera que se puede requerir agente reductor de hidruro adicional para permitir tal reaccion.
En una realizacion particular, el agente reductor de hidruro es un borohidruro. En una realizacion mas particular, el
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agente reductor de hidruro es borohidruro sodico.
En una realizacion particular, la cantidad de agente reductor de hidruro, tal como borohidruro sodico, anadida es suficiente para permitir la reduccion completa de los grupos terminales aldetndos y de las especies oxidantes residuales.
El experto en la materia apreciara que la cantidad de hidruro requerida para la reduccion completa de los grupos terminales aldetndo y de las especies oxidantes residuales se puede calcular en base a la cantidad de heparina empleada en el procedimiento y el grado de despolimerizacion de la misma, y la cantidad de agente oxidante empleada.
El experto en la materia comprendera que el hidruro, tal como borohidruro sodico, se puede anadir a la solucion a temperatura reducida (por ejemplo, a fin de contrarrestar la naturaleza exotermica de la reaccion). En una realizacion particular, el hidruro se anade a la solucion a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 17 °C.
El experto en la materia apreciara que el hidruro, tal como borohidruro sodico, se puede anadir a la solucion acuosa en una porcion, de modo continuo o en etapas (es decir, mediante la adicion de varias porciones mas pequenas). Asimismo, el hidruro se puede anadir en forma de un solido o de una solucion (por ejemplo, una solucion acuosa estabilizada de un alcali, tal como una solucion acuosa alcalina estabilizada de borohidruro sodico).
Tras la adicion del hidruro, la reaccion se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para completar la reduccion de los grupos terminales aldetndo a alcoholes primarios, opcionalmente a una temperatura reducida (por ejemplo, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 17 °C). Por ejemplo, la solucion se puede mantener durante un periodo de aproximadamente 4 a aproximadamente 24 horas (por ejemplo, de aproximadamente 14 a aproximadamente 20 horas).
Tal como se usa en el presente documento, la reduccion completa de los grupos terminales aldetndo se puede referir a obtener un derivado de heparina que carece sustancialmente de restos aldetndo, por ejemplo, cuando < un 1 % de grupos aldetndo permanece sin reducir, tal como se determina mediante analisis RMN (por ejemplo, RMN 13C).
Una vez transcurrido el tiempo requerido para la reduccion de los grupos terminales aldetndo, la reaccion de reduccion se puede inactivar. Tal como se usa en el presente documento con respecto a la reaccion de reduccion (es decir, la etapa (iv) definida en el presente documento), la referencia a la inactivacion de la reaccion el experto en la materia comprendera que se refiere a la finalizacion de la reaccion de reduccion mediante la neutralizacion del agente reductor residual.
La reaccion de reduccion se puede inactivar usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia, tal como mediante la adicion de agua o, mas en particular, un acido acuoso (por ejemplo, una solucion acuosa de un acido fuerte definido en el presente documento, tal como una solucion 1 a 4 molar de HCl).
En una realizacion particular, la reaccion de reduccion (es decir, la etapa (iv) definida en el presente documento) puede ser inactivada disminuyendo el pH a fin de formar una solucion acida (por ejemplo, mediante la adicion de una solucion acuosa de un acido fuerte definido en el presente documento, tal como una solucion 1 a 4 molar de HCl).
Asf, en una realizacion particular, el procedimiento del primer aspecto de la invencion comprende adicionalmente (es decir, tras la etapa (iv)) la etapa de:
(iva) inactivar la reaccion de reduccion disminuyendo el pH a fin de formar una solucion acida.
Tal como se usa en el presente documento con respecto a la inactivacion de la reaccion de reduccion (por ejemplo, con respecto a la etapa (iva), cuando sea aplicable), la referencia a la disminucion del pH a una solucion acida se refiere a la disminucion del pH a un valor inferior a 7.
En una realizacion particular, la reaccion se inactiva disminuyendo el pH a un valor de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 (tal como de aproximadamente 3 a aproximadamente 5). En una realizacion mas particular, la reaccion se inactiva disminuyendo el pH a aproximadamente 4.
En una realizacion particular, la reaccion se inactiva disminuyendo el pH a una solucion acida (por ejemplo, a un pH a aproximadamente 4) y manteniendo el pH de la solucion durante mas de aproximadamente 30 minutos (por ejemplo, de aproximadamente 45 a aproximadamente 60 minutos).
Asf, en una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende las etapas de:
(iv) reducir los grupos terminales aldetndo de dicha heparina despolimerizada mediante la adicion de borohidruro sodico a la solucion obtenida en la etapa (iii); y
(iva) inactivar la reaccion de reduccion disminuyendo el pH a fin de formar una solucion acida.
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Recuperacion del producto
El experto en la materia comprendera que el procedimiento de la invencion puede comprender adicionalmente una o mas etapas para la recuperacion y, si fuese necesario, la purificacion del derivado de heparina.
Por ejemplo, el experto en la materia comprendera que cuando el procedimiento de la invencion comprende la etapa de:
(iva) inactivar la reaccion de reduccion disminuyendo el pH a una solucion acida,
la recuperacion del derivado de heparina puede requerir el ajuste de la solucion a un pH neutro (es decir, a aproximadamente 7).
Asf, en una realizacion particular, cuando el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende la etapa (iva) definida en el presente documento, dicho procedimiento opcionalmente comprende ademas (es decir, tras la etapa (iva)) la etapa de:
(ivb) ajustar el pH de la solucion obtenida en la etapa (iva) a un valor aproximadamente neutro.
El pH de la solucion se puede ajustar mediante la adicion de una base adecuada, tal como un metal alcalino (por ejemplo una solucion acuosa de hidroxido sodico) o, particularmente, un carbonato de un metal alcalino (por ejemplo una solucion acuosa de carbonato sodico).
En una realizacion particular, el procedimiento del primer aspecto de la invencion comprende adicionalmente (es decir, tras la etapa (iv) o, cuando sea aplicable, la etapa (iva) o (ivb)) la etapa de:
(v) recuperar el derivado de heparina de la solucion obtenida en la etapa (iv) (o cuando sea aplicable, la etapa (iva) o (ivb)).
Tal como se usa en el presente documento, la referencia a la recuperacion del derivado de heparina el experto en la materia comprendera que se refiere a aislar al menos una porcion del derivado de heparina producido por el procedimiento del primer aspecto de la invencion a partir de la solucion obtenida en el mismo.
La recuperacion del derivado de heparina se puede conseguir usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia. Tales tecnicas pueden incluir, en particular, la precipitacion del derivado de heparina en la solucion, la cual se puede conseguir ajustando la polaridad de la solucion (por ejemplo, mediante la adicion de un disolvente polar, tal como etanol).
La etapa de recuperacion del derivado de heparina de la solucion puede comprender procedimientos (o se puede combinar con los mismos) para una purificacion adicional del producto, por ejemplo, mediante la eliminacion de impurezas y/o modificaciones estructurales no deseadas.
Asf, en una realizacion particular, la etapa (v) del procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion, si se lleva a cabo, puede comprender uno o mas procedimientos para la purificacion del producto.
El experto en la materia comprendera que esta purificacion adicional del derivado de heparina se puede conseguir usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, tal procedimiento puede implicar tecnicas de cromatograffa, filtracion, captura de impurezas, centrifugacion y/o procedimientos de secado.
Minimizacion de modificaciones estructurales no deseadas
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion requiere controlar el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) a fin de minimizar el efecto de agentes oxidantes residuales.
Tal como se ha discutido en el presente documento, pueden estar presentes especies oxidantes residuales en la solucion obtenida en la etapa (i) del procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion, especies que se inactivan despues mediante la adicion de un agente reductor en la etapa (iv). En particular, la presencia de estas especies oxidantes se ha descubierto que llevan a una despolimerizacion no espedfica del derivado de heparina, es decir, una despolimerizacion distinta a la conseguida mediante beta eliminacion alcalina (es decir, en la etapa (iii)), despolimerizacion que da como resultado modificaciones estructurales no deseadas en el derivado de heparina.
Asf, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede requerir el control del periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) a fin de minimizar el efecto de agentes oxidantes residuales y minimizar el nivel de las modificaciones estructurales no deseadas resultantes en el derivado de heparina.
En particular, la referencia a controlar el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) puede referirse al control de dicho periodo de tiempo a fin de minimizar la presencia de modificaciones estructurales no deseadas en el derivado de heparina caracterizadas por senales en la region de 5,0 ppm a 6,5 ppm (en particular a 5,95 ppm y 6,15 ppm) del espectro de RMN 1H del derivado de heparina.
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En una realizacion particular, se proporciona un procedimiento para preparar un derivado de heparina que tiene senales en la region de 5,0 ppm a 6,5 ppm del espectro de RMN 1H correspondiente con una intensidad (proporcion en %) de < aproximadamente un 4 % (por ejemplo, < aproximadamente un 3 %) relativa a la senal a 5,42 ppm del espectro de RMN 1H de la heparina no fraccionada.
En una realizacion mas particular, se proporciona un procedimiento para preparar un derivado de heparina que tiene senales a 5,95 ppm y 6,15 ppm del espectro de RMN 1H correspondiente cada una de las cuales tiene una intensidad (proporcion en %) de < aproximadamente un 4 % (por ejemplo, < aproximadamente un 3 %) relativa a la senal a 5,42 ppm del espectro de rMn 1H de la heparina no fraccionada.
En una realizacion particular, el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion comprende minimizar el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iii).
El experto en la materia comprendera que el maximo periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iii) aceptable a fin de minimizar el nivel de modificaciones estructurales no deseadas en el derivado de heparina dependera de factores tales como la temperatura de la solucion durante este periodo y la concentracion de los reactivos (tales como la heparina y los derivados resultantes de la misma) en solucion.
En una realizacion mas particular, el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iii) es un maximo de 6 horas (por ejemplo, un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas).
Composiciones farmaceuticas
Tal como se ha discutido en el presente documento, el derivado de heparina preparado usando el procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede ser util en medicina. En particular, se pueden preparar composiciones farmaceuticas que contienen tales derivados usando el derivado de heparina obtenido del procedimiento del primer aspecto de la invencion, composiciones que pueden ser utiles en la administracion a un paciente a fin de reducir el parto prolongado.
Asf, en un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para la preparacion de una composicion farmaceutica (es decir, una composicion farmaceutica que comprende un derivado de heparina preparado tal como se ha definido con respecto al primer aspecto de la invencion), que comprende las etapas de:
(a) preparar un derivado de heparina usando un procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion, y
(b) combinar el derivado de heparina obtenido en la etapa (a) con uno o mas adyuvantes, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.
En una realizacion particular, la composicion farmaceutica definida con respecto al segundo aspecto de la invencion se puede proporcionar en forma de un vial, una jeringa precargada, una solucion intravenosa (i.v.) o una formulacion para inyeccion subcutanea.
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener la ventaja de que proporciona un derivado de heparina de bajo peso molecular que tiene baja actividad anticoagulante, derivado que tiene un bajo nivel de modificaciones estructurales indeseadas resultantes del efecto de las especies oxidantes residuales retenidas entre las etapas del procedimiento. Eso se consigue mediante el control de las etapas del procedimiento para asegurar que se emplean condiciones reductoras con un mmimo tiempo posible tras finalizar la etapa de oxidacion.
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener tambien la ventaja de ser mas predecible con respecto al peso molecular del derivado de heparina resultante obtenido, como resultado de la eliminacion de los agentes oxidantes residuales. Esto es debido a que se ha descubierto que la presencia de especies oxidantes residuales (es decir, especies oxidantes que permanecen en el derivado de heparina obtenido tras la finalizacion de la etapa de oxidacion, denominada en el presente documento etapa (i)) conduce a una despolimerizacion no espedfica del derivado de heparina, es decir, a una despolimerizacion distinta a la conseguida mediante beta eliminacion alcalina (es decir, denominada en el presente documento etapa (ii)).
El procedimiento definido en el primer aspecto de la invencion puede tener tambien la ventaja de que mediante el analisis de la solucion en la etapa de despolimerizacion (es decir, denominada en el presente documento etapa (ii)), o por referencia al analisis de un procedimiento de despolimerizacion sustancialmente identico que se haya realizado previamente, el experto en la materia puede conseguir un mayor control del peso molecular del derivado de heparina a pesar de la variabilidad del material de partida (por ejemplo, cuando se usan diferentes lotes de heparina no fraccionada).
Descripcion de las figuras
La figura 1 muestra un grafico del peso molecular de la heparina despolimerizada obtenido a lo largo del tiempo en el ejemplo 2a proporcionado en el presente documento.
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Ejemplos
La presente invencion se puede ilustrar adicionalmente mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1
Se pueden llevar cabo procedimientos como los descritos en el presente documento usando los siguientes procedimientos generales.
Oxidacion del acido iduronico y glucuronico (restos), eliminacion de la actividad anticoagulante.
Se disuelve una cantidad de aproximadamente 3000 gramos de heparina (heparina de la mucosa de calidad de la Farmacopea europea y estadounidense) en agua purificada para obtener una solucion al 10-20 % p/v. El pH de esta solucion se ajusta a 4,5-5,5. Posteriormente, se anade metaperyodato sodico (NalO4) a la solucion del procedimiento, siendo la cantidad de peryodato un 15-30 %, idealmente un 25 %, del peso de la heparina. El pH se ajusta de nuevo a 4,5-5,5. El reactor se protege de la luz. La solucion del procedimiento se hace reaccionar durante 18-26 horas con agitacion constante y mantenimiento de la temperatura a 13-17 °C (por ejemplo, a aproximadamente 15 °C), reduciendo la temperatura a 5 °C durante las dos ultimas horas.
Despolimerizacion de las cadenas de polisacarido mediante un procedimiento de beta eliminacion alcalina
Mientras se mantiene la temperatura a 5-10 °C, se anade una solucion de NaOH hasta que se obtiene un pH de 10,5-11,5. La reaccion de despolimerizacion se inicia de este modo lo que conduce a una disminucion lenta del pH hasta que se neutralizan los iones OH'. Asf, el pH se aumenta con cuidado y se controla estrechamente en el intervalo de 10,5-11,5 mediante la adicion de una solucion de NaOH o de Na2CO3. Simultaneamente, se inicia el control en marcha a fin de seguir el grado de despolimerizacion mediante analisis GPC-HPLC repetidos. La reaccion procede durante un periodo de hasta 4 horas o cuando se obtiene el peso molecular optimo. Es preferente un intervalo ideal de pesos moleculares de 5,7-6,3 kDa. Se podna usar una tabla (vease el ejemplo 2) o un grafico (vease la figura 1) para predecir el tiempo de reaccion necesario para obtener el intervalo preferente de peso molecular.
La reaccion se detiene mediante la adicion lenta de HCl 4 M hasta obtener un pH de 5,5-6,5.
El peso molecular se determina mediante GPC-HPLC que se lleva a cabo en columnas TSK 2000 y TSK 3000 SW en serie, calibradas usando la primera norma internacional para LMWH. El mdice de refraccion se usa para monitorizar la concentracion del eluato.
Reduccion de compuestos de yodo a yoduro y yodo, estabilizacion del producto mediante conversion de los grupos terminales aldehido del polisacarido a los correspondientes alcoholes
Mientras se mantiene la temperatura a 5-17 °C, se anade despues en porciones una cantidad de 130-200 gramos de borohidruro sodico, esto para evitar el sobrecalentamiento por la reaccion exotermica, y el pH aumentara hasta un valor de 9 (por ejemplo 10) a 11. La reaccion se continua durante 14-20 horas. Tras este tiempo de reaccion, se anade un acido diluido lentamente a fin de ajustar el pH a un valor de 4, esto degrada el borohidruro sodico remanente. Tras mantener el pH a 4 durante 45-60 minutos, el pH de la solucion se ajusta a 7 con una solucion diluida de NaOH.
Precipitacion del producto reducido y eliminacion inicial de compuestos que contienen yodo
Se anade etanol (95-99,5 %) a la mezcla de reaccion durante un periodo de 0,5-1 horas, con agitacion cuidadosa y a una temperatura de 5-25 °C. El volumen de etanol que se ha de anadir esta en el intervalo de 1-2 volumenes de etanol por volumen de solucion del procedimiento. Seguidamente, la heparina oxidada se deja precipitar y sedimentar durante 15-20 horas, tras lo cual las aguas madre se decantan y se descartan. A continuacion, el sedimento se disuelve en agua purificada para obtener una solucion del procedimiento del 15-30% p/v. Se anade NaCl para obtener una concentracion de 0,15-0,30 mol/l en la solucion del procedimiento.
Purificacion del producto
Se anade despues un volumen de la solucion del procedimiento a 1,5-2,5 volumenes de etanol (95-99,5 %) seguido de la centrifugacion a > 2000 g, y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanta y se descarta.
La pasta de producto obtenida mediante centrifugacion se disuelve despues en agua purificada para obtener una concentracion de producto de un 10-20% p/v. Seguidamente se anade NaCl para obtener una concentracion de 0,20-0,35 mol/litro. A continuacion se anaden 1,5-2,5 volumenes de etanol (95-99,5%) por volumen de la solucion del procedimiento lo que precipita el producto en la solucion. A esto le sigue una centrifugacion a > 2000 g, y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanta y se descarta.
Despues, a la pasta remanente se le anade agua purificada para disolverla. La concentracion del producto debena
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
estar ahora en el intervalo del 10-20% p/v. El pH de la solucion de producto se ajusta entonces a 6,5-7,5. La solucion se filtra despues para eliminar cualquier partfcula. Luego, a un volumen de la solucion del procedimiento se anaden 1,5-2,5 volumenes de etanol (95-99,5 %). A esto le sigue una centrifugacion a > 2000 g, y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanta y se descarta.
Reduccion del tamano y del contenido de agua de la pasta de precipitado
Se llena entonces un reactor con etanol, volumen 2 litros. Mientras se agita el etanol, se anade la pasta de precipitado. La agitacion mecanica solidifica la pasta y sustituye el agua presente por el etanol dando lugar a una suspension de partfculas homogeneas. Se interrumpe la agitacion tras 1-2 horas tras lo cual se dejan sedimentar las partfculas, y a continuacion se decantan las aguas madre. Este procedimiento se repite dos veces. El precipitado se afsla sobre un tejido para filtracion de polipropileno (PP). Este procedimiento se repite dos veces mas. Tras eliminar el exceso de lfquido, las partfculas se pasan a traves de un tamiz para obtener partfculas de tamano menor y uniforme.
Secado al vacio y tamizado
El producto se distribuye homogeneamente sobre dos bandejas previamente pesadas, y se situa en una campana de vado. La presion se reduce mediante una bomba de vado, anotando la presion realmente obtenida y las bandejas se calientan a 35-40 °C, con registro constante de la temperatura. Se hace pasar una corriente de nitrogeno a traves del secador en ese momento, manteniendo la presion baja en el secador. Al cabo de 2-3 dfas las bandejas se retiran de la campana de vado y se miden sus pesos. El secado continua entonces durante 24 horas adicionales, tras lo cual las bandejas se extraen y se pesan. Este procedimiento se efectua para monitorizar el progreso del secado. Cuando se obtiene un peso constante, es decir, cuando ya no se observa mas evaporacion, el secado se considera completo. El producto seco se dispensa en bolsas de plastico de 2 capas cubiertas con papel de aluminio/plastico laminado. El almacenamiento se efectua en un area seca a una temperatura de 20-25 °C.
Ejemplo 2
El procedimiento se llevo a cabo en los tres conjuntos de condiciones (ejemplos 2a, 2b y 2c), usando dos lotes diferentes de heparina no fraccionada (denominados en el presente documento lote A y lote B), en las siguientes condiciones generales.
Oxidacion del acido iduronico y glucuronico (restos), eliminacion de la actividad anticoagulante.
Se disolvio una cantidad de aproximadamente 25 gramos de heparina en agua purificada para obtener una solucion del 15 % p/v. Despues se anadieron 6,25 gramos de metaperyodato sodico (NalO4) a la solucion del procedimiento y el pH se ajusto luego a 4,9-5,0. El reactor se protegio de la luz. La solucion del procedimiento se hizo reaccionar durante 22 horas con agitacion constante y mantenimiento de la temperatura a 15 °C, tras lo cual la temperatura se redujo a 5 °C durante las dos ultimas horas. El tiempo de reaccion total fue de 24 horas.
Despolimerizacion de las cadenas de polisacarido mediante un procedimiento de beta eliminacion alcalina
Mientras se mantema la temperatura a 5-10 °C, se anadio una solucion de NaOH hasta que se obtuvo un pH de 1111,5. El pH se monitorizo constantemente y se ajusto al pH indicado con respecto al ejemplo 2a, 2b, 2c (a continuacion) durante un periodo de 250 minutos. La reaccion se detuvo mediante la adicion lenta de HCl 4 M hasta obtener un pH de 5,5-6,5. El tiempo de reaccion necesario para ajustar el pH fue de aproximadamente 15 minutos.
Durante el tiempo de reaccion, se tomaron once muestras en puntos de tiempo espedficos durante el tiempo de reaccion. Las muestras se diluyeron inmediatamente con una solucion de tampon fosfato 15 mM y el pH se ajusto a 7 para detener la reaccion en curso. Las muestras se sometieron despues a un analisis del peso molecular mediante GPC-HPLC, tal como se discute mas adelante. Se creo una tabla para cada procedimiento (vease a continuacion). El peso molecular se determino mediante GPC-HPLC que se llevo a cabo en columnas TSK 2000 y TSK 3000 SW en serie, calibradas usando la primera norma internacional para LMWH (tal como se ha discutido en el presente documento). Se uso un mdice de refraccion para monitorizar la concentracion del eluato.
Reduccion de compuestos de yodo a yoduro y yodo, estabilizacion del producto mediante conversion de los grupos terminales aldehido del polisacarido a los correspondientes alcoholes
Mientras se mantema la temperatura a 5-15 °C, se anadio entonces en porciones una cantidad de 1,75 gramos de borohidruro sodico durante 30 minutos, esto para evitar el sobrecalentamiento por la reaccion exotermica, y el pH aumento hasta 10. Se extrajo una muestra de la solucion tras finalizar la adicion de borohidruro sodico y se analizo para determinar el peso molecular. Los resultados confirmaron que el peso molecular permaneda inalterado. La reaccion se continuo durante 20 horas. Tras este tiempo de reaccion, se anadio un acido diluido hasta un pH de 44,5, el cual degrado el borohidruro sodico remanente. Se observo la formacion de burbujas de hidrogeno, lo que confirmo que el NaBH4 se habfa anadido inicialmente en exceso con respecto a la cantidad requerida. Tras mantener el pH a 4 durante 45-60 minutos, el pH de la solucion se ajusto a 7 con una solucion diluida de NaOH.
5
10
15
20
25
30
Precipitacion del producto reducido y eliminacion inicial de compuestos que contienen yodo
Se anadio etanol (95-99,5 %) a la mezcla de reaccion durante un periodo de 0,5-1 horas, con agitacion cuidadosa y a una temperatura de 5-25 °C. El volumen de etanol anadido era de 1,5 volumenes de etanol por volumen de solucion del procedimiento. El producto precipito en la solucion y se separo mediante centrifugacion a aproximadamente 5000 g durante 20 minutos. Despues se decantaron las aguas madre. A continuacion, la pasta de producto se disolvio en agua purificada para obtener una solucion del procedimiento del 15-30% p/v. Se anadio NaCl para obtener una concentracion de 0,15-0,30 mol/litro en la solucion del procedimiento. Seguidamente se anadio etanol, en una cantidad de 2 volumenes de etanol por volumen de solucion del procedimiento. El producto precipito en la solucion y se separo mediante centrifugacion a aproximadamente > 2000 g durante 20 minutos. Se decantaron las aguas madre otra vez.
Despues, a la pasta remanente se le anadio agua purificada para disolverla. La concentracion del producto estaba entonces en el intervalo del 15-30 % p/v. El pH de la solucion de producto se ajusto entonces a 6,5-7,5 y la solucion se filtro despues para eliminar cualquier partfcula. Luego, a un volumen de la solucion del procedimiento se anadieron 2 volumenes de etanol (95-99,5 %). A esto le siguio una centrifugacion a > 2000 g, y a < 20 °C durante 20-30 minutos, tras lo cual el sobrenadante se decanto y se descarto. La pasta se deshidrato despues mediante adiciones repetidas dos veces y decantacion del etanol y molienda manual de la pasta.
Secado al vado y molienda
La pasta deshidratada se transfirio entonces a un matraz de vidrio conectado a un desecador de vado. El secado siguio a vado a una temperatura de 38-40 °C. El secado se detuvo despues de secar durante aproximadamente 48 horas. Despues le siguio una molienda tras la cual el producto final se dispenso en viales de vidrio hermeticos.
Analisis de la etapa de despolimerizacion
El progreso de la etapa de despolimerizacion se analizo mediante GPC-HPLC usando columnas TSK 2000 y TSK 3000 SW en serie, calibradas usando la primera norma internacional para LMWH (empleando tecnicas tales como las descritas en el presente documento). Se uso el mdice de refraccion para monitorizar la concentracion del eluato.
Las tablas proporcionadas con respecto a cada uno de los ejemplos 2a a 2c siguientes muestran los tiempos que se necesitaron para conseguir un particular peso molecular promedio en las respectivas condiciones de reaccion. Los tiempos indicados con respecto al ejemplo 2a se muestran tambien en el grafico proporcionado como figura 1.
Ejemplo 2a
El ejemplo 2a se hizo reaccionar en la reaccion de despolimerizacion a un pH de 11 usando el lote A de heparina.
Muestra
Mw (kDa) Tiempo (min)
1
12,6 0
2
8,5 15
3
7,7 30
4
7,3 45
5
7,0 60
6
6,8 73
7
6,7 84
8
6,2 127
9
6,1 152
10
5,9 210
11
5,8 248
Ejemplo 2b
El ejemplo 2b se hizo reaccionar en la reaccion de despolimerizacion a un pH de 11,5 usando el lote A de heparina.
Muestra
Mw (kDa) Tiempo (min)
1
13,0 0
2
7,3 15
3
6,7 30
4
6,4 45
5
6,2 60
6
6,1 73
7
6,0 84
8
5,7 127
9
5,6 152
10
5,4 210
11
5,3 248
Ejemplo 2c
El ejemplo 2c se hizo reaccionar en la reaccion de despolimerizacion a un pH de 11 usando el lote B de heparina.
Muestra
Mw (kDa) Tiempo (min)
1
10,4 0
2
8,5 15
3
7,6 30
4
6,6 45
5
6,8 59
6
6,7 69
7
6,5 83
8
5,9 131
9
6,0 152
10
5,7 210
11
5,6 248
5 Ejemplo 3
La tabla siguiente muestra los resultados del analisis de RMN 1H de derivados de heparina obtenidos usando el procedimiento expuesto en el ejemplo 2, siguiendo la Direccion europea de calidad del medicamento y la asistencia sanitaria (EDQM), monograffa 7, tal como se expone en la farmacopea europea.
Muestra
Intensidad (proporcion en %) comparada con la senal de 5,42 ppm de la heparina no fraccionada
6,15 ppm % de la senal de ref. 5,95 ppm % de la senal de ref.
Ejemplo 2a
2,0 2,5
Ejemplo 2c
2,5 2,0
Ejemplo 4
El producto obtenido de los procedimientos de acuerdo con uno cualquiera de los ejemplos proporcionados en el presente documento se puede formular en una composicion farmaceutica mediante un procedimiento aseptico convencional.
5 En particular, se puede preparar una composicion farmaceutica formando una solucion que comprende 150 mg/ml de producto activo y fosfato de Na hasta 15 mM con un pH de 6-8. La composicion farmaceutica asf obtenida esta prevista principalmente para administracion subcutanea, aunque tambien es adecuada para administracion intravenosa.
10

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de preparacion de un derivado de heparina que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 4,6 a aproximadamente 6,9 kDa y una actividad anti-factor Xa inferior a aproximadamente 10 Ul/mg,
    y en el que el derivado de heparina tiene un disacarido que se produce predominantemente tal como se muestra en la formula I siguiente
    imagen1
    en la que
    imagen2
    y n es un numero entero de 2 a 20, correspondiente a pesos moleculares entre 1,2 y 12 kDa,
    y en el que el derivado de heparina tiene senales en la region de 5,0 ppm a 6,5 ppm de un espectro de RMN 1H con una intensidad (proporcion en %) inferior o igual a aproximadamente un 4 % relativa a la senal a 5,42 ppm del espectro de RMN 1H de la heparina no fraccionada, que comprende las etapas consecutivas de:
    (i) oxidar una solucion acuosa acida de heparina no fraccionada mediante la adicion de un agente oxidante;
    (ii) despolimerizar la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un alcali para formar una solucion alcalina;
    (iii) mantener dicha solucion de la etapa (ii) a un pH alcalino durante un periodo de tiempo requerido para proporcionar heparina despolimerizada con un peso molecular dentro del intervalo anteriormente mencionado; y
    (iv) reducir los grupos terminales aldehfdo de dicha heparina despolimerizada mediante la adicion de un agente reductor de hidruro a la solucion obtenida en la etapa (iii);
    en el que el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iv) esta controlado a fin de minimizar el efecto de los agentes oxidantes residuales; y
    en el que dicho periodo de tiempo de la etapa (iii) se determina mediante analisis de dicha solucion o por referencia a una etapa (iii) sustancialmente identica llevada a cabo previamente.
  2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que, en el derivado de heparina, al menos un 70 % de las moleculas tiene un peso molecular superior a aproximadamente 3 kDa.
  3. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el derivado de heparina comprende polisacaridos con una distribucion de pesos moleculares acumulados tal como se indica en la tabla siguiente:
    Peso molecular, kDa
    Peso acumulado, %
    > 10
    4-15
    > 8
    10-25
    > 6
    22-45
    > 3
    > 70
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  4. 4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en el derivado de heparina, las senales en el espectro de RMN 1H estan presentes a aproximadamente 5,95 ppm y aproximadamente 6,15 ppm.
  5. 5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento es para la preparacion de un derivado de heparina que tiene tambien una actividad anti-factor IIa inferior a 10 Ul/mg.
  6. 6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en el derivado de heparina, las cadenas de polisacarido presentes en el derivado de heparina carecen esencialmente de secuencias de sacarido qmmicamente intactas que median en el efecto anticoagulante.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en el derivado de heparina, al menos aproximadamente un 90 % de los restos diol vecinales no sulfatados del material de partida de heparina no fraccionada se han convertido.
  8. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que los restos diol vecinales no sulfatados comprenden los restos de acido iduronico y glucuronico de la heparina.
  9. 9. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente oxidante usado en la etapa (i) es metaperyodato sodico.
  10. 10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (i) requiere la oxidacion de una solucion acuosa de heparina no fraccionada mediante la adicion de metaperyodato sodico, a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 5,5 y a temperatura reducida.
  11. 11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (ii) requiere la despolimerizacion de la heparina oxidada sometiendo el producto de la etapa (i) a un alcali para formar una solucion que tiene un pH de aproximadamente 8 a aproximadamente 13.
  12. 12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende adicionalmente una o mas de las etapas de:
    (iiia) someter la solucion obtenida en la etapa (iii) a un acido para formar una solucion que tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5;
    (iva) inactivar la reaccion de reduccion disminuyendo el pH a fin de formar una solucion acida y, opcionalmente,
    (ivb) ajustar el pH de la solucion de la etapa (iva) a un valor aproximadamente neutro; y
    (v) recuperar el derivado de heparina de la solucion obtenida en la etapa (iv) (o cuando sea aplicable, la etapa (iva) o (ivb)).
  13. 13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente reductor usado en la etapa (iv) es borohidruro sodico.
  14. 14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el periodo de tiempo entre el final de la etapa (i) y el inicio de la etapa (iii) es un maximo de 6 horas.
  15. 15. Un procedimiento de preparacion de una composicion farmaceutica que comprende un derivado de heparina definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a) preparar un derivado de heparina usando un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14; y
    (b) combinar el derivado de heparina obtenido en la etapa (a) con uno o mas adyuvantes, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.
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