TWI672146B - 新化學修飾肝素及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於具有約4.6kDa至約6.9kDa之平均分子量及小於約10IU/mg之抗因子Xa活性的肝素衍生物及其形成方法，該等方法包含以下步驟：氧化未分化肝素、解聚合及還原所得末端基團。

Description

新化學修飾肝素及其製造方法
本發明係關於新化學修飾葡糖胺聚糖(諸如，化學修飾肝素)及其製備方法。
本說明書中顯然先前已公佈之文獻的清單或論述不應必然地視作承認該文獻為現有技術或公共常識之一部分。
肝素為一種多分散的、天然產生之多醣，其抑制凝血，而血栓塞藉由凝血過程發生。肝素由具有不同長度及分子量的未分支多醣鏈組成。具有5000道耳頓(dalton)至超過40,000道耳頓之分子量的鏈構成醫藥級肝素。
典型地來源於天然來源(諸如，豬腸或牛肺組織)之肝素可在治療上投予以用於預防及治療血栓塞。然而，未分化肝素之作用可能難以預測。因此，在用未分化肝素治療血栓塞期間，必須非常密切地監測凝血參數以防止抗凝血過度或抗凝血不足。
眾多種類之肝素及低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)(諸如，達肝素(dalteparin)及伊諾肝素(enoxaparin))可用於依賴其抗凝血活性之治療。大量試管內及動物實驗研究且甚至臨床試驗指示，肝素及其衍生物具有除與其抗凝血作用相關之彼等特性之外的有利特性。然而，現存的肝素及LMWH由於與抗凝血作用相關聯之出血風險 而不適於治療其他醫學病症。
已證實LMWH達肝素可減少接受深靜脈血栓塞預防之婦女的滯產。據信該機制涉及達肝素誘導之白介素含量增加，引起促進子宮頸成熟之有利炎性反應。另外，已證實達肝素增加子宮收縮力(ActaObstetriciaetGynecobgica，2010年；89：147-150)。然而，肝素及LMWH由於許多種原因而不適於預防或治療該等疾病。
首先，肝素及LMWH具有顯著、熟知之抗凝血作用，由於出血風險而限制了其在妊娠晚期及分娩期間用於預防及急性應用。舉例而言，當進行硬膜外麻醉(一種常在分娩期間採用之措施)時，嚴格禁忌使用達肝素。
其次，肝素且在某種程度上LMWH已與肝素誘發之血小板減少症(一種可能在暴露於肝素之任何患者中出現的嚴重免疫介導的藥物反應)相關聯。其為由肝素依賴性抗體引起之潛在毀滅性血栓塞前疾病，該等抗體在患者使用肝素五天或更多天後或在患者先前曾肝素暴露之情況下產生。
長期用肝素治療之另一非所需之可能影響為其可誘發骨去礦化且引起骨質疏鬆症。
已作出許多嘗試來根除或降低肝素或低分子量肝素之抗凝血活性以便提供低抗凝血性肝素(low anticoagulant heparin，LAH)，此舉旨在自肝素鏈引起的除抗凝血作用外之其他潛在臨床作用獲益，同時沒有與肝素相關聯之非所需作用帶來的風險，主要是出血。然而，有關此類肝素之臨床經驗有限，且迄今為止，尚無此等產品被允許在臨床上使用。
肝素主要經由與絲胺酸蛋白酶抑制劑抗凝血酶(antithrombin；AT)之高親和力結合及AT之活化來發揮其抗凝血活性。作為重要的生理性凝血抑制劑，AT藉由與活化凝血因子形成穩定複合物來中 和該等因子。肝素多醣鏈內特定戊糖之結合導致AT之構形改變，由此大幅增強凝血因子之抑制率，從而使凝血及血凝塊之形成衰減。
歐洲專利申請案EP 1 059 304揭示產生一種具有低抗凝血作用之產品的具有9kDa至13kDa之平均分子量的經酶促降解或氧化之肝素，其被建議用於神經退化性疾病之治療。
美國專利4,990,502說明一種處理天然肝素以分解負責抗凝血作用之戊糖殘基且隨後解聚合以產生具有5.8kDa至7.0kDa之平均分子量的低抗凝血性、低分子量肝素的方式。然而，在US 4,990,502中，使用了耗時的方法，諸如約15小時之透析，來終止氧化製程。此等製程可影響最終產物之分子量分佈，且產生由1H NMR可見之不利結構變體。
控制多醣鏈之分子量及長度對獲得化合物之所需生物作用至關重要。長鏈肝素在皮下給藥後之生物可用率低，且肝素誘發血小板減少症(thrombocytopenia，HIT)之誘發可能性亦與鏈長度呈正相關。為減少該等臨床上非所需之特性，肝素衍生物不應具有完全長度。具有某一分子量之肝素鏈可藉由分化標準肝素而獲得。然而，藉由分化方法(諸如，凝膠過濾、醇沈澱及離子交換層析法)製造具有中間或低分子量之肝素衍生物由於丟棄了高分子質量肝素而伴隨原材料之顯著浪費。
如本文中所揭示，具有低抗凝血活性之肝素衍生物可使用包含以下步驟之方法製備：氧化未分化肝素、解聚合及還原所得末端基團，該等衍生物用於減少滯產之持續時間。
詳言之，吾人已意外地發現，藉由控制在氧化步驟與還原步驟之間消逝之時間可使得在使用該等方法製備肝素衍生物期間發生的不期望之結構修飾之程度降至最低。另外，吾人發現，所得肝素衍生物之平均分子量可藉由監測解聚合步驟之進展(或藉由參考先前執行之方法)且相應地調整解聚合步驟之持續時間來進行控制。
國際(PCT)申請案第PCT/SE2012/051433號(公開號：WO 2013/095279)揭示一種製備未分化肝素之衍生物的方法，其包含以下步驟：氧化、解聚合及末端基團還原，該等衍生物具有低抗凝血活性且用於減少滯產之持續時間。然而，此國際申請案並未提及監測解聚合步驟之進展以控制所得肝素衍生物之平均分子量。
在本發明之第一態樣中，提供一種用於製備具有約4.6kDa至約6.9kDa之平均分子量及小於約10IU/mg之抗因子Xa活性之肝素衍生物的方法，其包含以下連續步驟：(i)藉由添加氧化劑來氧化未分化肝素之酸性水溶液；(ii)藉由使步驟(i)之產物經受鹼處理以形成鹼性溶液來使經氧化肝素解聚合；(iii)將來自步驟(ii)之該溶液維持在鹼性pH值下達提供具有在上述範圍內之分子量的解聚合肝素所需的時間段；及(iv)藉由將氫化物還原劑添加至自步驟(iii)獲得之溶液中來還原該解聚合肝素之末端醛基，其中步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段經控制以使殘餘氧化劑之影響減到最小；且其中步驟(iii)中之該時間段係藉由分析該溶液或藉由參考先前執行之實質上相同之步驟(iii)來確定。
熟習此項技術者將理解，如本文中描述的本發明之任何具體實例可與任一個或多個其他具體實例組合以便提供本發明之另外的具體實例。特定地涵蓋本文中描述之具體實例之所有此等組合。因此，提及本發明之任何態樣將包括提及其任何具體實例或具體實例之組合。
如本文中所使用，術語「約(about)」可指在指定值之10% 內(具體而言，在5%內，諸如在1%內)的值。在每次出現時，本發明之具體實例包括移除了術語「約(about)」之彼等具體實例。
熟習此項技術者將理解，提及步驟為「連續的(consecutive)」指示該等步驟係以所示次序循序執行。在特定具體實例中，步驟可以直接順序執行，例如，沒有插入步驟。因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法可稱為由本發明之第一態樣(或其任何具體實例或具體實例之組合)中所提及之連續步驟「組成(consisting)」。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法可在單一反應容器中執行(所謂的「一鍋(one-pot)」法)。
肝素衍生物
本發明之第一態樣中所定義之方法允許使用低分子量肝素之當前國際標準來製造具有約4.6kDa至約6.9kDa之平均分子量(molecular weight；Mw)及小於約10IU/mg之抗因子Xa活性之肝素衍生物。
為避免疑問，熟習此項技術者將理解，本文中提及之術語「平均分子量(average molecular weight)」係指重量平均分子量。
可使用熟習此項技術者已知之技術來測定肝素衍生物之平均分子量。舉例而言，可藉由使用高效液相層析法(high performance liquid chromatography；HPLC)(諸如，凝膠滲透層析法HPLC(gel permeation chromatography HPLC；GPC-HPLC))分析由本發明之第一態樣中所定義之方法獲得的肝素衍生物樣本來測定平均分子量。
詳言之，可根據由Mulloy等人修改的關於低分子質量肝素之凝膠滲透層析法的歐洲藥典(Ph Eur)程序(專論0828)(「Molecular Weight Measurements of Low Molecular Weight Heparins by Gel Permeation Chromatography」,Thrombos.Haemostas. 77,1997,668-674)來執行分子量分析，其中利用了有關低分子量肝素之國際分子量標準來校準層析系統。
在特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製備的肝素衍生物具有約5.0kDa至約6.0kDa(諸如，約5.2kDa至約5.9kDa，例如約5.3kDa至約5.8kDa或者約5.7kDa至約6.3kDa)之平均分子量。
由本發明之第一態樣中所定義之方法製備的特定肝素衍生物包括具有約5.8kDa、約5.6kDa或約5.3kDa之平均分子量的彼等衍生物。
在特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製備的肝素衍生物包含具有如下表1中指示之累積分子量分佈之多醣。
在特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物可由多個分子組成，其中至少70%具有大於約3kDa之分子量。
本發明之第一態樣中所定義之方法允許製造具有低抗凝血特性之肝素衍生物。
熟習此項技術者將理解，肝素及類似物之抗凝血活性係由與絲胺酸蛋白酶抑制劑抗凝血酶(AT)之高親和力結合及AT之活化引起。活化之AT又起作用以與各種凝血因子形成穩定複合物，且因此中和該等因子之作用。因此，藉由測定該等凝血因子之活性來量化抗凝血特性係可能的。
熟習此項技術者將理解，由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物的抗凝血活性可藉由測定凝血因子Xa及凝血因子IIa之活性來量測。
在特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製 造的肝素衍生物具有小於10IU/mg之抗因子Xa活性及抗因子IIa活性。
在更特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物可具有小於5IU/mg之抗因子Xa活性及/或小於5IU/mg之抗因子IIa活性。舉例而言，由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物可具有小於5IU/mg之抗因子Xa活性及小於5IU/mg之抗因子IIa活性。
在更特定具體實例中，由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物可具有小於1IU/mg之抗因子Xa活性及/或小於1IU/mg之抗因子IIa活性。
可根據關於低分子質量肝素之歐洲藥典程序(專論0828)測定抗凝血活性(抗因子IIa及抗因子Xa)，其中使用了有關低分子量肝素之國際活性標準來校準系統。
在特定具體實例中，使用本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物可具有不可偵測之抗凝血活性，如由此項技術中已知之分析方法所量測。
熟習此項技術者將瞭解，本發明之第一態樣中所定義之方法允許對存在於未分化肝素中之殘基進行氧化、解聚合且還原，此又提供由經修飾殘基組成且具有低分子量之肝素衍生物。
在特定具體實例中，存在於肝素衍生物中之多醣鏈基本上不含介導抗凝血作用之化學上完整的醣序列(例如，存在於肝素衍生物中之多醣鏈中1%包含該等化學上完整之醣序列，如可由NMR偵測)。
在另一具體實例中，肝素衍生物中主要存在之雙醣如下式I中所示。
其中：
且n為2至20之整數。
如本文中所使用，術語「主要存在(predominantly occurring)」可理解為指各別特徵在大多數(亦即，大於50%，例如大於60%，或特定而言，大於80%)情況下存在。
在另一具體實例中，多醣鏈具有2至20(式I中之n)個雙醣單元，對應於在1.2kDa與12kDa之間的分子量。
熟習此項技術者亦將理解，本發明之第一態樣中所定義之方法允許製造肝素衍生物，其中保留了存在於未分化肝素中之硫酸基團。
在特定具體實例中，提供一種製備肝素衍生物之方法，其中存在至少約70%(諸如，至少約80%，例如至少約90%)之硫酸基團。
如本文中所描述，本發明之第一態樣中所定義之方法允許製造具有較低不期望之結構修飾程度的肝素衍生物，該等不期望之結構修飾係由殘餘氧化劑之作用導致。
如本文中所使用，術語「殘餘氧化劑(residual oxidising agent)」可指在完成步驟(i)後存在於該方法中的能夠進一步氧化自彼步驟獲得之肝素衍生物的一或多種物質。
已發現，該等物質之存在導致肝素衍生物之不期望之結構修 飾。詳言之，已發現該等不期望之結構修飾係由肝素衍生物之非特異性解聚合導致，亦即，並非由鹼性β消去所介導之解聚合(亦即，如本文中界定之步驟(ii))的解聚合。
此等非特異性解聚合製程可導致形成缺乏分子量可預測性且具有弱穩定性之肝素衍生物，且可導致變色(其可在儲存時加劇)。
詳言之，本文中提及的不期望之結構修飾可藉由未識別之化學修飾肝素殘基之存在來特性化。舉例而言，該等未識別之化學修飾肝素殘基可藉由肝素衍生物之1H NMR光譜之5.0ppm至6.5ppm區域中的信號來特性化。更特定而言，此等未識別之化學修飾肝素殘基可藉由存在於多醣之單醣單元之C4-C5位處的雙鍵來特性化，該雙鍵可藉由肝素衍生物之1H NMR光譜中在約5.0ppm與約6.5ppm(例如，在約5.95ppm與約6.15ppm)之間的信號識別。
在特定具體實例中，提供一種製備肝素衍生物之方法，相對於在未分化肝素之1H NMR光譜之5.42ppm處的信號，該肝素衍生物在相應1H NMR光譜之5.0ppm至6.5ppm區域中具有強度(%比率)約4%(例如，約3%，諸如約2.5%)的信號。
在更特定具體實例中，提供一種製備肝素衍生物之方法，相對於在未分化肝素之1H NMR光譜之5.42ppm處的信號，該肝素衍生物在相應1H NMR光譜中之5.95ppm及6.15ppm處具有強度(%比率)約4%(例如，約3%，諸如約1%)的信號。
在另一具體實例中，提供一種可使用如本發明之第一態樣中所定義之方法獲得的肝素衍生物(例如，如關於本發明之第一態樣所定義)。
氧化
本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟： (i)藉由添加氧化劑來氧化未分化肝素之酸性水溶液。
如本文中所使用，術語「水溶液(aqueous solution)」係指在水中之溶液。詳言之，提及未分化肝素之水溶液可指在水中之溶液，其中溶解至少90%(特定而言，至少95%，諸如至少99%)之肝素。更特定而言，其可指如藉由目視檢驗觀察不含未溶解之肝素的溶液。
如本文中關於本發明之第一態樣之方法的步驟(i)所使用，提及酸性溶液應理解為意謂具有小於7(例如，小於約6)之pH值的溶液。詳言之，其可指具有約3至約6(例如，約3.5至約6，諸如約4.5至約5.5)之pH值的溶液。
熟習此項技術者將理解，可在添加氧化劑之前或之後(例如，之前)調整水溶液之pH值。
在特定具體實例中，維持溶液之pH值，直至氧化完成(亦即，如本文中所定義之步驟(i)完成)。
熟習此項技術者將理解，可藉由添加合適酸，諸如合適強酸(例如，具有小於約5，諸如約1至約5之pKa值之無機酸或有機酸，諸如無機酸)來調整及/或維持水溶液之pH值。
在特定具體實例中，可將溶液之pH值調整至且維持在約4.5至約5.5，諸如約5。
在特定具體實例中，溶液中肝素之濃度以水之體積計為約10wt%至約20wt%(例如，約15wt%)之肝素。
熟習此項技術者將理解，提及的氧化劑意欲指能夠氧化未分化肝素之試劑。詳言之，熟習此項技術者將理解，提及的氧化劑可指能夠氧化分解未分化肝素中之鄰二醇(亦即，產生相應醛部分)之試劑。
為避免疑問，提及的藉由添加氧化劑來氧化未分化肝素之酸性水溶液(亦即，如本文中所定義之步驟(i)所提及)可指藉由添加能夠分解其中之鄰二醇部分之氧化劑來氧化未分化肝素之酸性水溶液。
在特定具體實例中，氧化劑可為合適過碘酸鹽(諸如，偏過碘酸鈉)或過錳酸鹽(諸如，過錳酸鉀)。在更特定具體實例中，氧化劑為偏過碘酸鈉。
熟習此項技術者將瞭解，氧化劑(諸如，偏過碘酸鈉)可一次性、逐步或連續添加至水溶液中。此外，氧化劑可以固體或以溶液(例如，水溶液)形式添加。
在特定具體實例中，添加之氧化劑(諸如，偏過碘酸鈉)之量以重量計將為存在於溶液中之肝素之量的約15%至約35%(例如，以重量計為存在於溶液中之肝素之量的約25%)。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)可在較低溫度下執行。
如本文中所使用，熟習此項技術者將理解，術語「較低溫度(reduced temperature)」係指低於周圍溫度(室溫)，亦即，低於約25℃(例如，低於約20℃)之溫度。可在添加氧化劑之前或在該添加之後立即調整溶液之初始溫度。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)之溫度在反應之最後兩小時可降低至約5℃。
在更特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)可在低於室溫但高於約10℃之溫度下(例如，在約13℃至約17℃之溫度下)執行。
在更特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)可在約13℃至約17℃之溫度下執行且接著在反應之約最後兩小時裏冷卻至約5℃之溫度。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)可為避光的。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)執行足以允許完全氧化肝素之持續時間(亦即，時間段)，該時間段可為約18小時至約26小時(例如，約18小時至約24小時)。
如本文中所使用，提及的達成完全氧化可指獲得經氧化衍生物，其中至少約90%(例如，至少約95%，諸如至少約99%)之非硫酸化鄰二醇部分(例如，在肝素之艾杜糖醛酸及葡糖醛酸殘基中)已轉化成相應醛(例如，如藉由GPC-HPLC及NMR所測定)。
熟習此項技術者將理解，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)之進展可藉由調整反應之溫度及持續時間來控制。
熟習此項技術者將理解，本發明之第一態樣之方法的步驟(i)之進展之後可為例如使用GPC-HPLC對取自溶液之樣本進行分析，且相應地調整步驟(i)所需之時間段。詳言之，隨後可為本發明之第一態樣之方法的步驟(i)，且調整持續時間，以便使解聚合(如由平均分子量之降低來識別)減至最少。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法的步驟(i)需要藉由添加偏過碘酸鈉至步驟(i)中獲得之溶液中來氧化該肝素，且接著將所得溶液在約4.5至約5.5之pH值且視情況在較低溫度下維持一段約18小時至約26小時之時間。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟：(i)在約4.5至約5.5之pH值及較低溫度下，藉由添加偏過碘酸鈉來氧化未分化肝素之水溶液。
解聚合
本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟：(ii)藉由使步驟(i)之產物經受鹼處理以形成鹼性溶液來使經氧化肝 素解聚合；及(iii)將來自步驟(ii)之該溶液維持在鹼性pH值下達提供具有在上述範圍(亦即，如本發明之第一態樣中界定)內之分子量的解聚合肝素所需的時間段，其中步驟(iii)中之該時間段係藉由分析該溶液或藉由參考先前執行之實質上相同之步驟(iii)來確定。
熟習此項技術者將理解，在如本發明之第一態樣中所定義之方法的步驟(ii)及步驟(iii)中，自步驟(i)獲得之經氧化肝素的解聚合係藉由鹼性β消去達成。
如本文中關於本發明之第一態樣中所定義之方法的步驟(ii)及步驟(iii)所使用，提及的形成鹼性溶液應理解為指將溶液之pH值調整到約8至約13。詳言之，保持溶液之pH值低於約13係重要的。
可藉由添加合適鹼，例如鹼金屬氫氧化物(例如，氫氧化鈉)或鹼金屬碳酸鹽(例如，碳酸鈉)，來調整及/或維持溶液之pH值。
在特定具體實例中，例如藉由添加可為水溶液(例如，1莫耳至4莫耳之溶液)形式之鹼金屬氫氧化物(諸如，氫氧化鈉)將溶液之pH值調整到約10.5至約11.5。
熟習此項技術者將理解，可在較低溫度下調整溶液之pH值。在特定具體實例中，在本發明之第一態樣之方法的步驟(ii)中，在溶液處於約5℃至約10℃之溫度下的同時調整溶液之pH值。
熟習此項技術者將理解，解聚合反應之進展可藉由調整本發明之第一態樣之方法的步驟(iii)中之溫度來控制。舉例而言，溶液可維持在約5℃至約25℃(例如，約5℃至約10℃)之溫度。
熟習此項技術者將瞭解，解聚合步驟中獲得之平均分子量將決定由本發明之第一態樣中所定義之方法製造的肝素衍生物之平均分子 量。因此，溶液維持在所需pH值下(且視情況在所需溫度下)達提供具有在上述範圍(亦即，約4.6kDa至約6.9kDa)內之所需分子量之解聚合肝素所需的時間段。
熟習此項技術者將理解，獲得具有所需平均分子量之解聚合肝素衍生物所需之時間段將視本發明之第一態樣之方法的步驟(ii)及步驟(iii)中使用的條件而定。在上文所描述之條件下，該時間段將典型地為最多約四小時。
如本文中所提及，獲得具有所需平均分子量之解聚合肝素衍生物所需之時間段可藉由使用熟習此項技術者已知之技術分析溶液來確定。詳言之，可藉由自反應混合物取得樣本且使用各種基於層析之技術(諸如，GPC-HPLC)分析彼等樣本來監測解聚合肝素衍生物之平均分子量。
因此，提及的獲得具有所需平均分子量之解聚合肝素衍生物所需的時間段可指分析溶液以確認解聚合肝素衍生物具有所需分子量所需的時間段。
在特定具體實例中，使用重複GPC-HPLC分析(例如，以約30分鐘之間隔)執行溶液之分析。可使用本文中描述之技術，例如根據由Mulloy等人修改的關於低分子質量肝素之凝膠滲透層析法的歐洲藥典程序(專論0828)(「Molecular Weight Measurements of Low Molecular Weight Heparins by Gel Permeation Chromatography」,Thrombos.Haemostas. 77,1997,668-674)來執行此分析，其中利用了有關低分子量肝素之國際分子量標準來校準層析系統。
或者，獲得具有所需平均分子量之解聚合肝素衍生物所需之時間段可藉由參考先前執行之實質上相同之步驟(iii)加以確定。
如本文中所使用，提及的實質上相同之步驟(iii)應理解為指對應於本發明之方法之步驟(iii)的先前執行之方法步驟(亦即，反應)， 該方法步驟係使用實質上相同之試劑且在與本發明之第一態樣之方法的步驟(iii)實質上相同的條件下執行。
如本文中所使用，提及的實質上相同之條件應理解為指在本發明之第一態樣之方法的現存步驟(iii)中使用之彼等條件的10%變化內(例如，在5%變化內，諸如在1%變化內)的條件(諸如，pH、試劑濃度及溫度)。
如本文中所使用，提及實質上相同之試劑將包括提及使用與自本發明之第一態樣之方法的步驟(i)及步驟(ii)獲得之肝素衍生物實質上相同的肝素衍生物。
熟習此項技術者將瞭解，提及使用實質上相同之肝素衍生物的先前執行之步驟(iii)可指在實質上相同之步驟(i)及步驟(ii)之後執行的步驟(iii)。
如本文中所使用，提及實質上相同之步驟(i)及步驟(ii)應理解為以與提及實質上相同之步驟(iii)相同的方式。
詳言之，提及實質上相同之步驟(i)將指以實質上相同之未分化肝素起始的先前執行之步驟(i)。
如本文中所使用，提及實質上相同之未分化肝素可指自與本發明之第一態樣之現存方法中使用之肝素相同的供應商獲得之未分化肝素。詳言之，提及實質上相同之未分化肝素可指自與本發明之第一態樣之現存方法中使用的肝素相同的批次取得之未分化肝素。
如本文中關於實質上相同之步驟(i)、步驟(ii)及步驟(iii)所使用，提及實質上相同之試劑亦將包括提及與本發明之第一態樣之現存方法中使用的試劑在化學上相同或在功能上等效的氧化劑及/或還原劑之使用。
熟習此項技術者將理解，獲得具有所需平均分子量之解聚合 肝素衍生物所需之時間段可與在本文中所提及之實質上相同之步驟(iii)中獲得特定平均分子量所需的時間大致相同或與該時間之外延大致相同。
一旦獲得具有所需平均分子量之解聚合肝素衍生物所需之時間段消逝，即可終止解聚合反應。在特定具體實例中，可藉由形成酸性溶液來終止解聚合反應。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法進一步包含(亦即，在步驟(iii)與步驟(iv)之間)以下步驟：(iiia)使自步驟(iii)獲得之溶液經受酸處理以形成酸性溶液。
如本文中關於本發明之第一態樣之方法的步驟(iii)(及關於其提及步驟(iiia)之具體實例)所使用，提及形成酸性溶液係指藉由添加如本文中先前所定義之合適酸(例如，HCl，諸如，4莫耳HCl溶液)來調整pH值低於7(諸如，約4至約6.5，例如約5.5至約6.5)。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟：(ii)藉由使步驟(i)之產物經受鹼處理以形成具有約8至約13(例如，約10.5至約11.5)之pH值之溶液來使經氧化肝素解聚合；及(iii)將來自步驟(ii)之該溶液維持在鹼性pH值下達提供具有在上述範圍(亦即，如本發明之第一態樣中界定)內之分子量的解聚合肝素所需的時間段；及(iiia)使自步驟(iii)獲得之溶液經受酸處理以形成具有約5.5至約6.5之pH值的溶液，其中步驟(iii)中之該時間段係藉由分析該溶液或藉由參考實質上相同之步驟(iii)來確定。
還原
本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟： (iv)藉由將氫化物還原劑添加至自步驟(iii)獲得之溶液中來還原該解聚合肝素之末端醛基。
熟習此項技術者將理解，在包括步驟(iiia)的本發明之第一態樣之方法的具體實例中，步驟(iv)可指藉由添加氫化物還原劑至自步驟(iiia)獲得之溶液中來還原該解聚合肝素之末端醛基。
熟習此項技術者將瞭解，末端醛基係作為前述解聚合步驟(亦即，步驟(ii)至步驟(iii)(或適當時，步驟(ii)至步驟(iiia)))之產物形成。
添加氫化物還原劑允許還原末端醛基以形成相應一級醇。添加還原劑亦允許還原(且因此，中和)步驟(i)中使用之殘餘氧化劑，例如殘餘偏過碘酸鈉或其衍生物。此殘餘氧化劑可以過碘酸鹽(及/或碘酸鹽)物質之形式存在於溶液中，其可還原成反應性不太高的碘及碘化物物質。
添加氫化物還原劑亦可具有增加溶液之pH值(例如，到約9(例如，約10)至約11)的作用。
在前述解聚合步驟係藉由添加酸來終止之具體實例中，添加氫化物還原劑亦將與該酸反應且中和該酸。在此等具體實例中，熟習此項技術者將理解，可能需要額外氫化物還原劑以允許此類反應。
在特定具體實例中，氫化物還原劑為硼氫化物。在更特定具體實例中，氫化物還原劑為硼氫化鈉。
在特定具體實例中，添加之氫化物還原劑(諸如，硼氫化鈉)之量足以允許完全還原末端醛基及殘餘氧化物質。
熟習此項技術者將瞭解，完全還原末端醛基及殘餘氧化物質所需之氫化物之量可基於該方法中使用之肝素之量及其解聚合程度以及使用之氧化劑之量來計算。
熟習此項技術者將理解，氫化物(諸如，硼氫化鈉)可在較 低溫度下添加至溶液中(例如，以便抵消反應之放熱性質)。在特定具體實例中，氫化物係在約5℃至約17℃之溫度下添加至溶液中。
熟習此項技術者將瞭解，氫化物(諸如，硼氫化鈉)可一次性、連續或逐步(亦即，藉由添加若干較小份)添加至水溶液中。此外，氫化物可以固體或以溶液(例如，鹼穩定性水溶液，諸如硼氫化鈉之鹼穩定性水溶液)形式添加。
在添加氫化物之後，視情況在較低溫度下(例如，約5℃至約17℃下)維持反應一段足以將末端醛基完全還原成一級醇之時間。舉例而言，可維持溶液一段約4小時至約24小時(例如，約14小時至約20小時)之時間。
如本文中所使用，提及完全還原末端醛基可指獲得基本上不含醛部分之肝素衍生物，例如，其中1%之醛基保持未還原，如藉由(例如，13C)NMR分析所測定。
一旦還原末端醛基所需之時間消逝，即可中止還原反應。如本文中關於還原反應(亦即，如本文中所定義之步驟(iv))所使用，提及中止反應將被熟習此項技術者理解為指經由中和殘餘還原劑來終止還原反應。
還原反應可使用熟習此項技術者已知之技術，諸如藉由添加水，或特定而言，酸水溶液(例如，如本文中定義之強酸之水溶液，諸如，1莫耳至4莫耳HCl溶液)來中止。
在特定具體實例中，還原反應(亦即，如本文中定義之步驟(iv))可藉由降低pH值以形成酸性溶液(例如，藉由添加如本文中定義之強酸之水溶液，諸如，1莫耳至4莫耳HCl溶液)來中止。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法進一步包含(亦即，在步驟(iv)之後)以下步驟： (iva)藉由降低pH值以形成酸性溶液來中止還原反應。
如本文中關於中止還原反應(例如，在適用時，關於步驟(iva))所使用，提及降低pH值至酸性溶液係指將pH值降低至低於7。
在特定具體實例中，反應係藉由降低pH值到約2至約6(諸如，約3至約5)來中止。在更特定具體實例中，反應係藉由降低pH值至約4來中止。
在特定具體實例中，反應係藉由降低pH值至酸性溶液(例如，至約pH 4)且將溶液之pH值維持超過約30分鐘(例如，約45分鐘至約60分鐘)來中止。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法包含以下步驟：(iv)藉由將硼氫化鈉添加至自步驟(iii)獲得之溶液中來還原該解聚合肝素之末端醛基；及(iva)藉由降低pH值以形成酸性溶液來中止還原反應。
產物回收
熟習此項技術者將理解，本發明之方法可進一步包含用於回收及(若需要)純化肝素衍生物之一或多個步驟。
舉例而言，熟習此項技術者將理解，在本發明之方法包含以下步驟時：(iva)藉由降低pH值至酸性溶液來中止還原反應，回收肝素衍生物可能需要將溶液調整至中性pH值(亦即，約7)。
因此，在本發明之第一態樣中所定義之方法包含如本文中定義之步驟(iva)的特定具體實例中，該方法視情況進一步包含(亦即，在步驟(iva)之後)以下步驟：(ivb)將自步驟(iva)獲得之溶液的pH值調整至約中性。
可藉由添加合適鹼，諸如鹼金屬(例如，氫氧化鈉之水溶液)或特定而言，鹼金屬碳酸鹽(例如，碳酸鈉之水溶液)，來調整溶液之pH值。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣之方法進一步包含(亦即，在步驟(iv)或在適用時在步驟(iva)或步驟(ivb)之後)以下步驟： (v)自在步驟(iv)(或在適用時，步驟(iva)或步驟(ivb))中獲得之溶液回收肝素衍生物。
如本文中所使用，提及肝素衍生物之回收將被熟習此項技術者理解為指將由本發明之第一態樣之方法製造的肝素衍生物之至少一部分自該方法中獲得之溶液分離。
肝素衍生物之回收可使用熟習此項技術者已知之技術達成。詳言之，此等技術可包括自溶液沈澱肝素衍生物，其可藉由調整溶液之極性(例如，藉由添加極性溶劑，諸如乙醇)來達成。
自溶液回收肝素衍生物之步驟可包含(或組合有)用於例如經由移除雜質及/或不期望之結構修飾進一步純化產物之製程。
因此，在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法的步驟(v)(若進行)可包含用於純化產物之一或多個製程。
熟習此項技術者將理解，肝素衍生物之進一步純化可使用熟習此項技術者已知之技術達成。舉例而言，此方法可涉及層析技術、過濾、鉗合雜質、離心及/或乾燥方法。
使不期望之結構修飾減至最少
本發明之第一態樣中所定義之方法需要控制步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段，以便使殘餘氧化劑之影響減至最少。
如本文中所論述，殘餘氧化物質可存在於本發明之第一態樣中所定義之方法的步驟(i)中獲得之溶液中，接著可藉由在步驟(iv)中添加還原劑來中止該等物質。詳言之，已發現該等氧化物質之存在導致肝素衍生物之非特異性解聚合，亦即，並非藉由鹼性β消去(亦即，在步驟(iii)中)達成之解聚合(該解聚合導致肝素衍生物中之不期望之結構修飾)的解聚合。
因此，本發明之第一態樣中所定義之方法可能需要控制步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段，以便使殘餘氧化劑之影響減至最少且將肝素衍生物中之所得不期望之結構修飾的程度降至最低。
詳言之，提及控制步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段可指控制該時間段以使藉由在肝素衍生物之1H NMR光譜中之5.0ppm至6.5ppm區域中(詳言之，在5.95ppm及6.15ppm處)的信號特性化之存在於肝素衍生物中的不期望之結構修飾減至最少。
在特定具體實例中，提供一種製備肝素衍生物之方法，相對於在未分化肝素之1H NMR光譜之5.42ppm處的信號，該肝素衍生物在對應1H NMR光譜之5.0ppm至6.5ppm區域中具有強度(%比率)約4%(例如，約3%)的信號。
在更特定具體實例中，提供一種製備肝素衍生物之方法，相對於在未分化肝素之1H NMR光譜之5.42ppm處的信號，該肝素衍生物在相應1H NMR光譜中之5.95ppm及6.15ppm處具有強度(%比率)約4%(例如，約3%)的信號。
在特定具體實例中，本發明之第一態樣中所定義之方法包含：使步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段減至最少。
熟習此項技術者將理解，可接受的使肝素衍生物中不期望之結構修飾程度降至最低的在步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的最長時間段將視多種因素而定，諸如該時間段期間溶液之溫度及溶液中之試 劑(諸如，肝素及其所得衍生物)的濃度。
在更特定具體實例中，步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段最長為6小時(例如，約2小時至約6小時之時間)。
醫藥組成物
如本文中所論述，使用本發明之第一態樣中所定義之方法製備的肝素衍生物可用於藥品中。詳言之，含有此等衍生物之醫藥組成物可使用由本發明之第一態樣之方法獲得的肝素衍生物製備，該等組成物可用於投予至患者以便減少滯產。
因此，在本發明之第二態樣中，提供一種製備醫藥組成物(亦即，包含如關於本發明之第一態樣所定義來製備之肝素衍生物的醫藥組成物)之方法，其包含以下步驟：(a)使用如本發明之第一態樣中所定義之方法製備肝素衍生物；及(b)組合步驟(a)中獲得之肝素衍生物與一或多種醫藥學上可接受之佐劑、賦形劑或稀釋劑。
在特定具體實例中，關於本發明之第二態樣所定義之醫藥組成物可以小瓶、預填充注射器、靜脈內(IV)溶液或皮下注射用調配物形式提供。
本發明之第一態樣中所定義之方法可具有以下優點：其提供具有低抗凝血活性之低分子量肝素衍生物，該衍生物具有較低程度的由方法步驟之間保留之殘餘氧化物質之作用導致的不期望之結構修飾。此可藉由控制方法步驟達成以確保在氧化步驟完成後在最短可能時間內使用還原條件。
由於消除了殘餘氧化劑，本發明之第一態樣中所定義之方法亦可具有更可預測所得肝素衍生物之分子量的優點。此係因為已發現殘餘氧化物質(亦即，保留在本文中稱為步驟(i)之氧化步驟完成後所獲得之 肝素衍生物中的氧化物質)之存在導致肝素衍生物之非特異性解聚合，亦即，並非藉由鹼性β消去達成之解聚合(亦即，本文中稱為步驟(ii))的解聚合。
本發明之第一態樣中所定義之方法亦可具有以下優點：藉由分析解聚合步驟(亦即，在本文中稱為步驟(ii))中之溶液或藉由參考對先前已執行之實質上相同之解聚合製程的分析，熟習此項技術者可達成對肝素衍生物之分子量的較佳控制，而不必考慮起始材料之變化性(例如，當使用不同批次之未分化肝素時)。
圖1展示在本文中提供之實施例2a中所獲得之解聚合肝素之分子量隨時間變化的曲線。
實施例
本發明可藉由以下實施例進一步加以說明。
實施例1
本文中描述之方法可使用以下一般方法執行。
葡糖醛酸及艾杜糖醛酸(殘基)之氧化、抗凝血活性之缺失
將約3000公克之量之肝素(歐洲藥典及USP品質之黏膜肝素)溶解於純化水中以獲得10% w/v至20% w/v之溶液。將此溶液之pH值調整到4.5至5.5。隨後將偏過碘酸鈉(NaIO4)添加至處理溶液中，其中過碘酸鹽之量為肝素重量之15%至30%，目標為25%。再次將pH值調整到4.5至5.5。使反應器避光。處理溶液在恆定攪拌維持13℃至17℃(例如，約15℃)之溫度下反應18小時至26小時，其中在最後兩小時期間將溫度降低至5℃。
藉由鹼性β消去法進行之多醣鏈之解聚合
在溫度維持於5℃至10℃之同時，添加NaOH溶液，直至獲得10.5至11.5之pH值。由此起始解聚合反應，由於中和OH-離子，此導致pH值之緩慢降低。因此，藉由添加NaOH或Na2CO3溶液來小心地升高pH值且將其嚴格控制在10.5至11.5之範圍中。同時，開始製程中控制以藉由重複之GPC-HPLC分析來跟蹤解聚合程度。反應進行長達4小時或直至獲得最佳分子量。5.7kDa至6.3kDa之目標分子量範圍係較佳的。可使用表格(參見實施例2)或曲線(參見圖1)來預測獲得較佳分子量範圍所需之反應時間。
藉由緩慢添加4M之HCl，直至獲得5.5至6.5之pH值來停止反應。
藉由用串聯TSK 2000及TSK 3000 SW管柱(使用有關LMWH之第一國際標準來校準)進行之GPC-HPLC測定分子量。使用折射率監測洗提液之濃度。
碘化合物成為碘化物及碘之還原、藉由使多醣之末端醛基轉化成相應醇進行的產物穩定化
在溫度維持於5℃至17℃之同時，接著分數份(此舉避免由放熱反應導致之過熱)添加130公克至200公克之量之硼氫化鈉，且pH值將升高至9(例如，10)至11。反應持續14小時至20小時。在此反應時間之後，緩慢添加稀酸，以便將pH值調整至4，此舉使剩餘硼氫化鈉降解。在維持pH 4達45分鐘至60分鐘之後，藉由稀NaOH溶液將溶液之pH值調整至7。
還原產物之沈澱及含碘化合物之初始移除
在小心攪拌下且在5℃至25℃之溫度下，經0.5小時至1小時之時間將乙醇(95%至99.5%)添加至反應混合物中。待添加之乙醇的體 積在每體積處理溶液1體積至2體積乙醇之範圍中。接著使經氧化肝素沈澱且沈積15小時至20小時，此後，傾析母液並丟棄。接下來，將沈積物溶解於純化水中以獲得15% w/v至30% w/v處理溶液。添加NaCl以在處理溶液中獲得0.15mol/L至0.30mol/L之濃度。
產物之純化
接著將一體積之處理溶液添加至1.5體積至2.5體積之乙醇(95%至99.5%)中，之後在>2000 G及<20℃下離心20分鐘至30分鐘，此後，傾析上清液且丟棄。
接著將藉由離心獲得之產物糊漿溶解於純化水中以獲得10% w/v至20% w/v之產物濃度。接著，添加NaCl以獲得0.20莫耳/公升至0.35莫耳/公升之濃度。另外，每體積處理溶液添加1.5體積至2.5體積之乙醇(95%至99.5%)，以使產物自溶液沈澱。之後在>2000 G及<20℃下離心20分鐘至30分鐘，此後，傾析上清液且丟棄。
接下來，向剩餘糊漿添加純化水以使其溶解。產物濃度現將在10% w/v至20% w/v之範圍中。現將產物溶液之pH值調整到6.5至7.5。接著過濾溶液以移除任何顆粒。接著，將1.5體積至2.5體積之乙醇(95%至99.5%)添加至一體積之處理溶液中。之後在>2000 G及<20℃下離心20分鐘至30分鐘，此後，傾析上清液且丟棄。
沈澱糊漿之大小及含水量的降低
接著使反應器充滿乙醇，體積為2公升。在攪拌乙醇的同時，添加沈澱糊漿。機械攪拌使該糊漿固化且用乙醇替換現存的水，從而提供均質粒子懸浮液。在1小時至2小時後中斷攪拌，此後，使粒子沈積，接著傾析母液。將此程序重複兩次。在聚丙烯(polypropylene；PP)濾布上分離沈澱物。將此程序再重複兩次。在移除過量液體之後，使粒子穿過篩網以獲得較小且均勻大小之粒子。
真空乾燥及篩分
將產物均勻分佈在兩個預先稱重之托盤上，且置放於真空櫃中。用真空泵降低壓力，記錄實際獲得之壓力，且將托盤加熱至35℃至40℃，同時持續記錄溫度。在維持乾燥機中之低壓的同時，使氮氣流穿過乾燥機。2天至3天之後，自乾燥櫃移出托盤，且量測其重量。接著再繼續乾燥24小時，此後將托盤取出且稱重。執行此程序以監測乾燥之進展。當獲得恆定重量，亦即，注意到無進一步蒸發時，認為乾燥完成。將乾燥產物分配於由層壓塑膠/鋁箔覆蓋之兩層塑膠袋中。在乾燥區域中於20℃至25℃之溫度下執行儲存。
實施例2
在三組條件(實施例2a、實施例2b及實施例2c)下使用兩個不同批次之未分化肝素(本文中稱為批次A及批次B)在以下一般條件下執行該方法。
葡糖醛酸及艾杜糖醛酸(殘基)之氧化、抗凝血活性之缺失
將約25公克之量之肝素溶解於純化水中以獲得15% w/v之溶液。接著，將6.25公克之偏過碘酸鈉(NaIO4)添加至處理溶液中，且將pH值調整到4.9至5.0。使反應器避光。處理溶液在恆定攪拌維持15℃之溫度下反應22小時，此後，在最後兩小時期間將溫度降低至5℃。總反應時間為24小時。
藉由鹼性β消去法進行之多醣鏈之解聚合
在溫度維持於5℃至10℃之同時，添加NaOH溶液，直至獲得11至11.5之pH值。繼續監測pH值且經250分鐘將其調整至關於實施例2a、實施例2b及實施例2c(以下)所指示的pH值。藉由緩慢添加4M之HCl，直至獲得5.5至6.5之pH值來停止反應。調整pH值所需之時間為約15分鐘。
在反應時間期間，在反應時間期間之指定時間點取得十一個樣本。立即藉由15mM之磷酸鹽緩衝溶液稀釋樣本，且將pH值調整至7以停止正在進行之反應。接著使樣本經受藉由GPC-HPLC進行之分子量分析，如下所論述。創建有關每一方法的表格(見下文)。藉由用串聯TSK 2000及TSK 3000 SW管柱(如本文中所論述，使用有關LMWH之第一國際標準來校準)進行之GPC-HPLC測定分子量。使用折射率監測洗提液之濃度。
碘化合物成為碘化物及碘之還原、藉由將多醣之末端醛基轉化成相應醇進行的產物穩定化
在溫度維持於5℃至15℃之同時，接著在30分鐘期間分數份(此舉避免由放熱反應導致之過熱)添加1.75公克之量之硼氫化鈉，且將pH值升高至10。在添加硼氫化鈉完成後，自溶液取出樣本且分析分子量。結果確認分子量保持不變。繼續反應20小時。在此反應時間之後，添加稀酸，直至獲得4至4.5之pH值，由此降解剩餘硼氫化鈉。注意到氫氣泡之形成，此確認最初添加了超過所需量之NaBH4。在維持pH 4達45分鐘至60分鐘之後，藉由稀NaOH溶液將溶液之pH值調整至7。
還原產物之沈澱及含碘化合物之初始移除
在小心攪拌下且在5℃至25℃之溫度下，經0.5小時至1小時之時間將乙醇(95%至99.5%)添加至反應混合物中。添加之乙醇的體積為每體積處理溶液1.5體積乙醇。使產物自溶液沈澱析出，且在約5000 G下離心20分鐘以分離產物。接著，傾析母液。接下來，將產物糊漿溶解於純化水中以獲得15% w/v至30% w/v處理溶液。添加NaCl以在處理溶液中獲得0.15莫耳/公升至0.30莫耳/公升之濃度。接下來，添加乙醇，添加量為每一體積處理溶液2體積乙醇。使產物自溶液沈澱析出，且在約>2000 G下離心20分鐘以分離產物。再次傾析母液。
接下來，向剩餘糊漿添加純化水以使其溶解。產物濃度現處 於15% w/v至30% w/v之範圍中。接著將產物溶液之pH值調整到6.5至7.5，且接著過濾溶液以移除任何顆粒。接著，將2體積乙醇(95%至99.5%)添加至一體積之處理溶液中。之後在>2000 G及在<20℃下離心20分鐘至30分鐘，此後，傾析上清液且丟棄。接著藉由將乙醇添加及傾析以及手動研磨糊漿重複兩次來使糊漿脫水。
真空乾燥及碾磨
接著將經脫水糊漿轉移至一個連接至真空乾燥機之玻璃燒瓶中。之後在真空下在38℃至40℃之溫度下進行乾燥。在乾燥約48小時之後停止乾燥。之後進行碾磨，此後，將最終產物分配在氣密式玻璃小瓶中。
解聚合步驟之分析
藉由GPC-HPLC，使用串聯TSK 2000及TSK 3000 SW管柱(使用有關LMWH之第一國際標準來校準)分析解聚合步驟之進展(使用如本文中所描述之技術)。使用折射率監測洗提液之濃度。
以下關於實施例2a至實施例2c中之每一者提供的表格展示在各別反應條件下達成特定平均分子量所用之時間。如圖1提供之曲線中亦展示了關於實施例2a所指示之時間。
實施例2a
實施例2a係在解聚合反應中使用批次A之肝素在pH 11下反應。
實施例2b
實施例2b係在解聚合反應中使用批次A之肝素在pH 11.5下反應。
實施例2c
實施例2c係在解聚合反應中使用批次B之肝素在pH 11下反應。
實施例3
下表展示遵循歐洲藥品品質及健康管理局(European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare；EDQM)專論7(如歐洲藥典中所述)，使用實施例2中所述之程序獲得之肝素衍生物的1H NMR分析之結果。
實施例4
由根據本文中提供之實施例中之任一者之方法獲得的產物可藉由習知無菌方法調配為醫藥組成物。
詳言之，可藉由形成包含150mg/mL之活性產物及15mM之磷酸鈉且pH值為6至8的溶液來製備醫藥組成物。如此獲得之醫藥組成物主要意欲用於皮下投予，但亦適於靜脈內投予。

Claims (16)

  1. 一種用於製備具有約4.6kDa至約6.9kDa之平均分子量及小於約10IU/mg之抗因子Xa活性之肝素衍生物的方法，其中該肝素衍生物具有-如以下式I中所示的主要存在之雙醣：
    Figure TWI672146B_C0001
    其中：
    Figure TWI672146B_C0002
    且n為2至20之整數，對應在1.2和12kDa之間的分子量，以及-相對於在未分化肝素之1H NMR光譜之5.42ppm處的信號，在1H NMR光譜中之5.0ppm至6.5ppm區域中之強度(%比率)小於或等於約4%的信號，該方法包含以下連續步驟：(i)藉由添加氧化劑來氧化未分化肝素之酸性水溶液；(ii)藉由使步驟(i)之產物經受鹼處理以形成鹼性溶液來使該經氧化肝素解聚合；(iii)將來自步驟(ii)之該溶液維持在鹼性pH值下達提供具有在該上述範圍內之分子量之解聚合肝素所需的時間段，其中步驟(iii)中之該時間段係藉由分析該溶液或藉由參考先前執行之實質上相同之步驟(iii)來確定；及(iv)藉由將氫化物還原劑添加至自步驟(iii)獲得之該溶液中來還原該解聚合肝素之末端醛基，其中步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段經控制以使殘餘氧化劑之影響減至最少。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該肝素衍生物中，至少70%的分子具有大於約3kDa之分子量。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該肝素衍生物包含具有如表1中所示之累積分子量分佈之多醣：
    Figure TWI672146B_C0003
    。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該肝素衍生物之1H NMR光譜的信號係存在於約5.95ppm及約6.15ppm處。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其該肝素衍生物也具有小於10IU/mg之抗因子IIa活性。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其該肝素衍生物具有小於5IU/mg之抗因子Xa活性及/或小於5IU/mg之抗因子IIa活性。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中存在於該肝素衍生物中之多醣鏈基本上不含介導抗凝血作用之化學上完整的醣序列。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(i)後，起始未分化肝素物質中至少約90%之非硫酸化鄰二醇部分已被轉化為相應醛。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該等非硫酸化鄰二醇部分包含肝素之艾杜糖醛酸及葡糖醛酸殘基。
  10. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(i)中使用之該氧化劑為偏過碘酸鈉。
  11. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(i)需要在約4.5至約5.5之pH值下且在較低溫度下藉由添加偏過碘酸鈉來氧化未分化肝素之水溶液。
  12. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(ii)需要藉由使步驟(i)之產物經受鹼處理以形成具有約8至約13之pH值的溶液來使該經氧化肝素解聚合。
  13. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該方法進一步包含一或多個以下步驟：(iiia)使自步驟(iii)獲得之該溶液經受酸處理以形成具有約5.5至約6.5之pH值的溶液；(iva)藉由降低該pH值以形成酸性溶液來中止該還原反應；及視情況，(ivb)將來自步驟(iva)之溶液之pH值調整至約中性；以及(v)自步驟(iv)(或在適用時，步驟(iva)或步驟(ivb))中獲得之溶液回收該肝素衍生物。
  14. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中步驟(iv)中使用之還原劑為硼氫化鈉。
  15. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(i)之完成與步驟(iv)之開始之間的時間段最長為6小時。
  16. 一種製備包含肝素衍生物之醫藥組成物的方法，該方法包含以下步驟：(a)使用如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之方法製備肝素衍生物；及(b)組合步驟(a)中獲得之該肝素衍生物與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
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