CN105026480A

CN105026480A - 包含透明质酸的稳定组合物

Info

Publication number: CN105026480A
Application number: CN201480013335.5A
Authority: CN
Inventors: D·M·格雷维特; P·何
Original assignee: Carbylan Biosurgery Inc
Current assignee: Kalvista Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-01-11
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2015-11-04
Also published as: TW201446270A; KR20150104202A; US20150352142A1; HK1214618A1; JP2016506909A; WO2014110454A1; EP2943531A1; CA2897976A1; AU2014205213A1; RU2015133465A; BR112015016734A2; IL239894A0; AU2014205213B2

Abstract

本发明提供了基于透明质酸的组合物及相关方法，在稳定量的一种或多种稳定化助剂存在的情况下，该组合物包含基于透明质酸的聚合物和皮质类固醇。所得组合物在储存、加工和使用条件下基本上保持其粘弹性和相关的流变性。

Description

包含透明质酸的稳定组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年1月11日提交的美国临时专利申请序列号为61/751,811的优先权，将该专利申请的全部内容并入本发明中作为参考。

技术领域

本发明通常涉及包含透明质酸和/或基于透明质酸的聚合物的组合物，以及用于制造、使用和稳定该组合物的相关方法。所得的具有生物相容性的组合物，如药物组合物，可以用于例如生物活性剂的局部传递，以及各种医学病症的治疗。一般情况下，当与不含有稳定量的稳定化助剂相比时，所得的组合物可以更好地保持其粘度不随时间而变化，更具体的详情如下所述。

背景技术

透明质酸是一种天然存在的、阴离子型的非硫酸化粘多糖，其广泛分布于结缔组织、上皮组织，和神经组织。平均体重为70kg(154lbs)的人在他/她的体内具有约15g的透明质酸，其中的三分之一每天被周转代谢(降解和合成)(Stern R.Eur J Cell Biol 83(7):317–25,(2004))。由于透明质酸天然存在于人体内的多个组织中，从而具有生物相容性，因此，认为其非常适合于生物医学应用。遗憾的是，透明质酸以其天然存在的形式作为治疗给药和使用时，通常从体内被快速清除，使得必须频繁给药。因此，非常有必要获得既可以保持透明质酸原型所具有的如良好生物相容性的优点，又可以克服其被快速清除的问题的透明质酸剂型。理想情况下，该剂型应该具有良好的细胞相容性，有利的化学、流变学和其他特性，良好的稳定性，并具有方便给药的特点。

之前已经描述了透明质酸的化学修饰形式。请参阅，例如J.W.Kuo,et al.,Materials of Biological Origins–Materials,Analysis,and Implant Uses,Comprehensive Biomaterials,Elsevier,2010。透明质酸(也被称为玻尿酸)，其衍生形式、相关的组合物和共轭物，可以被用作注射生物材料，以及被用于医疗设备和植入材料。其应用包括将治疗分子传递至局部位点，用作粘合剂或密封剂，用于组织工程中，用作粘弹性补充剂，以及用于伤口愈合过程，等等。基于透明质酸的材料可以被制备成多种不同的形式-粘弹性溶液，软或硬的水凝胶、无纺布编织网、海绵，等等，并且可以在临床前和临床环境范围内使用。对于多种临床前和临床用途，保持这种基于透明质酸的材料的粘弹性是很重要的。

因此，能够提供基于透明质酸的组合物是非常有益的，该组合物可以基本上保持其粘弹性，例如在储存、加工和使用条件下表现出良好的化学和物理稳定性。

发明内容

本申请是基于，至少部分基于申请人的发现，即包含如曲安奈德(triamcinolone acentonide)或其它皮质类固醇的基于透明质酸(HA)聚合物的组合物，表现出粘度随时间的损失明显大于不含有皮质类固醇的基于相同HA聚合物的组合物所观察到的结果。根据上述发现，申请人已经确定某些材料可以有效地明显稳定这种含有HA聚合物的组合物，通过引入一种或多种这种稳定化助剂使得粘度随时间基本上保持不变。因此，当与不含有稳定化助剂的类似组合物相比时，本发明提供的组合物可以更好地保持其粘度随时间的变化(例如，表现出减少粘度随时间的损失)。另外，本发明还提供了一种改善含有皮质类固醇的基于透明质酸的组合物的储存稳定性的方法，该方法包括将稳定量的助剂引入该组合物中，可以有效地导致稳定比(具体条件如下所述)大于1，优选为大于1.2，更有选为大于1.3，其中，所述稳定比是含有稳定化助剂的主体组合物相对于不含有稳定化助剂的相同组合物的粘度随时间损失的减少的测量值。(稳定比大于1表示在规定的时间点和特定的储存条件下粘度保留百分数相比不含有助剂的对照组合物的改善)。

该组合物、方法、用途等的其它实施方式通过以下描述、实施例和权利要求体现。通过上述和下述内容可以理解的是本发明所述的每一个特征，以及两个或多个特征的每一种组合均被包含在本发明的范围内，本发明提供的包含这种组合形式的特征是不相互矛盾的。另外，本发明的任何实施方式均未特定包含任何特征或特征的组合。本发明的其它特征及优点将在下述内容中予以说明，特别考虑到将具体实施例和附图结合。

附图的简要说明

本申请无附图。

具体实施方式

下文将对本发明进行更全面地描述。然而，本发明可能通过多种不同的方式进行实施，而不应该被理解为仅限于本发明所述的实施方式；更确切地说，提供这些实施方式使得本发明公开得彻底和完全，并且向本领域技术人员充分地传达了本发明所要保护的范围。

本申请引用的所有发表文献、专利和专利申请，无论上文还是下文，均以其整体的形式并入本文，除非另有说明。例如，在并入本文的发表文献、专利或专利申请以及本发明公开的内容中均定义了相同的术语，在本发明公开的内容中的定义表示的是对照定义。参考发表文献、专利和专利申请中对化合物、化学物质等的特定类型的描述，与所述化合物、化学物质等的相关部分为本文中以引用的方式所包含的文献部分。

定义

必须注意的是，本说明书中使用的单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包含复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，所述“聚合物”包含单一聚合物，以及两种或多种相同的或不同的聚合物。

除非特别注明，本文中术语的定义均为有机合成，以及聚合物和制药科学领域中使用的标准定义。

在本发明的描述和权利要求中，根据如下所述的定义使用以下术语。

“生物相容聚合物”是具有降解产物的聚合物，其与活体组织相容，或者具有有益的生物学特性。生物相容聚合物其自身可能具有生物相容性，和/或当与生物活性剂联合使用时具有协同生物相容性。

术语“透明质酸聚合物”指的是含有重复二糖亚单位玻尿酸的聚合物，其中，在二糖重复亚单位的D-葡萄糖醛酸和/或D-N-乙酰葡糖胺单位的一个或多个位点该重复单位可能被衍生化。透明质酸聚合物或基于透明质酸的聚合物是指包含透明质酸(也被称为玻尿酸、衍生化的透明质酸、盐的形式，和透明质酸连接复合物。

术语“透明质酸”指的是未经修饰的或非衍生化的透明质酸。

术语“透明质酸衍生物”或“衍生化的透明质酸”或“经修饰的透明质酸”或“取代的透明质酸”指的是经过化学修饰的透明质酸。

术语“反应活性”指的是官能团(如存在于聚合物中)在有机合成的常规条件下容易发生反应或者以实际速率发生反应。这与那些不能发生反应或者需要强催化剂或者在不可行的反应条件下才可发生反应(如“无反应活性的”或“惰性”基团)的基团截然不同。

本文中使用的“分子质量”或分子量，在水溶性聚合物如透明质酸背景下指的是通过多角度激光散射法测定的聚合物的标称平均分子质量。分子量可以被表示为数均分子量或者重均分子量。除非另有说明，本文中引用的所有分子量均指的是数均分子量。在缺少分子量值的情况下，聚合物还可以通过其内在的或固有的粘度进行表征，这是一种用于测量分子量的粘度测定法。

术语“水凝胶”指的是含水的三维亲水性聚合物网状结构或凝胶，其中，水是连续相，例如，含水量大于50％(w/w)。

所谓“凝胶化”指的是材料呈凝胶态。

“无菌”组合物为使用美国药典无菌检验确定的无活体微生物的一种组合物。请参阅“美国药典”，第30次修订版，美国药典委员会：2008。

可以互换使用的术语“药物”或“药物活性剂”或“生物活性剂”或“活性剂”指的是具有生物活性并且适用于或者被用于治疗目的的任何有机或无机化合物或原料药。“药物”的更广泛的定义包括蛋白质、激素、抗癌剂、小分子化学化合物和类似物、寡核苷酸、DNA、RNA和基因疗法。如本发明所使用的，所述药物如皮质类固醇，以及本发明中所述的其它化学化合物，指的是包含任何其药学可接受形式的化合物，包括异构体，例如非对映体和对映体，盐、溶剂化物和多晶型物，特别是晶型，以及外消旋混合物和本发明所述化合物的纯异构体，如果适用的话。

“水不溶性药物”或“水溶性差的药物”为一种水溶解度低于10mg/mL的药物。

如本发明提供的术语组合物(或水凝胶或聚合物)的“有效量”或“药物有效量”或“治疗有效量”指的是非毒性但是足以使组合物发生预期反应的量，如预防、减轻或消除受试者体内的疼痛。所需的准确量将因受试者而异，这依赖于受试者的种族、年龄和一般情况、治疗时的病情严重程度、使用的特定药物或多种药物、该组合物的特性、给药方式等等。任何个例的合适“有效”量均可以通过一名本领域的普通技术人员使用常规实验方法进行确定。

“任选的”或“可选地”指的是随后所述的情况可能发生或者可能不发生，所以所述内容包括情况发生的实例及其不发生的实例。

关于某一特征或实体的术语“基本上”指的是就该特征或实体方面达到显著程度或者几乎完全的程度(如达到85％或以上的程度)。

术语“约”，特别是关于规定量，指的是包含加或减百分之五的偏差。

附加定义也可以在下面的章节中找到。

概述

本申请是基于，至少部分基于申请人发现某些助剂可以有效地稳定组合物，通常为含有基于透明质酸的聚合物和皮质类固醇的水性组合物。如前所述，申请人认为含有基于透明质酸的聚合物和皮质类固醇的水性组合物表现出的粘度随时间的损失明显大于含有基于相同的HA的聚合物但无皮质类固醇的组合物所观察到的结果。基于前述内容，申请人已经确定某些材料可以有效地显著地稳定如包含HA聚合物的组合物，例如通过引入一种或多种该稳定化助剂可以基本上消除粘度随时间的损失。

在本文中，“稳定”指的是减少含有透明质酸聚合物-皮质类固醇(HA-CORT)的组合物所观察到的粘度(虽然也可以使用其它测量方式)随时间损失的程度，例如，当与未引入助剂的含有相同透明质酸聚合物-皮质类固醇的组合物相比较时。从实施例1-27可以看出，当暴露于加速储存的稳定条件下时(例如，在延长时间间期加速温度)，与不含有所述稳定化助剂的HA-CORT组合物相比，含有稳定量的某些糖(单糖，二糖，多糖)、糖醇、多元醇、以及含有多元醇的表面活性剂的HA-CORT组合物通过它们的稳定比表现出其粘度的保留明显提高。稳定比是在特定的时间点和规定的储存条件下测量时，含有HA-CORT稳定化助剂的组合物(HA-CORT-SA)的HA粘度保留百分数与相同HA-CORT组合物(不含有助剂)的HA粘度保留百分数的比值。以这种方式，通过将数据标准化，可以很容易比较助剂的作用。在制备的组合物中，仅含有透明质酸聚合物的组合物的数据表明皮质类固醇对HA的粘度具有失稳作用，这可以通过其作用的减弱进行证明。例如，请参阅实施例1A。在材料由于稳定化助剂的引入而有效的情况下，粘度随时间的保留百分数具有显著性。例如，特别有用的组合物为那些于60℃下储存6天时与其初始粘度值(零时间点)相比表现出粘度的降低不超过约50％。作为稳定化助剂的合适材料，当于60℃下储存6天时通常将表现出相应组合物的稳定比至少为1.2，优选地至少为1.3。从实施例可以看出，有效的助剂在上述条件下产生的稳定比范围为约1.2至约2.6或更高。(加速储存条件/保质期的选择是任意的并且仅需为适合作为本发明所述组合物助剂的材料提供方便的评价测量方法)。根据支持的实施例中可以看出，基于HA的组合物可以在多个温度(40℃、45℃、55℃、60℃、80℃等)、湿度(环境湿度和增湿环境)和储存期(数小时，如10小时、20小时、22小时、25小时、30小时等；数天，如1天、3天、5天、6天、7天、15天、30天、45天等；数周，如1周、2周、3周、4周、6周、8周等；数月，如1个月、2个月、4个月、5个月、6个月等，或者甚至数年(1年或以上))条件下进行测定。根据实施例可以看出，样本储存在更极端的条件下通常可以观察到更明显的作用，如高温(例如请参阅实施例13，在80℃下实施(观察到的稳定比的范围为约5至约7)，或者延长时间间期(例如请参阅实施例22，其中稳定的组合物所具有的稳定比为7.47)。

组合物

基于HA的组分

本发明所述的组合物中使用的透明质酸聚合物可以被衍生化或者未被衍生化，并且可以或者不可以发生交联。另外，本发明所述组合物可以包含一种以上的透明质酸，例如经化学修饰的透明质酸(其自身可以或者不可以发生交联)、交联的透明质酸、未经修饰的透明质酸，或者为前述的组合。更具体地，透明质酸聚合物组分可以为流体形式或者凝胶形式或者二者的组合。在一种优选的实施方式中，透明质酸聚合物包含悬浮在未经修饰的透明质酸水溶液中的经修饰的透明质酸凝胶。

一种示例的经修饰的透明质酸为通过将其羟基与二乙烯砜反应使其衍生化，然后与交联剂如PEG-二硫醇轻微交联所得的透明质酸。在优选的实施方式中，被修饰的透明质酸的程度为10％或更少，在该过程中通过与二乙烯砜反应将其10％或更少的羟基转化为(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)基团((2-(vinylsulfonyl)ethoxy)groups)。特别地，透明质酸所具有的羟基转化为(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)基团的转化度可以选自：1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,和10％。可选地，透明质酸具有的羟基转化度可以在任意两个上述百分率之间的范围内：例如，从1-10％，2-10％，3-10％，4-10％，等等，以及提供的整数的每个组合，例如，从2-7％，从2-6％，从3-8％，从3-7％，等等。在另一个更具体的实施方式中，透明质酸具有的羟基转化为(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)基团的转化度约为每二糖重复单位4-5％。母体聚合物的取代/修饰程度可以通过任意数量的合适方法进行确定，例如NMR，UV，或IR分析，或元素分析。所产生的具有活性的透明质酸通常指的是2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)透明质酸以及美国专利编号7,829,118所述的VS-HA。

适用于与透明质酸聚合物反应的交联剂例如可以为VS-HA，其中包括含有两个或多个硫醇基团的含有硫醇的交联剂。该硫醇基团将与如经乙烯砜衍生化的透明质酸中的乙烯砜发生反应。例如硫醇交联剂可以包括PEG-二硫醇(HS-PEG-SH)，三臂-PEG-三硫醇(3-arm-PEG-tri-thiol,以丙三醇为核)，四臂PEG-terathiol(4-arm PEG-tetrathiol,以季戊四醇为核)，或者八臂PEG-八硫醇(8-arm PEG-octa-thiol,以三羟甲基丙烷为核)。优选的交联剂为PEG-二硫醇。交联剂的分子量通常小于经修饰的透明质酸。一般情况下，交联剂的分子量范围为约200至约20,000道尔顿。示例性交联剂的分子量，如PEG硫醇，或任何其它合适的交联剂，包括约3350,3400，和5000道尔顿，或在其它范围内。例如，请参阅本文中的实施例28-33。实施例28描述了一种示例性经乙烯砜衍生化的透明质酸的制备，其具有的经乙烯砜修饰的水平约为4％。实施例29描述了通过乙烯砜衍生化的透明质酸的反应制备凝胶的过程，所述透明质酸经分子量为3400的PEG-二硫醇交联剂进行了低水平修饰。实施例30描述了在生理盐水中的HA-VS/PEG-二硫醇凝胶浆料的制备，而实施例31描述了在透明质酸溶液中的HA-VS/PEG-二硫醇凝胶浆料的制备。所有这些剂型提供了适用于引入稳定化助剂的示例性透明质酸聚合物组分，例如水溶液、凝胶及其组合。

基于透明质酸的聚合物还可以包含如PCT/US/2004/040726(WO2005/056608)所述的酰肼反应性基团和/或氨氧基反应性基团，本发明关于HA衍生化的相关部分以及产生的聚合物本身以其整体形式被本文用作参考。

可选地，所述HA可以为经硫醇衍生化的，例如为经硫醇衍生化的透明质酸。示例性经硫醇衍生化的透明质酸聚合物包含如美国专利号7,981,871；6,884,788；6,620,927；6,548,081；6,537,979；6,013,679；5,502,081；和5,356,883所述的部分，与本文包含的以其整体作为参考的所述经硫醇衍生化的聚合物相关的部分。

透明质酸聚合物的额外实施例包括经半胱氨酸衍生化的透明质酸，其中包含但不仅限于“粘多糖药物复合物的控释”R.V.Sparer et al.,Chapter 6,pages 107-119,in T.J.Roseman et al.,CONTROLLED RELEASE DELIVERYSYSTEMS,Marcel Dekker,Inc.,New York(1983)中所述的那些聚合物。

额外的优选聚合物的实施例包含经衍生化的透明质酸，其中通过烃基、芳基、取代的烃基或取代的芳基将硫醇侧基连接至N-酰基脲基团。本文提供的组合物和方法中使用的示例性聚合物包含Carbylan^TM-S(详情如国际专利公开号WO 2005/056608所述)。

另外，透明质酸或经衍生化的透明质酸可以与反应连接剂共价结合和/或与具有双官能或多官能作用的丙烯酸酯、烯丙基或甲基丙烯酸酯化合物发生交联。用于透明质酸修饰的代表性连接剂包括，但并不限于，聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)、聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(PEGDM)、聚(乙二醇)二丙烯(PEGDAA)和聚(乙二醇)二甲基丙烯酰胺(PEGDMA)，及其衍生物。前述连接剂的PEG部分可以为低聚的或是聚合的，例如，含有2至100或更多的亚单位。适用于聚合物如透明质酸的修饰/官能化的额外连接剂包括但不限于葡聚糖酯、葡聚糖酯、葡聚糖丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酯官能化的透明质酸、丙烯酸酯官能化的透明质酸、甘油二甲基丙烯酸酯、1,3-二甘油醇酸二丙烯酸甘油酯、山梨醇酯及其衍生物。

透明质酸或基于透明质酸的聚合物通常具有的平均分量范围为约700至3,000,000道尔顿。例如分子量范围可以从约1,000至2,000,000道尔顿，或者从约5,000至1,000,000道尔顿。额外的合适分子量范围包括从约50,000道尔顿至约1,000,000道尔顿，或者从约100,000道尔顿至约1,200,000道尔顿，或者从约90,000道尔顿至约300,000道尔顿。透明质酸的分子量通常为分子质量的平均值，例如，可以通过多角度激光散射排阻色谱法(MALLS-SEC)进行确定。根据其来源，透明质酸具有的多分散度(M_w/M_n)可高达3左右，或者在优选情况下高达2左右。一般情况下，透明质酸具有相当窄的分子量分布，其值低于约2.5，更优选为低于约2。透明质酸聚合物的示例性多分散度的范围为约1.02至约2.5，其中初始透明质酸具有的多分散度可以约为1.02,1.05,1.1,1.2,1.3,1.3,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,0,2.1,2.2,2.3,2.4或2.5，或者甚至更高。可选地，透明质酸聚合物在特定浓度的水中的粘度通常以厘泊为单位，这相当于上述平均分子量范围中的任意一种或多种。

如上所述，透明质酸组分可以包含透明质酸水溶液中的基于交联HA的水凝胶颗粒。实施例31描述了一种所述组合物。优选的水溶液为透明质酸的生理盐水溶液，其中，被加入至水凝胶的示例性透明质酸的水溶液具有的浓度范围为按照重量计从约0.3％至约4％，或者约0.5％至约2％。一种代表性剂型包含以下相对量的组分：含有2mL浓度为20mg/mL透明质酸的4mL凝胶浆料((2-(乙烯基)乙氧基)1-10％透明质酸/PEG-二硫醇)。特别优选的剂型包括含有2mL浓度为20mg/mL透明质酸的4mL凝胶浆料((2-(乙烯基)乙氧基)4％透明质酸/PEG-二硫醇)。一般情况下，在所得的膨胀凝胶中透明质酸的最终含量的范围为约0.05％至5％(0.5mg/mL至50mg/mL)。优选地，在所得的膨胀凝胶中透明质酸的最终含量的范围为约0.1％至3％，或者约0.1％至1％，或者约0.5-0.8％。在所得的膨胀凝胶中透明质酸的示例性最终浓度，例如可以相当于以下任意百分数：0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,2.0,3.0,4.0,和5.0。例如，透明质酸相对于所得的组合物中交联的(如(2-(乙烯基)乙氧基)1-10％透明质酸/PEG-二硫醇)水凝胶颗粒的代表性相对量(重量比)通常在约10:1，或约5:1，或约3:1，或约1:1范围内。

其它的示例性基于HA的组合物包括那些被称为(一种含有hylan A流体，hylan B凝胶，和生理盐水的凝胶样混合物)，HYLASTAN^TM,MONOVISC^TM,(请参阅美国专利公开号2012/01426229)或进一步还包含皮质类固醇的组合物。本发明提供的结合皮质类固醇和稳定化助剂使用的其它基于透明质酸的组合物包括那些如美国专利号4,713,448，美国专利号5,143,724，美国专利号5,827,937，美国专利号6,013,679，美国专利号5,356,883，美国专利号5,502,081，以及美国专利号6,884,788，6,548,081，6,620,927所述的组合物。

在一种或多种实施方式中，本发明提供的透明质酸聚合物组分是无菌的。灭菌的常规方法包括加热，高压灭菌，化学处理或过滤。

皮质类固醇

本发明所述的基于HA聚合物的组合物包含皮质类固醇。如前述所讨论的，申请人认为含有皮质类固醇如曲安奈德或其它的水性透明质酸聚合物的组合物表现出的粘度随时间的损失大于不含有皮质类固醇的相同组合物所观察到的结果。因此，认为有必要提供对粘度随时间的降低具有强大耐受性的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物。

一般而言，皮质类固醇选自以下的一种或多种：氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、醋酸可的松(cortisone acetate)、巯氢可的松(tixocortol pivalate)、泼尼松龙(prednisolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)、呋曲安奈德(triamcinolone furetonide)、己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide)、双乙酸呋曲安奈德(triamcinolone diacetate)、曲安西龙醇(triamcinolonealcohol)、莫米松(mometasone)、安西奈德(amcinonide)、布地奈德(budesonide)、地奈德(desonide)、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、氟轻松(fluocinoloneacetonide)、哈西奈德(halcinonide)、倍他米松(betamethasone)、倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate)、氟可龙(fluocortolone)、氢化可的松-17-丁酸酯(hydrocortisone-17-butyrate)、氢化可的松-17-戊酸酯(hydrocortisone-17-valerate)、阿氯米松双丙酸酯(aclometasone dipropionate)、倍他米松戊酸酯(betamethasone valerate)、倍他米松二丙酸酯(betamethasonedipropionate)、泼尼卡酯(prednicarbate)、氯倍他松-17-丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、氯倍他松-17-丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、氟可龙己酸酯(fluocortolone caproate)、氟可龙新戊酸酯(fluocortolone pivalate)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)、倍他米松二丙酸酯一水合物(beclomethasone dipropionate monohydrate)、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、糠酸莫米松一水合物(mometasone furoatemonohydrate)和糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)。

在一个优选的实施方式中，该组合物包含曲安奈德。本发明提供的在水凝胶剂型中使用的一种优选的化合物为曲安西龙(11β，16α)-9-氟11,16,17,21四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮)，或者为其衍生物如曲安奈德，或者为其药学上可接受的盐，酯或溶剂化物。曲安奈德的结构如下所示。

本发明提供的皮质类固醇通常被混合，悬浮于，或者包封于基于HA聚合物的组合物中。可选地，所述皮质类固醇可以以聚合物偶联的形式，或者以可释放的形式共价连接于一种组分以用于制备基于HA的水凝胶。

一般情况下，所述组合物中含有的皮质类固醇的量在约0.5-80mg/mL范围内。可选地，以每单位重量为基础，根据其药效的不同，本发明提供的水性组合物包含约0.01重量％至约20重量％的皮质类固醇。示例性皮质类固醇的量(基于整体湿凝胶重量)，例如对于药效较低的皮质类固醇而言，从约10重量％至约20重量％；以及例如对于药效更强的生物活性剂如曲安奈德而言，从约0.01重量％至约10重量％，或者从约0.01重量％至5重量％，或者从约0.01重量％至约3重量％，或者从约0.1重量％至约2重量％皮质类固醇，或者甚至从约0.1重量％至约1重量％的皮质类固醇。

稳定化助剂

为了尝试使本发明提供的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物稳定，申请人探索了大量不同类型的助剂，其中多数对防止或最小化观察到的粘度的降低无作用。然而，申请人发现本发明所述的助剂如糖、糖醇、多元醇和衍生的多元醇特别有效。因此，被引入本发明提供的基于HA的聚合物-皮质类固醇组合物的稳定化助剂包括某些糖(单糖、二糖、多糖)、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂。虽然该类材料通常在处理过程中已经被用于稳定蛋白以防止其失活，但是该类材料似乎尚未被报道或者被认为与皮质类固醇合用时可用于稳定基于HA-聚合物的材料以防止其粘度或其它流变学特性的损失。在一个实施方式中，如本发明所述的水性的基于HA的聚合物的组合物不含有治疗蛋白或多肽。一般而言，在未受理论束缚的情况下，所述稳定化助剂倾向于具有一个或多个羟烷基基团，如羟基-低级烷基羟甲基(-CH₂-OH)或羟乙基(-CH₂CH₂OH)。本文提供的被发现适合作为含有皮质类固醇的组合物中的稳定化助剂的材料包括多糖如蔗糖和葡聚糖-40和衍生化多糖，羧甲基纤维素；糖醇如甘露醇和山梨醇；单糖如N-乙酰氨基葡糖和葡萄糖；二糖如海藻糖、麦芽糖和乳糖；多元醇如聚乙二醇(PEG)和衍生的多元醇，TRITON^TM-X-100(含有芳香族烃部分和一个PEG链，4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基聚乙二醇的非离子表面活性剂)，和甘油(一种简单的多元醇)，如支持性实施例所示。适合使用的多元醇如PEG和衍生的多元醇具有约4至约500个环氧乙烷重复单位，或者优选为约6至约100个。

实施例1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27均表明蔗糖作为含有透明质酸聚合物溶液以及额外还含有基于透明质酸聚合物的凝胶的透明质酸聚合物溶液中的稳定化助剂具有良好的性能。因此，优选的稳定化助剂为蔗糖。这些实施例表明蔗糖的加入可以有效赋予在进行测定的实施例条件下防止粘度降低1.2倍至至少11.3倍的稳定化作用。其它的优选助剂包括甘露醇、山梨醇和N-乙酰葡糖胺(请参阅，例如，实施例5，6，13)；乳糖，葡聚糖-40，PEG 4000，羧甲基纤维素，TRITON^TM-x-100和甘油(请参阅，例如，实施例16)；海藻糖和葡萄糖(请参阅，例如，实施例17)。

为了达到明显的稳定化作用通常不需要大量的稳定化助剂。例如，在稳定化助剂的量低至1％wt/wt时可以观察到有益的效果。一般情况下，以上提供的稳定化助剂的量的范围为从约0.25％至约20％。以重量百分数为基础，稳定化助剂的示例量的范围为从约0.5重量％至约10重量％，或者更多，优选为从约1重量％至约5％，所述稳定化助剂选自蔗糖、葡聚糖-40、羧甲基纤维素、甘露醇、山梨醇、n-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、聚乙二醇、TRITON^TM-X-100和甘油。本发明提供的上述组合物的示例量包括0.5％(所有均为重量％)，1.0％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，7％，8％，和10％。请参阅，例如，实施例22，其中1％蔗糖在6个月(40℃)时所达到的稳定比为7.47。

粘度和其它测量

虽然粘度可以被用作基于透明质酸聚合物的组合物的稳定性的指标，但是其它流变学测定也是适用的，如弹性模量，以及通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定的分子量的变化以反映稳定性。一般情况下，在本发明的实施例中，使用流变仪在实施例设定的条件下测定粘度。粘度的测定在多种温度(作为热稳定性的指标)，湿度和时间条件下进行，例如，用于提供保质期的指标。通过实施例可以看出，本发明所述的稳定化助剂在多种条件下可以有效地明显防止实施例中使用的基于透明质酸的皮质类固醇组合物的粘度随时间的损失。

示例性组合物和方法

一般而言，本发明提供的组合物和方法可以有效地使含有皮质类固醇的基于透明质酸的聚合物的组合物稳定，以防止其粘度随时间降低。所述稳定化可以通过多种不同方式中的任意一种进行测定，例如，通过提供一种组合物，当该组合物于60℃下储存6天时，其粘度的降低与初始值相比不超过约50％。可选地，该组合物于60℃下储存6天时，其粘度的降低与初始值相比不超过45％。优选地，该组合物于60℃下储存6天时表现出的粘度的降低与初始值相比不超过40％。可以采用任何适用于评价优势稳定化作用的合适阈值，可以参阅相应的实施例。于60℃下储存6天的选择(如在加速储存条件下)为常规测定方式，因为其可以在相对较短的持续时间内提供剂型的稳定性。然而，从实施例可以看出，增强稳定性的测定可以在多个温度中的任意温度下进行，例如，60℃，55℃，40℃，45℃，80℃，等等，以及经过任意代表性时间段，例如，1天，3天，5天，6天，7天，10天，14天，21天，1个月，2个月，3个月，或6个月，或者相对湿度下，例如，通常在约30％至75％的相对湿度范围内进行。

在用于说明本发明所述的引入稳定化助剂的稳定化作用优势的一种可选的实施方式中，本发明提供的组合物中通常具有的稳定比大于1.2。如前所述，稳定比是在特定时间点和规定的储存条件下测量时，含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数与不含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数的比值。因此，具有稳定比为1.0的组合物与不含有稳定化助剂的组合物一样均表现出粘度降低，也就是说，该助剂未能提供可测量程度的保护作用以防止粘度随时间降低。优选地，本发明提供的组合物具有的稳定比至少为1.3，或者至少为1.5。特别优选的组合物具有的稳定比大于约1.8。在相应的实施例中提供的示例性稳定比包括以下值：约1.5，约1.6，约1.7，约3.0，约4，约5.0，约7，约7.5，或者甚至更大。因此，本发明提供的组合物和方法适用于提供一种水性透明质酸聚合物的组合物，该组合物具有的稳定比相当于上述各值中的任意一个或多个，或者落在上述任意两个稳定比值之间的范围内。稳定比的确定可以在任意合适的时间点，例如，在第1天，第3天，第5天，第6天，第7天，第10天，第14天，第21天，1个月，2个月，3个月，或6个月，以及任意合适的储存温度下，例如，25℃，40℃，45℃，55℃，60℃，或80℃，通常在相对湿度为约30％至75％范围内(例如，以下各值的任意一个：30％ RT,35％ RT,40％ RT,45％ RT,50％ RT,55％ RT,60％ RT,65％ RT,70％ RT,和75％ RT)进行。例如，在一个实施方式中，该组合物于60℃下储存6天时测定稳定比。

还提供一种减少基于透明质酸聚合物的组合物的粘度随时间的降低的方法，该方法包括引入含有透明质酸聚合物和皮质类固醇的水性组合物，稳定量的稳定化助剂，所述稳定化助剂可以选自包含糖、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂，从而提供一种稳定比大于1.2的组合物，或者可选地，该组合物于60℃下储存6天时表现出粘度的降低相比于其初始值不超过约50％。在该方法中，例如，该组合物可以为透明质酸组合物的水性溶液，其可以为透明质酸本身，或者基于透明质酸的聚合物，或者该组合物可以包含基于透明质酸的聚合物的水溶液，其可以为透明质酸，结合基于透明质酸聚合物的水凝胶。该水性聚合物可以包含多种盐如氯化钠，多种缓冲物，等等。一般情况下，将包含透明质酸聚合物，稳定化助剂，和皮质类固醇的水性组合物进行混合，例如，混合时间为数分钟至数小时。然后，通常将所得的组合物样本转移至容器中，如无菌玻璃瓶中，密封，并将其放置于如上所述以及实施例中选择的储存条件下。在储存之前，测定水溶液的粘度(例如，相当于零时间点)，以提供用作比较基础的初始值。

本发明提供的特别有效的水性组合物为那些含有蔗糖作为稳定化助剂的组合物。水性组合物中蔗糖的示例量为1％ wt/wt，2％ wt/wt，3％ wt/wt，4％ wt/wt，5％ wt/wt，6％ wt/wt，7％ wt/wt，8％ wt/wt，9％ wt/wt，和10％ wt/wt。确实，发现蔗糖在稳定化方面特别有效，即使在低浓度如1％，1.25％，和1.75％(wt/wt)时。因此，根据本发明，组合物可以包含任一示例量的稳定化助剂，蔗糖，或者其量落在任意两个上述重量百分数之间。

另外，发现甘露醇在防止粘度的降低方面特别有效，即使其浓度为如1％wt/wt,2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或更高，如5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt。因此，根据本发明，组合物可以包含任一示例量的稳定化助剂，甘露醇，或者其量落在任意两个上述重量百分数之间。

还发现其它的稳定化助剂在防止粘度降低方面特别有效，例如，山梨醇(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，N-乙酰氨基葡糖(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，乳糖(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，葡聚糖-40(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％wt/wt,和10％ wt/wt)，PEG 4000(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，羧甲基纤维素(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，TRITON-x-100(例如，浓度以％wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，甘油(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，海藻糖(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％ wt/wt)，和葡聚糖(例如，浓度以％ wt/wt表示，为2％ wt/wt,3％ wt/wt,4％ wt/wt，或甚至更高，例如，5％ wt/wt,6％ wt/wt,7％ wt/wt,8％ wt/wt,9％ wt/wt,和10％wt/wt)。因此，根据本发明，其它的组合物可以包含任意上述的示例性助剂，其量如上所述，或者其量落入任意两个上述重量百分数之间。

下面提供实施的组合物。一方面，提供包含基于透明质酸的聚合物，皮质类固醇和如上所述的稳定化助剂的水性组合物。在一种实施方式中，该水性组合物为溶液。在实施例1-22中提供了基于透明质酸聚合物的组合物的示例性实施例。在另一种实施方式中，该水性组合物包含透明质酸聚合物组分，基于透明质酸的聚合物溶液以及基于透明质酸的聚合物凝胶，其中，前述的代表性实施例由实施例23-27提供。

优选的水性溶液为含有未经修饰的透明质酸的溶液，例如，在生理盐水中，其中，实施的透明质酸水性溶液具有的浓度范围为约0.3重量％至约4重量％，或者约0.5重量％至约2重量％。可选地，该水溶液可以包含本发明提供的任意基于合适透明质酸的聚合物。该水溶液或溶液-凝胶组合物进一步还包含如上所述的皮质类固醇，以及本发明提供的稳定量的稳定化助剂(例如，糖、糖醇、多元醇或衍生的多元醇)。

在一个具体实施方式中，所述皮质类固醇选自包含氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、巯氢可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、苯曲安奈德、呋曲安奈德、己曲安奈德、双乙酸呋曲安奈德、曲安西龙醇(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松醋酸酯、氟轻松、哈西奈德、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、阿氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松二丙酸酯、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他松-17-丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯、醋酸氟泼尼定、倍他米松二丙酸酯一水合物、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松一水合物和糠酸氟替卡松的组。

在一种或多种优选的实施方式中，所述皮质类固醇为曲安西龙或者曲安西龙的衍生物如曲安奈德。

在一种或多种优选的实施方式中，所述皮质类固醇为曲安奈德。

在另一个进一步的实施方式中，以重量百分数为基础，水性组合物包含的稳定化助剂为约0.5重量％至约10重量％，或者更优选为约1重量％至约5重量％。

在另一个与前述任意一项或多项相关的实施方式中，所述稳定化助剂选自包含蔗糖、葡聚糖-40、羧甲基纤维素、甘露醇、山梨醇、n-乙酰氨基葡糖、葡聚糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、聚乙二醇、TRITON^TM-X-100和甘油。

在另一个与前述相关的一种或多种优选的实施方式中，所述稳定化助剂为蔗糖。

关于含有基于透明质酸聚合物的凝胶的水性组合物，例如，通常与如上所述的未经修饰的透明质酸合用，本发明提供了示例性组合物。在一个优选的实施方式中，所述透明质酸凝胶为通过与二乙烯基砜发生反应经衍生化得到的含有10％或更少羟基的透明质酸，所述二乙烯基砜与具有两个或多个硫醇的硫醇交联剂发生交联。在一个具体的优选实施方式中，通过与二乙烯基砜发生反应经衍生化得到的含有10％或更少羟基的透明质酸与PEG-二硫醇交联。例如，透明质酸的羟基转化为2-(乙烯砜基)乙氧基的转化度选自1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％和10％。请参阅，例如，本发明的实施例28和29。当以凝胶的形式时，本发明所述的组合物中透明质酸聚合物组分可以为水性组合物如水性浆料，或者与未经修饰的透明质酸溶液合用(请见，例如，实施例31)。优选的水溶液为透明质酸的生理盐水溶液，其中将实施的透明质酸水溶液加入至水凝胶中，以重量计，该水凝胶的浓度范围为约0.3％至约4％，或者约0.5％至约2％。包含以下相对量的基于透明质酸聚合物组分的一个代表性剂型为：4mL凝胶浆料((2-(乙烯砜基)乙氧基)1-10％透明质酸/PEG-二硫醇)以及2mL浓度为20mg/mL的透明质酸。具体的优选剂型包含4mL凝胶浆料((2-(乙烯砜基)乙氧基)4％透明质酸/PEG-二硫醇)以及2mL浓度为20mg/mL的透明质酸。通常地，透明质酸在产生的膨胀凝胶中的最终含量的范围为约0.05％至5％(0.5mg/mL至50mg/mL)。优选地，透明质酸在产生的膨胀凝胶中的最终含量为约0.1％至3％，或约0.1％至1％，或约0.5-0.8％。透明质酸在产生的膨胀凝胶中的示例性最终含量可以为，例如，相当于任意下列百分数：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，3.0，4.0，和5.0。例如，在产生的组合物中透明质酸相对于交联的(例如，(2-(乙烯砜基)乙氧基)1-10％透明质酸/PEG-二硫醇)水凝胶颗粒的代表性相对量通常落在约10:1，或约5:1，或约3:1，或约1:1的范围内。

具体的优选剂型和相关的方法为包含如前所述的透明质酸聚合物组分，曲安奈德和蔗糖。

在所提供的该组合物和方法的一种或多种实施方式中，该组合物是无菌的。另外，该组合物可以被包装和储存在如注射器中供以后用。

用途

本发明所述的稳定的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物可以在多个应用中使用，例如，用于伤口愈合，血管发生和肿瘤发生。请参阅D.D.Allisonand K.J.Grande-Allen,Tissue Engineering,Vol.12,Number 8,2131-2140(2006)；G.D.Prestwich et al,Tissue Engineering,Vol.12,Number 8,2171-2180(2006)；G.D.Prestwich et al,Tissue Engineering,Vol.12,Number 12,3405-3416(2006)。该稳定的组合物也可以被用作组织填充剂，真皮填充剂，膨胀剂，例如，用作尿道或食管膨胀剂，以及修复软骨缺损/损伤的栓剂或制剂和增强骨修复和/或生长的制剂。有利的情况下，基于包含稳定化助剂的组合物保持其粘度的程度大于不包含该助剂的组合物，以提供用于给药治疗的组合物，该组合物在理想情况下在靶点保持的持续期延长。

所述组合物还可以用于骨关节炎或类风湿性关节炎的治疗，或者用于其它炎性关节炎如痛风或焦磷酸钙沉积病(例如，通过注射将其注入关节的关节腔内空间)，或者用于降低或防止外科手术后粘连的形成。所述组合物特别适用于治疗慢性或急性炎症。特别地，通过将皮质类固醇引入透明质酸聚合物，本发明所述的组合物适用于降低对软骨的损伤。例如，关于含有凝胶的剂型，皮质类固醇的引入可以有效地防止大部分类固醇颗粒与关节组织的直接接触。另外，在基于透明质酸聚合物的水凝胶中包封类固醇颗粒可以有效地使类固醇在关节中的局部浓度最大化，同时使其全身浓度最小化。另外，本发明提供的在水凝胶剂型中包封类固醇颗粒可以有效地防止类固醇颗粒从关节过早地清除。最后，通过在水凝胶中包封类固醇，在相比于未包封的水凝胶更低的总剂量下即可获得类固醇的疗效，同时使非预期的局部和全身不良反应最小化。

所述组合物还可以被用于眼部疾病，急性痛风性关节炎，急性和亚急性滑囊炎，急性非特异性腱鞘炎，上髁炎，或滑膜炎的治疗。所述组合物可以被用于斑秃；盘状红斑狼疮；瘢痕瘤；环状肉芽肿，扁平苔藓，慢性单纯性苔藓(神经性皮炎)，和银屑病斑块的局部肥厚、浸润、炎性病灶；糖尿病性脂质渐进性坏死。它还可以被用于腱膜或肌腱(神经节)的囊性肿瘤。

现将结合某些实施方式对本申请进行描述，但是这些实施方式并不是用于限制本发明的范围的。相反地，本申请涵盖权利要求范围内所包含的全部可选的，修改的，和相当的情况。因此，下述内容将说明本申请的实际情况，旨在说明某些实施方式并且用于提供哪些被认为是其过程和概念方面的有用且易懂的描述。

实施例

以下实施例被用于为本领域普通技术人员提供如何获得并评价本发明提供的化合物、组合物和方法的完全公开和描述，并且起到纯示例作用。因此，这些实施例决不是为了限制发明人关于本发明的范围。反应条件存在多种变化和组合，例如，组分浓度、所需的溶剂、溶剂混合物、温度、压力以及可能被用于优化产品特性如纯度、产量等的其它反应参数和条件。这些也被认为在本发明公开的范围内。在由此产生的所有可能变化中，上述因素的任意组合均被包含在本发明中，除非其中另有说明或者与上下文明显矛盾。

实施例1A

观察到含有皮质类固醇的基于交联透明质酸的组合物的粘度的降低

在对含有悬浮在透明质酸溶液中的基于交联透明质酸的水凝胶的剂型的进行研究的期间，观察到在皮质类固醇、曲安奈德(TA)存在的情况下，当于25℃下储存时透明质酸组分的粘度随时间的降低比皮质类固醇、曲安奈德不存在的相同剂型更快。

表1

基于表1中总结的观察结果，需要进行额外的研究以确定上述粘度的损失是否可以被改善，例如，通过多种途径包括可能的稳定化助剂的引入。

实施例1B

80℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.9g透明质酸，HA(Lifecore，888KDa)溶解于881mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.97mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将372mg USP等级的曲安奈德(TA)与223.2mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约1.5g蔗糖分别加入74±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在80℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表2

如上表所示粘度明显降低，这些结果进一步证明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果还表明蔗糖的加入导致粘度的降低与未加入蔗糖的HA/TA样本相比显著减少。

实施例2

60℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.9g HA(Lifecore，888KDa)溶解于881mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.97mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将372mg USP等级的曲安奈德(TA)与223.2mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约1.5g蔗糖分别加入74±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表3

如上表所示粘度明显降低，这些结果表明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果进一步表明蔗糖的加入导致粘度的降低与未加入蔗糖的HA/TA样本相比显著减少。

实施例3

55℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.9g HA(Lifecore，888KDa)溶解于881mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.97mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将135.3mg USP等级的曲安奈德(TA)与81.2mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.5g蔗糖分别加入24±2mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表4

如上表所示粘度降低，这些结果表明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果进一步表明蔗糖的加入导致粘度的降低与未加入蔗糖的HA/TA样本相比显著减少，并且在每个时间点蔗糖的存在均产生明显的稳定化作用，特别是在进一步的时间点(例如，第6天表现出未含有助剂的组合物与含有助剂的组合物之间的粘度差异比第3天等的更大)。

实施例4

40℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.9g HA(Lifecore，888KDa)溶解于881mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.97mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将372mg USP等级的曲安奈德(TA)与223.2mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约1.5g蔗糖分别加入74±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0周的样本以外，均被放置在40℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0周的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6周的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表5

如上表所示粘度降低，这些结果表明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果进一步表明蔗糖的加入导致粘度的降低与未加入蔗糖的HA/TA样本相比显著减少。该作用进一步在40℃下得到证实，并且随着时间的延长变得越来越明显。

实施例5

45℃下多种助剂对HA粘度的影响

将7.83g HA(Lifecore，910KDa)溶解于1000mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将4.38mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将500mg USP等级的曲安奈德(TA)与300mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.37g蔗糖、葡聚糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇和N-乙酰氨基葡糖分别加入37±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约1％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在45℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第12周的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表6

这些结果表明蔗糖、麦芽糖、山梨醇和N-乙酰氨基葡糖的加入导致HA粘度的保留与未加入助剂的样本相比更高(且是大量的)。另外、糖、葡聚糖和麦芽糖对透明质酸-曲安奈德组合物的稳定无效，通过将其与不含有助剂的组合物相比可以看出。

实施例6

80℃下助剂对HA粘度的影响

将7.83g HA(Lifecore，910KDa)溶解于1000mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将4.38mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。分装约16g(±1g)至6个无菌的nalgene瓶中。将蔗糖加入至3个瓶中，使得每瓶中蔗糖的最终含量分别为约2％(w/w)，5％(w/w)和10％(w/w))。将山梨醇加入至剩余的3个瓶中，使得每瓶中山梨醇的最终含量分别为约2％(w/w)，5％(w/w)和10％(w/w))。将曲安奈德(USP)加入至每份约为8g的HA/助剂溶液中，使得TA的最终含量为约1.67mg每克HA/助剂溶液。通过吸取8.17ml HA缓冲液并加入曲安奈德(USP)制备对照样本，使得TA的最终含量为约1.67mg每克HA溶液。将样本进行搅拌使得TA可以很好地分散在溶液中。将约2ml的每个样本转移至玻璃闪烁瓶中并旋紧旋帽。将半数样本放置在80℃的烘箱中22小时。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过22小时样本与0小时样本的粘度(2个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。22小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表7

表7中的结果表明蔗糖和山梨醇的加入导致HA粘度比未加入任何助剂的样本的保留更大。

实施例7

80℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g蔗糖分别加入48±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0周的样本以外，均被放置在80℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点(10小时，20小时和30小时)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表8

结果表明蔗糖的加入导致HA粘度的保留大于未加入蔗糖的样本。

实施例8

60℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g蔗糖分别加入48±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第4天和第6天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表9

实施例9

55℃下蔗糖对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g蔗糖分别加入48±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第5天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表10

实施例10

55℃下蔗糖对HA(880)粘度的影响

将4.7g HA(Lifecore，880KDa)溶解于600mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将0.84mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至167.51mL已过滤的HA溶液中。然后，将248.4mg USP等级的曲安奈德(TA)与144.2mL已溶解的HA在无菌的250mLNalgene瓶中进行混合。将约0.24g，0.30g，0.36g，0.42和0.48g蔗糖分别加入24±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，1.25％(w/w)，1.5％(w/w)，,1.75％(w/w)和2％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点(第1天，第3天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有蔗糖的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表11

这些数据表明TA的存在导致HA粘度的降低与无TA的HA样本相比有所增加。这些结果表明将蔗糖加入至HA/TA混合物导致HA粘度的降低与无蔗糖的HA/TA混合物相比有所减少。

实施例11-分子量的影响

55℃下蔗糖对HA(730)粘度的影响

将4.7g HA(Lifecore，730KDa)溶解于600mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将0.86mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至171.8mL HA溶液中。然后，将248.2mg USP等级的曲安奈德(TA)与148.9mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.24g，0.30g，0.36g，0.42和0.48g蔗糖分别加入24±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，1.25％(w/w)，1.5％(w/w)，,1.75％(w/w)和2％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点(第1天，第3天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有蔗糖的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表12

实施例12

55℃下蔗糖对HA(＞1000)粘度的影响

将15.66g HA(Shiseido，＞1000KDa)溶解于2000mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将9.4mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至1873.9mL HA溶液中。然后，将256.7mg USP等级的曲安奈德(TA)与154mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.24g，0.30g，0.36g，0.42和0.48g蔗糖分别加入24±1mLHA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，1.25％(w/w)，1.5％(w/w)，,1.75％(w/w)和2％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点(第1天，第3天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有蔗糖的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表13

这些结果表明将蔗糖加入至HA/TA混合物导致HA粘度的降低与无蔗糖的HA/TA混合物相比有所减少。

实施例13

80℃下甘露醇对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g甘露醇分别加入24±1mLHA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)助剂的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0周的样本以外，均被放置在80℃的烘箱中。除了0小时的样本以外，每个时间点(10小时，20小时和30小时)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表14

结果表明甘露醇的加入导致HA粘度的保留大于未加入甘露醇的样本。

实施例14

60℃下甘露醇对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g甘露醇分别加入24±1mLHA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)甘露醇的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第4天和第6天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表15

实施例15

55℃下甘露醇对HA粘度的影响

将6.31g HA(Lifecore，)溶解于805.5mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将3.7mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将1.23gmg USP等级的曲安奈德(TA)与740.5mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g，0.96g，1.4g和1.9g甘露醇分别加入24±1mLHA/TA浆料的独立样本中，以提供分别含有约1％(w/w)，2％(w/w)，3％(w/w)和4％(w/w)甘露醇的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在55℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第5天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表16

实施例16

60℃下助剂对HA粘度的影响

将3.92g HA(Shiseido，IV＝2m³/kg)溶解于500mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将2.16mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将344.3mg USP等级的曲安奈德(TA)与206.6mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g乳糖、蜜二糖、葡聚糖40、聚乙二醇4000(PEG4000)，羧甲基纤维素钠盐(CMC)、titron-X100和甘油分别与每份24±1mL HA/TA混合1小时，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本防止于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第3天和第7天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第7天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表17

如上表所示粘度降低，这些结果表明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果表明乳糖、葡聚糖40、PEG 40000、CMC、triton x100和甘油的加入导致粘度的降低与无助剂的HA/TA样本相比有所减少。

实施例17

60℃下助剂对HA粘度的影响

将3.92g HA(Shiseido，IV＝2m³/kg)溶解于500mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将2.16mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至HA溶液中。然后，将344.3mg USP等级的曲安奈德(TA)与206.6mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇和N-乙酰葡糖胺分别与每份24±1mL HA/TA混合1小时，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了0小时的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(第1天，第3天和第6天)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表18

如上表所示粘度降低，这些结果表明TA的存在导致HA的降解增加。这些结果表明海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇和N-乙酰葡糖胺的加入导致粘度的降低与无助剂的HA/TA样本相比有所减少。

实施例18

60℃下助剂对HA粘度的影响

将19.6g HA(Shiseido，IV＝2m³/kg)溶解于2.5L 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将1.15mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至228.9mL HA溶液中。然后，将334.9mg USP等级的曲安奈德(TA)与200.95mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖分别加入至24±1mL的HA/TH浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每份混合物混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表19

这些结果表明曲安奈德的存在导致HA的粘度与无曲安奈德的HA相比有所降低。这些结果表明将甘露醇、山梨醇、蔗糖和甘油加入HA/TH样本中导致HA粘度的保留比仅含有HA/TH的样本更高。

实施例19

60℃下助剂对HA粘度的影响

将15.66g HA(Shiseido，IV＝1.9m³/kg)溶解于2L 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将9.4mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至1.87L HA溶液中。然后，将333.3mg甲基强的松龙乙酸酯(MPA)与200mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖分别加入至24±1mL的HA/MPA浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每份混合物混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表20

将甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖加入HA/MAP样本所得的结果为其HA粘度的保留高于仅含有HA/MAP的样本。加入助剂的所有样本的第6天稳定率均大于1。

实施例20

60℃下助剂对HA粘度的影响

将15.66g HA(Shiseido，IV＝1.9m³/kg)溶解于2L 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将9.4mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至1.87L HA溶液中。然后，将338.9mg倍他米松磷酸钠(BMSP)与203.4mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖分别加入至24±1mL的HA/BMSP浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每份混合物混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表21

将甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖加入HA/BMSP样本所得的结果为其HA粘度的保留高于仅含有HA/BMSP的样本。加入助剂的所有样本的第6天稳定率均大于1。

实施例21

60℃下助剂对HA粘度的影响

将15.66g HA(Shiseido，IV＝1.9m³/kg)溶解于2L 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将9.4mLpH值为6.71的1M磷酸钠加入至1.87L HA溶液中。然后，将356.7mg醋酸泼尼松龙(PA)与210.4mL已溶解的HA在无菌的250mL Nalgene瓶中进行混合。将约0.48g甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖分别加入至24±1mL的HA/BMSP浆料的独立样本中，以提供含有约2％(w/w)助剂的样本。每份混合物混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本放置于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在60℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。第6天的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表22

将甘露醇、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、甘油、葡聚糖40和乳糖加入HA/PA样本所得的结果为其HA粘度的保留高于仅含有HA/PA的样本。加入助剂的所有样本的第6天稳定率均大于1。

实施例22

40℃下蔗糖对HA粘度的影响

将3.5g HA(Lifecore，730KDa)溶解于450mL 0.9％的NaCl中，过夜。溶解的HA经0.2μm滤器(Millipore，Opticap 4”)过滤除菌。将1.77mL pH值为6.71的1M磷酸钠加入至354mL HA溶液中。然后，将590mg USP等级的曲安奈德(TA)与354mL已溶解的HA在无菌的Nalgene瓶中进行混合。将约0.587g蔗糖分别加入58.7±1mL HA/TA浆料的独立样本中，以提供含有约1％(w/w)蔗糖的样本。每个混合物均混合1小时。对照样本中未添加助剂。对于每个大样本，将2±0.2mL的分装样本防止于无菌的4mL玻璃瓶中，然后使用隔膜和铝盖将其密封。所有这些分装样本，除了第0天的样本以外，均被放置在40℃的烘箱中。除了第0天的样本以外，每个时间点(15天，30天，45天和6个月)从烘箱中取出3个样本并使其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与第0天的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。6个月时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表23

实施例23

蔗糖对水凝胶/HA溶液的HA粘度的影响

剂型B：将29.19g经乙烯基砜修饰的透明质酸(HAVS)，(平均取代＝3.9％)溶解于1837.6mL注射用水(WFI)中。将807.6g该HAVS溶液在无菌条件下转移至已经过0.2μm滤器进行了两次除菌过滤的无菌8L反应器中。22.7g无菌的已过滤的磷酸盐(磷酸二氢钠一水合物[USP]，12.4g溶于161g WFI，使用6N NaOH和6N HCL调节pH值至7.4)。然后，将9.19g无菌的曲安奈德加入至溶液中。将该混合物在50rpm下搅拌10分钟并在150rpm下搅拌2个小时。将28.4g无菌的已过滤的二硫酚聚乙二醇3350溶液(50mg/mL溶于WFI)加入至混合物中。该混合物在150rpm下搅拌3分钟，然后，将循环水浴(45℃)中的水在反应器的水套中进行循环。然后，混合物在50rpm下搅拌15分钟，之后关闭搅拌器。约17小时后，停止水循环并且通过打开搅拌器在50rpm下搅拌5分钟将已形成的凝胶破碎成小块。将4.5621g无菌的已过滤的HA/0.9％ NaCl溶液(7.8mg/mL，)加入至已破碎的凝胶。2小时后，在无菌条件下将所得的混合物通过2×840μm筛网并将其泵入填充罐中。经过筛网的混合物在20rpm下搅拌3小时，之后使用Baxa中继泵将混合物填充至无菌的10mL玻璃注射器中(约6.2mL每个注射器)。然后将注射器塞住。部分注射器在40℃/75％ RH条件下储存3个月，另一部分注射器在25℃/60％RH条件下储存3个月。

剂型B+蔗糖：使用与所述方法相似的方法制备剂型，除了使用的HA/0.9％ NaCl溶液含有1.7％或2％(w/w)蔗糖(USP)。

使用Cannon-Ubbelohde半微量玻璃粘度计在温度设定为25℃的水浴中测定以上制备的样本的上清液的比粘度。通过吸取1mL样本上清液并使用7mL 0.1M磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钠一水合物，pH 7)将其稀释以制备用于粘度测定的样本。使用磷酸盐缓冲液测定溶剂流动时间。通过3个月时的比粘度(3个样本的平均)与0个月的比粘度的比值确定HA粘度的保留百分数。

表24在40℃/75％ RH条件下储存

表25在25℃/60％ RH条件下储存

这些数据表明将蔗糖加入剂型导致HA组分在25℃和40℃下的粘度保留大于未加入蔗糖的剂型。

实施例24

80℃下蔗糖对水凝胶/HA溶液的HA粘度的影响

将4.92g HAVS(Mw 730-950KDa；平均取代＝3.9％)溶解于351mL WFI中。然后，使用0.2μm的滤器将该溶液进行除菌过滤。将约13.5±0.5mL的HAVS溶液分装至100mL塑料瓶中。共分装成4瓶。将曲安奈德(USP)[TA]加入每份分装溶液中使得TA含量约为1.67mg/mL。将内容物混合均匀。将约0.38mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)加入至每个混合瓶中并且使内容物混合均匀。将约0.47mL的50mg/mL二硫酚聚乙二醇3350溶液加入至每瓶。将内容物混合均匀。关闭瓶子的旋帽并且将每份溶液于45℃下放置过夜。制备7.83mg/mL HA溶液(0.9％生理盐水)并且经过0.2μm滤器进行过滤。加入3.4mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)至678mL的HA溶液中。将瓶子从烘箱中取出并且每瓶加入约77±2mL HA溶液(MW＝730KDa；7.83mg/mL溶于0.9％生理盐水)。向其中一瓶加入蔗糖以产生约为2％(w/w)蔗糖的制剂。向第二瓶加入蔗糖以产生约为3％(w/w)蔗糖的制剂。混合1小时后，使用60mL注射器及含有筛网的注射器过滤器将每瓶的内容物从840μm的筛网挤出。将每份挤出的混合物分装(约6.2mL)至20mL的玻璃闪烁瓶中。使用旋帽盖将瓶子封闭，除了0小时样本，将这些样本放置于温度设定为80℃的烘箱中。除了0小时样本以外，每个时间点(10小时，20小时和30小时)，从烘箱中取出3个样本并将其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30个小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表26

这些结果表明蔗糖的加入导致HA粘度的保留大于未加入蔗糖的样本。

实施例25

80℃下蔗糖对水凝胶/HA溶液的HA粘度的影响

将4.92g HAVS(Mw 730-950KDa；平均取代＝3.9％)溶解于351mL WFI中。然后，使用0.2μm的滤器将该溶液进行除菌过滤。将约14.2±0.5mL的HAVS溶液分装至100mL塑料瓶中。共分装成4瓶。将曲安奈德(USP)[TA]加入每份分装溶液中使得TA含量约为1.67mg/mL。将内容物混合均匀。将约0.4mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)加入至每个混合瓶中并且使内容物混合均匀。将约0.5mL的50mg/mL二硫酚聚乙二醇3350溶液加入至每瓶。将内容物混合均匀。关闭瓶子的旋帽并且将每份溶液于45℃下放置过夜。制备7.83mg/mL HA溶液(0.9％生理盐水)并且经过0.2μm滤器进行过滤。加入3.97mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)至794.7mL的HA溶液中。将瓶子从烘箱中取出并且每瓶加入约82±2mL HA溶液(MW＝880KDa；7.83mg/mL溶于0.9％生理盐水)。向其中一瓶加入蔗糖以产生约为2％(w/w)蔗糖的制剂。向第二瓶加入蔗糖以产生约为3％(w/w)蔗糖的制剂。混合1小时后，使用60mL注射器及含有筛网的注射器过滤器将每瓶的内容物从840μm的筛网挤出。将每份挤出的混合物分装(约6.2mL)至20mL的玻璃闪烁瓶中。使用旋帽盖将瓶子封闭，除了0小时样本，将这些样本放置于温度设定为80℃的烘箱中。除了0小时样本以外，每个时间点(10小时，20小时和30小时)，从烘箱中取出3个样本并将其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30个小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表27

实施例26

60℃下蔗糖对水凝胶/HA溶液的HA粘度的影响

将4.92g HAVS(Mw 730-950KDa；平均取代＝3.9％)溶解于351mL WFI中。然后，使用0.2μm的滤器将该溶液进行除菌过滤。将约13.5±0.5mL的HAVS溶液分装至100mL塑料瓶中。共分装成4瓶。将曲安奈德(USP)[TA]加入每份分装溶液中使得TA含量约为1.67mg/mL。将内容物混合均匀。将约0.38mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)加入至每个混合瓶中并且使内容物混合均匀。将约0.47mL的50mg/mL二硫酚聚乙二醇3350溶液加入至每瓶。将内容物混合均匀。关闭瓶子的旋帽并且将每份溶液于45℃下放置过夜。制备7.83mg/mL HA溶液(0.9％生理盐水)并且经过0.2μm滤器进行过滤。加入3.97mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)至794.7mL的HA溶液中。将瓶子从烘箱中取出并且每瓶加入约77±2mL HA溶液(MW＝730KDa；7.83mg/mL溶于0.9％生理盐水)。向其中一瓶加入蔗糖以产生约为2％(w/w)蔗糖的制剂。向第二瓶加入蔗糖以产生约为3％(w/w)蔗糖的制剂。混合1小时后，使用60mL注射器及含有筛网的注射器过滤器将每瓶的内容物从840μm的筛网挤出。将每份挤出的混合物分装(约6.2mL)至20mL的玻璃闪烁瓶中。使用旋帽盖将瓶子封闭，除了第0天样本，将这些样本放置于温度设定为60℃的烘箱中。除了第0天样本以外，每个时间点(第1天，第3天，第6天)，从烘箱中取出3个样本并将其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30个小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表28

实施例27

55℃下蔗糖对水凝胶/HA溶液的HA粘度的影响

将4.92g HAVS(Mw 730-950KDa；平均取代＝3.9％)溶解于351mL WFI中。然后，使用0.2μm的滤器将该溶液进行除菌过滤。将约14.2±0.5mL的HAVS溶液分装至100mL塑料瓶中。共分装成4瓶。将曲安奈德(USP)[TA]加入每份分装溶液中使得TA含量约为1.67mg/mL。将内容物混合均匀。将约0.4mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)加入至每个混合瓶中并且使内容物混合均匀。将约0.5mL的50mg/mL二硫酚聚乙二醇3350溶液加入至每瓶。将内容物混合均匀。关闭瓶子的旋帽并且将每份溶液于45℃下放置过夜。制备7.83mg/mL HA溶液(0.9％生理盐水)并且经过0.2μm滤器进行过滤。加入3.97mL 1M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)至794.7mL的HA溶液中。将瓶子从烘箱中取出并且每瓶加入约82±2mL HA溶液(MW＝880KDa；7.83mg/mL溶于0.9％生理盐水)。向其中一瓶加入蔗糖以产生约为2％(w/w)蔗糖的制剂。向第二瓶加入蔗糖以产生约为3％(w/w)蔗糖的制剂。混合1小时后，使用60mL注射器及含有筛网的注射器过滤器将每瓶的内容物从840μm的筛网挤出。将每份挤出的混合物分装(约6.2mL)至20mL的玻璃闪烁瓶中。使用旋帽盖将瓶子封闭，除了第0天样本，将这些样本放置于温度设定为55℃的烘箱中。除了第0天样本以外，每个时间点(第1天，第3天，第6天)，从烘箱中取出3个样本并将其冷却至室温。使用配有40mm 2°钢锥的AR550流变仪(TA仪器)于22℃下扫描3min以测定每个样本的粘度。通过特定天数与0小时的粘度(3个样本的平均值)的比值确定HA粘度的保留百分数。30个小时的稳定比为含有特定助剂的HA粘度的保留百分数与不含有助剂的样本的HA粘度的保留百分数的比值。

表29

实施例28

乙烯基砜衍生的透明质酸(HA-VS)的合成-低修饰度

本实施例描述了用于本发明提供的稳定化组合物的一种示例性和优选材料的制备。

称量5g透明质酸(HA)[9.4×10⁴cps(3％水溶液)至1L圆底烧瓶中。将500mL无菌经过滤的水加入至HA。将烧瓶放置在转速设定为20-100rpm的旋转蒸发仪上。溶液旋转直至所有的HA均被溶解(约16-18小时)。然后，将HA溶液(10mg/mL)转移至1L玻璃烧杯中。将连接顶置式搅拌器的搅拌棒插入溶液中并且设定搅拌速度以保证溶液搅拌充分。将333mL 0.25NNaOH溶液(83.2mL 1N NaOH加入至249.8mL去离子水)加入至正在搅拌的HA溶液。约1min后，快速加入150mL乙烯基砜溶液(18mL乙烯基砜溶解在132mL去离子水中)至正在搅拌的溶液。15秒后(按照从乙烯基砜溶液加入结束起开始测定)，通过快速加入约14mL 6N HCl调节溶液的pH值为5至6之间。然后，使用切向流过滤系统(spectrapor系统，cartridge P/NM6-100S-301-01P)透析反应溶液。总体积为原溶液体积的11倍。一旦纯化步骤结束，溶液被浓缩至约14-20mg/mL。从TFF系统中取出经乙烯基砜官能化的HA(HA-VS)并将其放置于塑料容器中，之后拧闭旋帽。取出HA-VS样本，于-80℃冷冻，然后进行冻干。冻干的样本被用于¹H-NMR分析。

HA-VS中乙烯基砜取代百分数的确定

称量约15-17mg的冻干样本于去皮重的2mL试管中。样本于1.5mL D₂O中重悬。将样本转移至NMR试管中。进行样本的¹H-NMR(256次扫描)并且打印出波谱，整合6.3-6.5ppm的特征峰(乙烯基砜残基产生的2个CH²＝质子导致的2个峰)和1.5-2.5ppm区域(HA的N-乙酰基产生的3个CH₃-质子导致的单峰)。取代百分数的计算如下所示：

¹H-NMR波谱(图1)表明基于完整的乙烯基砜峰相对于透明质酸的乙酰基峰，表示HA具有的乙烯基砜取代水平约为4％。

确定HA-VS样本的干重，该值被用于确定HA-VS溶液特定浓度。HA-VS的浓度为18mg/mL。

实施例29

由乙烯基砜修饰的透明质酸(HA-VS)和PEG-3400-二硫醇制备的凝胶的合成

使用去离子水将根据实施例1所述方法制备的HA-VS溶液稀释至浓度为14mg/mL。将11mL HA-VS溶液置于20mL注射器中。通过0.2μm无菌注射器将HA-VS溶液过滤至无菌的50mL离心管中。通过溶解40.1mgPEG-(SH)₂于0.802mL去离子水中制备50mg/mL的PEG-(SH)₂溶液[Laysan生物公司，项目#SH-PEG-SH-3400-1g]。将PEG-(SH)₂溶液转移至1mL无菌注射器中并经0.2μm无菌注射器滤器过滤。将10mL无菌的经过滤的HA-VS转移至无菌的50mL离心管中。加入250μL 0.5M磷酸钠溶液(经0.2μm无菌的注射器滤器过滤)至HA-VS溶液中。将所得的溶液彻底混合。将380μL[19mg PEG-(SH)₂]无菌的50mg/mL PEG-(SH)₂溶液加入至HA-VS溶液中。将所得的溶液彻底混合。上述步骤均在净化台中进行以保持无菌性。然后，将HA-VS/PEG-(SH)₂溶液放置于37℃培养箱中至少16小时以促进凝胶形成。至少16小时以后，HA-VS/PEG-(SH)₂溶液才发生交联形成凝胶。然后，将凝胶材料从培养箱中取出。

实施例30

HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶浆料的制备-单次挤压

使用玻璃棒将从实施例29获得的HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶进行物理破碎。将凝胶转移至无菌的60mL带有注射器盖的注射器中。加入40mL 0.9％无菌NaCl至凝胶中。将柱塞插入注射器筒并将注射器倒置。打开注射器帽以释放压力，然后关闭。反复倒置注射器数次以保证生理盐水与凝胶碎片混合均匀。凝胶膨胀过夜(至少16小时)。

使用23mm的皮革打孔器切下直径为23mm的聚酯筛网圆片(McMasterCarr，货号9218T13，网孔大小：20.3×20.3，正方形/长方形尺寸：0.0331”，Micron等级：840Microns，开放面积百分数：46，直径阈值：0.0157”)。将圆片插入25mm的注射器过滤器支架中(Cole Palmer，货号EW-29550-42)并且关闭过滤器支架。将包含筛网的过滤器支架进行高温灭菌。取出注射器的帽并将包含筛网的注射器过滤器与注射器附连。凝胶通过筛网挤出至无菌的50mL离心管中。盖上离心管的旋帽。所得的产品为略有粘度的颗粒浆料，其中，颗粒已经析出但是仍然悬浮。上述步骤在净化台中进行。

实施例31

含有透明质酸的HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶浆料的制备

称量2g透明质酸(HA)[9.4×10⁴cps(3％水溶液)至250mL圆底烧瓶中。将100mL无菌的生理盐水加入至烧瓶中的透明质酸。烧瓶于转速为50rpm的旋转蒸发仪(Buchi)上旋转至少16个小时以形成2％透明质酸溶液。在净化台中实施下列步骤。透明质酸溶液经0.2μm无菌滤器进行过滤。使用HAVS/PEG-(SH)₂凝胶浆料制备一系列剂型，其中制备的HAVS/PEG-(SH)₂凝胶浆料与透明质酸混合。用于制备这些剂型的透明质酸溶液和HAVS/PEG-(SH)₂凝胶浆料的体积如下表所示。

表30

剂型	透明质酸体积(ML)	HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶浆料体积(ML)
			1	1	5(单次挤压的浆料)
2	2	4(单次挤压的浆料)
			3	3	3(单次挤压的浆料)
4	4	2(单次挤压的浆料)
			5	5	1(单次挤压的浆料)
6	1	5(二次挤压的浆料)
			7	2	4(二次挤压的浆料)
8	3	3(二次挤压的浆料)
			9	4	2(二次挤压的浆料)
10	5	1(二次挤压的浆料)

如上表所示，将规定体积的透明质酸溶液和HAVS/PEG-(SH)₂凝胶浆料加入15mL无菌离心管中。将盖子放置在离心管上并且将离心管反复倒置直至组分混合均匀。然后，将每种剂型转移至10mL带有注射器帽的玻璃注射器中，之后插入柱塞并排出多余的空气。然后，旋紧注射器帽。

实施例32

含有曲安奈德的HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶的合成

使用去离子水将HA-VS溶液稀释至浓度为14mg/mL。将11mL HA-VS溶液置于20mL注射器中。通过0.2μm无菌注射器将HA-VS溶液过滤至无菌的50mL离心管中。通过溶解40.1mg PEG3400-(SH)₂于0.802mL去离子水中制备50mg/mL的PEG-(SH)₂溶液。将PEG-(SH)₂溶液转移至1mL无菌注射器中并经0.2μm无菌注射器滤器过滤。将10mL无菌的经过滤的HA-VS转移至无菌的50mL离心管中。将100mg曲安奈德(Spectrum Chemicals，U.S.P等级，微粉)加入HAVS溶液。将离心管的盖子放在离心管上并且将溶液反复倒置直至曲安奈德与HA-VS混合均匀。将250μL无菌的已过滤的(0.2μm无菌滤器)0.5M磷酸钠溶液加入至HA-VS溶液中。将所得的溶液彻底混合。上述步骤均在净化台中进行。然后，将HA-VS/PEG-(SH)₂溶液放置于37℃培养箱内至少16小时。在该阶段HA-VS/PEG-(SH)₂溶液发生交联形成凝胶。然后，将凝胶材料从培养箱中取出。所得的凝胶含有约0.2％曲安奈德。

上述过程亦按照如前所述实施，除了加入20mg曲安奈德(SpectrumChemicals，U.S.P等级，微粉)至HA-VS溶液。

实施例33

含有曲安奈德的HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶浆料的制备：单次挤压

使用玻璃棒将含有曲安奈德的HA-VS/PEG-(SH)₂凝胶进行物理破碎。将凝胶转移至无菌的60mL带有注射器盖的注射器中。加入40mL 0.9％无菌NaCl至凝胶中。将柱塞插入注射器筒并将注射器倒置。打开注射器帽以释放压力，然后关闭。反复倒置注射器数次以保证生理盐水与凝胶碎片混合均匀。凝胶膨胀过夜(至少16小时)。

Claims

1.一种用于稳定基于透明质酸的聚合物的组合物以防止其粘度随时间降低的方法，该方法包括：

将稳定量的稳定化助剂引入含有透明质酸聚合物和皮质类固醇的水性组合物中，所述稳定化助剂选自含有糖、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂的组，从而提供一种组合物，该组合物于60℃下储存6天时表现出的粘度相对于其初始值的降低不超过50％。

2.一种用于减少含有皮质类固醇的基于透明质酸的聚合物的组合物的粘度随时间降低的方法，该方法包括：

将稳定量的稳定化助剂引入含有透明质酸聚合物和皮质类固醇的水性组合物中，所述稳定化助剂选自含有糖、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂的组，从而提供一种组合物，该组合物的稳定比大于1.2，

其中，所述稳定比是在特定时间点和规定的储存条件下测量时，含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数与不含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数的比值。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，引入步骤包括将稳定化助剂引入含有透明质酸聚合物的水性组合物，并进行混合。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其中，所述透明质酸聚合物选自含有可以或者不可以交联的未经修饰的透明质酸，可以或者不可以交联的经化学修饰的透明质酸，以及它们的组合物的组。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述水性组合物为溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述溶液包含未经修饰的透明质酸。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述水性组合物包含基于透明质酸聚合物的凝胶。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包含未经修饰的透明质酸溶液。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述透明质酸凝胶为通过与二乙烯基砜反应衍化所得的含有10％或更少羟基的透明质酸，所述二乙烯基砜与具有两个或多个硫醇的硫醇交联剂发生交联。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，透明质酸的羟基转化为2-(乙烯砜基)乙氧基的转化度选自1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述凝胶中透明质酸的最终含量的范围为约0.05-5％(0.5-50mg/mL)。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，在所述组合物中透明质酸与水凝胶颗粒的相对量(重量比)的范围为约10:1。

13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中，所述稳定化助剂包含一种或多种羟基低级烷基。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中，所述稳定化助剂选自包含蔗糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰氨基葡糖、葡聚糖-40、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素、TRITON-X-100、甘油、海藻糖、右旋糖、麦芽糖和乳糖的组。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述稳定化助剂为蔗糖。

16.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中，被引入所述组合物的稳定化助剂的量的范围为约0.25-20重量％。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，被引入所述组合物的稳定化助剂的量的范围为约0.5-10重量％。

18.根据权利要求2-17中任意一项所述的方法，其中，所述引入步骤可以有效地提供稳定比大于1.5的组合物。

19.根据权利要求2-12中任意一项所述的方法，其中，所述稳定比是在所述组合物于60℃下储存6天时进行测量的。

20.根据权利要求2-18中任意一项所述的方法，其中，所述稳定比的测量时间点选自第1天、第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天、第21天、1个月、2个月、3个月或6个月，储存温度选自25℃、40℃、45℃、55℃、60℃、80℃，并且在相对湿度的范围为30％至75％下进行。

21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法，其中，所述皮质类固醇选自包含氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、巯氢可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、曲安西龙、曲安奈德、苯曲安奈德、呋曲安奈德、己曲安奈德、双乙酸呋曲安奈德、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松醋酸酯、氟轻松、哈西奈德、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、阿氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松二丙酸酯、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他松-17-丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯、醋酸氟泼尼定、倍他米松二丙酸酯一水合物、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、糠酸莫米松一水合物和糠酸氟替卡松的组。

22.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中，所述皮质类固醇为曲安奈德或者其在药学上可接受的盐的形式。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述皮质类固醇为曲安奈德。

24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述皮质类固醇选自包含曲安西龙、曲安奈德、苯曲安奈德、呋曲安奈德、己曲安奈德和双乙酸呋曲安奈德的组。

25.根据权利要求1-24中任意一项所述的方法，其中，所述组合物包含约0.01重量％至约20重量％的皮质类固醇。

26.一种包含透明质酸聚合物、皮质类固醇和稳定化助剂的水性组合物，所述稳定化助剂选自含有适量的糖、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂的组，从而有效地提供如上述权利要求1-25中任意一项所述的组合物，所述组合物于60℃下储存6天时表现出的粘度相对于其初始值的降低不超过50％。

27.一种包含透明质酸聚合物、皮质类固醇和稳定化助剂的水性组合物，所述稳定化助剂选自含有适量的糖、糖醇、多元醇和含有多元醇的表面活性剂的组，从而有效地提供如上述权利要求2-25中任意一项所述的组合物，所述组合物的稳定比大于1.2，其中，所述稳定比是在特定时间点和规定的储存条件下测量时，含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数与不含有稳定化助剂的透明质酸聚合物-皮质类固醇组合物的粘度保留百分数的比值。