TW201446270A - 包含玻尿酸的經穩定化組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供以玻尿酸為底質之組成物，該組成物包含在含有穩定化用量的一種或多種穩定化添加劑之下的以玻尿酸為底質之聚合物及皮質類固醇，以及相關的方法。所得的組成物實質上在貯存、處理、及使用的條件下保留其黏彈性及相關的流變特性。

Description

包含玻尿酸的經穩定化組成物 相關申請案的交互參考
本申請案主張於2013年1月11日提出之U.S.臨時專利申請案No.61/751,811優先權的利益，其整體以引用方式納入本文。
本揭示大致關於包含玻尿酸及/或以玻尿酸為底質之聚合物之組成物，及相關的製造、使用及將該組成物穩定化的方法。所得之生物可相容的組成物(如藥學組成物)可使用於例如生物活性劑的局部輸送，及用於處理多種醫學的情況。通常，當與不含穩定化量的穩定化添加劑之組成物比較時，所得的組成物較能隨時間保留其黏度，以下將更詳細地描述。
玻尿酸為廣泛分佈於結締、上皮、及神經組織之天然產生、陰離子性、非硫酸化的醣胺聚多醣。平均70kg(154lbs)者在他/她體內擁有大約15克的玻尿酸，其 中的三分之一每天轉換(分解與合成)(Stern R.Eur J Cell Biol 83(7)：317-25,(2004))。因為玻尿酸天然地發現於身體的許多組織中且所以為生物可相容，相信相當適合於生物醫學的應用。不幸的是，當以其天然產生的形式予以投藥及使用時，玻尿酸通常自身體快速地清除，而需要經常投藥。因此，玻尿酸的調合物能維持未改變的玻尿酸的利益如良好的生物相容性，但高度所欲為克服快速清除的問題。該調合物應該理想地具有良好的細胞相容性、有利的化學、流變及其他特性、良好的穩定性、及擁有投藥的便利性。
先前已述及玻尿酸的化學修飾形式。參見如J.W.Kuo等人，生物起源的材料-材料、分析、及植入用途，完整的生物材料，Elsevier，2010年。玻尿酸(也稱為透明質酸)其衍生化形式、相關的組成物及共軛物可用以作為可注射的生物材料，以及用於醫學設備及可植入的材料中。應用包括將治療分子輸送至局部位置、用作為黏合劑或密封劑、組織工程中、作為黏彈性補充劑及特別是傷口治癒。以玻尿酸為底質的材料可製備成一些不同的形式-黏彈性溶液、軟或硬的水凝膠、不織網、海綿、及類似者，且可使用於臨床前與臨床的調查範圍內。對於許多臨床前與臨床的用途，重要的是維持該以玻尿酸為底質之材料的黏彈特性。
因此，能夠提供例如在貯存、處理、及使用的條件下持續維持其黏彈特性(亦即表現良好的化學及物 理穩定性)之以玻尿酸為底質之組成物為高度有利的。
本揭示以本申請者(至少一部份)的發現為基礎，包含例如縮丙酮特安皮質醇或其他皮質類固醇之以玻尿酸聚合物為底質之組成物表現出黏度隨時間的損失明顯大於不含該皮質類固醇之相同以HA聚合物為底質之組成物所觀察的。基於前述，本申請者已鑑別出能有效將該包含HA聚合物組成物明顯穩定化的特定材料，藉由加入該一種或多種穩定化添加劑，使得黏度隨時間的損失實質上減少。因此，當與不含穩定化添加劑之可相比較的組成物比較時，在此提供隨時間能較好地保留其黏度的組成物(亦即表現黏度隨時間的損失降低)。在此也提供增進包含皮質類固醇之以玻尿酸為底質之組成物的貯存穩定性之方法，其係藉由將穩定化用量的添加劑加入至該組成物中，有效導致大於1的穩定化比例(在以下將更詳細敘述的條件下)，較佳為大於1.2，更佳為大於1.3，其中該穩定化比例為對於包含穩定化添加劑之標的組成物與不含穩定化添加劑之相同組成物相比，黏度隨時間的損失減少之測量。(穩定化比例大於1代表在給定時間點及在特定的貯存條件下，黏度保留百分比超過該不含添加劑的控制組成物之增強。)
由以下的敘述、實例、及申請專利範圍，組成物、方法、用途及類似者之額外的實施態樣會很明顯。 倘若包括在該組合中的特性並非相互不一致，由前述及以下敘述可瞭解，在此所述之每一者及每個特性、及二個或更多個該特性之每一者及每個組合皆包括在本揭示的範圍內。此外，任何特性或特性的組合可特別自本發明的任何實施態樣中排除。以下敘述中說明本發明額外的觀點及優點，特別是當與附帶的實例及圖形一併考量時。
本申請案未附帶圖式。
〔詳細敘述〕
以下將更完整地敘述本發明。然而，本發明可以不同形式加以具體化且應該不視為受在此所說明的實施態樣所限制；而是，提供這些實施態樣以使本揭示會透徹且完全，並對熟悉本技藝者完整傳達本發明的範圍。
在此所述之所有公告、專利及專利申請案，除非另外指示，否則不論前述或下述皆以引用方式將其整體納入。在以引用的方式納入本文的公告、專利或專利申請案中及本揭示中皆定義的相同術語之情況下，本揭示中的定義代表控制用定義。對於公告、專利及專利申請案提及其特定類型化合物的敘述、化學等、附屬於該化合物、化學等的部份為以引用的方式納入本文之文件的那些部 份。
定義
必須注意的是，除非上下文清楚地另外指定，如本說明書中所使用的單數形式「一個」及「該」包括多個指示對象。因此，例如提及「聚合物」包括單一聚合物及二種或更多種該相同或不同的聚合物。
除非特別另外注意，術語在此的定義為有機合成的技藝、及聚合物與藥學科學中所使用的標準定義。
在敘述及主張本發明中，會根據下述的定義使用以下用語。
「生物可相容的聚合物」為具有能與活組織相容或具有有利的生物特性之分解產物的聚合物。該生物可相容的聚合物本身可為生物可相容，及/或當與生物活性劑一併使用時其為協同地生物可相容。
術語「玻尿酸聚合物」係指包含重複的透明質酸雙醣次單元之聚合物，其中該重複單元可在D-葡萄糖醛酸的一個或多個位置及/或該雙醣重複次單元的D-N-乙醯葡萄胺糖單元處衍生化。玻尿酸聚合物或以玻尿酸為底質之聚合物意為包含玻尿酸(也稱為透明質酸)、衍生化的玻尿酸、鹽類形式、及玻尿酸的連結劑錯合物。
術語「玻尿酸」意為指未修飾或未衍生化的玻尿酸。
術語「玻尿酸衍生物」或「衍生化的玻尿 酸」或「修飾的玻尿酸」或「取代的玻尿酸」係指已經過化學性修飾的玻尿酸。
術語「反應的」係指在習用的有機合成條件下，容易或以實際速率反應的官能基(例如存在於聚合物中)。此與不反應或需要強催化劑或不實際的反應條件以反應之那些基團(亦即「不反應的」或「惰性」基團)相反。
在例如玻尿酸的水溶性聚合物的上下文中，如在此所用的「分子質量」或分子量係指以多角度光散射所決定之聚合物的外觀平均分子質量。分子量可表示成數目平均分子量或重量平均分子量。除非另外指定，否則在此所有指出的分子量係指重量平均分子量。當缺乏分子量的值時，也可以聚合物的內在或原有的黏度加以特徵化，其為用於測量分子量的測黏度方法。
術語「水凝膠」係指含有水的三維親水性聚合物網狀結構或凝膠，其中水為連續相，例如，其中水含量為大於50%(重量/重量)。
藉由「凝膠化」意為物質以凝膠狀態形成。
「滅菌」組成物為使用USP無菌測試所決定不含可生長的微生物者。參見「美國藥典」，第30版，美國藥典會議，2008年。
術語「藥物」或「藥學活性劑」或「生物活性劑」或「活性劑」可互換使用，意為具有生物活性及調整或使用於治療用途之任何有機或無機化合物或物質。蛋 白質、荷爾蒙、抗癌劑、小分子化學化合物及擬似者、低聚核苷酸、DNA、RNA及基因治療皆包括在廣義的「藥物」下。如在此所用，提及例如皮質類固醇的藥物以及在此提及的其他化學化合物意為包括以其任何藥學可接受形式的化合物，其中可使用的包括例如非鏡像異構物及鏡像異構物的異構物、鹽類、溶合物、及特別是結晶形式的多形體，以及外消旋混合物及在此所述化合物的純異構物。
「非水溶性藥物」或「難溶於水的藥物」為水溶液溶解度低於10mg/mL者。
如在此所提供之組成物(或水凝膠或聚合物)的術語「有效量」或「藥學有效量」或「治療有效量」係指無毒但足夠量的組成物以提供所欲的反應，如預防、減少或消除施用對象的疼痛。所需的精確量隨施用對象至施用對象而變，視施用對象的物種、年齡、及一般情況、待治療情況的嚴重性、特別的藥物或所使用的藥物、組成物的特殊性、投藥的模式、及類似者而定。由一般熟悉本技藝者使用例行的實驗可決定任何個別個案中之適當的「有效」量。
「任意」或「任意地」意為可能或可不發生後述的情況，使得該敘述包括該情況發生的案例及其不發生的案例。
在提及特定的特性或特質的術語「實質上」意為提及該特性或特質之明顯的程度或幾近完全(亦即達85%或更高的程度)。
術語「約」在特別是指給定的量時，意為包含加或減百分之五的偏差。
以下章節中也可發現額外的定義。
概論
本申請案至少一部份係基於申請者發現特定添加劑能有效穩定化組成物，一般為包含以玻尿酸為底質之聚合物及皮質類固醇之水性組成物。如前述，本申請者認為包含以玻尿酸為底質之聚合物及皮質類固醇之水性組成物表現出黏度隨時間的損失明顯大於不含該皮質類固醇之相同以HA聚合物為底質之組成物所觀察的。基於前述，本申請者已鑑別出能有效將該包含HA聚合物組成物明顯穩定化的特定材料，藉由加入該一種或多種穩定化添加劑，使得黏度隨時間的損失實質上減少。
在此上下文中，例如當與不含添加劑之該相同的包含玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物比較時，藉由「穩定化」意為降低對於包含玻尿酸聚合物-皮質類固醇(HA-CORT)組成物隨時間所觀察之黏度損失的程度(雖然可使用其他方法)。由實例1至27可見，當暴露於加速的貯存穩定度條件下(亦即在延伸的時間期程中將溫度加速)，包含穩定化用量的特定糖類(單醣、雙醣、多醣)糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑之HA-CORT組成物與不含該穩定化添加劑之HA-CORT組成物相比，當方便地以其穩定化比例加以指示時，表現出明顯增強的黏度保 留。該穩定化比例為在特定時間點及在特定貯存條件之下，所測量之含有HA-CORT穩定化添加劑組成物(HA-CORT-SA)之HA黏度保留百分比對相同HA-CORT組成物(不含添加劑)之HA黏度保留百分比的比例。以此方式，藉由將數據歸一化，可容易比較該添加劑的效應。在所製備的組成物中，僅含玻尿酸聚合物組成物的數據顯示皮質類固醇對HA黏度之去穩定化效應，因其減少明顯可見。例如參見實例1A。在具有有效作為穩定化添加劑的物質之個案中，黏度隨時間的保留百分比很明顯。例如，當於60℃下貯存6天的期程後與其起始黏度值(時間為零)比較時，特別有用的組成物為表現不超過約50%的黏度降低者。對於當於60℃下貯存6天之相對應組成物，適合作為穩定化添加劑的物質通常會表現至少1.2、且較佳至少1.3的穩定化比例。由實例可見，在上述條件下，有效的添加劑導致穩定化比例在自約1.2至約2.6或更大之範圍。(加速貯存條件/庫存壽命的選擇為任意的，並簡單提供評估適合用作為標的組成物中之添加劑物質的方便方法)。在支援的實例中可見，於多種溫度(40℃、45℃、55℃、60℃、80℃、等)、濕度(週界及增加濕度)、及貯存期程(小時如10小時、20小時、22小時、25小時、30小時等，天如1天、3天、5天、6天、7天、15天、30天、45天等，週如1週、2週、3週、4週、6週、8週、等，月如1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月等，或甚至年(1年或更久))之下，檢驗以HA為底質之組成物。由實例可見，通常對於 在更極端條件下貯存的樣本可見到更明顯的效應，如高溫(參見例如實例13，於80℃下進行(觀察到穩定化比例的範圍為自約5至約7)、或延伸時間期程(參見例如實例22，其中該穩定化組成物擁有7.47的穩定化比例)。
組成物 以HA為底質之組份
在標的組成物及方法中所使用的玻尿酸聚合物可為衍生化或未衍生化，且可為交聯或未交聯。而且，標的組成物可包含超過一種類型的玻尿酸，例如化學性修飾的玻尿酸(其可為交聯或未交聯)、交聯的玻尿酸、未修飾的玻尿酸、或前述的組合。更特別的是，該玻尿酸聚合物組份可為流體形式或為凝膠形式或該二者的組合。在一較佳實施態樣中，玻尿酸聚合物包含懸浮在未修飾的玻尿酸水溶液中之修飾的玻尿酸凝膠。
一示範的修飾玻尿酸為以其羥基與二乙烯碸反應並再與例如PEG-二硫醇之交聯劑輕度交聯所衍生化之玻尿酸。在一較佳實施態樣中，藉由與二乙烯碸反應而將其10%或更少的羥基轉化成2-(乙烯基碸基)乙氧基，將該玻尿酸修飾至10%或更低的程度。特別是，該玻尿酸可擁有羥基轉化成(2-(乙烯基碸基)乙氧基)的程度係選自以下：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、及10%。或是，該玻尿酸可擁有羥基的轉化程度落在任何二個前述百分比之間的範圍內：例如1至10%、2至10%、3至 10%、4至10%等，對於所提供的整數之每一個及每一組合，例如自2至7%、自2至6%、自3至8%、自3至7%等。而在更特別的實施態樣中，該玻尿酸具有羥基轉化成(2-(乙烯基碸基)乙氧基)的程度為每雙醣重複單元約4至5%。藉由許多適合方法之任一者可決定母聚合物的取代/修飾程度，例如NMR、UV、或IR分析、或元素分析。所得的活化玻尿酸係指大致如(2-(乙烯基碸基)乙氧基)玻尿酸或VS-HA且敘述於美國專利7,829,118。
適合用於與例如VS-HA之玻尿酸聚合物反應的交聯劑實例包括包含二個或更多個硫醇基之含有硫醇的交聯劑。該硫醇基會與例如在乙烯碸衍生化的玻尿酸內的乙烯碸反應。說明性的硫醇交聯劑包括PEG-二硫醇(HS-PEG-SH)、3-臂PEG-三硫醇(甘油-核)、4-臂PEG-四硫醇(新戊四醇核)、或8-臂PEG八硫醇(六甘油核)。較佳的交聯劑為PEG-二硫醇。交聯劑的分子量通常低於修飾的玻尿酸。通常，交聯劑的分子量範圍在自約200至約20,000道耳吞。對於例如PEG二硫醇的交聯劑或任何其他適合的交聯劑之示範分子量包括尤其是約3350、3400、及5000道耳吞。例如參見在此的實例28至33。實例28敘述乙烯碸修飾程度大約4%之示範的乙烯碸衍生化玻尿酸的製備。實例29敘述藉由低程度修飾的乙烯碸衍生化玻尿酸與分子量為3400的交聯劑PEG-二硫醇反應之凝膠的製備。實例30敘述HA-VS/PEG-二硫醇凝膠漿液於鹽水中的製備，而實例31敘述HA-VS/PEG-二硫醇凝膠漿液於玻尿酸溶液中的製 備。所有這些調合物提供示範的玻尿酸聚合物組份，例如水溶液、凝膠、及其組合，適用於穩定化添加劑的加入。
以玻尿酸為底質之聚合物也可包含如PCT/US/2004/040726(WO 2005/056608)中所述之醯肼反應的基團及/或胺氧基反應的基團，該揭示的相關部份與HA的衍生化有關且其所得的聚合物皆以提及的方式將其全部納入本文。
或是，HA可為硫醇衍生化的，例如硫醇衍生化的玻尿酸。示範的硫醇衍生化玻尿酸聚合物包括美國專利7,981,871、6,884,788、6,620,927、6,548,081、6,537,979、6,013,679、5,502,081、及5,356,883中所敘述，其與該硫醇衍生化聚合物有關的相關部份皆以提及的方式將其全部納入本文。
玻尿酸聚合物的額外實例包括半胱胺酸衍生化玻尿酸，其包括但不限於揭示於「控制醣胺聚多醣藥物錯合物的釋放」，R.V.Sparer等人，第6章，第107至119頁，T.J.Roseman等人，「控制釋放的輸送系統」，Marcel Dekker公司，紐約(1983)中的聚合物。
額外較佳聚合物的實例包括以下垂的硫醇基經由烴基、芳基、取代的烴基、或取代的芳基基團連接至N-醯基尿素所衍生化的玻尿酸。使用於在此所提供的組成物及方法中之說明性聚合物包括CarbylanTM-S(詳細描述於國際專利公告No.WO 2005/056608)。
額外地，玻尿酸或衍生化玻尿酸可共價地接 至反應的連接劑及/或與二官能或多官能丙烯酸酯、丙烯基或甲基丙烯酸酯化合物交聯。用於玻尿酸的修飾之代表性連接劑包括、但不限於聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇-二甲基丙烯酸酯(PEGDM)、聚乙二醇-二丙烯醯胺(PEGDAA)及聚乙二醇-二甲基丙烯醯胺(PEGDMA)，及其衍生物。前述交聯劑的PEG團可為低聚合或高聚合，例如包含自2至100或更多次單元。適用於例如玻尿酸的聚合物修飾/官能化的額外交聯劑包括但不限於聚葡萄糖丙烯酸酯、聚葡萄糖甲基丙烯酸酯、聚葡萄糖環氧丙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯官能化玻尿酸、丙烯酸酯官能化玻尿酸、甘油二甲基丙烯酸酯、甘油1,3-二甘油酯二丙烯酸酯、山梨醇丙烯酸酯及其衍生物。
玻尿酸或以玻尿酸為底質之聚合物通常會擁有在約700至3,000,000道耳吞範圍內的平均分子量。說明性的分子量範圍為自約1,000至2,000,000道耳吞、或自約5,000至1,000,000道耳吞。額外適合的分子量範圍包括自約50,000道耳吞至約1,000,000道耳吞、或自約100,000道耳吞至約1,200,000道耳吞、或自約90,000道耳吞至約300,000道耳吞。玻尿酸的分子量通常為平均分子質量值，其例如可藉由多角度雷射光散射排除層析法(multi-angle laser light scattering exlusion chrormatography (MALLS-SEC))予以決定。視其來源而定，玻尿酸可具有達約3或更佳為達約2的多分散性(Mw/Mn)。通常，玻尿酸會有相當窄的分子量分佈，其值低於約2.5，更佳為低於 約2。玻尿酸聚合物的示範多分散性範圍為自約1.02至約2.5，其中該起始玻尿酸可擁有約1.02、1.05、1.1、1.2、1.3、1.3、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2,0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5、或甚至更大的多分散性。或是，玻尿酸聚合物於水中特定濃度時具有的黏度(通常以厘泊計)相當於以上所提供之任一或更多的平均分子量範圍。
如前述，玻尿酸組份可包含以交聯的HA為底質之水凝膠顆粒於玻尿酸的水溶液中。一種該組成物敘述於實例31中。較佳的水溶液為玻尿酸的鹽水溶液，其中添加至水凝膠之玻尿酸的示範水溶液的濃度範圍為自約0.3重量%至約4重量%、或自約0.5重量%至約2重量%。一代表性調合物包含以下相對量的組份：含有濃度為20mg/mL的2mL玻尿酸之4mL的凝膠漿料((2-(乙烯基碸基)乙氧基)1-10%玻尿酸/PEG-二硫醇)。特別佳的調合物包含含有濃度為20mg/mL的2mL玻尿酸之4mL的凝膠漿料((2-(乙烯基碸基)乙氧基)4%玻尿酸/PEG-二硫醇)。通常，在所得膨脹凝膠中的最終玻尿酸含量範圍自約0.05至5%(0.5mg/mL至50mg/mL)。較佳的是，在所得膨脹凝膠中的最終玻尿酸含量為自約0.1至3%、或自約0.1至1%、或自約0.5至0.8%。在所得膨脹凝膠中之說明性最終玻尿酸含量可為例如相當於以下百分比之任一者：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0。例如，在所得組成物中之玻尿酸對交聯的(例如(2-(乙烯基碸基)乙氧基)1-10%玻尿酸/PEG-二硫醇)水凝膠顆粒的代表性 相對量(重量比例)通常落在自約10：1、或自約5：1、或自約3：1、或自約1：1的範圍內。
其他示範的以HA為底質之組成物包括那些稱為SYNVISC®(包含海藍(hylan)A流體、海藍B凝膠及鹽水之類似凝膠的混合物)HYLASTANTM,MONOVISCTM,GEL-ONE®(參見例如美國專利公告No.2012/01426229)或DUROLANE®的組成物，進一步包含皮質類固醇。與皮質類固醇及如在此所提供的穩定化添加劑組合使用之額外以玻尿酸為底質之組成物包括敘述於美國專利4,713,448、美國專利5,143,724、美國專利5,827,937、美國專利6,013,679、美國專利5,356,883、美國專利5,502,081、以及美國專利6,884,788、6,548,081、6,620,927者。
在一個或更多個實施態樣中，在此所提供的玻尿酸聚合物組份為無菌的。一般的滅菌方法包括加熱、高壓滅菌、化學處理或過濾。
皮質類固醇
標的之以HA-聚合物為底質之組成物包含皮質類固醇。如先前所討論，本申請者認知含有例如縮丙酮特安皮質醇或其他的皮質類固醇之水性玻尿酸聚合物組成物顯示、黏度隨時間的損失明顯大於不含皮質類固醇之相同組成物所觀察到的。因此，認知有需要提供對黏度隨時間降低具有堅固抵抗性之玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物。
通常，皮質類固醇係選自以下之一者或多者：皮質醇(hydrocortisone)、乙酸皮質醇(hydrocortisone acetate)、乙酸皮質酮(cortisone acetate)、巰氫可的松新戊酸酯(tixocortol pivalate)、培尼皮質醇(prednisolone)、甲基培尼皮質醇、培尼皮質酮(prednisone)、特安皮質醇(triamcinolone)、縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone acetonide)、苯甲醯胺縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone benetonide)、縮丙酮特安皮質醇氧茚酯(triamcinolone furetonide)、己縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone hexacetonide)、醋酸特安皮質醇(triamcinolone diacetate)、特安皮質醇(triamcinolone alcohol)、默美塔松(mometasone)、醋酸環戊[酮]縮去炎松(amcinonide)、亞丁皮質醇(budesonide)、丙縮羥強龍(desonide)、氟洛奈皮質醇(fluocinonide)、丙酮氟洛皮質醇(fluocinolone acetonide)、氯氟松(halcinonide)、貝皮質醇(betamethasone)、貝皮質醇磷酸酯鈉(betamethasone sodium phosphate)、迪皮質醇(dexamethasone)、迪皮質醇磷酸酯鈉(dexamethasone sodium phosphate)、氟考龍(fluocortolone)、皮質醇-17-丁酸酯(hydrocortisone-17-butyrate)、皮質酮-17-戊酸酯(hydrocortisone-17-valerate)、阿率米塔松二丙酸酯(aclometasone dipropionate)、貝皮質醇戊酸酯(betamethasone valerate)、貝皮質醇二丙酸酯(betamethasone dipropionate)、波尼卡酯(prednicarbate)、氯氟美松酮-17-丁酸酯(clobetasone-17- butyrate)、氯氟美松-17-丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、氟考龍己酸酯(fluocortolone caproate)、氟考龍新戊酸酯(fluocortolone pivalate)、醋酸氟甲叉龍(fluprednidene acetate)、氯地米松二丙酸酯單水合物(beclomethasone dipropionate monohydrate)、9-去氟膚輕鬆(flunisolide)、克廷膚丙酸酯(fluticasone propionate)、默美塔松糠酸酯單水合物(mometasone furoate monohydrate)、及克廷膚糠酸酯(fluticasone furoate)。
在一較佳實施態樣中，該組成物包含縮丙酮特安皮質醇。使用於在此所提供水凝膠調合物之較佳的化合物為特安皮質醇(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羥基孕-1,4-二烯-3,20-二酮)、或其衍生物例如縮丙酮特安皮質醇、或藥學可接受的鹽、酯、其溶合物。縮丙酮特安皮質醇的結構顯示如下。
通常會將皮質類固醇混合、懸浮於、或包覆於在此所提供之以HA-聚合物為底質之組成物中。或是，皮質類固醇可為聚合物的共軛形式，或可為以可釋出的形式共價接至使用以製備以HA為底質之水凝膠的組份。
通常，組成物中含有皮質類固醇的量在約0.5至80mg/mL的範圍內。或是，以每重量計，如在此所提供的水性組成物含有自約0.01重量%至約20重量%皮質類固醇，視其效能而定。皮質類固醇說明性的量(總濕凝膠重計)例如對於較低效能的皮質類固醇為自約10重量%至約20重量%，及例如縮丙酮特安皮質醇之更有效的生物活性劑為自約0.01%至約10重量%、或自約0.01%至約5%、或自約0.01%至約3%、或自約0.1至約2%皮質類固醇、或甚至自約0.1至約1%皮質類固醇。
穩定化添加劑
為了將在此所提供的玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物穩定化，本申請者探討許多不同類型的添加劑，觀察到許多對於預防或將黏度的降低最小化並無效。然而，發現如在此所述例如糖、糖醇、多元醇及衍生化的多元醇的添加劑特別有效。因此，加入至現成的以HA-聚合物為底質-皮質類固醇組成物的穩定化添加劑包括特定的糖(單醣、雙醣、多醣)、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑。雖然該物質已經使用於將蛋白質穩定化以免去活化，通常在處理期間，該物質似乎並未已經報導或認知用於當與皮質類固醇混合時使以HA-聚合物為底質之物質抵抗黏度或其他流變特性的損失。在一實施態樣中，如在此所述水性之以HA-聚合物為底質之組成物缺乏治療性蛋白質或胜肽。通常，未與理論結合，該穩定化添加劑傾 向擁有一個或多個羥基烷基，例如羥基-低級烷基羥基甲基(-CH2-OH)或羥基乙基(-CH2CH2OH)。發現適合作為在此所提供之含有皮質類固醇組成物中的穩定化添加劑之物質包括例如蔗糖及聚葡萄糖-40的多醣及衍生化多醣、羧甲基纖維素；例如甘露醇及山梨醇的糖醇；例如n-乙醯葡萄胺糖及右旋糖的單醣；例如海藻糖、麥芽糖、及乳糖的雙醣；例如聚乙二醇(PEG)及衍生化多元醇之多元醇、TRITONTM-X-100(包含芳族烴基團及PEG鏈、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇的陰離子界面活性劑)、及甘油(簡單的多元醇)，如支援的實例中所示。適合使用之例如PEG及衍生化多元醇之多元醇擁有環氧乙烷的重複單元數目自約4至約500、或較佳自約6至約100。
實例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27皆顯示蔗糖作為含有玻尿酸聚合物的溶液中之穩定化添加劑及在額外包含以玻尿酸聚合物為底質之凝膠的玻尿酸聚合物的溶液中的優異成效。因此，較佳的穩定化添加劑為蔗糖。實例顯示在所檢測的示範條件下，蔗糖的添加有效地給予抵抗1.2至至少11.3倍的黏度降低之穩定化效應。其他較佳的添加劑包括甘露醇、山梨醇及N-乙醯葡萄胺糖(參見例如實例5、6、13)；麥芽糖、聚葡萄糖-40、PEG 4000、羧甲基纖維素、TRITONTM-x-100、及甘油(參見例如實例16)；海藻糖及右旋糖(參見例如實例17)。
通常，要給予明顯的穩定化效應並不需要大 量的穩定化添加劑。例如，以低至1%重量/重量的穩定化添加劑的量可觀察到有利的穩定化效應。通常，如前述所提供的穩定化添加劑的用量範圍自約0.25%至約20%。示範的用量以重量百分比計的範圍為選自蔗糖、聚葡萄糖-40、羧甲基纖維素、甘露醇、山梨醇、n-乙醯葡萄胺糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、聚乙二醇、TRITONTM-X-100、及甘油的添加劑之自約0.5重量%至約10重量%、或更佳為自約1重量%至約5%。在前述現成組成物中的說明性用量包括0.5%(皆以重量%)、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7%、8%、及10%。參見例如實例22，其中1%蔗糖係有效以提供6個月(40℃)時7.47的穩定化比例。
黏度及其他測量
雖然黏度可用作為以玻尿酸聚合物為底質之組成物的指示，例如彈性模數之其他流變測量也同樣適用，及藉由凝膠滲透層析法(GPC)測量的分子量改變以顯示穩定度。通常，在本現成的實例中，於實例中所說明的條件下使用流變儀測量黏度。在溫度(為熱穩定度的指示)、濕度、及例如提供庫存壽命的指示之時間的各種條件下測量黏度。由實例中可見，在此所述的穩定化添加劑有效地明顯預防在多種條件下所檢測示範之以玻尿酸為底質之皮質類固醇組成物之黏度隨時間的明顯損失。
示範的組成物及方法
一般而言，在此所提供的組成物及方法有效地將抵抗黏度隨時間降低之包含皮質類固醇的以玻尿酸為底質之聚合物組成物穩定化。可由許多不同方法之任一種加以測量該穩定化，例如藉由提供當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約50%黏度的降低之組成物。或是，該組成物當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比可表現不超過約45%黏度的降低。較佳的是，該組成物當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約40%黏度的降低。甚至更佳的是，該組成物當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約40%黏度的降低。因為由隨赴的實例中可見，可使用用於評估有利的穩定化之任何適合的閾值。於60℃貯存達6天期程的選擇(亦即在加速的貯存條件下)為方便的方法，因其提供在相對短的時間期程中調合物穩定度的評估。然而，由實例中可見，在許多溫度之任一者之下可測量到加強的穩定度，例如60℃、55℃、40℃、45℃、80℃、及其類似者，且經過任何代表性的時間期程，例如第1天、第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、或6個月，或相對濕度，例如通常在自約30%至75%相對濕度的範圍內。
在用於說明加入如在此所述的穩定化添加劑的穩定化優點之可替代的方法中，如在此所提供的組成物通常會擁有大於1.2的穩定化比例。如前述，當於給定時 間點及在定義的貯存條件組之下測量時，該穩定化比例為包含該穩定化添加劑之玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物之黏度保留百分比對不含該穩定化添加劑之相同的玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物之黏度保留百分比的比例。因此，擁有1.0的穩定化比例之組成物表現黏度的降低與不含該穩定化添加劑的組成物相同，亦即，該添加劑無法提供保護抵抗黏度隨時間降低之可測量的程度。較佳的是，在此所提供的組成物會擁有至少約1.3、或至少約1.5的穩定化比例。特別佳的組成物擁有大於約1.8穩定化比例。如隨附實例中所提供的示範穩定化比例包括以下的值：約1.5、約1.6、約1.7、約3.0、約4、約5.0、約7、約7.5、或甚至更大。因此，在此所提供的組成物及方法為適合於提供具有穩定化比例相當於前述之任一或更多的值或落在前述穩定化比例值之任二者之間的範圍內的水性玻尿酸聚合物組成物。可在任何適合的時間點測量穩定化比例，例如在第1天、第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、或6個月，及在任何適合的貯存溫度，例如25℃、40℃、45℃、55℃、60℃、或80℃，通常在自約30%至75%範圍內的相對濕度(例如在以下之任一者：30% RT、35% RT、40% RT、45%RT、50% RT、55% RT、60% RT、65% RT、70% RT、及75% RT)。例如，在一實施態樣中，穩定化比例係在組成物於60℃下貯存第6天時予以測量。
也提供一種製造具有減少黏度隨時間降低之 以玻尿酸為底質之聚合物組成物的方法，該方法包含將穩定化用量之選自由糖、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑所組成的群組之穩定化添加劑，加入至包含玻尿酸聚合物及皮質類固醇的水性組成物中，藉以提供穩定化比例大於1.2、或可替代地當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約50%黏度的降低之組成物。在該方法中，組成物可例如為玻尿酸聚合物的水溶液，其可為玻尿酸本身、或以玻尿酸為底質之聚合物，或組成物可包含以玻尿酸為底質之聚合物的水溶液，其可為與以玻尿酸聚合物為底質之水凝膠混合的玻尿酸。該水性組成物可包含例如氯化鈉之多種鹽類、例如磷酸鈉之多種緩衝劑、及其類似者。通常，包含玻尿酸聚合物、穩定化添加劑、及皮質類固醇的水性組成物係混合例如達數分鐘至數小時。所得組成物的樣本通常再轉移至例如滅菌的玻璃樣本瓶之容器、密封，並置於如前述及實例中之選擇的貯存條件下。在貯存之前，測量水溶液的黏度(例如在時間等於零時)，以提供初始值而提供用於比較的基礎。
如在此所提供之特別有效的水性組成物為包含蔗糖作為穩定化添加劑者。蔗糖在水性組成物中的說明性用量為1%重量/重量、2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量、5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量。發現蔗糖確實是對穩定化特別有效，甚至在例如1%、1.25%、及1.75%(重量/重量)的低濃度下。因此，根據本揭示的組成 物可含有穩定化添加劑(蔗糖)的任一說明性用量，或落在上述所提供的任意二個重量百分比之間的用量。
額外地，發現甘露醇對於預防黏度的降低特別有效，甚至在例如1%重量/重量、2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量的濃度，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量。因此，根據本揭示的組成物可含有穩定化添加劑(甘露醇)的任一說明性用量，或落在上述所提供的任意二個重量百分比之間的甘露醇用量。
也發現額外的穩定化添加劑對於預防黏度的降低特別有效，例如山梨醇(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、N-乙醯葡萄胺糖(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、乳糖(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、聚葡萄糖-40(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重 量、及10%重量/重量)、PEG 4000(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、羧甲基纖維素(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、TRITON-x-100(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、甘油(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、海藻糖(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量、或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)、及右旋糖(例如以%重量/重量的濃度，2%重量/重量、3%重量/重量、4%重量/重量，或甚至更大，例如5%重量/重量、6%重量/重量、7%重量/重量、8%重量/重量、9%重量/重量、及10%重量/重量)。因此，根據本揭示的額外組成物可含有如所述的量或落在上述所提供的任意二個重量百分比之間的用量之前述說明性添加劑之任一者。
以下提供示範的組成物。在一觀點中，提供如前述之包含以玻尿酸為底質之聚合物、皮質類固醇及穩定化添加劑之水性組成物。在一實施態樣中，該水性組成物為溶液。實例1至22提供以玻尿酸聚合物為底質之溶液的說明性實例。而在另一實施態樣中，該水性組成物包含用於玻尿酸聚合物組份之以玻尿酸為底質之聚合物及以玻尿酸聚合物為底質之凝膠的溶液，其中前述的代表性實例提供於實例23至27中。
較佳的水溶液為包含未修飾玻尿酸的溶液於例如鹽水中，其中玻尿酸的示範水溶液的濃度範圍自約0.3%至約4%、或自約0.5%至約2重量%。或是，該水溶液可包含如在此所提供之任何適合的以玻尿酸為底質之聚合物。該水溶液或溶液凝膠組合進一步包含如前述的皮質類固醇，及如在此所提供之穩定化用量的穩定化添加劑(例如糖、糖醇、多元醇或衍生化多元醇)。
在一特別的實施態樣中，皮質類固醇係選自由皮質醇、乙酸皮質醇、乙酸皮質酮、巰氫可的松新戊酸酯、培尼皮質醇、甲基培尼皮質醇、培尼皮質酮、特安皮質醇、縮丙酮特安皮質醇、苯甲醯胺縮丙酮特安皮質醇、縮丙酮特安皮質醇氧茚酯、己縮丙酮特安皮質醇、醋酸特安皮質醇、特安皮質醇、默美塔松、醋酸環戊[酮]縮去炎松、亞丁皮質醇、丙縮羥強龍、氟洛奈皮質醇、丙酮氟洛皮質醇、氯氟松、貝皮質醇、貝皮質醇磷酸酯鈉、迪皮質醇、迪皮質醇磷酸酯鈉、氟考龍、皮質醇-17-丁酸酯、皮 質酮-17-戊酸酯、阿率米塔松二丙酸酯、貝皮質醇戊酸酯、貝皮質醇二丙酸酯、波尼卡酯、氯氟美松酮-17-丁酸酯、氯氟美松-17-丙酸酯、氟考龍己酸酯、氟考龍新戊酸酯、醋酸氟甲叉龍、氯地米松二丙酸酯單水合物、9-去氟膚輕鬆、克廷膚丙酸酯、默美塔松糠酸酯單水合物、及克廷膚糠酸酯所組成的群組。
在一個或多個較佳實施態樣中，皮質類固醇為特安皮質醇或例如縮丙酮特安皮質醇之特安皮質醇的衍生物。
在一個或多個特別佳實施態樣中，皮質類固醇為縮丙酮特安皮質醇。
而在進一步的實施態樣中，該水性組成物包含以重量百分比計之自約0.5重量%至約10重量%、或更佳為自約1重量%至約5%的穩定化添加劑。
而在與前述之任一者或多者相關的另一實施態樣中，該穩定化添加劑係選自蔗糖、聚葡萄糖-40、羧甲基纖維素、甘露醇、山梨醇、n-乙醯葡萄胺糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、聚乙二醇、TRITONTM-X-100、及甘油。
而在與前述相關之一個或多個較佳實施態樣中，該穩定化添加劑為蔗糖。
考量包含以玻尿酸聚合物為底質之凝膠的水性組成物，例如通常與如前述之未修飾玻尿酸混合，在此提供說明性的組成物。在較佳的實施態樣中，該玻尿酸凝 膠為以其10%或更低的羥基與二乙烯碸反應而衍生的玻尿酸，其與具有二個或更多硫醇基之硫醇交聯劑交聯。在特別佳的實施態樣中，該以其10%或更低的羥基與二乙烯碸反應而衍生的玻尿酸係與PEG-二硫醇交聯。例如，該玻尿酸的羥基轉化成2-(乙烯基碸基)乙氧基的程度係通常選自1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、及10%。參見例如在此實例28及29。當以凝膠形式時，本組成物中的玻尿酸聚合物組份可為例如水性漿料的水性組成物，或可為與未修飾玻尿酸的溶液混合(參見例如實例31)。較佳的水溶液為玻尿酸的鹽水溶液，其中添加至水凝膠的玻尿酸示範水溶液的濃度範圍為自約0.3%至約4%、或自約0.5%至約2重量%。一代表性的調合物包含以玻尿酸聚合物為底質之組份的以下相對量：含有濃度為20mg/mL的2mL玻尿酸之4mL的凝膠漿料((2-(乙烯基碸基)乙氧基)1-10%玻尿酸/PEG-二硫醇)。特別佳的調合物包含含有濃度為20mg/mL的2mL玻尿酸之4mL的凝膠漿料((2-(乙烯基碸基)乙氧基)4%玻尿酸/PEG-二硫醇)。通常，在所得膨脹凝膠中的最終玻尿酸含量範圍自約0.05至5%(0.5mg/mL至50mg/mL)。較佳的是，在所得膨脹凝膠中的最終玻尿酸含量為自約0.1至3%、或自約0.1至1%、或自約0.5至0.8%。在所得膨脹凝膠中之說明性最終玻尿酸含量可為例如相當於以下百分比之任一者：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0。例如，在所得組成物中之玻尿酸對交聯的(例如(2-(乙烯基碸基)乙氧 基)1-10%玻尿酸/PEG-二硫醇)水凝膠顆粒的代表性相對量(重量比例)通常落在自約10：1、或自約5：1、或自約3：1、或自約1：1的範圍內。
特別佳的調合物及相關的方法為包含如前述說明的玻尿酸聚合物組份、縮丙酮特安皮質醇及蔗糖者。
在所提供的組成物及方法之一個或多個實施態樣中，組成物為無菌。額外地，可將該組成物包裝及貯存於例如針筒中，以供後續使用。
用途
在此所述之穩定化的玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物可使用於許多應用中，例如用於受傷的治療、血管生長、及腫瘤形成。參見D.D.Allison及K.J.Grande-Allen，組織工程，第12冊，第8期，2131-2140(2006)；G.D.Prestwich等人，組織工程，第12冊，第8期，2171-2180(2006)；G.D.Prestwich等人，組織工程，第12冊，第12期，3405-3416(2006)。該穩定化的組成物也可用作為組織填料、皮膚填料、例如作為尿道或食道體積膨脹劑之體積膨脹劑、及栓塞劑，以及修復軟骨缺陷/受傷的藥劑及強化骨頭修復及/或生長的藥劑。有利的是，該組成物基於包括穩定化添加劑對其黏度會比其另外不含該添加劑者維持至更大的程度，而提供會理想地在目標位置持續達一段長的延伸時間期程之用於投藥的治療性組成物。
該組成物也可用於骨關節炎或類風濕性關節 炎的治療，或用於例如痛風或焦磷酸鈣沈積症之其他發炎性關節炎(例如藉由注入至關節的關節內空間)，或降低或預防可隨著外科程序而形成之黏著。該組成物特別有用於治療慢性或急性發炎。特別是，當以皮質類固醇加入至玻尿酸聚合物之皮質類固醇的注射時，標的組成物有用於降低軟骨的傷害。例如，參考包含凝膠的調合物，皮質類固醇的加入可有效預防大部份的類固醇顆粒與關節組織的直接接觸。而且，類固醇顆粒陷入在以玻尿酸聚合物為底質之水凝膠中可有效地將關節中的類固醇局部濃度最大化，同時將其系統濃度最小化。額外地，類固醇顆粒埋覆於在此所提供之水凝膠調合物可有效地包戶類固醇顆粒以免自關節過早清除。最後，藉由將類固醇埋覆於水凝膠中，達到之類固醇的治療效果比不含水凝膠埋覆可達到者的總劑量更低，同時將不要的局部及系統性副作用最小化。
該組成物也可使用於眼睛疾病、急性痛風性關節炎、急性及亞急性滑囊炎、急性非特定的腱鞘炎、上髁炎、或滑膜炎中的治療。組成物可使用於斑形脫髮中的治療；盤狀紅斑狼瘡；瘢瘤；環狀肉芽腫的局部肥大、浸潤、炎性病變，扁平苔癬，慢性單純苔癬(神經性皮炎)，及牛皮癬斑塊；糖尿病脂性漸進壞死。對於腱膜或肌腱(神經節)的囊腫瘤也有用。
現在連結特定的實施態樣說明本申請案，其並非要限制本發明的範圍。相反地，本申請案涵蓋包括在申請專利範圍內之所有替代方案、修改、及等效物。因 此，以下將說明用於特定實施態樣的說明目的之本申請案的實施，且將其呈現以提供其程序及觀點相信是有用且容易瞭解的說明。
實例
以下實例係用以對一般熟悉本技藝者提供完整的揭示及如何完成與評估在此所提供的化合物、組成物、及方法的敘述，並要作為純粹示範用。因此，該實例絕非要限制本發明者看待其發明的範圍。有許多變化及反應條件的組合，例如組份的濃度、所欲的溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力、及其他反應參數與條件，可使用以將例如純度、產量、及類似者之產物特性最佳化。其也同樣視為在本揭示的範圍內。除非在此另外指出或是以上下文另外清楚地否定，否則其所有可能變化中的前述元素之任何組合皆為本發明所包含。
實例1A 對於含有皮質類固醇之以交聯的玻尿酸為底質之組成物觀察到黏度的增強降低
在以懸浮於玻尿酸溶液中之含有以交聯的玻尿酸為底質之水凝膠的調合物研究期間，當貯存25℃時，觀察到含有皮質類固醇、縮丙酮特安皮質醇(TA)時，玻尿酸組份的黏度隨時間降低的比不含皮質類固醇、縮丙酮特安皮質醇的相同調合物更快。
以表1中所摘錄的觀察為基礎，進行額外的研究，以決定是否可改善前述的黏度損失，例如藉由包含加入可能的穩定化添加劑之不同路徑。
實例1B 蔗糖對80℃下HA黏度的效應
將6.9g的玻尿酸HA(Lifecore，888KDa)溶解於881mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.97mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將372mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與223.2mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約1.5g蔗糖分別添加至74±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在80℃的烘箱中。除了0小時樣本以外，在每一時 間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對0小時的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。30小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果進一步顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度明顯降低所示。結果也顯示蔗糖的添加比不含蔗糖的HA/TA樣本導致黏度減少之明顯降低。
實例2 蔗糖對60℃下HA黏度的效應
將6.9g的HA(Lifecore，888KDa)溶解於881mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.97mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將372mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與223.2mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約1.5g蔗糖分別添加至74±1mL的 HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度明顯降低所示。結果進一步顯示蔗糖的添加比不含蔗糖的HA/TA樣本導致黏度減少之明顯降低。
實例3 蔗糖對55℃下HA黏度的效應
將6.9g的HA(Lifecore，888KDa)溶解於881mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.97mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將135.3mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與81.2mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.5g蔗糖分別添加至24±2mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了第0天樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度降低所示。結果進一步顯示蔗糖的添加比不含蔗糖的HA/TA樣本導致黏度減少之可注意的降低，在每一時間點藉由含有蔗糖而帶來明顯的穩定化，但特別是在進一步的時間點(例如第6天顯示未含有添加劑的組成物與含有添加劑的組成物之間的黏度差異比第3天更大等等)。
實例4 蔗糖對40℃下HA黏度的效應
將6.9g的HA(Lifecore，888KDa)溶解於881mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.97mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將372mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與223.2mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約1.5g蔗糖分別添加至74±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0週樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在40℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0週的黏度比 例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6週的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度降低所示。結果進一步顯示蔗糖的添加比不含蔗糖的HA/TA樣本導致黏度減少之明顯降低。該效應於40℃下進一步持續，且隨時間變得越來越突出。
實例5 多種添加劑對45℃下HA黏度的效應
將7.83g的HA(Lifecore，910KDa)溶解於1000mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore,Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將4.38mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將500mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與300mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.37g蔗糖、右旋糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇及N-乙醯葡萄胺糖分別添加至37±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約1%(重量/重量)添加劑 的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在45℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第12週的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示蔗糖、甘露醇、山梨醇及N-乙醯葡萄胺糖的添加比無該添加劑的樣本導致HA黏度的更大(且實質的)保留。而且，當與不含添加劑的組成物比較可見，糖類(右旋糖及麥芽糖)對於將玻尿酸-縮丙酮特安皮質醇組成物的穩定化無效。
實例6 添加劑對80℃下HA黏度的效應
將7.83g的HA(Lifecore，910KDa)溶解於1000mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將4.38mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。將大約16g(±1g)等分置入6個滅菌的nalgene瓶中。將蔗糖添加至3個瓶中，以使每一瓶中的最終蔗糖含量分別為大約2%(重量/重量)、5%(重量/重量)及10%(重量/重量)。將山梨醇添加至剩餘的3瓶，以使每一瓶中的最終山梨醇含量分別為大約2%(重量/重量)、5%(重量/重量)及10%(重量/重量)。將縮丙酮特安皮質醇(USP)添加至大約8g之每一HA/添加劑溶液，以使最終TA含量為每克HA/添加劑溶液大約1.67mg。取8.17ml的緩衝HA溶液並添加縮丙酮特安皮質醇(USP)以製備控制樣本，以使最終TA含量為每克HA溶液大約1.67mg。攪拌樣本，以使TA良好地分散於溶液中。再將大約2ml的每一樣本移至玻璃閃爍瓶並關閉螺旋蓋。將一半樣本置於設在80℃的烘箱中達22小時。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以22小時樣本對0小時樣本的黏度比例(2個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。22小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
表7中的結果顯示添加蔗糖及山梨醇皆比無該任一添加劑的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例7 蔗糖對80℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw880KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g蔗糖分別添加至48±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶 中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在80℃的烘箱中。除了0小時的樣本以外，在每一時間點(10小時、20小時及30小時)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對0小時的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。30小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加蔗糖比無蔗糖的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例8 蔗糖對60℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw730KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器 (Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g蔗糖分別添加至48±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第4天及第6天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加蔗糖比無蔗糖的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例9 蔗糖對55℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw880KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g蔗糖分別添加至48±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之 所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第5天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加蔗糖比無蔗糖的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例10 蔗糖對55℃下HA(880)黏度的效應
將4.7g的HA(Lifecore，880KDa)溶解於600mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將0.84mL的1M磷酸 鈉(pH 6.71)添加至167.51mL的該經過濾的HA溶液。再將248.4mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與144.2mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.24g、0.30g、0.36g、0.42g及0.48g蔗糖分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、1.25%(重量/重量)、1.5%(重量/重量)、1.75%(重量/重量)及2%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了0小時的樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
數據顯示含有TA比無TA的HA樣本導致增加HA黏度的降低。結果顯示對HA/TA混合物添加蔗糖比無蔗糖的HA/TA混合物導致減少HA黏度的降低。
實例11-MW的效應 蔗糖對55℃下HA(730)黏度的效應
將4.7g的HA(Lifecore，730KDa)溶解於600mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將0.86mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至171.8mL的該HA溶液。再將248.2mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與148.9mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.24g、0.30g、0.36g、0.42g及0.48g蔗糖分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、1.25%(重量/重量)、1.5%(重量/重量)、1.75%(重量/重量)及2%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等 分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了0小時的樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
數據顯示含有TA比無TA的HA樣本導致增加HA黏度的降低。結果顯示對HA/TA混合物添加蔗糖比無蔗糖的HA/TA混合物導致減少HA黏度的降低。
實例12 蔗糖對55℃下HA(>1000)黏度的效應
將15.66g的HA(Shiseido，>1000KDa)溶解於2000mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將9.4mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至1873.9mL的該HA溶液。再將256.7mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與154mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.24g、0.30g、0.36g、0.42g及0.48g蔗糖分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、1.25%(重量/重量)、1.5%(重量/重量)、1.75%(重量/重量)及2%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了0小時的樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示對HA/TA混合物添加蔗糖比無蔗糖的HA/TA混合物導致減少HA黏度的降低。
實例13 甘露醇對80℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw880KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g甘露醇分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)甘露醇的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在80℃的烘箱中。除了0 小時的樣本以外，在每一時間點(10小時、20小時及30小時)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對0小時的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。30小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加甘露醇比無甘露醇的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例14 甘露醇對60℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw730KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g甘露醇分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)甘露醇的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第4天及第6天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加甘露醇比無甘露醇的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例15 甘露醇對550℃下HA黏度的效應
將6.31g的HA(Lifecore，平均Mw880KDa)溶解於805.5mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將3.7mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將大約1.23g mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與740.5mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.48g、0.96g、1.4g及1.9g甘露醇分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)、2%(重量/重量)、3%(重量/重量)及4%(重量/重量)甘露醇的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在55℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第5天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不 含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示添加甘露醇比無甘露醇的樣本導致HA黏度的更大保留。
實例16 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將3.92g的HA(Shiseido，IV=2m3/kg)溶解於500mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將2.16mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將344.3mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與206.6mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g乳糖、蜜二糖、聚葡萄糖40、聚乙二醇4000(PEG 4000)、羧甲基纖維素鈉鹽(CMC)、titron-X 100及甘油分別與每一24±1mL的HA/TA混合達1小時，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2 mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第7天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第7天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度降低所示。結果顯示乳糖、聚葡萄糖40、PEG 40000、CMC、triton x100及甘油的添加比不含添加劑的HA/TA樣本導致黏度減少之降低。
實例17 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將3.92g的HA(Shiseido，IV=2m3/kg)溶解於500mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將2.16mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至該HA溶液。再將344.3mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與206.6mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g海藻糖、蔗糖、右旋糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇及N-乙醯葡萄胺糖分別與每一24±1mL的HA/TA混合達1小時，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了0小時樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第6天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有TA導致HA的增加分解，如黏度降低所示。結果顯示海藻糖、蔗糖、右旋糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇及N-乙醯葡萄胺糖的添加比不含添加劑的HA/TA樣本導致黏度減少之降低。
實例18 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將19.6g的HA(Shiseido，IV=2m3/kg)溶解於2.5L的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將1.15mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至228.9mL的該HA溶液。再將334.9mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與200.95mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖分別添加至24±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約 2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示含有己縮丙酮特安皮質醇比不含己縮丙酮特安皮質醇的HA導致HA黏度的減少。甘露醇、山梨醇、蔗糖及甘油添加至HA/TH樣本的結果為比僅有 HA/TH的樣本有更高的HA黏度保留。
實例19 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將15.66g的HA(Shiseido，IV=1.9m3/kg)溶解於2L的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將9.4mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至1.87L的該HA溶液。再將333.3mg的乙酸甲基培尼皮質醇(MPA)與200mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖分別添加至24±1mL的HA/MPA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖添加至HA/MPA樣本的結果為比僅有HA/MPA的樣本有更高的HA黏度保留。對於所有含有該添加劑的樣本，在第6天的穩定化比例大於1。
實例20 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將15.66g的HA(Shiseido，IV=1.9m3/kg)溶解於2L的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將9.4mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至1.87L的該HA溶液。再將338.9mg的貝皮質醇磷酸酯鈉(BMSP)與203.4mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖分別添加至24±1mL的HA/BMSP懸浮液的個別樣本，以提供含有大約 2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖添加至HA/BMSP樣本的結果為比僅有HA/BMSP的樣本有更高的HA黏度保留。對於所有含有該 添加劑的樣本，在第6天的穩定化比例大於1。
實例21 添加劑對60℃下HA黏度的效應
將15.66g的HA(Shiseido，IV=1.9m3/kg)溶解於2L的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將9.4mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至1.87L的該HA溶液。再將356.7mg的乙酸培尼皮質醇(PA)與210.4mL的溶解HA於滅菌的250mL Nalgene瓶中混合。將大約0.48g甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖分別添加至24±1mL的HA/PA懸浮液的個別樣本，以提供含有大約2%(重量/重量)添加劑的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在60℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
甘露醇、山梨醇、麥芽糖、蔗糖、甘油、聚葡萄糖40及乳糖添加至HA/PA樣本的結果為比僅有HA/PA的樣本有更高的HA黏度保留。對於所有含有該添加劑的樣本，在第6天的穩定化比例大於1。
實例22 蔗糖對40℃下HA黏度的效應
將3.5g的HA(Lifecore，730KDa)溶解於450mL的0.9% NaCl中過夜。以0.2μm過濾器(Millipore，Opticap 4”)將溶解的HA無菌過濾。將1.77mL的1M磷酸鈉(pH 6.71)添加至354mL的該HA溶液。再將590mg的USP等級縮丙酮特安皮質醇(TA)與354mL的溶解HA於滅菌的Nalgene瓶中混合。將大約0.587g蔗糖分別添加至58.7±1mL的HA/TA懸浮液的個別樣本，以提供分別含有大約1%(重量/重量)蔗糖的樣本。每一混合物皆混合1小時。控制樣本中未添加添加劑。將每一大的樣本(2±0.2mL等 分樣本)置於滅菌的4mL玻璃樣本瓶中，再以墊片及鋁蓋加以密封。將除了第0天樣本以外之所有這些等分的樣本置於設在40℃的烘箱中。除了第0天的樣本以外，在每一時間點(15天、30天、45天及6個月)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。6個月的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
實例23 水凝膠/HA溶液之蔗糖對HA黏度的效應
調合物B：將29.19g乙烯碸修飾的玻尿酸(HAVS)(Mw730KDa，平均取代=3.9%)溶解於1837.6mL水中以供注射(WFI)。將807.6g之該HAVS溶液無菌地移至滅菌的8L反應槽中，接著經過0.2μm膠囊式濾心的雙重滅菌過濾。22.7g的滅菌過濾的磷酸鹽(磷酸二氫鈉單水合物[USP]，12.4g於161g WFI中，使用6N NaOH及6N HCl 將pH調整至pH7.4)。再將9.19g滅菌的縮丙酮特安皮質醇(USP)添加至該溶液。於50rpm下攪拌混合物達10分鐘及於150rpm下達2小時。將28.4g滅菌的過濾二硫醇聚乙二醇3350溶液(於WFI中50mg/mL)添加至該混合物。於150rpm下攪拌混合物達3分鐘，然後將來自循環水浴(45℃)的水循環進該反應槽水套管。再將該混合於50rpm下攪拌15分鐘後，關閉攪拌器。在大約17小時後，停止水循環，且藉由開啟攪拌器於50rpm下達5分鐘，將所形成的凝膠破碎成更小塊。將4,6521g的滅菌過濾HA/0.9% NaCl溶液(7.8mg/mL,Mw730KDa)添加至該破碎的凝膠。2小時之後，所得的混合物滅菌地泵送經過2×840um篩網並進入填充槽中。將該經篩網的混合物於20rpm下攪拌3小時，然後使用Baxa repeater泵浦(大約每針筒6.2mL)將混合物填充進滅菌的10mL玻璃針筒。然後停止該指針筒。針筒的一部份貯存於40℃/75% RH下達3個月且針筒的另一部份貯存於25℃/60%RH達3個月。
調合物B+蔗糖：除了所使用的HA/0.9% NaCl溶液含有1.7%或2%(重量/重量)蔗糖(USP)以外，使用與所述的相同方法製備調合物。
使用Cannon-Ubbelohde半微玻璃黏度計於設定在25℃的水浴中，測量前述所製備的樣本上澄溶液的比黏度。取1mL的樣本上澄液並以7mL 0.1M磷酸鹽緩衝液(磷酸二氫鈉單水合物，pH7)將其稀釋，以製備用於黏度測量的樣本。使用該磷酸鹽緩衝液以測量溶劑的流動時 間。以3個月對第0個月的比黏度(3個樣本的平均)比例，決定HA黏度保留百分比。
數據顯示對調合物添加蔗糖導致比未添加蔗糖的調合物於25℃及40℃下皆有較大的HA組份黏度保留。
實例24 水凝膠/HA溶液於80℃下之蔗糖對HA黏度的效應
將4.92g HAVS(Mw 730至950KDa，平均取代=3.9%)溶解於351mL WFI。再使用0.2μm過濾器將該溶液滅菌過濾。將大約13.5±0.5mL的HAVS溶液等份置入100mL塑膠瓶中。總共填充4瓶。將縮丙酮特安皮質醇(USP)[TA]添加至每一等份，以使TA含量為大約1.67mg/mL。將 內容物良好地混合。將大約0.38mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)添加至每一混合物瓶並將內容物良好地混合。將大約0.47mL的50mg/ml二硫醇聚乙二醇3350溶液添加至每一瓶。將內容物良好地混合。將瓶子的螺旋蓋蓋緊並將每一溶液於45℃下恆溫過夜。製備7.83mg/mL HA溶液(0.9%鹽水)並經過0.2μm過濾器過濾。將3.4mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 6.7)添加至678mL的HA溶液。自烘箱移出瓶子並將大約77±2mL HA溶液(MW=730KDa，7.83mg/mL於0.9%鹽水中)添加至每一瓶。對其中一瓶添加蔗糖，以產生含有大約2%(重量/重量)蔗糖的調合物。對第二瓶添加蔗糖，以產生含有大約3%(重量/重量)蔗糖的調合物。在1小時的攪拌之後，使用60mL針筒及含有篩網的針筒過濾器使每一瓶的內容物經過840um篩網擠製。將每一擠製的混合物等分(大約6.2mL)置入20ml玻璃閃爍樣本瓶中。以螺旋蓋將樣本瓶蓋緊，且除了0小時樣本以外，將樣本置入設在80℃的烘箱中。除了0小時樣本以外，在每一時間點(10小時、20小時及30小時)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對0小時的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。30小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示蔗糖的添加比無蔗糖的樣本導致更大的HA黏度保留。
實例25 水凝膠/HA溶液於80℃下之蔗糖對HA黏度的效應
將4.92g HAVS(Mw 730至950KDa，平均取代=3.9%)溶解於351mL WFI。再使用0.2μm過濾器將該溶液滅菌過濾。將大約14.2±0.5mL的HAVS溶液等份置入100mL塑膠瓶中。總共填充4瓶。將縮丙酮特安皮質醇(USP)[TA]添加至每一等份，以使TA含量為大約1.67mg/mL。將內容物良好地混合。將大約0.4mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)添加至每一混合物瓶並將內容物良好地混合。將大約0.5mL的50mg/ml二硫醇聚乙二醇3350溶液添加至每一瓶。將內容物良好地混合。將瓶子的螺旋蓋蓋緊並將每一溶液於45℃下恆溫過夜。製備7.83mg/mL HA溶液(0.9%鹽水)並經過0.2μm過濾器過濾。將3.97mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 6.7)添加至794.7mL的HA溶液。自烘箱移出瓶子並將大約82±2mL HA溶液(MW=880KDa，7.83mg/mL於0.9%鹽水中)添加至每一瓶。對其中一瓶添加蔗糖，以產生含有大約2%(重量/重量)蔗糖的調合物。對第二瓶添加 蔗糖，以產生含有大約3%(重量/重量)蔗糖的調合物。在1小時的攪拌之後，使用60mL針筒及含有篩網的針筒過濾器使每一瓶的內容物經過840um篩網擠製。將每一擠製的混合物等分(大約6.2mL)置入20ml玻璃閃爍樣本瓶中。以螺旋蓋將樣本瓶蓋緊，且除了0小時樣本以外，將樣本置入設在80℃的烘箱中。除了0小時樣本以外，在每一時間點(10小時、20小時及30小時)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對0小時的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。30小時的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示蔗糖的添加比無蔗糖的樣本導致更大的HA黏度保留。
實例26 水凝膠/HA溶液於60℃下之蔗糖對HA黏度的效應
將4.92g HAVS(Mw 730至950KDa，平均取代 =3.9%)溶解於351mL WFI。再使用0.2μm過濾器將該溶液滅菌過濾。將大約13.5±0.5mL的HAVS溶液等份置入100mL塑膠瓶中。總共填充4瓶。將縮丙酮特安皮質醇(USP)[TA]添加至每一等份，以使TA含量為大約1.67mg/mL。將內容物良好地混合。將大約0.38mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)添加至每一混合物瓶並將內容物良好地混合。將大約0.47mL的50mg/ml二硫醇聚乙二醇3350溶液添加至每一瓶。將內容物良好地混合。將瓶子的螺旋蓋蓋緊並將每一溶液於45℃下恆溫過夜。製備7.83mg/mL HA溶液(0.9%鹽水)並經過0.2μm過濾器過濾。將3.4mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 6.7)添加至678mL的HA溶液。自烘箱移出瓶子並將大約77±2mL HA溶液(MW=730KDa，7.83mg/mL於0.9%鹽水中)添加至每一瓶。對其中一瓶添加蔗糖，以產生含有大約2%(重量/重量)蔗糖的調合物。對第二瓶添加蔗糖，以產生含有大約3%(重量/重量)蔗糖的調合物。在1小時的攪拌之後，使用60mL針筒及含有篩網的針筒過濾器使每一瓶的內容物經過840um篩網擠製。將每一擠製的混合物等分(大約6.2mL)置入20ml玻璃閃爍樣本瓶中。以螺旋蓋將樣本瓶蓋緊，且除了第0天樣本以外，將樣本置入設在60℃的烘箱中。除了第0天樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第6天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度 保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示蔗糖的添加比無蔗糖的樣本導致更大的HA黏度保留。
實例27 水凝膠/HA溶液於55℃下之蔗糖對HA黏度的效應
將4.92g HAVS(Mw 730至950KDa，平均取代=3.9%)溶解於351mL WFI。再使用0.2μm過濾器將該溶液滅菌過濾。將大約14.2±0.5mL的HAVS溶液等份置入100mL塑膠瓶中。總共填充4瓶。將縮丙酮特安皮質醇(USP)[TA]添加至每一等份，以使TA含量為大約1.67mg/mL。將內容物良好地混合。將大約0.4mL 1M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)添加至每一混合物瓶並將內容物良好地混合。將大約0.5mL的50mg/ml二硫醇聚乙二醇3350溶液添加至每一瓶。將內容物良好地混合。將瓶子的螺旋蓋蓋緊並將每一溶液於45℃下恆溫過夜。製備7.83mg/mL HA溶液(0.9%鹽水)並經過0.2μm過濾器過濾。將3.97mL 1M磷酸鹽緩衝 液(pH 6.7)添加至794.7mL的HA溶液。自烘箱移出瓶子並將大約82±2mL HA溶液(MW=880KDa，7.83mg/mL於0.9%鹽水中)添加至每一瓶。對其中一瓶添加蔗糖，以產生含有大約2%(重量/重量)蔗糖的調合物。對第二瓶添加蔗糖，以產生含有大約3%(重量/重量)蔗糖的調合物。在1小時的攪拌之後，使用60mL針筒及含有篩網的針筒過濾器使每一瓶的內容物經過840um篩網擠製。將每一擠製的混合物等分(大約6.2mL)置入20ml玻璃閃爍樣本瓶中。以螺旋蓋將樣本瓶蓋緊，且除了第0天樣本以外，將樣本置入設在55℃的烘箱中。除了第0天樣本以外，在每一時間點(第1天、第3天及第6天)自烘箱移出3個樣本，並使冷卻至室溫。使用AR550流變儀(TA Instrument)，利用40mm 2°鋼錐於22℃以3分鐘的時間掃描，測量每一樣本的黏度。以指定的天對第0天的黏度比例(3個樣本的平均)決定HA黏度保留百分比。第6天的穩定化比例為含有特定添加劑的HA黏度保留百分比對不含添加劑的樣本之HA黏度保留百分比的比例。
結果顯示蔗糖的添加比無蔗糖的樣本導致更大的HA黏度保留。
實例28 乙烯碸衍生化玻尿酸的合成(HA-VS)-低程度的修飾
本實例敘述用於在此所提供的穩定化組成物之示範及較佳物質的製備。
於1L圓底燒瓶中秤取5g玻尿酸(HA)(9.4×104cps(於水中3%))。將500mL滅菌過濾水添加至該HA。將燒瓶置於設定在20至100rpm之間旋轉的旋轉蒸發器上。旋轉該溶液直到所有HA溶解(大約16至18小時)。再將HA溶液(10mg/mL)移至1L玻璃燒杯。連接至上方攪拌器的攪拌槳置入於溶液中，並設定至確保溶液有效攪拌的攪拌速度。將333mL的0.25N NaOH溶液(83.2mL 1N NaOH添加至249.8mL去離子水)添加至該攪拌中的HA溶液。大約1分鐘後，將150mL的二乙烯碸溶液(18mL二乙烯碸溶解於132mL去離子水中)快速添加至該攪拌中的溶液。15秒後 (自二乙烯碸溶液添加完成後測量)，快速添加大約14mL 6N HCl調整該溶液的pH在5及6之間。再使用切線流過濾系統(spectrapor系統，套筒P/N M6-100S-301-01P)將該反應溶液透析。總體積為原始溶液體積的11倍。一旦純化步驟完成時，將溶液濃縮至大約14至20mg/mL。自該TFF系統移出乙烯碸官能化HA(HA-VS)並置於塑膠容器中，再以螺旋上蓋蓋緊。移出HA-VS樣本，於-80℃下冰凍並再予以冷凍乾燥。將乾燥的樣本送至1H-NMR分析。
對HA-VS的乙烯碸取代百分比的決定
於經歸零的2mL管中秤取大約15至17mg的乾燥樣本。樣本於1.5mL D2O中重組。將樣本移至NMR管。取得樣本的1H-NMR(256次掃描)且印出具有在6.3至6.5ppm(來自2 CH2的2個波峰=來自乙烯碸殘餘的氫)及1.5至2.5ppm(來自HA的N-乙醯基之3 CH3-氫的單重態)區域待積分的特定波峰之圖譜。以如下計算百分比修飾：
以乙烯碸波峰相對於玻尿酸的乙醯胺甲基的積分為基礎，1H-NMR圖譜顯示HA的乙烯碸取代水準大約4%。
使用HA-VS的樣本以決定用以決定HA-VS溶液的比濃度乾重。HA-VS濃度為18mg/mL。
實例29 以乙烯碸修飾的玻尿酸(HA-VS)及PEG-3400-二硫醇所製備的凝膠之合成
使用去離子水將如實例1所述製備的HA-VS溶液稀釋至14mg/mL的濃度。將11mL的HA-VS溶液置於20mL滅菌的針筒中。HA-VS溶液經過0.2μm滅菌針筒過濾器過濾至滅菌的50mL離心管中。將40.1mg PEG-(SH)2溶解於0.802mL去離子水中，以製備50mg/mL溶液的PEG-(SH)2[Laysan Bio Inc,Item# SH-PEG-SH-3400-1g]。將該PEG-(SH)2溶液移至1mL滅菌針筒並經過0.2μm滅菌針筒過濾器過濾。將10mL該滅菌過濾的HA-VS移至滅菌的50mL離心管。將250μL的0.5M磷酸鈉溶液(經過0.2μm滅菌針筒過濾器過濾)添加至HA-VS溶液。徹底地攪拌所得的溶液。將380μL[19mg PEG-(SH)2]的滅菌50mg/mL PEG-(SH)2溶液添加至該HA-VS溶液。徹底地攪拌所得的溶液。前述步驟係在生物煙櫥中進行以維持滅菌性。再將HA-VS/PEG-(SH)2溶液置於37℃培養箱中達至少16小時，以提升凝膠的形成。在至少16小時後，HA-VS/PEG-(SH)2溶液已經交聯而形成凝膠。再自培養箱移出該膠化的物質。
實例30 HA-VS/PEG-(SH)2凝膠漿料的製備-單一擠壓
使用玻棒將實例29的HA-VS/PEG-(SH)2凝膠物理性破碎成小片。將該凝膠移至以針筒蓋蓋住之滅菌的60mL針筒。將40mL 0.9%滅菌NaCl添加至凝膠。將推桿插入進針筒並將針筒反轉。打開針筒蓋以釋放任何壓力再將其關閉。將針筒反轉數次以確保鹽水與該凝膠小片良好的混合。使凝膠膨脹過夜(至少16小時)。
使用23mm皮革穿孔器，切出23mm直徑碟片的聚酯篩網(McMaster Carr，Cat # 9218T13，篩網尺寸：20.3×20.3，方形/矩形尺寸：0.0331"，微米分級：840微米，開口區域百分比：46，線直徑：0.0157")。將該碟片插入至25mm針筒過濾器的夾具(Cole Palmer,Cat # EW-29550-42)，並關閉該過濾器夾具。將含有篩網的過濾器夾具高壓滅菌。移出針筒的針筒蓋，並將含有篩網的針筒過濾器接至針筒。將凝膠擠壓經過篩網進入滅菌的50mL離心管中。該離心管以螺旋上蓋蓋緊。所得的產物為略微黏性的顆粒漿料，其中顆粒並未真正沈澱出來而通常是維持懸浮。在生物煙櫥中進行前述步驟。
實例31 含有玻尿酸之HA-VS/PEG-(SH)2凝膠漿料的製備
於250mL圓底燒瓶中秤取2g玻尿酸(9.4×104cps(於水中3%))。將100mL滅菌鹽水添加至燒瓶中的玻尿酸。將燒瓶接至旋轉蒸發器(Buchi)並以50rpm旋轉達至少16小時，以形成2%玻尿酸溶液。於生物煙櫥中進行以下 系列的步驟。將玻尿酸溶液經過0.2μm滅菌過濾器過濾。使用HAVS/PEG-(SH)2凝膠漿料，製備一系列的調合物，其中該所製備的HA-VS/PEG-(SH)2凝膠漿料與玻尿酸混合。用以製備這些調合物之玻尿酸溶液及HA-VS/PEG-(SH)2凝膠漿料的體積如下表所示：
將如上表中所鑑別之玻尿酸溶液及HA-VS/PEG-(SH)2凝膠漿料的指示體積添加至15mL滅菌離心管。管上置放蓋子且將該管前後反轉直到組份良好地混合。再將每一調合物移至具有針筒蓋的10mL玻璃針筒後，將推桿插入並排出過剩的空氣。再將針筒蓋蓋緊。
實例32 含有縮丙酮特安皮質醇之HA-VS-PEG-(SH)2凝膠的合成
使用去離子水將HA-VS溶液稀釋成14mg/mL的濃度。將11mL HA-VS溶液置入20mL滅菌針筒中。將 HA-VS溶液經過0.2μm滅菌針筒過濾器過濾至滅菌的50mL離心管中。將40.1mg PEG3400-(SH)2溶解於0.802mL的去離子水中，以製備PEG-(SH)2的50mg/mL溶液。將PEG-(SH)2溶液移至1mL滅菌針筒並經過0.2μm滅菌針筒過濾器過濾。將10mL的滅菌過濾HA-VS移至滅菌的50mL離心管。將100mg的縮丙酮特安皮質醇(Spectrum Chemicals,U.S.P等級，微米化)添加至HAVS溶液。將離心管的蓋子置於管上且將該管前後反轉直到縮丙酮特安皮質醇與HA-VS均勻地混合。將250μL的滅菌過濾(0.2μm滅菌過濾器)0.5M磷酸鈉溶液添加至HA-VS溶液。徹底地混合所得的溶液。將380μL的滅菌50mg/mL PEG-(SH)2溶液添加至HA-VS溶液。徹底地混合所得的溶液。在生物煙櫥中進行前述步驟。再將HA-VS/PEG-(SH)2溶液置於37℃培養箱中達至少16小時。在此階段，HA-VS/PEG(SH)2溶液已經交聯而形成凝膠。再自培養箱移出該膠化的物質。所得的凝膠含有大約0.2%縮丙酮特安皮質醇。
除了20mg的縮丙酮特安皮質醇(Spectrum Chemicals,U.S.P等級，微米化)添加至HA-VS溶液以外，如前述說明也進行前述程序。
實例33 含有縮丙酮特安皮質醇之HA-VS-PEG-(SH)2凝膠漿料的製備：單一擠壓
使用玻棒將含有縮丙酮特安皮質醇的HA- VS/PEG-(SH)2凝膠物理性破碎成小片。將該凝膠移至蓋著針筒蓋之滅菌的60mL針筒。將40mL 0.9%滅菌NaCl添加至凝膠。將推桿插入至針筒且將針筒反轉。打開針筒蓋以釋放任何壓力並再將其關閉。針筒反轉數次，以確保鹽水與凝膠小片良好的混合。使凝膠膨脹過夜(至少16小時)。
使用23mm皮革穿孔器，切出23mm直徑碟片的聚酯篩網(McMaster Carr，Cat # 9218T13，篩網尺寸：20.3×20.3，方形/矩形尺寸：0.0331"，微米分級：840微米，開口區域百分比：46，線直徑：0.0157")。將該碟片插入至25mm針筒過濾器的夾具(Cole Palmer,Cat # EW-29550-42)，並關閉該過濾器夾具。將含有篩網的過濾器夾具高壓滅菌。移除針筒的針筒蓋，並將含有篩網的針筒過濾器接至針筒。將凝膠擠壓經過篩網進入滅菌的50mL離心管中。該離心管以螺旋上蓋蓋緊。在生物煙櫥中進行前述步驟。

Claims (27)

  1. 一種用於穩定化以玻尿酸為底質之聚合物組成物抵抗黏度隨時間降低的方法，該方法包含將穩定化用量之選自由糖、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑所組成的群組之穩定化添加劑，加入至包含玻尿酸聚合物及皮質類固醇的水性組成物中，藉以提供當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約50%黏度的降低之組成物。
  2. 一種用於減少包含皮質類固醇之以玻尿酸為底質之聚合物組成物的黏度隨時間降低的方法，該方法包含將穩定化用量之選自由糖、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑所組成的群組之穩定化添加劑，加入至包含玻尿酸聚合物及皮質類固醇的水性組成物中，藉以提供具有大於1.2的穩定化比例之組成物，其中，當於特定時間點及在定義的貯存條件組之下測量時，該穩定化比例為包含該穩定化添加劑之玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物之黏度保留百分比對不含該穩定化添加劑之玻尿酸聚合物-皮質類固醇組成物之黏度保留百分比的比例。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該加入步驟包含將該穩定化添加劑加入至包含該玻尿酸聚合物及皮質類固醇之水性組成物中，並混合。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該玻尿酸聚合物係選自由交聯或未交聯之未修飾的玻尿酸、交聯或未 交聯之化學性修飾的玻尿酸、及其組合所組成的群組。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該水性組成物為溶液。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該溶液包含未修飾的玻尿酸。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該水性組成物包含以玻尿酸聚合物為底質之凝膠。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其進一步包含未修飾的玻尿酸於溶液中。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該玻尿酸凝膠為以其10%或更低的羥基與二乙烯碸反應而衍生的玻尿酸，其與具有二個或更多硫醇基之硫醇交聯劑交聯。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該玻尿酸的羥基轉化成2-(乙烯基碸基)乙氧基的程度係選自1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、及10%。
  11. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該凝膠中之最終玻尿酸含量範圍自約0.05至5%(0.5mg/mL至50mg/mL)。
  12. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該組成物中玻尿酸對水凝膠顆粒的相對量(重量比例)在自約10：1的範圍內。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該穩定化添加劑包含一個或多個羥基低級烷基。
  14. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該穩定化 添加劑係選自由蔗糖、甘露醇、山梨醇、N-乙醯基葡萄糖胺、聚葡萄糖-40、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纖維素、TRITON-X-100、甘油、海藻糖、右旋糖、麥芽糖、及乳糖所組成的群組。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該穩定化添加劑為蔗糖。
  16. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中加入至該組成物中的穩定化添加劑之用量範圍自約0.25重量%至約20重量%。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中加入至該組成物中的穩定化添加劑之用量範圍自約0.5重量%至約10重量%。
  18. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該加入步驟係有效以提供具有大於1.5的穩定化比例之組成物。
  19. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該穩定化比例係在該組成物於60℃下貯存第6天時加以測量。
  20. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該穩定化比例係在選自25℃、40℃、45℃、55℃、60℃、80℃的貯存溫度及在自30%至75%範圍內的相對濕度下，於選自第1天、第3天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天、第21天、1個月、2個月、3個月、或6個月的時間點加以測量。
  21. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該皮質類固醇係選自由皮質醇(hydrocortisone)、乙酸皮質醇 (hydrocortisone acetate)、乙酸皮質酮(cortisone acetate)、巰氫可的松新戊酸酯(tixocortol pivalate)、培尼皮質醇(prednisolone)、甲基培尼皮質醇、培尼皮質酮(prednisone)、特安皮質醇(triamcinolone)、縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone acetonide)、苯甲醯胺縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone benetonide)、縮丙酮特安皮質醇氧茚酯(triamcinolone furetonide)、己縮丙酮特安皮質醇(triamcinolone hexacetonide)、醋酸特安皮質醇(triamcinolone diacetate)、特安皮質醇(triamcinolone alcohol)、默美塔松(mometasone)、醋酸環戊[酮]縮去炎松(amcinonide)、亞丁皮質醇(budesonide)、丙縮羥強龍(desonide)、氟洛奈皮質醇(fluocinonide)、丙酮氟洛皮質醇(fluocinolone acetonide)、氯氟松(halcinonide)、貝皮質醇(betamethasone)、貝皮質醇磷酸酯鈉(betamethasone sodium phosphate)、迪皮質醇(dexamethasone)、迪皮質醇磷酸酯鈉(dexamethasone sodium phosphate)、氟考龍(fluocortolone)、皮質醇-17-丁酸酯(hydrocortisone-17-butyrate)、皮質酮-17-戊酸酯(hydrocortisone-17-valerate)、阿率米塔松二丙酸酯(aclometasone dipropionate)、貝皮質醇戊酸酯(betamethasone valerate)、貝皮質醇二丙酸酯(betamethasone dipropionate)、波尼卡酯(prednicarbate)、氯氟美松酮-17-丁酸酯(clobetasone-17-butyrate)、氯氟美松-17-丙酸酯(clobetasol-17-propionate)、氟考龍己酸酯(fluocortolone caproate)、氟考 龍新戊酸酯(fluocortolone pivalate)、醋酸氟甲叉龍(fluprednidene acetate)、氯地米松二丙酸酯單水合物(beclomethasone dipropionate monohydrate)、9-去氟膚輕鬆(flunisolide)、克廷膚丙酸酯(fluticasone propionate)、默美塔松糠酸酯單水合物(mometasone furoate monohydrate)、及克廷膚糠酸酯(fluticasone furoate)所組成的群組。
  22. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該皮質類固醇為縮丙酮特安皮質醇或其藥學上可接受的鹽形式。
  23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該皮質類固醇為縮丙酮特安皮質醇。
  24. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該皮質類固醇係選自由特安皮質醇、縮丙酮特安皮質醇、苯甲醯胺縮丙酮特安皮質醇、縮丙酮特安皮質醇氧茚酯、己縮丙酮特安皮質醇、及醋酸特安皮質醇所組成的群組。
  25. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該組成物包含自約0.01重量%至約20重量%的皮質類固醇。
  26. 一種水性組成物，其包含玻尿酸聚合物、皮質類固醇、及選自由糖、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑所組成的群組之穩定化添加劑，其用量有效提供當於60℃貯存達6天的期程與其起始值相比表現不超過約50%黏度的降低之組成物，該組成物如前述申請專利範圍第1至25項中任一項所定義。
  27. 一種水性組成物，其包含玻尿酸聚合物、皮質類 固醇、及選自由糖、糖醇、多元醇、及含有多元醇的界面活性劑所組成的群組之穩定化添加劑，其用量有效提供具有大於1.2的穩定化比例之組成物，該組成物如申請專利範圍第2至25項中任一項所定義，其中，當於特定時間點及在定義的貯存條件組之下測量時，該穩定化比例為包含該穩定化添加劑之玻尿酸聚合物-皮質類固醇水凝膠組成物之黏度保留百分比對不含該穩定化添加劑之玻尿酸聚合物-皮質類固醇水凝膠組成物之黏度保留百分比的比例。
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