FR2969618A1 - Procede de preparation de chondroitine sulfate de sodium - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé d'obtention de chondroïtine sulfate de sodium à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire ainsi qu'une préparation de chondroïtine sulfate de sodium.
Description
La présente invention concerne un procédé d'obtention de chondroïtine sulfate de sodium à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire. La chondroïtine sulfate est un glycosaminoglycanne présent dans le tissu conjonctif. La chondroïtine sulfate est un polysaccharide sulfaté constitué de dimères d'acide glucuronique et de N-acétyl galactosamine. Dans les tissus, les polymères de chondroïtine sulfate sont fixés covalemment à des chaînes protéiques pour former des protéoglycanes. La chondroïtine sulfate est bien connue pour son utilisation thérapeutique, notamment dans le traitement de la douleur due à l'arthrose. De nombreuses publications décrivent la production de chondroïtine sulfate à partir de cartilages d'animaux tels que les bovins, ovins, porcins, chevaux, requins, poissons et baleines. Classiquement, la chondroïtine sulfate est extraite d'organes cartilagineux d'origine bovine et notamment des trachées de bovins.
Le principe général de l'extraction de la chondroïtine sulfate est le suivant . les organes cartilagineux sont soumis à une déprotéinisation alcaline ou acide de façon à débarrasser la chondroïtine sulfate des glycoprotéines auxquelles elle est associée à l'état naturel. La déprotéinisation est ensuite suivie d'une purification de la chondroïtine sulfate réalisée par dialyse, séparation sur résines échangeuses d'ion ou précipitation avec des sels d'ammonium quaternaires du lysat issu de l'étape de déprotéinisation. La chondroïtine sulfate ainsi obtenue est ensuite précipitée au moyen d'un solvant organique, puis séchée. Le brevet FR 2 756 828 concerne un procédé de préparation de chondroïtine sulfate à partir de cartilages aviaires. La chondroïtine sulfate est obtenue par réaction enzymatique à l'aide d'une protéase alcaline d'origine fongique, par exemple l'AlcalaseO, décantation, puis ultrafiltration. Le filtrat est ensuite soumis à une hydrolyse chimique par l'acide chlorhydrique afin de réduire le poids moléculaire de la chondroïtine sulfate. La solution est ensuite neutralisée à la soude, puis la chondroïtine sulfate est isolée par précipitation et lavage à l'éthanol.
Le brevet EP 1 560 856 concerne un procédé de préparation de chondroïtine sulfate à partir de cartilages de bovins, ovins, porcins, chevaux, oiseaux, poissons. La chondroïtine sulfate est obtenue par réaction enzymatique à l'aide d'une protéase, suivie d'une précipitation, séparation et filtration. L'étape de précipitation est réalisée avec des hydroxydes d'alcalino-terreux et est suivie d'une étape de séparation pour éliminer les impuretés précipitées. La chondroïtine sulfate est isolée après l'étape de filtration et simple séchage.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention de chondroïtine sulfate d'origine aviaire. Par « origine aviaire », on entend au sens de la présente invention les organes cartilagineux de poulets, de poules, de coqs, de dindes, de canards, ou d'oies.
Les événements relatifs notamment à l'encéphalite spongiforme bovine, dite maladie de la vache folle, ont posé le problème de l'innocuité de la chondroïtine sulfate en fonction de son origine. Avec l'apparition récente du virus H5N1, ou grippe aviaire, ce problème concerne maintenant également la chondroïtine sulfate d'origine aviaire. La présente invention se propose de remédier à cet inconvénient. En effet, elle concerne une préparation de chondroïtine sulfate présentant une sécurité microbiologique et virale accrue, c'est-à-dire exempte de toute maladie propre aux mammifères et aux espèces aviaires.
De plus, le procédé selon la présente invention permet l'obtention de la chondroïtine sulfate de manière reproductible, quelle que soit la qualité d'origine des organes cartilagineux. Ce procédé permet également de préparer de la chondroïtine sulfate de haute qualité présentant une densité élevée permettant ainsi d'introduire une quantité importante de produit dans la forme galénique désirée. En outre, la préparation de chondroïtine sulfate de sodium de l'invention présente une population de chondroïtine sulfate de sodium plus homogène en masses moléculaires. Un premier objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une masse moléculaire au maximum du pic (Mp) supérieure ou égale à 22 100 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS. Préférentiellement, ladite masse moléculaire au maximum du pic (Mp) est comprise entre 22 100 Daltons et 23 300 Daltons, par exemple elle est de 22 600 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS. Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une masse moléculaire moyenne en poids (Mw) supérieure ou égale à 20 700 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
Préférentiellement, ladite masse moléculaire moyenne en poids (Mw) est comprise entre 20 700 Daltons et 23 000 Daltons, par exemple elle est de 22 000 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 14 100 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS. Préférentiellement, ladite masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) est comprise entre 14 100 Daltons et 18 000 Daltons, par exemple elle est de 16 200 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une densité comprise entre 0,8 et 1, par exemple une densité de 0, 9.
Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente un indice de polydispersité inférieur ou égal à 1,47, mesuré par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
Préférentiellement, ledit indice de polydispersité est compris entre 1,22 et 1,47, par exemple il est de 1,37, mesuré par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS. Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium et moins de 0,09% de protéines mesurées selon la méthode de Bradford. Préférentiellement, ladite préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprend entre 0,05% et 0,09% de protéines, par exemple entre 0,05% et 0,06% de protéines mesurées selon la méthode de Bradford. Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium et moins de 2,0% de protéines mesurées selon la méthode de Lowry. Préférentiellement, ladite préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprend entre 1,7% et 2,0%, par exemple entre 1,7 et 1,8% de protéines mesurées selon la méthode de Lowry. Un autre objet de l'invention concerne une préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, caractérisée en ce qu'elle contient des quantités non détectables par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS d'agrégats de chondroïtine sulfate de sodium et de composés de haute masse moléculaire d'une taille supérieure à 106 g/mol. Avantageusement, la préparation de chondroïtine sulfate de sodium de l'invention comprend plus de 95%, de préférence plus de 98%, de chondroïtine sulfate de sodium. La présente invention concerne donc un procédé de préparation de la chondroïtine sulfate de sodium comprenant trois grandes étapes solubilisation de la matière animale, sécurisation et purification de la chondroïtine sulfate et cristallisation du produit. Le procédé de préparation de chondroïtine sulfate de sodium à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire conforme à l'invention comprend les étapes suivantes : 1. solubilisation de la matière animale par i) hydrolyse protéolytique des cartilages ; 2. sécurisation et purification par ii) traitement thermique; iii) séparation de la chondroïtine sulfate; iv) floculation ; v) purification du milieu à pH basique ; vi) traitement basique ; vii) traitement à l'eau oxygénée ; 3. et cristallisation du produit. La solubilisation de la matière animale peut comprendre une étape préalable à l'hydrolyse, le broyage des organes cartilagineux pour rendre le milieu plus accessible à l'étape suivante d'hydrolyse, l'hydrolyse dudit broyat obtenu permettant de déstructurer les tissus et solubiliser les constituants. Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, l'hydrolyse protéolytique du broyat est effectuée en présence d'une protéase, par exemple l'Alcalase 3.OTO. Selon un mode de réalisation de l'invention, le traitement thermique est réalisé entre 90 et 100°C pendant au moins 3 heures, par exemple à 92 ± 2°C. Cette étape apporte plusieurs avantages : elle permet d'inactiver les virus éventuellement présents, de faciliter la décantation, i.e. la séparation des graisses, et d'inactiver la protéase utilisée pour l'hydrolyse du cartilage. Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, la séparation de la chondroïtine sulfate est réalisée par une décantation, favorisée par le traitement thermique. Par « séparation de la chondroïtine sulfate » on entend au sens de la présente invention la décantation destinée à séparer les phases solides (résidus osseux) de la phase contenant la chondroïtine sulfate et de la phase graisseuse, suivie de l'isolement des différentes phases. Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, l'hydrolysat comprenant la chondroïtine sulfate subit une floculation par addition d'hydroxyde de sodium de manière à obtenir un pH de 11 ± 0, 5 . L'étape de floculation est réalisée à une température comprise entre 25 et 60°C, par exemple 49°C. L'ajout d'hydroxyde de sodium entraîne la formation d'un floculat de nature protéique . il y a précipitation des résidus protéiques qui sont éliminés par filtration. Cette étape permet ainsi de purifier le produit plus facilement lors des étapes suivantes en facilitant l'étape de filtration qui suit en évitant de colmater les membranes. Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention la purification du milieu est conduite à pH 11. Réaliser cette étape en milieu basique permet une meilleure élimination des impuretés, essentiellement d'origine protéique et permet de limiter la prolifération microbiologique. Avantageusement, l'étape de purification consiste en une ultrafiltration tangentielle avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 3 et 30 kDa, par exemple 10 kDa (signifiant que la masse molaire le chondroïtine sulfate est d'au moins 10 000 Da), selon la masse molaire de chondroïtine sulfate désirée. L'étape d'ultrafiltration permet d'éliminer toutes les molécules ayant une masse molaire inférieure à celle de la chondroïtine sulfate désirée et susceptibles de la contaminer, telles que les protéines hydrolysées, les glycoprotéines hydrolysées, les sels minéraux, etc. Selon un mode particulier de l'invention, le procédé peut comprendre une étape de réduction de la masse molaire de la chondroïtine sulfate après l'étape de filtration.
Avantageusement, ladite étape de réduction du poids moléculaire est réalisée par l'acide chlorhydrique à une concentration, température et pendant une durée déterminées selon le poids moléculaire final recherché. 8 Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention le traitement basique, réalisé après l'étape de purification par filtration, est effectué par addition d'hydroxyde de sodium, à une concentration, une température et une durée déterminées pour finaliser l'hydrolyse des composés de nature protéique à éliminer. Ce traitement permet d'éliminer les résidus d'acides aminés qui sont encore fixés sur la chondroïtine sulfate et de limiter la prolifération microbienne.
Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention le traitement à l'eau oxygénée est réalisé par ajout de peroxyde d'hydrogène 30 V, à une concentration finale de 0,1 à 0,5% v/v, de préférence autour de 0,4%. Ce traitement est effectué à pH basique (de l'ordre de 9) et à une température comprise entre 47 et 51°C pendant une durée inférieure à 1 heure, de préférence de l'ordre de 20 minutes. L'étape de traitement thermique élimine les virus et réduit de manière significative les populations de micro- organismes présents dans la solution de chondroïtine sulfate mais il ne s'agit pas d'une stérilisation complète. Il subsiste donc une pollution microbienne pendant le procédé avec croissance éventuelle des microorganismes non éliminés par le chauffage. Les micro-organismes et notamment les bactéries se développent uniquement en solution, la forme poudre du produit n'évolue pas. Il est donc nécessaire de pallier à cet inconvénient avant précipitation du produit. Différentes solutions de traitement ont été envisagées pour avoir une sécurité microbienne : filtration stérilisante, traitement thermique et traitement à H2O2. La filtration stérilisante n'est pas envisageable car le produit purifié et concentré est trop (épais) visqueux pour être filtré. Le traitement thermique présente un risque élevé de dégradation du produit par apparition de réactions secondaires à des températures élevées. Le traitement à l'eau oxygénée permet de garantir une qualité microbiologique en ayant pour seuls produits dérivés de l'eau et de l'oxygène. Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention la cristallisation du produit est réalisée par précipitation éthanolique. Dans un mode de réalisation du procédé, l'étape de précipitation éthanolique est réalisée en coulant la solution de chondroïtine sulfate dans 3 fois son volume d'éthanol 93°, sous agitation mécanique forte. De cette manière, la phase aqueuse et la phase organique sont mélangées immédiatement et ainsi le précipité en formation est dispersé. Dans un mode de réalisation, l'étape de précipitation est suivie d'une décantation et d'une élimination du surnageant. Dans un mode de réalisation, le précipité est ensuite déshydraté par ajout d'alcool (par exemple, d' éthanol 93 ° ) jusqu'à l'obtention d'un degré alcoolique compris entre 80 et 85°, de préférence 83° ± 1°, sous agitation continue, tout en ajustant le pH du milieu à une valeur comprise entre 7,5 et 8,0, par addition éventuelle d'acide chlorhydrique ou d'hydroxyde de sodium. La maîtrise des étapes de précipitation éthanolique et de déshydratation permet d'aboutir à la densité élevée. Ces étapes permettent l'obtention de chondroïtine sulfate ayant une densité comprise entre 0,8 et 1 (à confirmer). Cette densité élevée donne la possibilité d'inclure une quantité importante de produit dans la forme galénique souhaitée, par exemple comprimé ou gélule.
Le procédé selon l'invention peut comprendre, après l'étape de cristallisation, une étape de séchage de la chondroïtine sulfate purifiée. Dans un mode de réalisation de l'invention, la chondroïtine sulfate purifiée est séchée en étuve sous vide, de préférence à pression inférieure à 150 mbars, à une température supérieure à 90°C, de préférence entre 95 et 100°C. Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape finale de conditionnement du produit éventuellement précédé d'un broyage permettant d'obtenir la granulométrie désirée. Selon un mode de réalisation du procédé selon l'invention, les organes cartilagineux sont utilisés à l'état frais ou congelé. Les organes cartilagineux peuvent également se présenter sous forme séchée ou salée.
Les organes cartilagineux susceptibles d'être broyés conformément au procédé de l'invention peuvent provenir de poulets, de poules, de coqs, de dindes, de canards, ou d'oies. La qualité de la matière première varie d'organes cartilagineux très propres aux organes cartilagineux contaminés par d'autres tissus. De préférence, les organes cartilagineux sont choisis parmi les bréchets, les trachées et les cartilages articulaires. Un autre objet de la présente invention concerne la 25 préparation de chondroïtine sulfate de sodium obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'invention et au 30 moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Ladite composition selon l'invention se présente sous forme de dose unitaire pour administration orale. Avantageusement, chaque dose unitaire contient entre 250 mg et 1g de chondroïtine sulfate de sodium, par exemple 500 mg. La forme orale est choisie parmi les comprimés, les gélules, les granulés, les poudres, les solutions aqueuses, 5 les émulsions et les suspensions. Un autre objet de la présente invention concerne la préparation de chondroïtine sulfate de sodium obtenue par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament. 10 Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de ladite préparation de chondroïtine sulfate de sodium pour la prévention et/ou le traitement de l'arthrose. Avantageusement, l'utilisation se rapporte à la prévention et/ou le traitement de l'arthrose du genou et/ou 15 de la hanche. Préférentiellement, le traitement de l'arthrose comprend la prise de 1 à 2 g par jour de ladite préparation de chondroïtine sulfate de sodium, par exemple 2 g, pour un patient présentant une telle pathologie. 20 La description se réfère aux figures annexées sur lesquelles : - la Figure 1 représente le minimum de réduction logarithmique de l'étape de dénaturation thermique sur l'hydrolysat de cartilages de poulet pour les 4 virus 25 étudiés ; - la Figure 2 représente la répartition de 6 lots selon la teneur en protéines résiduelles en fonction du rendement ; - la Figure 3 représente la répartition de 6 lots 30 selon la teneur en chondroïtine sulfate en fonction du rendement ; - la Figure 4 représente l'analyse par SEC avec détection réfractométrique de 20 lots de chondroïtine sulfate aviaire préparés selon l'ancien procédé et selon le procédé de l'invention ; - la Figure 5 représente l'analyse par SEC avec détermination de la masse moléculaire par MALLS de 20 lots de chondroïtine sulfate aviaire préparés selon l'ancien procédé (A) et selon le procédé de l'invention (B).
EXEMPLE 1 PROCEDE D'OBTENTION DE CHONDROÏTINE SULFATE DE SODIUM Etape 1 : Solubilisation de la matière première Après décongélation de la matière, un broyage est effectué. Le broyat est mélangé à de l'eau, à raison de 2,3 litres par kg de matière première. On chauffe le milieu pour atteindre une température de 60°C de façon homogène dans le réacteur de digestion. Le pH du milieu est ajusté à 7,5-8,0 par addition d'hydroxyde de sodium 30%, sous agitation mécanique constante. La protéase, AlcalaseO 3.0T (Subtilisine Carlsberg) est ajoutée au milieu à raison de 7 kg par 1 tonne de cartilages. La quantité d'enzyme est additionnée en 4 charges de 25% de la quantité totale et à 2 heures d'intervalle. La durée de l'hydrolyse protéolytique est de 8 heures minimum, avec des rajouts d'enzyme toutes les 2 heures et des ajustements de pH autour de 7,5 et 7,0 en cours de digestion. A l'issue de la digestion enzymatique, le milieu est homogène dissolution complète des cartilages, avec éventuellement des résidus osseux si la matière première en contient. Etape 2 Sécurisation et Purification de la chondroïtine sulfate Le pH de l'hydrolysat est ajusté à 5,8-6,0 par addition d'acide chlorhydrique 32%. Le milieu est ensuite chauffé à une température minimale de 93°C pendant un minimum de 3 heures, sous agitation mécanique. Cette opération a pour but d'assurer la dénaturation thermique de l'enzyme et une inactivation des virus conventionnels ainsi que de permettre la séparation des graisses. L'agitation est stoppée et le produit est décanté à chaud (température supérieure à 50°C minimum). Pendant le refroidissement, la graisse décante pour former une phase supérieure, tandis que les résidus non digérés comme les morceaux osseux, tombent en fond de réacteur. La phase inférieure est l'hydrolysat contenant la chondroïtine sulfate. La phase aqueuse est soutirée et filtrée sur filtre presse. La phase supérieure de nature graisseuse est éliminée. Le pH de l'hydrolysat est ajusté à 11 ± 0,5 par addition d'hydroxyde de sodium 30% p/p. La température est maintenue autour de 49°C. Il se forme un floculat de nature protéique qui décante légèrement. Il est éliminé par filtration sur terre de diatomée. Le milieu est poli sur filtre de porosité 1pm. La purification de l'hydrolysat est réalisée par filtration tangentielle sur une membrane de 10 kDa.
On débute l'opération par une concentration à pH 11 et à une température de 49±2°C. Pour cette étape, on concentre jusqu'à un volume final de 36,5% du volume initial de l'hydrolysat (soit un facteur de concentration volumique FCV de 2,75). Ensuite une diafiltration continue est réalisée avec un minimum de 4 volumes d'eau par rapport au volume de concentrat initial pour éliminer les résidus protéiques et les sels minéraux. On termine par une surconcentration finale pour obtenir une concentration en chondroïtine sulfate de l'ordre de 5±0,5°Brix (pouvant être assimilé à un extrait sec, en suivi de production). Une dernière concentration est réalisée par voie thermique : évaporation d'eau grâce à un évaporateur couche mince de type LUWA (vide inférieur à 0,3 bar, température de l'ordre de 55-75°C, débit d'alimentation de 1500-2000 litres/heure), pour atteindre une concentration finale de l'ordre de 8 à 8,5°Brix. Un traitement basique finalise la purification de la chondroïtine sulfate : on ajoute de l'hydroxyde de sodium NaOH 30%, qsp une concentration finale de 0,2N ± 0,05N. La température du milieu est amenée à 35°C ± 2°C. On laisse le traitement basique réagir pendant 1 heure sous agitation mécanique, avant de procéder à une neutralisation avec addition d'acide chlorhydrique HCl 32%, qsp un pH 9 ± 0,2. La solution de chondroïtine sulfate purifiée et concentrée est chauffée à 49 ± 2°C. On ajoute 0,4% v/v de peroxyde d'hydrogène 30V. Après 20 minutes d'agitation, la solution est neutralisée à pH 7,0 ± 0,2 avec de l'acide chlorhydrique 32%. Etape 3 : Récupération du produit sous forme de poudre La chondroïtine sulfate est récupérée sous forme de solide par précipitation éthanolique. La solution de chondroïtine sulfate purifiée (1 volume) est coulée sur de l'éthanol 93° recyclé (3 volumes par rapport au volume de phase aqueuse) sous agitation mécanique forte. A la fin de la coulée, on laisse l'agitation pendant au moins 30 minutes avant de l'arrêter. Après un minimum de 8 heures de décantation, le surnageant est soutiré et envoyé à distiller. On ajoute de l'éthanol 93° distillé de façon à obtenir un degré alcoolique final de 83°, et éventuellement de l'acide chlorhydrique 32% de façon à obtenir un pH de 7,5 à 8,0. On laisse agiter pendant environ 20 minutes. Le précipité de chondroïtine sulfate est récupéré par centrifugation. L'essoreuse en rotation est alimentée par le milieu alcoolique jusqu'à atteindre sa capacité maximale. On arrête l'alimentation pour procéder à un épuisement du milieu, avant de décharger le gâteau essoré en contenants. L'opération est reconduite jusqu'à vidange complète du réacteur de précipitation. Le précipité de chondroïtine sulfate peut également être récupéré par filtration sur filtre Buchner inox. Les contenants sont transférés dans la zone de séchage. Le gâteau est étalé sur des plateaux de séchage, qui sont ensuite introduits dans les étuves de séchage. Les paramètres de conduite du séchage sont une température de 95-100°C, un vide inférieur à 150 mBar et une durée de séchage supérieure à 2 heures. Un suivi de séchage permet de définir la fin du séchage. Le produit est récupéré, pour être broyé et conditionné.
Rendement en chondroïtine sulfate . environ 32 kg de chondroïtine sulfate par charge de 1000 kg de matière première aviaire congelée. La poudre sèche finale présente une densité supérieure à 0,8 (comprise entre 0,9 et 1). Selon la qualité de la matière première utilisée, le rendement peut varier de 25 à plus de 40 kg de chondroïtine sulfate pur par charge de 1000 kg de matière première aviaire, sans affecter la qualité du produit final.
EXEMPLE 2 : SECURISATION VIRALE L'inactivation virale a été vérifiée en dopant le milieu de digestion des cartilages avec des charges virales connues. Les milieux sont titrés en virus avant et après traitement thermique à 90°C ± 2°C.
Les virus suivants ont été testés : - virus à ARN et enveloppé : - Xenotropic Murine Leukaemia Virus (MuLV), représentant le type rétrovirus type C non défectif et 5 ayant une résistance physico-chimique faible ; - Influenza Virus (FLU), constituant un modèle pour les virus aviaires et ayant une résistance physico-chimique moyenne ; - virus à ADN et sans enveloppe : 10 - Réovirus 3 (REO), représentant un modèle pour les orbivirus, rotavirus et virus de la langue bleue des bovins et ayant une résistance physico-chimique moyenne à élevée ; - Porcine Parvovirus (PPV), représentant un modèle pour le parvovirus humain B19 et ayant une résistance 15 physico-chimique élevée. Résultats : La Figure 1 indique pour chaque virus testé, le minimum de réduction logarithmique de l'étape de dénaturation thermique sur l'hydrolysat de cartilages de 20 poulet. Un minimum de réduction logarithmique de 4 est assuré pour tous les virus, voire > 6 pour Reovirus et PPV, par le traitement thermique de 3 heures à une température de 90°C ± 2°C. 25 EXEMPLE 3 : ROBUSTESSE ET REPRODUCTIBILITE DU PROCEDE Les matières premières cartilagineuses peuvent être contaminées par des tissus annexes comme la viande, de la graisse, des fragments d'os, 30 Il a été étudié la répartition de 6 lots de production selon les deux principaux critères de pureté du produit, teneur en protéines résiduelles et dosage en chondroïtine sulfate en fonction du rendement (Figure 2 et Figure 3).
Résultats : L'étude de 6 lots de production montre que la qualité de la chondroïtine sulfate produit est constante : titre en chondroïtine sulfate entre 96 et 99%, teneur en protéines résiduelles entre 2,2 et 2,9%, teneur en substances apparentées inférieure à 2% (Tableau 1). Lot Rendement Titre Protéines Substances Pertes Ethanol pH (%) en CS (op/p apparentées <2% à la (%) (op/P sec) (Electrophorèse) dessiccation sec) (%) 1 3,46 98 2,8 Conforme 9,9 0,3 6,3 2 3,83 98 2,4 Conforme 9,1 0,3 6,6 3 2,85 99 2,2 Conforme 9,4 0,3 6,7 4 2,80 96 2,9 Conforme 6,4 0,3 6,1 5 3,15 96 2,9 Conforme 7,4 0,3 6,4 6 2,88 96 2,7 Conforme 8,5 0,5 6,5 Tableau 1 Les autres items (aspect, solubilité, test du sodium, teneur en chlorures, spectre Infra rouge, teneur en métaux lourds et microbiologie) sont également constants et conformes aux spécifications. Il n'y a pas de lien direct entre la qualité des lots produits et le rendement obtenu ceci démontre la robustesse du procédé, capable d'utiliser différentes qualités de matières premières tout en obtenant toujours un produit de qualité constante. Quelle que soit la qualité des matières premières engagées, la chondroïtine sulfate de sodium obtenue est toujours conforme aux spécifications de la Pharmacopée Européenne. La présence de ces tissus annexes n'est pas pénalisante en termes de qualité du produit obtenu. 1725 EXEMPLE 4 : COMPOSITION PHARMACEUTIQUE La chondroïtine sulfate employée est obtenue selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Chondroïtine sulfate de sodium 500 mg Talc qs Gélatine qs Dioxyde de titane qs Indigotine qs Dans les exemples 5 à 7, on entend par « ancien procédé » le procédé décrit dans le brevet FR 2 756 828.
EXEMPLE 5 ETUDE DE DISTRIBUTION DE LA MASSE MOLECULAIRE PAR SEC ET DETECTION RI/MALLS Méthodes d'évaluation Le système se compose d'un système de chromatographie Agilent 1200 series avec un détecteur DAD (G1315B). Des détecteurs spécifiques sont le système de diffusion multiangulaire de la lumière laser MALLS DAWN EOS (Wyatt Technology) et un réfractomètre différentiel (Waters 2414). L'albumine de sérum bovin (ASB), une protéine monodisperse ayant une masse moléculaire de 66 400 Da (une valeur de dn/dc de 0,185, Perbio) est utilisée pour normaliser le détecteur DAWN EOS. La conformité est réalisée en utilisant un étalon pullulane ayant une masse moléculaire de 22 800 Da (valeur de dn/dc de 0,145, Polymer laboratories). Les données ont été analysées avec le logiciel ASTRA (Wyatt Technology), une valeur de dn/dc de 0,141 pour la chondroïtine sulfate (telle que définie dans le rapport précédent) et des ajustements de Zimm de premier ordre. L'ASB est mise en suspension dans la phase mobile (125 mM Na2SO4r 0,03% NaN3) à 1 mg/mL et filtrée à travers un filtre de 0,02 }gym. Le pullulane et les lots de chondroïtine sulfate sont mis en suspension dans la phase mobile à 5 mg/mL, incubés pendant une nuit sous agitation à température ambiante et filtrés à travers des filtres de 0,45 pm avant l'injection de 100 pL à un débit de 0,5 mL/min.
Résultats Les profils chromatographiques des 20 lots de chondroïtine de l'ancien procédé et du procédé de l'invention sont obtenus par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) avec détection réfractométrique (RI, figure 4) et détermination de la masse moléculaire par MALLS (figure 5). Les masses moyennes et les résultats de polydispersité sont présentés dans le tableau 2.
La comparaison des procédés par analyse par SEC avec détection réfractométrique est présentée sur la figure 4. Les tracés des indices de réfraction de chondroïtine sulfate (figure 4) présentent un pic éluant à approximativement 13,5 minutes pour les deux procédés, correspondant à la distribution de la masse moléculaire de la chondroïtine. Les sels sont élués ultérieurement, tel que ceci est illustré par le pic à approximativement 19 minutes et plus. Des différences dans la forme des pics sont cependant observées. En effet, les lots du procédé de l'invention présentent un profil homogène avec une population plus gaussienne, comparés aux lots de l'ancien procédé ayant un pic moins symétrique, particulièrement pour les masses moléculaires faibles.
Les tracés de diffusion de la lumière laser et les valeurs moyennes de masse moléculaire déterminées par SEC avec détection MALLS sont présentés sur la figure 5.
Les lignes sont les tracés de la diffusion de la lumière laser pour le détecteur à 90°(a) et les valeurs moyennes de masse moléculaire calculées pour chaque intervalle de temps avec ajustement linéaire (b).
Tel qu'observé pour le signal RI, les profils MALLS (pic éluant à - 13,5 minutes) des lots de chondroïtine sulfate aviaire obtenus avec le procédé de l'invention sont plus homogènes. En outre, des populations de masse moléculaire élevée sont observées avec un temps d'élution compris entre 10 et 12 minutes. Ces agrégats sont plus nombreux dans les lots de l'ancien procédé, tel que ceci peut être observé sur la figure 5-A. Quel que soit le procédé, les agrégats présentent des masses moléculaires supérieures à 1 x 105 g/mol (voir les tracés b sur la figure 5), mais en une très faible quantité tel que ceci est illustré sur la figure 4 où aucun signal RI n'est détecté entre 10 et 12 minutes. L'analyse de la masse moléculaire moyenne et les 20 résultats de polydispersité sont présentés dans le tableau 2. Numéro de Mp Mn Mw Indice de lot polydispersité 1929 19,5 10,8 17,1 1,58 'eu 1930 19,7 10,9 17,1 1,57 -cs ,c 1931 19,8 11,4 17,2 1,51 1933 18,9 10,9 16,6 1,52 1934 19,0 10,7 16,4 1,54 '~ 1935 18,3 10,4 15,9 1,53 Moyenne 19,2 10,8 16,7 1,54 ETR % 2,9 3,1 3,1 1,8 2138 22,6 17,4 22,3 1,29 -cs 2140 22,6 17,0 22,1 1,30 -cs 2141 22,5 16,4 21,7 1,33 ,cu 2144 22,2 18,0 22,0 1,22 a 2262 23,0 15,3 22,6 1,47 2264 22,5 16,5 22,0 1,34 2266 22,4 16,4 23,0 1,41 2268 22,2 16,3 21,9 1,34 2272 22,6 15,8 21,9 1,39 2274 22,4 14,9 21,5 1,44 2276 22,1 15,8 20,7 1,31 2278 22,7 15,9 21,9 1,38 2279 23,3 14,1 22,5 1,60 2280 22,9 16,7 22,0 1,32 Moyenne 22,6 16,2 22,0 1,37 ETR % 1,4 6,1 2,4 6,8 Tableau 2 : masses moléculaires moyennes et résultats de polydispersité d'une analyse par SEC-MALLS de 20 lots de chondroïtine sulfate aviaire avec la masse moléculaire au maximum du pic (Mp, kDa), la masse moléculaire moyenne des différentes chaînes en nombre (Mn, kDa) ou en poids (Mw, kDa) et l'indice de polydispersité (Mw/Mn) (ETR : écart type relatif) A noter que l'indice de polydispersité de 1,60 du lot 10 2279 correspond à une valeur aberrante. Les valeurs sont homogènes pour les lots de chaque procédé avec un écart type relatif qui n'est pas supérieur à 7 ° 0 La masse moléculaire au maximum du pic de l'ancien 15 procédé est différente de celle du procédé de l'invention avec des valeurs de 19,2 et 22,6 kDa, respectivement. Ce décalage est également observé sur les chromatogrammes présentés sur la figure 5 avec des pics éluant à - 13,5 minutes (ancien procédé) et - 13,2 minutes (procédé de 20 l'invention). Les valeurs de masses moléculaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) sont supérieures pour les lots du procédé de l'invention comparés aux lots de l'ancien procédé.
L'indice de polydispersité de 1,37 pour les lots du procédé de l'invention est inférieur à celui des lots de l'ancien procédé avec une valeur de 1,54, indiquant une meilleure homogénéité de la population pour les lots de l'invention. En résumé, par comparaison à l'ancien procédé, le procédé de l'invention conduit à une distribution plus homogène de la masse moléculaire de la population de chondroïtine sulfate aviaire, avec une masse moléculaire légèrement plus élevée et moins de grands agrégats.
EXEMPLE 6 ANALYSE QUANTITATIVE ET QUALITATIVE DES PROTEINES Méthodes d'évaluation Dosage des protéines totales - Méthode de Bradford Le dosage des protéines totales est réalisé selon la Pharmacopée européenne, section 2.5.33, méthode 3, à laquelle on fait communément référence comme à la méthode de Bradford. Ce procédé est basé sur le déplacement de l'absorption de 470 nm à 595 nm observé lorsque le bleu de Coomassie se lie à la protéine. 7 solutions étalons d'albumine de sérum bovin sont préparées à partir de 25 à 1 500 pg/mL d'eau. Relativement aux échantillons, 2 préparations par lot de chondroïtine sulfate en suspension dans l'eau à 100 mg/mL sont faites. Les échantillons, les solutions étalons et le témoin (constitué d'eau) sont incubés avec le réactif de Coomassie pendant 10 minutes à température ambiante. L'absorbance de l'échantillon et des solutions étalons est déterminée à 595 nm, en utilisant le témoin comme liquide de compensation.
Méthode de Lowry Le dosage des protéines totales est réalisé selon la Pharmacopée européenne, section 2.5.33, méthode 2. Cette méthode se base sur la réduction par la protéine du chromogène acide mixte phosphomolybdotungstique dans le réactif phosphomolybdotungstique, qui résulte en un maximum d'absorbance à 750 nm. 5 solutions étalons d'albumine de sérum bovin sont préparées dans 0,1 N NaOH, de 25 à 1 000 pg/mL. Relativement aux échantillons, 2 préparations par lot de chondroïtine sulfate sont mises en suspension dans l'eau à 50 mg/mL et diluées dans 0,1 N NaOH à 10 mg/mL. Les échantillons, les solutions étalons et le témoin (constitué de 0,1 N NaOH) sont incubés avec le réactif de Lowry pendant 10 minutes à température ambiante. Le réactif de Folin est ajouté avant l'incubation pendant 30 minutes à température ambiante. Les absorbances de l'échantillon et des solutions étalons sont déterminées à 750 nm, en utilisant le témoin comme liquide de compensation.
Electrophorèse SDS en gel de polyacrylamide La chondroïtine sulfate est mise en suspension dans l'eau à 100 mg/mL puis placée sous agitation rotative pendant 30 minutes. Les protéines sont extraites avec du méthanol/chloroforme/eau (4/1/3 v/v) et centrifugées à 10 000 g pendant 10 minutes. Les phases supérieures et inférieures sont précautionneusement retirées en évitant le contact avec l'interphase protéique. Une seconde extraction de protéines est réalisée tel que décrit ci-avant jusqu'à l'interphase protéique. Les protéines sont précipitées avec du méthanol et centrifugées à 14 000 g pendant 3 minutes. Les culots sont séchés puis remis en suspension dans 40 pL de tampon de charge (Bio-Rad 161-0791). Les échantillons sont chauffés pendant 3 minutes à 95 °C puis centrifugés 2 minutes à 14 000 g. Dix microlitres (10 pL) de surnageants d'échantillon et de marqueur de masse moléculaire (LMW, GE, 17-0446-01) sont chargés sur le gel Criterion XT Bis-Tris à 12 % (Bio-Rad 345-0118). L'électrophorèse sur gel est réalisée avec une cellule Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) à température ambiante et à une tension constante de 200 V. Les gels sont colorés au bleu de Coomassie R-250, capturés à l'aide d'un appareil photo (GBOX-Chemi-XT16) et analysés avec le logiciel SYNGENE.
Résultats Analyse quantitative par dosages des protéines totales Quel que soit le procédé utilisé, la courbe d'étalonnage est obtenue par représentation graphique de l'absorbance des solutions étalons par rapport aux concentrations protéiques. La concentration protéique est déterminée dans les solutions d'échantillons à partir de la courbe d'étalonnage et de l'absorbance de la solution d'échantillon. La quantité de protéines totales est évaluée à l'aide de 2 méthodes : les méthodes de Bradford et de Lowry, dont les principes diffèrent par l'interaction avec les acides aminés et la taille du peptide. En effet, la méthode de Bradford présente principalement une réaction avec les résidus arginines à l'intérieur d'une protéine (sans liaison aux acides aminés libres) et la méthode de Lowry ne permet une interaction qu'avec 4 liaisons peptidiques d'une part et avec la tyrosine et le tryptophane d'autre part. Ainsi, la différence majeure réside dans la taille des peptides et des protéines soumis aux tests, avec une reconnaissance d'une protéine de masse moléculaire plus élevée pour la méthode de Bradford, comparé à la méthode de Lowry.
Les quantités de protéines totales sont résumées dans le tableau 3. Méthode de Méthode de Bradford Lowry Numér Quantité de Quantité de o de lot protéines totales* (%) protéines totales* (%) 1929 0,13 3,0 ,cu 1930 0,13 3,0 -cs '~ 1931 0,12 3,0 1933 0,12 2,9 1934 0,12 2,9 1935 0,11 3,0 Moyen 0,12 3,0 ne ETR 5,8 2,1 % 2138 0,08 1,7 2140 0,06 2,0 2141 0,05 1,8 2144 0,05 1,7 c 2262 0,07 1,7 2264 0,07 1,9 2266 0,08 1,8 .; 2268 0,09 1,8 cu 2272 0,07 1,8 ,cu 2274 0,07 1,8 -cs ,~ 2276 0,05 1,8 2278 0,05 1,7 2279 0,06 1,9 2280 0,06 1,9 Moyen 0,06 1,8 ne ETR 19,4 5,1 % 26 Tableau 3 : quantité de protéines totales de 20 lots de chondroïtine sulfate aviaire déterminée par les méthodes de Bradford et Lowry (* les quantités de protéines totales sont exprimées 5 sur une base de substance anhydre - ETR : écart type relatif) Les quantités de protéines totales présentent des valeurs inférieures à 0,13 % avec la méthode de Bradford et à 3,0 % avec la méthode de Lowry, toutes estimées sur une 10 base de substance anhydre. Les différences entre ces méthodes peuvent être corrélées à la structure des protéines essentiellement présentes sous la forme de petits peptides dans les lots de chondroïtine sulfate. En outre, les résultats obtenus pour les lots de 15 l'ancien procédé présentent des valeurs approximativement 2 fois supérieures à celles des lots du procédé de l'invention.
Analyse qualitative par SDS-PAGE 20 Des électrophorégrammes ont été réalisés. Les électrophorégrammes présentent 2 types de profiles protéiques selon les lots testés. En effet, les lots de l'ancien procédé présentent un plus grand nombre de bandes (avec une masse moléculaire inférieure à 70 kDa) que les 25 lots du procédé de l'invention, qui ne présentent que 2 bandes diffuses (proches de 20 et 45 kDa).
EXEMPLE 7 ETUDES QUANTITATIVES ET QUALITATIVES DE L'ADN
30 Méthodes d'évaluation
Dosage d'ADN par la méthode à la diphénylamine Le dosage est réalisé selon la procédure codée STANDCOC-36CO0201 avec deux modifications mineures (30 mg, plutôt que 25 mg, de chondroïtine sulfate sont utilisés et la courbe d'étalonnage est obtenue en utilisant un point supplémentaire à une faible concentration (approximativement 0,027 mg d'ADN/mL)). Brièvement, l'ADN est hydrolysé par de l'acide trichloroacétique. L'interaction entre le désoxyribose libre et le réactif diphénylamine conduit au développement d'une absorbance à 600 nm. La quantification est réalisée en utilisant une courbe d'étalonnage d'ADN de thymus de veau.
Extraction d'ADN et analyse électrophorétique La chondroïtine sulfate est mise en suspension dans un tampon de digestion (60 mM acétate de sodium, 50mM Tris-HC1 pH 8.0) à 100 mg/mL et incubée avec 0,16 unité de chondroïtinase ABC de Proteus vulgaris, Sigma C3667, pendant 4 heures. L'ADN est extrait avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25/24/1 v/v), précipité avec un volume de 1/10° de 3 M d'acétate de sodium et d'éthanol à 100 %. Le culot, réhydraté avec de l'éthanol à 70 %, est dissous dans un tampon de 10 mM tris-HCl, 1 mM de solution tampon EDTA, pH 8,0. Un gel d'agarose à 0,8 % est utilisé pour visualiser l'ADN extrait. La migration est réalisée dans un tampon de 89 mM tris /89 mM acide borique /2 mM EDTA, pH 8,0, avec une tension constante de 130V pendant 2 heures. Trois microlitres et demi (3,5 pL) de marqueur de masse moléculaire ADN Low range I (Interchim 467490) sont chargés sur les deux côtés du gel. Dix microlitres (10 pL) d'échantillon (correspondant à 5 mg de substance médicamenteuse équivalente) sont mélangés avec 2 pL de tampon de charge 6x et le mélange et chargé dans chaque puits. Après la migration, le gel est incubé pendant 10 minutes dans une solution de bromure d'éthidium à 1 et l'ADN est visualisé sous illumination UV longues ondes.
Résultats
Analyse quantitative de l'ADN par la méthode à la diphénylamine Les quantités d'ADN sont résumées dans le tableau 4. Ancien procédé Procédé de l'invention Numéro de % d'ADN Numéro de % lot (p/p) lot d'ADN (p/p) 1929 1,24 2138 1,26 1930 1,20 2140 1,18 1931 1,27 2141 1,28 1933 1,53 2144 0,95 1934 1,59 2262 1,30 1935 1,62 2264 1,14 2266 1,17 2268 0,91 2272 1,19 2274 1,33 2276 1,08 2278 1,33 2279 1,38 2280 1,42 Moyenne 1,41 Moyenne 1,21 ETR % 13,5 ETR % 12,5 Tableau 4 : quantité d'ADN de 20 lots de chondroïtine 15 sulfate aviaire (ETR : écart type relatif)
Quel que soit le procédé utilisé, il n'y a pas de différence significative entre les lots. La quantité d'ADN 10 est comprise entre 0,9 et 1,6 % (p/p) de la substance médicamenteuse chondroïtine sulfate.
Analyse qualitative d'ADN par extraction au phénol/chloroforme Des électrophorégrammes ont été réalisés. Aucune différence significative entre l'ancien procédé et le procédé de l'invention n'est observée. Une faible bande de 1 400 paires de bases est observée dans la plupart des lots. En outre, et indépendamment des lots testés, les ADN extraits sont dégradés tel que ceci est mis en évidence par les traînées avec des masses moléculaires inférieures à 700 paires de bases, correspondant à approximativement 230 000 daltons d'ADN monocaténaire.
CONCLUSION La caractérisation de chondroïtine sulfate aviaire par comparaison de l'ancien procédé de production avec le procédé de production de l'invention est abordée en termes de distribution moléculaire, d'analyse protéique et de l'ADN. La distribution de la masse moléculaire, déterminée par SEC-MALLS, présente une population plus homogène avec une masse moléculaire légèrement plus élevée et moins de gros agrégats pour les lots du procédé de l'invention comparé aux lots de l'ancien procédé. L'analyse protéique est abordée selon un aspect quantitatif et qualitatif. La quantité de protéines totales des lots de l'ancien procédé, déterminée par les méthodes de Bradford et Lowry, présente des valeurs approximativement deux fois supérieures à celles des lots du procédé de l'invention. En outre, des différences significatives sont observées selon la méthode utilisée (jusqu'à 0,13 % et 3,0 % pour les méthodes de Bradford et de Lowry, respectivement). En raison des principes de ces méthodes, cette différence peut être corrélée à la structure des protéines essentiellement présentes sous la forme de petits peptides dans les lots de chondroïtine sulfate. L'analyse qualitative des protéines extraites met en évidence deux profiles sur les électrophorégrammes selon les lots testés. En effet, les lots de l'ancien procédé présentent un plus grand nombre de bandes (avec une masse moléculaire inférieure à 70 kDa) que les lots du procédé de l'invention, qui ne présentent que 2 bandes diffuses (proches de 20 et 45 kDa). L'analyse de l'ADN est abordée en termes de quantification par la méthode à la diphénylamine et la caractérisation par électrophorèse sur agarose après extraction au phénol/chloroforme. Il n'y a pas de différence significative entre les lots testés et le procédé utilisé, avec des quantités d'ADN très faibles (entre 0,9 et 1,6 % (p/p) ) présent sous des formes dégradées (masses moléculaires inférieures à 700 paires de bases).
Claims (27)
- REVENDICATIONS1. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) supérieure ou égale à 14 100 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
- 2. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 1 ladite masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) étant comprise entre 14 100 Daltons et 18 000 Daltons, de préférence étant de 16 200 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
- 3. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 1, laquelle présente une masse moléculaire moyenne en poids (Mw) supérieure ou égale à 20 700 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
- 4. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, ladite masse moléculaire moyenne en poids (Mw) étant comprise entre 20 700 Daltons et 23 000 Daltons, de préférence étant de 22 000 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC- MALLS.
- 5. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications 1 ou 3, laquelle présente une masse moléculaire au maximum du pic (Mp) supérieure ou égale à 22 100 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS
- 6. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 5, ladite massemoléculaire au maximum du pic (Mp) étant comprise entre 22 100 Daltons et 23 300 Daltons, de préférence étant de 22 600 Daltons, mesurée par chromatographie d'exclusion stérique SECMALLS.
- 7. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente une densité comprise entre 0,8 et 1. 10
- 8. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, laquelle présente un indice de polydispersité inférieur ou égal à 1,47, 15 mesuré par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
- 9. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 8 ledit indice de polydispersité étant compris entre 1,22 et 1,47, de préférence étant de 1,37, mesuré par 20 chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS.
- 10. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon d'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium et moins de 25 0,09% de protéines mesurées selon la méthode de Bradford.
- 11. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 10, comprenant entre 0,05% et 0,09% de protéines, de préférence entre 0,05% et 0,060 de protéines 30 mesurées selon la méthode de Bradford.
- 12. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant5plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium et moins de 2,0% de protéines mesurées selon la méthode de Lowry.
- 13. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 12 comprenant entre 1,7% et 2,0%, de préférence entre 1,7 et 1,8% de protéines mesurées selon la méthode de Lowry.
- 14. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 90% de chondroïtine sulfate de sodium, caractérisée en ce qu'elle contient des quantités non détectables par chromatographie d'exclusion stérique SEC-MALLS d'agrégats de chondroïtine sulfate de sodium et de composés de haute masse moléculaire d'une taille supérieure à 106 g/mol.
- 15. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 95%, de préférence plus de 98%, de chondroïtine sulfate de sodium.
- 16. Procédé de préparation de chondroïtine sulfate de sodium à partir d'organes cartilagineux d'origine aviaire comprenant les étapes suivantes : a) solubilisation de la matière animale par i) hydrolyse protéolytique des cartilages ; b) sécurisation et purification par ii) traitement thermique; séparation de la chondroïtine ; iv) floculation; v) purification du milieu à pH basique ; vi) traitement basique; vii) traitement à l'eau oxygénée, et c) cristallisation du produit.
- 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape de traitement thermique est réalisée entre 90 et 100°C pendant au moins 3 heures.
- 18. Procédé selon l'une des revendications 16 à 17 caractérisé en ce que l'étape de floculation est réalisée par ajout d'hydroxyde de sodium de manière à atteindre un pH de 11 ± 0, 5.
- 19. Procédé selon l'une des revendications 16 à 18 caractérisé en ce que l'étape de purification à pH basique est conduite à pH 11. 15
- 20. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19 caractérisé en ce que l'étape de traitement basique est effectué avec de l'hydroxyde de sodium.
- 21. Procédé selon l'une des revendications 16 à 20 20 caractérisé en ce que l'étape de cristallisation du produit est réalisée par précipitation éthanolique.
- 22. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre du procédé 25 selon l'une des revendications 16 à 21.
- 23. Composition pharmaceutique comprenant une préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une des revendications 1 à 15 et 22, et au moins un excipient 30 pharmaceutiquement acceptable.
- 24. Composition selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de dose unitaire pour administration orale. 1010
- 25. Composition selon l'une des revendications 23 à 24, caractérisée en ce que chaque dose unitaire contient entre 250 mg et 1 g de chondroïtine sulfate de sodium, de préférence 500 mg.
- 26. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon l'une des revendications 1 à 15 et 22 pour son utilisation en tant que médicament.
- 27. Préparation de chondroïtine sulfate de sodium selon la revendication 26 pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de l'arthrose.
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