FR2876386A1 - Lignees de mastocytes porcins produisant des molecules de type heparine - Google Patents

Abstract

La présente demande a pour objet des lignées de mastocytes porcins dont la croissance est indépendante des facteurs de croissance. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine bioactive comprenant la mise en culture de ces lignées de mastocytes.

Description

É 2876386

Liqnées de mastocytes porcins produisant des molécules de type héparine La présente demande a pour objet des lignées de mastocytes porcins dont la croissance est indépendante des facteurs de croissance. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine bioactive comprenant la mise en culture de ces lignées de mastocytes.

Les mastocytes sont des cellules du système immunitaire, dérivés de précurseurs hématopoïétiques, qui interviennent dans la réponse inflammatoire, notamment dans les 10 phénomènes d'allergie et d'hypersensibilité. Ils sont localisés dans le tissu conjonctif, notamment au niveau de la peau, des muqueuses intestinales et respiratoires.

Les mastocytes se présentent sous la forme de cellules arrondies d'un diamètre compris entre environ 5 à 25 pm et possèdent un noyau arrondi, unique, central ou excentré. Ils 15 sont aussi caractérisés par la présence de nombreuses granulations cytoplasmiques méta-chromatiques.

Ces granules renferment diverses espèces moléculaires ayant une activité pro-inflammatoire telles que l'histamine, la sérotonine, des protéoglycanes tels que l'héparine ou le chondroïtine sulfate, des enzymes, des cytokines et des facteurs chimioattractants des éosinophiles et des neutrophiles. Ces espèces sont libérées lors de l'activation mastocytaire.

Après activation, une réponse secondaire se met en place durant laquelle a lieu la synthèse des médiateurs tels que les leucotriènes, les prostaglandines, le PAF (platelet activating factor), des interleukines (IL4, 1L5, IL6, IL10, IL12 et IL 13), des cytokines (TGF beta, IFN gamma, GM-CSF) et des chimiokines (MCP-1,IL8, RANTES). L'ensemble de ces espèces participe au déclenchement d'un processus inflammatoire et à la mise en place d'une réponse immunitaire spécifique dépendante des lymphocytes T. Des cultures de mastocytes ont déjà été obtenues chez l'homme, la souris et le porc. Chez le porc, des lignées de mastocytes porcins ont été établies par la mise en culture de cellules souches obtenues à partir de foie foetal. Elles ont fait l'objet de la demande de brevet WO 03/035853 déposée aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) et de l'ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE MAISONS ALFORT (ENVA). Trois lignées ont fait l'objet de dépôts auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 respectivement sous les n 1-2734, 1-2735 et 1-2736.

Ces cellules, immortalisées spontanément, ont été maintenues en culture pendant plus de générations en présence de facteurs de croissance comme le rpSCF et le rpIL3. 5 Dans ces conditions, ces cellules s ont capables d e synthétiser des composés de type héparine. Ces lignées de mastocytes produisent des quantités importantes de molécules de type héparine.

La demande de brevet WO 03/035886 ayant pour objet un procédé de production d'héparine à partir de ces lignées a été déposée au nom d'Aventis Pharma S.A..

Chez le porc aussi Emery et al (Experimental Hematology, 24, 927-935, 1996) ont maintenu, durant 7 semaines, des cultures de cellules obtenues à partir de moelle osseuse. Néanmoins il apparaît que les cultures obtenues sont des mélanges de divers types cellulaires et non des cultures homogènes ou des lignées de mastocytes. De plus ces cultures contiennent des cellules non-différenciées en cultures homogènes de mastocytes.

Ashraf et al (Veterinary Parasitology; 29, 134-158, 1988) ont isolé des mastocytes de porcs à partir de la muqueuse intestinale sans maintenir de cultures amplifiables. En outre la caractérisation des mastocytes isolés révèle l'absence d'héparine.

Razin et al (J. Biol. Chem., 257, 7229-7236, 1982) décrivent l'obtention de mastocytes de 20 souris en utilisant des milieux de culture contenant de l'IL3.

Wang et al (Circ. Res., 84, 74-83, 1999) décrivent l'isolement de mastocytes séreux obtenus à partir de cavités pleurales et péritonéales de rat. Diverses espèces moléculaires sont produites mais uniquement quand les mastocytes sont co-cultivés avec des cellules de muscle lisse aortique de rat. La demande WO99/26983 décrit des travaux proches, et est très peu précise quant à l'application à d'autres espèces.

Chez la souris des lignées cellulaires ont été établies (Montgomery et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11327-11331, 1992 et demande WO90/14418) mais à partir de mastocytomes. Ces tumeurs sont extrêmement rares chez le porc.

Chez l'homme l'obtention de cultures de mastocytes s'est révélée difficile. Elle a tout d'abord été permise par l'utilisation de système de co-culture avec des fibroblastes (Ishizaka et al, Current Opinion in Immunology, 5, 937-943, 1993). D'autres auteurs sont ensuite parvenus à obtenir des mastocytes à partir de cellules intestinales et à maintenir ces cellules en culture pendant environ 6 mois en présence de SCF (Bischoff et al, J. Immunol., 159, 5560-5567, 1997).

Les auteurs de ces différents articles n'ont reportée qu'une faible production de composés de type héparine, quand toutefois elle a été mesurée.

La plupart des cultures de mastocytes ont besoin de facteurs de croissance tel que le SCF pour une croissance optimale. Le SCF induit, suite à sa fixation sur son récepteur ckit, des réponses cellulaires variées comme la prolifération, la différentiation, etc. L'étude de mastocytomes murin et humain a permis d'identifier des mutations ou délétions du gène c-kit responsables de l'activation constitutive du récepteur c-kit (c'est à dire sans fixation du SCF). L'expression du gène c-kit muté au niveau du V814 dans des mastocytes immatures IC2 induit la transformation de ces cellules à savoir l'acquisition d'une croissance indépendante du SCF et d'un potentiel tumorigène (Pia et a I, B lood, 87(8), 3117-3123, 1996).

L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique).

Dans le cas de l'héparine, qui appartient, avec I'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine. L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (Glc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-acétylée, N-sulfatée et Osulfatée.

Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/carboxylate est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.

Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane 30 essentiellement par les mastocytes.

La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué d'une répétition de résidus sérine et glycine. L'élongation de la chaîne d'héparine se fait par ajout d'un tétrasaccharide, puis par ajouts successifs d e glucosamines et d'acides uroniques, régulièrement alternés.

Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles: N-déacétylation, N-sulfatation, épimérisation de l'acide Dglucuronique, et 0-sulfatation. Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité.

Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30.000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules d es m astocytes. L'héparine est e xcrétée u niquement 1 ors de la dégranulation des mastocytes.

L'héparine joue u n rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique.

La majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf. DUCLOS, L'Héparine: fabrication, structure, propriétés, analyse ; Ed. Masson, Paris, 1984).

L'analyse de la composition en disaccharides de l'héparine de porc après dépolymérisation par les héparinases I, Il et III, et chromatographie permet de différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes. On distingue notamment huit principaux disaccharides (figure 1).

L'analyse HPLC permet aussi de détecter la présence des tétrasaccharides llallsglu et IlalVsglu (le surlignage symbolise une 30 sulfatation du disaccharide). La présence de ces tétrasaccharides est directement corrélée à la présence de site affin à l'ATIII. En effet, la 30 sulfatation du site affin à l'ATIII conduit à une digestion incomplète de ce site et donc à l'apparition des tétrasaccharides llallsglu et IlalVsglu. La 30 sulfatation du site affin à l'ATIII permet d'obtenir une héparine biologiquement active.

Les études mentionnées ci dessus ont permis l'isolement de lignées productrices. II est néanmoins nécessaire de les améliorer afin de permettre leur utilisation industrielle.

II est en particulier souhaitable de rendre la croissance de ces lignées indépendante des facteurs de croissance et d'améliorer la bioactivité des molécules produites. La demanderesse a montré de manière surprenante qu'il est possible d'améliorer ces deux aspects par la transformation de lignée de mastocytes par des protéines c-kit mutantes et d'obtenir, par la surexpression de la protéine 30STI, des productions de molécules de type héparine présentant une bioactivité compatibles avec une production industrielle.

La présente invention a pour objet des cultures ou lignées de mastocytes porcins caractérisées en ce qu'elles produisent des molécules de type héparine comprenant des tétrasaccharides lla Ils glu. De manière avantageuse ces cultures ou lignées produisent des quantités détectables de tétrasaccharides lla Ils glu. De manière préférentielle ces cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine contenant des tétrasaccharides lia Ils glu dans des quantités d'au moins 0,3 %, 0,5 %, 1 % ou encore 1,5 % des saccharides totaux.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux ces cultures ou lignées de mastocytes porcins produisent des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 50 UI/mg, préférentiellement supérieure à 75 Ul/mg, à 100 UI/mg ou à 150 Ul/mg.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux ces cultures ou lignées de mastocytes porcins p roduisent d es molécules d e type héparine présentant une activité anti Ila supérieure à au moins 50 UI/mg, préférentiellement supérieure à 75 UI/mg, à 100 UI/mg ou à 150 UI/mg.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disaccharides Is (préférentiellement au moins 40%, encore plus préférentiellement au moins 50%).

Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel, les lignées selon la présente l'invention 25 sont modifiées de manière à surexprimer une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.

De manière avantageuse lesdites lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine. La surexpression stable d'une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine permet d'augmenter la 30 sulfatation des composés hépariniques, et par conséquence leur activité biologique.

De manière avantageuse, l'enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine, est une 3-OST et de manière particulièrement avantageuse une 3OST1. L'enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine est préférentiellement la 3OSTI porcine présentant la séquence SEQ ID N 6, et codé par la séquence SEQ ID N5.

Alternativement, il est possible d'utiliser des gènes d'autres espèces codant pour l'expression de l'activité 3-O sulfatase et présentant une identité d'au moins 80%, 90%, 95% ou 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 5. Des acides nucléiques s'hybridant en conditions de forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 5 peuvent aussi être utilisés.

De manière avantageuse les lignées de mastocytes porcins sont modifiées de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion permettant de 10 s'affranchir du SCF.

De manière avantageuse lesdites lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.

Le c-kit présentant une mutation ou une délétion est avantageusement une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin. Il peut être 15 ainsi une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin, telle que qu'une protéine c-kit G556 porcin ou c-kit G560 humain.

II est préférentiellement le c-kit G559 murin, portant une mutation ponctuelle, préférentiellement celle responsable de la modification de la valine en glycine, présentant la séquence SEQ ID N 2, et codé par la séquence SEQ ID N 1.

II peut être aussi le c-kit G559 porcin présentant la séquence SEQ ID N 4, et codé par la séquence SEQ ID N 3.

Du fait de la conservation inter espèce du gène c-kit, les gènes murins, humains, bovins ou tout autre gène présentant une identité d'au moins 80%, 90%, 95% ou 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 peut être utilisé. Des acides nucléiques s'hybridant en conditions de forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 peuvent aussi être utilisés.

De manière surprenante la demanderesse a observé un profil héparinique des cellules exprimant le c-kit G559 murin amélioré par rapport aux cellules n'exprimant pas le c-kit G559 murin, c'est à dire une constitution différente des molécules de type héparine produites par ces cellules.

Il est aussi possible d'utiliser une protéine c-kit présentant une mutation ponctuelle responsable de la modification de l'acide aspartique en valine 814 ou 816 respectivement chez la souris et chez l'homme. Enfin, on peut aussi utiliser le gène murin c-kit délété au niveau des acides aminés TQLPYDH 573 à 579, chez le porc cette délétion est analogue aux acides aminés 570 à 576, chez l'homme 574-580.

Plus particulièrement la présente invention est relative à l'une des lignées de mastocytes porcins déposées auprès de la Collection d e Cultures d e Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 sous les n 1-2734, 1-2735 ou 1-2736 modifiée de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.

Préférentiellement ces lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.

Le terme culture désigne ici, d e manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées in vitro. Une culture développée directement à partir d'un prélèvement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal est dénommée culture primaire .

Le terme lignée est employé à partir du moment où au moins un passage, et généralement plusieurs passages consécutifs en sous-culture ont été effectués avec succès, et désigne toute culture qui en est issue (SCHAEFFER, ln Vitro Cellular and Developmental Biology, 26, 91-101, 1990) .

Le terme acide nucléique est employé pour désigner un ADN ou un ARN. Avantageusement il est un ADN complémentaire ou génomique.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions o u d es délétions ( par exemple d es gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.

Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.

A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence requête de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.

Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes: 1Pré-hybridation des membranes et: - Mélanger: 40pl ADN sperme de saumon (10mg/ml)+ 40 pI ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Compétition de la sonde marquée: - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 pI ADN Cot I, selon la quantité de répétitions.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3- Hybridation: - Oter le mix de pré hybridation.

- Mélanger 40 pI ADN sperme de saumon + 40 pI ADN placentaire humain; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.

- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et 30 la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4- Lavaqes: - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65 C.

- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.

Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.

Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985,"Nucleic acid hybridization: a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).

La présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins tels que décrits ci dessus.

Les lignées selon la présente invention sont de préférence cultivés dans un m ilieu d e culture défini (MEMa/DMEM, RPMI, IMDM, ...).

Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0,5% et 20% (v/v).

L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que A IMV (INVITROGEN) d e façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000).

Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal C ell B iology, Eds. Spier et Griffiths, Academic Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Academic Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983).

La culture peut également être réalisée en suspension ou sur microsupport selon la technique décrite par VAN WEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967).

On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en oeuvre à l'échelle industrielle (VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2"d edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 x 106 cellules/ml.

La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70% à 90%) pour les opérations d'extraction des GAGs et d'isolement de l'héparine et en conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules.

Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000).

Dans le cadre de la présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieure à celle pouvant être obtenue en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992; VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987) Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 10' et 5 x 10' cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire: pH, pO2, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbonés (par exemple glucose, fructose, galactose), métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc. Il peut être envisagé d'augmenter quantitativement et qualitativement le contenu en molécules de type héparine des mastocytes suite à un traitement avec le sodium butyrate (Nakamura et al (Biochim.Biophys.Acta. 627, 60-70, 1980).

Après 3 à 14 jours de culture, de préférence après 3 à 5 jours, les cellules sont récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.

Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2"d Edition, Noyes Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A.).

Alternativement ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20pm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec') afin de réduire le colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.

Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).

On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permet d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d'éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus ou autres macromolécules.

L'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée dans le cas où l'héparine aurait été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique ou des propriétés biologiques.

Dans le cadre de ce mode de mise en oeuvre, le seuil de coupure des membranes est de 35 préférence compris entre 1000 et 5 kDa. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro-filtration, par exemple, membranes spirales, membranes planes ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine).

Toutefois, on préférera généralement utiliser des méthodes de production et de récolte des cellules permettant de conserver l'héparine dans le contenu intracellulaire. La récupération de l'héparine à partir des mastocytes peut aussi se faire après dégranulation ou lyse des cellules.

La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type allergène (tels que fragment Fc desIgE ou analogues de ce fragment) sur les récepteurs IgE des mastocytes.

D'autres agents peuvent aussi induire une dégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T. W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann.

Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les mêmes cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules.

Dans le cas particulier de l'ionophore A23187, la dégranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.106 cellules/ml de mastocytes avec l'ionophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 à 100 pg/ml et des temps d'action variant de 1 minute à 4 heures.

La lyse des mastocytes, peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d'agents chimiques (NaOH, THESITTM, NP40TM, TWEEN 20TM, BRIJ-58TM, TRITON XTM-100,.

) ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...) ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes...DTD: Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité ci-dessus).

A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine: on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc...) ; les liaisons héparine- protéine peuvent être h ydrolysées e n m ilieu a Icalin, e n présence de sulfates ou de chlorures; on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs-protéines.

On peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par 20 l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc. Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.

La p résente i nvention a é gaiement pour o bjet 1 es p réparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en oeuvre un procédé selon l'invention.

Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.

Les figures de la présente demande sont les suivantes: É Figure 1: structures chimiques des disaccharides Is, Ils Ills et IVs correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine, des disaccharides homologues 35 acétylés la Ila, Illa et.lva ainsi que des tétrasaccharides lia Ils glu et lia IVs glu.

É Figures 2: analyse moléculaire des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015.Figure 2A- PCR génomique.Figure 2B- RT-PCR réalisée en absence (-) ou en présence (+) de Reverse transcriptase sur de l'ARN extrait de cultures contrôles MCpcDNA3.1/Hygro (1) ou de cultures MCpBXL2015 (2).(C: ADN plasmidique pBXL2015 témoin).

É Figure 3A: croissance des cellules contrôle MCpcDNA3.1/Hygro et des cellules MCpBXL2015 en milieu sans SCF. Figure 3B: Comparaison de la croissance des cellules témoins MCpcDNA3.1/Hygro en présence de SCF avec les cellules MCpBXL2015 en milieu sans SCF.

É Figure 4: Courbe de croissance de la culture MCpBXL2015 mère et des clones MCpBXL2015.

É Figure 5: Courbe de croissance de la culture PM125 mère et des clones PMC125 pBXL2033.

É Figure 6: Etude de la stabilité de la production de protéoglycanes au cours du temps par le clone PMC125 pBXL2033 19-D4. Le mucus, extrait et analysé dans les mêmes conditions que les cellules est placé comme témoin.

La présente invention est illustrée par les exemples de mise en oeuvre qui suivent. Ces exemples sont purement illustratifs et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.

EXEMPLES

EXEMPLE 1: Modification qénétique des mastocytes Les mastocytes peuvent être modifiés génétiquement par l'introduction d'un acide nucléique exogène en utilisant par exemple des techniques de transfection, d'électroporation, de nucléoporation ou d'infection ce qui résultera en l'expression transitoire ou stable de l'acide nucléique introduit. Dans le cas d'une expression stable, l'ADN peut être intégré dans le génome cellulaire ou être maintenu comme épisome.

ITransfection par nucléoporation et électroporation.

Des cellules transfectées de manière stable peuvent être obtenues en utilisant la méthode 35 de nucléoporation décrite ci-dessous, en appliquant, 24 à 72 heures après la nucléoporation, une pression de sélection (hygromycine, généticine, blasticidine, puromycine ou zeocine). La résistance à l'agent de sélection est conférée par l'intégration du plasmide porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance.

Nucléoporation Cette méthode, est utilisée préférentiellement car elle permet de cibler l'ADN directement dans le noyau.

1 à 2.106 mastocytes, en phase exponentielle, préférentiellement après 3 ou 4 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 pl de solution de nucléofection (Amaxa, Kit 8351). 2 à 4 pg de pcDNA3.1-eGFP, plasmide codant pour la GFP, sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique par l'utilisation d'un programme spécifique (comme U14, U23 et U28 AMAXA) Les cellules sont ensuite transférées dans 2 ml de milieu complet préchauffé à 37 C puis incubées à 37 C, 5%CO2.

24 à 48 heures après la transfection, les cellules sont récoltées pour être fixées au paraformaldéhyde (Prolabo) 1 %. Pour cela, la totalité de la culture est centrifugée 5 min à 1000 rpm. Après élimination du surnageant, les cellules sont lavées dans 4 ml de PBS lx puis centrifugées à nouveau. Le culot cellulaire est ensuite repris dans 1 ml de paraformaldéhyde 1 %. Les cellules ainsi fixées sont ensuite analysées au cytomètre (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) Les conditions de nucléoporation décrites ci-dessus permettent de transfecter les 25 mastocytes de porc avec une efficacité de transfection comprise entre 30 à 50 % tout en obtenant une bonne viabilité cellulaire, supérieure à 50%.

Electroporation 1 à 5.106 cellules, en phase exponentielle, sont mises en contact avec 1 à 30 pg d'ADN.

Les cellules, transférées dans une cuvette d'électroporation 4 mm, sont incubées 5 min dans la glace avant d'être électroporées à un voltage compris entre 150 V et 400 V avec une capacitance de 500 ou 960 pF (Gene Pulser II, Biorad) Après électroporation, les cellules sont à nouveau incubées 5 min dans la glace pour être finalement transférées dans 5 ml de milieu de culture complet et incubées à 37 C, 5%CO2.

Le processus de sélection de cellules ayant intégrées le transgène de façon stable utilise la même technique que décrit ci-dessus en utilisant la résistance conférée par l'intégration du plasmide à un agent de sélection.

2 Transfection par des vecteurs viraux, utilisation de vecteurs retroviraux pantropiques.

Alternativement aux méthodes de transfection par éléctroporation et nucléoporation, on peut utiliser des vecteurs retro-viraux recombinants et délétés pour la réplication. On peut par exemple utiliser des vecteurs pseudo typés avec la glycoprotéine d'enveloppe du vesicular stomatitis virus (VSV-G) qui permet la production de vecteurs retro-viraux pantropiques, capable d'infecter des cellules porcines.

Dans ce mode de transfection, le vecteur rétro-viral porteur du gène d'intérêt à exprimer ou intégrer dans le mastocyte porcin est produit dans un premier temps à l'aide du cellule d'empaquetage telle que GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), qui possède les éléments génétique pour la production du vecteur (gag et pot) à l'exception du gène pour la production de la protéine d'enveloppe pseudo-typée (env- VSV-G).

Lors de la production du vecteur rétro-viral, les cellules d'empaquetage sont co- transfectées avec le plasmide codant pour le gène d'enveloppe VSV-G et un plasmide rétro-viral codant pour le gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur avec ou sans gène de sélection.

Pratiquement, les cellules GP-293 sont mises en culture 48h à 72 heures avant la transfection afin d'être en phase exponentielle de croissance. Le jour de la transfection, le milieu de culture est changé par du milieu frais (15-20 ml pour 106 cellules), puis 1 à 2 ml de solution contenant le mélange du plasmide VSV-G (5 à 20pg pour 106 cellules) et du plasmide porteur du gène d'intérêt (10 à 30 pg pour 106 cellules), en tampon pH7 phosphate d e calcium sont a joutés goutte à goutte d ans le milieu d e culture (1 à 2 ml (Promega) Les cellules sont ensuite remises à incuber pendant 16 à 24 heures à 37 C ou préférablement à une température comprise entre 32 et 35 C. Le milieu de culture est changé à nouveau avec du milieu frais. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires à 32-35 C. A la fin de la période d'incubation, le surnageant de culture contenant les vecteurs rétro-viraux néo-formés est récolté. Une partie du surnageant d'infection des cellules d'empaquetage est aliquoté et congelé à -80 C, l'autre partie est mélangée au milieu de culture des mastocytes en phase exponentielle de croissance de croissance. En pratique les mastocytes en culture sont centrifugés et resupendus dans un milieu contenant 50% de milieu frais et 50% de surnageant d'infection. Les mastocytes sont mis à incuber pendant 24 heures à 32-35 C, puis le milieu est changé à nouveau par du milieu frais.

48 à 72 heures après l'infection des mastocytes, des échantillons sont prélevés pour analyser par cytofluorimetrie dans le cas du témoin d'infection avec le gène rapporteur fluorescent GFP (Green Fluorescent Protein) ou par PCR pour les infections avec le gène d'intérêt. Par cytofluorimetrie la mesure de l'efficacité de transfection est supérieure à 20% des cellules totales.

Les populations de cellules t ransfectés s ont e nsuite sélectionnées e n a joutant d ans le milieu de culture l'agent cytotoxique (Hygromycine, puromycine, G418, Zeocyne) pour lequel seuls les mastocytes transfectés avec le vecteur retro-viral porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance continuent à pousser. Par cette méthode le gène d'intérêt est intégré et s'exprime de manière stable.

Après sélection et clonage des populations, l'agent de sélection peut être enlevé du milieu de culture tout en conservant l'expression du gène d'intérêt. Le vecteur rétroviral produit de cette façon ne se réplique pas dans le mastocyte hôte et il n'y' a donc pas production de vecteurs réplicatifs.

Alternativement, on peut aussi utiliser des vecteurs pour lesquels l'expression est soumise à une induction du promoteur régulant l'expression du gène d'intérêt par un 25 composé ajouté au moment voulu dans le milieu de culture.

EXEMPLE 2: Génération d'une liqnée capable de croître en absence de SCF par expression stable du qène c-kitG559 murin Afin d'obtenir des mastocytes de porc dont la croissance serait indépendante du SCF à long terme, les mastocytes ont été transformés avec le gène c-kit muté. Pour cela, on a utilisé le gène c-kit murin portant une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 559 en glycine (gène noté ckitG559) Les mastocytes utilisés pour la transfection sont issus d'une culture de mastocytes porcins obtenus à partir de foie foetal comme décrit dans la demande de brevet WO 03/035853. Cette lignée de mastocytes 1-2735 a été maintenue en culture pendant 929 jours en présence de cytokines.

Les mastocytes sont cultivés en milieu MEMa complémenté avec 15% de sérum de veau foetal (Hyclone), 2 mM glutamine (Invitrogen), 10 nM pGE2 (Sigma), 2 ng/ml rplL-3 (Biotransplant) et 80 ng/ml rpSCF (Biotransplant). Ce milieu de culture est nommé milieu complet 1. Les cellules sont incubées à 37 C sous 5% de CO2 et ensemencées à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.

Le plasmide pEF-BOS-ckitc559 murin a été obtenu par clonage du fragment Xbal du gène 10 ckit murin muté dans le plasmide pEF-BOS (décrit par Mizushima et Nagata, Nucleic Acid Res., 18(17):5322, 1990) ouvert à Xbal.

Le gène c-kit porte une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 559 en glycine (gène noté c-kit 559) Cette mutation est analogue aux mutants c-kit 556 chez le porc et c-kitG56O chez l'homme.

Le plasmide pEF-BOS-ckit 559 murin a été digéré par Xbal pour obtenir l'ADNc murin ckitc559 muté. Le fragment d'ADNc a été cloné dans le plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen) au niveau du site Xbal. Le plasmide obtenu, après séquençage complet de l'ADNc, a été nommé pBXL2008.

Le plasmide pBXL2008 a été digéré par Xbal pour obtenir l'ADNc murin ckitG559 muté. Le 20 fragment d'ADNc a été cloné dans le plasmide pcDNA3. 1/Hygro (Invitrogen) au niveau du site Xbal. Le plasmide résultant est appelé pBXL2015.

Le fragment d'ADNc comprend la séquence SEQ ID N 1.

Les p réparations d 'ADN pour les transfections ont été réalisées avec le kit Endofree plasmid maxi (Quiagen).

Transfection-Sélection d'une population résistante à l'hyqromycine 5.106 mastocytes, en phase exponentielle, après 3 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 pl de milieu de transfection (MEMa complémenté avec 2mM glutamine, 10 nM PGE2, 80 ng/ml rpSCF et 2 ng/ml rpIL3). 30 pg de pcDNA3.1/Hygro ou de p BXL2015 sont e nsuite ajoutés à l a s uspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique 960 pF, 340 V (Gene Pulser, Biorad).

Après l'électroporation, les cellules sont transférées dans 5 ml de milieu complet 1 préchauffé à 37 C puis incubées à 37 C, 5%CO2.

48 heures après la transfection, les cellules sont numérées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml en milieu de sélection (milieu complet 1 supplémenté avec de l'hygromycine (Invitrogen) à une concentration de 0,2 mg/ml).

Une population cellulaire résistante à l'hygromycine est obtenue 16 jours après application de la sélection à l'hygromycine. Les cellules transfectées stablement avec le plasmide pcDNA3.1/Hygro sont nommées MCpcDNA3.1/Hygro; celles transfectées stablement avec le plasmide pBXL2015 sont nommées MCpBXL2015.

Les cultures cellulaires sont maintenues en culture dans le milieu de sélection.

Caractérisation moléculaire Détection du gène ckitG559 murin dans les cellules MCpBXL2015 La d étection d u gène ckitG559 murin a été réalisée par PCR à partir d'ADN génomique extrait des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015, en utilisant des amorces permettant d'amplifier spécifiquement le gène murin sans amplifier le gène porcin endogène.

L'ADN génomique a été extrait à partir de 5.106 cellules issues des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 selon le protocole du kit Dneasy Tissue de 20 Quiagen.

n g de ces ADN g énomique ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens C 19810 d e s équence S EQ ID N 7 5'- G CC GAG G CC A CT C GC -3' et d'une amorce anti-sens C19814 de séquence SEQ ID N 8 5'AGC CAT GTA CCG TCA CGC TG -3' d'après le protocole du kit Advantage 2GC PCR (Clontech). Après les 25 cycles thermiques (30 sec de dénaturation à 94 C, 45 sec d'hybridation à 58 C et 45 sec d'élongation à 68 C), la réaction PCR a été analysée sur un gel d'agarose 2% TBE1X pour détecter le fragment amplifié de 325 pb.

Dans ces conditions on observe un produit PCR d'environ 350 pb à partir de l'ADN génomique issu de la culture MCpBXL2015 et non pas avec l'ADN génomique issu de la culture MCpcDNA3.1/Hygro ce qui démontre la présence du gène ckitG559 murin (figure 2A).

Détection de l'expression du gène murin ckitG559 dans les cellules MCpBXL2015 La détection de l'expression du gène ckit0559 a été réalisée par RT-PCR.

L'ARN a été extrait à partir d e 10' cellules issues des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 selon le protocole du kit Rneasy mini de Quiagen. 30 pg d'ARN a ensuite été digéré avec 20 U de DNase 11 heure à 37 C puis purifié selon le protocole Cleanup du kit Rneasy mini de Quiagen.

2 pl de ces ARN a été reverse transcript en ADNc avec la reverse transcriptase RT AMV (Roche) en utilisant comme amorce l'oligonucléotide de séquence SEQ ID N 9 5'-gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv-3'.

La PCR a été réalisée sur 1 pl d'ADNc dans les conditions décrites dans le paragraphe 10 précédent.

Dans ces conditions on observe un produit issu de la RT-PCR d'environ 350pb à partir de l'ARN issu de la culture MCpBXL2015 et non pas avec l'ARN issu de la culture MCpcDNA3.1/Hygro ce qui démontre que le gène ckitG559 murin est effectivement exprimé dans les cellules (Figure 2B).

Caractérisation de la croissance en absence de SCF La fonctionnalité du ckitG559 a été évaluée en analysant la capacité des cellules à croître 20 en milieu dépourvu de SCF.

Pour cela, 5 à 6 semaines après la transfection, une partie des cellules MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 a été ensemencée à 2.105 C/ml en milieu dépourvu de SCF. Deux fois par semaine et pendant trois semaines, le milieu est renouvelé avec du milieu frais.

Les cellules témoins MCpcDNA3.1/Hygro ne sont pas capables de pousser dans un tel milieu: on observe un arrêt de la croissance suivi d'une mort cellulaire importante (Figure 3A).

Pour les cellules MCpBXL2015, on observe une période initiale d'environ trois semaines pendant laquelle la croissance est faible (Figure 3A). Cette période de latence peut s'expliquer par le fait que toutes les cellules n'expriment pas, malgré leur résistance à l'hygromycine, un récepteur murin ckitG559 fonctionnel ce qui se traduit par une incapacité à croître en absence de SCF. Après cette phase de latence, une population de cellules MCpBXL2015 capables de pousser en absence de SCF apparaît. Cette sous population a été amplifiée après numération et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours pendant au moins 11 semaines. Dans ces conditions, après ensemencement à 2.105 C/ml, la densité cellulaire maximale atteinte est comprise entre 4 à 10.105 cellules/ml avec un temps de doublement en phase exponentielle compris entre 24 et 48 heures.

La croissance des cellules MCpBXL2015, en absence de SCF, est identique à la celle des 5 cellules contrôles, MCpcDNA3.1/Hygro, en milieu supplémenté en SCF (Figure 3B).

L'expression du gène ckitG559 murin permet donc de s'affranchir du SCF tout en conservant le même niveau de croissance.

Caractérisation, en HPLC, des protéoglvcanes contenus dans les cultures 10 L'étude de la croissance des cellules MCpBXL2015, dans un milieu carencé en SCF, démontre que l'expression du récepteur ckitG559 permet de s'affranchir du SCF. Nous avons aussi étudié l'impact du retrait du SCF sur la production de protéoglycanes par les mastocytes.

Après cinq semaines de culture en absence de SCF, des échantillons de la culture MCpBXL2015 ont été prélevés pour analyser la composition en protéoglycanes des mastocytes selon le protocole décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9, 183-197, 1997).

Les échantillons sont traités de la façon suivante: Protéolyse: Les échantillons cellulaires, 2x106 cellules, sont centrifugés et rincés deux fois en tampon PBS. Chaque culot est repris dans 100pl d'eau distillée additionnés de 10p1 d'alcalase (Novozymes) puis chauffé pendant 5 heures à 60 C sous agitation. Puis les échantillons sont dilués avec 200pl de tampon Tris 10mM pH 7.0 (Prolabo) 0.5M NaCl (Prolabo) avant d'être centrifugés pendant 10 minutes à 10.000 tr/min. L'étape de protéolyse permet de libérer le contenu intracellulaire et de dissocier les liaisons protéines-polysaccharides.

Extraction: Le surnageant de chaque échantillon est purifié par échange d'ions sur résine ammonium quaternaire SAX en format plaque 96 puits, 100mg/2m1 (Thermohypersil).. Après fixation et lavage en tampon Tris pH7, NaCl 0.5M, les Glyco- aminoglycans (GAGs) sont élués par 500 pl de tampon Tris pH7.0, NaCl 3M.

Dessalage/concentration: Les échantillons sont ensuite dessalés sur colonne de gel perméation (NAP-5, Pharmacia) Après élution dans un volume de 1 ml, les échantillons sont concentrés par lyophilisation, 35 puis repris dans 130p1 d'eau distillée.

Dépolymérisation.

Pour l'analyse HPLC, les GAGs sont dépolymérisés par un mélange d'héparinases I, Il et III (Grampian enzymes) Chaque solution d'héparinase est ajustée à 0.5UI/ml en tampon phosphate. La solution d'héparinases I, II, III est préparée en mélangeant 1/3 volume à volume de chaque solution d'héparinase. Pour 100 pI d'échantillon à analyser, on ajoute 15pl du mélange d'héparinase et 10pl de tampon acétate contenant 0.73 ml d'acide acétique 100% (Prolabo) 12.5mg d'albumine bovine (Sigma) et 39.5 mg d'acétate de calcium (Prolabo) pour 30 ml d'eau distillée.

Analyse HPLC.

Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC sur colonne Waters spherisorb SAX 5pm, 250x3mm, Thermohypersil. 50 pI d'échantillon sont injectés par analyse, le tampon de la phase mobile est composé de 2.5mM de Sodium Di Hydrogeno Phosphate (Na2HPO4, Prolabo) dont le pH est ajusté à 2.9 avec de l'acide ortho-phosphorique (H3PO4, Prolabo). L'élution des disaccharides constitutifs des GAGs extraits des échantillons cellulaires est réalisé dans un gradient de 0 à 100% en 50 minutes de tampon Na2HPO4 2.5 mM et 1M de perchlorate (NaCIO4, Prolabo). Les disaccharides sont détectés par leur temps de rétention et par rapport à un échantillon d'héparine standard (Aventis) en UV à 234 nM.

Lorsque les MCpBXL2015 sont cultivées en absence de SCF, le profil héparinique est amélioré par rapport aux cellules témoin cultivées en présence de SCF.

Sans que la demanderesse ne soit liée par une théorie particulière il est possible d'expliquer ce phénomène soit par la sélection cellulaire réalisée lors de l'obtention des cellules poussant en absence de SCF, soit par une différence de maturation des mastocytes en présence ou non de SCF. En effet, le SCF permet aux cellules de proliférer mais intervient aussi dans la différentiation cellulaire.

EXEMPLE 3: Obtention d'un clone MCpBXL2015 par clonage par dilution limite 30 Les cellules MCpBXL2015 ont été clonées par la technique de dilution limite en milieu dépourvu de SCF. Pour cela, 10 plaques de 96 puits ont été ensemencées avec 0,3 cellule/100 pl/puits. Seuls les clones présentant une croissance en plaque 96 puits satisfaisante ont été retenus et amplifiés. Une fois à confluence, les clones ont été récupérés puis ensemencés en plaque 48 puits avec 500 pI de milieu puis en plaque 6 puits avec 2 ml de milieu et enfin en F25 avec 5 ml de milieu.

A l'issue de cette amplification, neuf clones ont été obtenus et amplifiés après numération et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.

Le choix final du clone a été réalisé après une analyse de la croissance et de la composition en protéoglycanes des mastocytes.

Une étude comparative de la croissance a été réalisée à partir de la culture mère MCpBXL2015 et des neuf clones obtenus. L'ensemble des clones présente une croissance comparable à celle de la culture MCpBXL2015 non clonée (Figure 3). Après quatre jours de culture, des échantillons ont été prélevés afin d'analyser la composition en protéoglycanes des différents clones.

D'après les résultats HPLC résumés dans le tableau 2, les polysacharrides synthétisés par chaque clone présentent des caractéristiques de type héparine avec des variations dans les quantités relatives de chaque disaccharide constitutifs de la chaîne héparinique (par exemple, la proportion de disaccharide Is varie de 5 à 30 % selon les clones). Néanmoins, tous les clones, comme la population non clonée MXpBXL2015, présentent un niveau de 30 sulfatation situé en dessous du seuil de détection (tétrasaccharide Ilallsglu non détectable).

En se basant sur les critères de productivité et de qualité pour la production 20 d'héparinoides, le clone MC pBXL2015 6-G4 a été retenu. Ce clone a été congelé sous le nom de PMC 125.

EXEMPLE 4: Génération d'une lignée indépendante du SCF et possédant une 25 activité de 30 sulfatation augmentée Afin d'augmenter l'activité biologique des composés de type héparine issus des cultures de mastocytes, il est possible de surexprimer de façon stable le gène codant pour la 3OST-1 (3 0-sulfatase-1). Dans cet exemple, nous avons utilisé le gène porcin.

Les mastocytes utilisés sont issus de la culture PMC125 décrite dans l'exemple 3.

Les mastocytes sont cultivés en milieu MEMé complémenté avec 15% de sérum de veau foetal (Hyclone), 2 mM glutamine (Invitrogen), 2 ng/ml rplL-3 (Biotransplant). Ce milieu de culture est nommé milieu de culture 2. Les cellules sont incubées à 37 C sous 5% de CO2 et passées tous les 3-4 jours.

Le plasmide HS3ST1-pE-IRES-neo2- codant pour la 3-OST1 porcine a été décrit dans la demande PCT/FR04/00902 déposée au nom d'AVENTIS PHARMA S.A. Pour rappel le plasmide HS3ST1-pE-IRES-neo2 a été obtenu comme suit.

Isolement et séquençage de la séquence 3' codante du qène 3-OST porcin La séquence partielle du gène porcin codant pour la 3-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BF075483). L'alignement de cette séquence avec la séquence humaine montre qu'il manque environ 650 pb de la région codante en 10 3'.

La portion manquante du gène 3-OST porcin a été identifiée en combinant la RT-PCR et le 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen) La transcription inverse de 2 pg d'ARN totaux en ADNc a été effectuée e n s uivant I e protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un mélange des oligonucléotides BS02 et BS03 de séquences respectives SEQ ID N 10 5'-GCA GCA GCC ACG TCG GG-3' et SEQ ID N 11 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC- 3'.

2 pl d e ces A DNc o nt e nsuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens BS05 de séquence SEQ ID N 12 5'-CGG NGA CCG CCT NAT CAG-3' etd'une amorce anti-sens BS06 de séquence SEQ ID N 13 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 98 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 30 sec d'élongation à 68 C), le fragment amplifié de 277 pb a été cloné dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquencé.

La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer 2 amorces BS21 et BS22 pour 30 isoler, par 3'-RACE, la totalité de la région 3'.

Dans le cadre du 3'-RACE, 1 pl d'ARN porcin de foie a été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligodT CDSIII de séquence SEQ ID N 14 (5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG T VN-3').

La région 3' du gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 pI d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens BS21 de séquence SEQ ID N 15 5'-GCA CCC CCA GAT CGA CCC C-3' et une amorce anti-sens CDSIII. 30 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 94 C, 30 sec d'hybridation à 60 C et 120 sec d'élongation à 68 C). La seconde PCR a ensuite été réalisée dans les mêmes conditions que la première PCR avec 1 pl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens BS22 de séquence SEQ ID N 16 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3' et l'amorce anti-sens CDSIII.

Le séquencage du produit PCR ainsi obtenu à l'issue du 3'-RACE a permis d'identifier la séquence 3' de la 3-OST porcine ainsi qu'environ 250 pb de la région non codante.

Isolement de la phase codante complète du qène 3-OST porcin.

Afin de cloner la phase codante complète de la 3-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape. La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente.

2 p g d 'ARN ont été reverse transcrit en A DNc d'après le protocole d u kit F irst Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24. Le gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par PCR en deux étapes. La première PCR a permis d'amplifier le gène y compris une portion de la séquence 3' non codante du gène, la seconde PCR a ensuite permis d'amplifier la séquence codante en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (Invitrogen) La première PCR a été réalisée sur 2 pI d'ADNc avec une amorce sens BS10 de séquence 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3' s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène 3-OST porcin et une amorce BS30 anti-sens de séquence 5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'UTR. 35 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98 C, 30 sec d'hybridation à 64 C et 150 sec d'élongation à 68 C) Une seconde PCR est ensuite réalisée sur 1 pI du produit PCR afin d'amplifier spécifiquement la phase codante. Pour cela, nous utilisons l'amorce sens BS31 de séquence SEQ ID N 17 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3' et l'amorce anti-sens BS32 de séquence SEQ ID N 18 5' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT CAA ATG TTC TGC C 3'. Le programme PCR utilisé est identique à celui utilisé pour la première PCR.

Le produit PCR de 1 kb a ensuite été cloné d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRESneo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquençage.

La séquence nucléotidique obtenue est la séquence SEQ IDN 5. La séquence protéique déduite est la séquence SEQ IDN 6.

Obtention du plasmide pBXL2033 Le gène 3OST1 porcin a été amplifié par PCR à partir du plasmide HS3ST1-pE-IRES-neo2 en présence d'une amorce sens C21755 de séquence SEQ ID N 19 5'- CGC GGA TCC CAG CAT GGC CGC GCT GCT CC -3' et d'une amorce anti-sens C21756 de séquence SEQ ID N 20 5'- CTA GTC TAG ATT AGT GCC AGT CAA ATG TTC -3' d'après le protocole du kit Advantage 2GC PCR (Clontech). Après les 25 cycles thermiques (30 sec de dénaturation à 94 C, 45 sec d'hybridation à 55 C et 45 sec d'élongation à 68 C), la réaction PCR est purifiée d'après le protocole du kit Quiaquick PCR purification de Quiagen. La totalité du produit PCR est ensuite digéré 4 heures à 37 C par BamHl et Xbal (Biolabs). Le produit de digestion est ensuite purifié, après migration sur gel d'agarose 1% TBE1x, d'après le protocole du kit Quiaquick gel extraction de Quiagen. Le produit PCR ainsi digéré est cloné dans le vecteur pcDNA3.1/Hygro ouvert à BamHl-Xbal.

Le plasmide obtenu, après séquençage complet de l'ADNc, a été nommé pBXL2032.

Le plasmide pBXL2032 a été digéré par Xbal-BamHl pour obtenir l'ADNc porcin 3OST1. Le fragment d'ADNc a été cloné dans le plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen) ouvert par Xbal-BamHl. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pBXL2033.

Les préparations d'ADN pour les transfections ont été réalisées avec le kit Endotoxin free plasmid (Quiagen).

Transfection-Sélection d'une population résistante à la dénéticine 5.106 mastocytes, en phase exponentielle, après 3 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 pl de solution de nucléoporation 8351 (Amaxa).

4pg de pcDNA3.1 ou de pBXL2033 sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique: programme U-28 (Nucleofector, Amaxa).

Après l'électroporation, les cellules sont transférées dans 2 ml de milieu de culture 2 préchauffé à 37 C puis incubées en plaque 6 puits à 37 C, 5%CO2.

48 heures après la transfection, les cellules sont numérées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml en milieu de sélection (milieu de culture 2 supplémenté avec la généticine (Invitrogen) à une concentration de 0,8 mg/ml).

Une population cellulaire résistante à la généticine a été obtenue 20 jours après application de la sélection. Les cellules PMC125 transfectées de manière stable avec le plasmide pcDNA3.1 sont nommées PMC125pcDNA3.1; celles transfectées de manière stable avec le plasmide pBXL2033 sont nommées PMC125pBXL2033.

Les cultures cellulaires sont maintenues en culture dans le milieu de sélection.

Caractérisation, en HPLC, des protéoglycanes contenus dans les cultures La fonctionnalité de la 3-OST1 a été évaluée par l'analyse du niveau de 30 sulfatation des protéoglycanes produits par les mastocytes contrôles PMC125 pcDNA3.1 et les mastocytes PMC125 pBXL2033. Le niveau de 30 sulfatation peut être suivi en quantifiant la quantité de tétrasaccharide Ilallsglu révélateur de la 30 sulfatation.

Pour cela, trois semaines après l'application de la sélection, des échantillons ont été prélevés 4 jours après ensemencement des cultures à 2.105 C/ml.

Les protéoglycanes produits par les cellules témoin PMC125pcDNA3.1 ne contiennent pas de quantités détectables de tétrasaccharide Ilallsglu (tableau 3). En revanche, les protéoglycanes synthétisés par les cellules PMC125pBXL2033 contiennent 0,9% de Ilallsglu révélateur d'une augmentation significative du niveau de 30 sulfatation dans ces cultures.

Ces résultats démontrent que la 3OSTI porcine s urexprimée d ans I es m astocytes est fonctionnelle c'est à dire qu 'elle induit une 3-0 sulfatation.

L'activité biologique de ces échantillons a ensuite été examinée. Pour cela, une mesure de l'activité anti-Xa et anti-Ila a été réalisée.

Caractérisation de l'activité biologique des protéoglycanes contenus dans la culture L'inactivation des facteurs Xa et lla est caractéristique de l'héparine et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane. La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie de la pharmacopée Européénene 3ieme édition (1997).

La réaction se déroule en trois étapes: 1: ATIII + héparine [ ATIII Héparine] 2: [ATIII Héparine] + Facteur en excès [ATIII-Heparine-Facteur] + Facteur résiduel 3: Facteur résiduel + Substrat chromophore Para-nitroaniline coloré La quantité de Paranitroaniline libérée est inversement proportionnelle à la quantité 5 d'héparine.

La quantité anti-Xa ou Anti-Ila est mesurée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM ( Standard International Héparine) La sensibilité de la méthode est de 0.006UI/ml.

L'activité biologique est exprimée en UI/mg en tenant compte de la quantification des disaccharides obtenue par HPLC.

L'activité biologique d'échantillons, identiques à ceux analysés en HPLC, a été déterminée.

Les protéoglycanes synthétisés par les cellules témoin PMC125pcDNA3.1 ne présentent pas d'activité biologique détectable. En revanche, l'analyse de l'activité des protéoglycanes produits par les cellules PMC125pBXL2033 révèle la présence d'activité biologique anti-Xa et anti-Ila comprise entre 60 à 80 UI/mg (Tableau 3).

On remarque que, à ce stade de la culture c'est à dire quatre jours après l'ensemencement, le ratio entre les deux activités est proche de 1, ce qui est caractéristique de l'héparine issue de l'extraction à partir de la muqueuse intestinale de porc.

Ces résultats démontrent p lus avant l'efficacité d 'expression d e la 3 OST1 r ésultant e n 25 l'apparition de Ilallsglu et l'activité biologique antiXa.

EXEMPLE 4: Obtention d'un clone MCpBXL2033 par clonage par dilution limite Les cellules PMC125 pBXL2033 ont été clonées par la technique de dilution limite. Pour cela, 20 plaques de 96 puits ont été ensemencées avec 0,3 cellule/100 pl/puits. Seuls les clones présentant une croissance en plaque 96 puits satisfaisante ont été retenus et amplifiés. Une fois à confluence, les clones ont été récupérés puis ensemencés en plaque 24 puits avec 0,5 ou 1 ml, en plaque 12 puits avec 2 ml de milieu puis en plaque 6 puits avec 4 ml de milieu et enfin en F25 avec 10 ml de milieu.

A l'issue de cette amplification, 156 clones ont été obtenus et amplifiés après numération 35 et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.

Une première analyse des protéoglycanes synthétisés a été réalisée par HPLC pour identifier les clones présentant une activité de 30 sulfatation. A l'issue de cette première étude, seuls 25 clones parmi les 156 testés étaient positifs en HPLC. Ces 25 clones ont ensuite été analysés pour déterminer l'activité biologique des protéoglycanes synthétisés.

A l'issue de cette seconde analyse, seuls dix neuf clones ont été conservés.

Les dix neuf clones sélectionnés à l'issue des deux analyses produisent des protéoglycanes présentant un niveau de 30 sulfatation augmenté Une étude comparative de la croissance a été réalisée à partir de la culture mère 10 PMC125pBXL2033 et de douze clones obtenus. Pour tous les clones étudiés on observe une prolifération cellulaire (Figure 5).

A l'issue de la courbe de croissance, des échantillons ont été prélevés pour analyser les protéoglycanes des différents clones.

L'analyse des protéoglycanes synthétisés par les clones en HPLC montrent que tous les clones produisent des protéoglycanes ayant en commun une 30 sulfatation mais variant dans leur composition (Tableau 4). De même, l'activité biologique anti-Xa des protéoglycanes varie, selon les clones analysés, entre 17 et 100 UI/mg (Tableau 5).

En considérant les critères de croissance, de qualité des protéoglycanes produits, le clone PMC125 pBXL2033 19-D4 a été retenu.

La stabilité du clone PMC125pBXL2033 19-D4 a été suivie pendant près de cinq mois. Ce suivi a montré que, des paramètres tels que la productivité (déterminé par analyse HPLC), le niveau de 30 sulfatation (déterminée par le suivi du tétrasaccharide llallsqlu) et l'activité biologique du produit étaient stables pendant cette période tout comme la croissance cellulaire (Figure 6).

% de MC MC pBXL Referenc disacchari pcDNA/Hygro 2015 e des + SCF - SCF IVa 8,3 8,5 6,0 IV-s 53,3 27,3 3,5 Il-a 1,2 2,6 4,2 III-a 0,1 0,4 1,0 11-s gal 2,0 Il-s 9,2 11,2 10,7 III-s 18,8 30,7 6,3 l-a 1,4 I-s 7,0 16, 6 56,3 1 -a 11-s glu 4,8 Tableau 1: Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par les MCpcDNA3.1/Hygro en présence de SCF et par les MCpBXL2015 dans un milieu 5 carencé en SCF.

% de MCpBXL20 clone 2- clone 10- clone 2- clone 3- clone 2- clone 8- clone 3- clone 6- clone 1- Reference disaccharides 15 F9 C12 H6 Cl0 F11 B2 H8 G4 A6 IV-a 9,8 14,8 11,6 13,9 7, 0 14,3 14,6 11,8 12,8 11,7 5,4 IV-s 32,8 20,2 27,2 15,6 56,4 12,3 18,2 19, 4 12,8 22,4 3,6 Il-a 1,0 1,2 1,3 1,9 0,4 5,4 0,6 2,4 7,0 2,6 4,1 III-a 0, 3 1,0 0,2 1,5 0,4 2,2 1,6 1,1 0,7 0,3 1,1 Il-s 10,9 5,1 13,3 4,6 4,4 5, 5 1,9 7,3 13,8 13,3 10,9 III-s 32,4 43,6 30,6 42,7 25,6 38,6 54,7 36,0 23, 3 26,0 6,4 1-a 0,0 0,0 0,1 0,0 0,0 0,4 0,0 0,0 0,3 0,2 1,4 I-s 12,8 14,1 15,7 19,7 5, 8 21,3 8,4 22,0 29,3 23,6 55,3 Il-a II-s qlu 4,9 Quantité 0,8 2,9 0,7 0, 6 0,8 0,7 0,5 2,6 3,2 héparinoïdes 2,1 (pg1106 cellules) Tableau 2: Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par la culture mère non cloné MCpBXL2015 et des différents clones obtenus par dilution limite, en milieu carencé en SCF.

HPLC Activité biologique Ilallsqlu Anti Xa (Ul/mg) Anti Ila (Ul/mg) Xa/lla PMC125pcDNA3.1 <.0,1 Non détectable Non détectable _ PMC125pBXL2033 0,9 60 80 0,8 Tableau 3: Analyse de la structure et de l'activité biologique des protéoglycanes 5 synthétisés par les cultures PMC125pcDNA3.1 et PMC125pBXL2033.

Disaccharide % Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Clone Référence 11 D5 2C3 20C4 9A10 4F4 4D5 1G12 12E5 5B12 19D4 7H3 2C7 7E5 IV-a 22,7 23, 8 19,4 16,2 20,0 16,9 17,2 20,5 21,7 14,1 15,8 26,1 24,8 3,4 IV-s 11-a 0,7 0,6 2,4 1,0 2,3 2,7 1,4 0,0 2,4 4,2 2,7 1,3 0,0 4,3 III-a 3,7 4, 0 3,9 2,1 1,7 3,8 2,6 3,5 2,3 2,3 2,6 4,9 0,9 1,3 Il-s gal 2,1 Il-s 5,2 3, 7 5,4 7,2 6,3 6,0 4,0 6,5 6,4 5,9 7,6 5,7 4,1 12,2 III-s 52,1 57,0 50, 4 56,8 44,3 47,3 54,9 58,1 38,7 41,4 49,9 49,2 23,1 7,1 -a 1,6 11-a IV-s qlu 1,9 0,0 2,1 1,5 3,4 2,8 4,5 0,0 2,6 8,0 2,5 1,0 0,0 0,0 I- s 13,1 10,9 15,7 14,3 20,8 19,3 14,4 11,4 24,6 21,3 17,9 11,9 4,3 62,4 Il- a 11-s qlu 0,76 <0,6 0,84 0,90 1,22 1,28 1,06 <0,8 1,26 2,85 1,07 <0,7 <0. 3 5,68 Quantité héparinoïdes 0,7 0,6 0,9 1,2 1,5 1,0 1,4 0,4 1,2 1,6 1, 2 0,5 0,7 (pg/106 cellules) Tableau 4: Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par les clones PMC125pBXL2033.

Clone Clone Clone. Clone Clone Clone. CloneClone Clone Clone Clone Clone Clone 11D5 2C3 20C4 9A10 4F4 4D5 5B12 19D4 7H3 2C7 7E5 1G12 12E5 Anti Xa 45, 8 65,8 44,6 31,3 73,7 48,8 53,4 58,8 77,9 122 46,9 33,1 17,4 (Ullmg) 45,8 65,8 44,6 25,6 76,2 54,2 47,5 45,8 86,6 129,2 39,7 33,1 17,4 Anti lla (Ul/mg) 1 1 1 1,2 1 0,9 1,1 12,3 0,9 0,9 1,2 1 1 Xa/Ila Tableau 5: Analyse de l'activité biologique des protéoglycanes synthétisés par les clones PMC125pBXL2033.

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Culture ou lignée de mastocytes porcins caractérisée en ce qu'elle produit d es 5 molécules de type héparine comprenant des tétrasaccharides Ila Ils glu.

2. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 50 Ul/mg.

3. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti Ila supérieure à au moins 50 Ul/mg.

4. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle surexprime une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.

5. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 4 20 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.

6. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3-25 OST.

7. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3-OST1.

8. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3-OST1 porcine.

9. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.

10. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c- kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin.

11. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 1 0 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c- kit G559 murin, c-kit G556 porcin ou c-kit 6560 humain.

12. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 1 1 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.

13. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 1 2 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit c559 murin.

14. Lignée de mastocytes porcins caractérisée en ce qu'elle est l'une des lignées de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 sous les n 12734, 1-2735 ou 1-2736 modifiée de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.

15. Lignée de mastocytes porcins selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.

16. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture d'une culture ou lignée de mastocytes porcins de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 15.