EP1846549A1 - Lignees de mastocytes porcins produisant des molecules de type heparine - Google Patents

Lignees de mastocytes porcins produisant des molecules de type heparine

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Publication number
EP1846549A1
EP1846549A1 EP05809321A EP05809321A EP1846549A1 EP 1846549 A1 EP1846549 A1 EP 1846549A1 EP 05809321 A EP05809321 A EP 05809321A EP 05809321 A EP05809321 A EP 05809321A EP 1846549 A1 EP1846549 A1 EP 1846549A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
culture
heparin
cells
porcine
line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05809321A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Marc Guillaume
Sandrine Perez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA, Aventis Pharma SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of EP1846549A1 publication Critical patent/EP1846549A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present application relates to porcine mast cell lines whose growth is independent of growth factors. It also relates to a method of producing bioactive heparin-like molecules comprising culturing these mast cell lines.
  • Mast cells are cells of the immune system, derived from hematopoietic precursors, which are involved in the inflammatory response, especially in the phenomena of allergy and hypersensitivity. They are located in the connective tissue, especially in the skin, intestinal and respiratory mucosa.
  • the mast cells are in the form of rounded cells with a diameter of about 5 to 25 ⁇ m and have a rounded, single, central or eccentric nucleus. They are also characterized by the presence of numerous meta-chromatic cytoplasmic granulations. These granules contain various molecular species having a pro ⁇ inflammatory activity such as histamine, serotonin, proteoglycans such as heparin or chondroitin sulfate, enzymes, cytokines and chemoattractant factors of eosinophils and neutrophils. These species are released during mast cell activation.
  • mediators such as leukotrienes, prostaglandins, PAF (platelet activating factor), interleukins (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 and IL13) takes place.
  • mediators such as leukotrienes, prostaglandins, PAF (platelet activating factor), interleukins (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 and IL13) takes place.
  • cytokines TGF beta, IFN gamma, GM-CSF
  • chemokines MCP-1, IL8, RANTES
  • Ashraf et al (Veterinary Parasitology, 29, 134-158, 1988) isolated pig mast cells from intestinal mucosa without maintaining amplifiable cultures. In addition, the characterization of isolated mast cells reveals the absence of heparin. Razin et al (J. Biol Chem., 257, 7229-7236, 1982) describe obtaining mouse mast cells using culture media containing IL3.
  • SCF growth factors
  • the SCF induces, following its fixation on its ckit receptor, various cellular responses such as proliferation, (differentiation, etc.).
  • the study of murine and human mastocytomas has identified mutations or deletions of the c-kit gene responsible for the constitutive activation of the c-kit receptor (ie without fixation of the SCF).
  • the expression of the c-kit gene mutated at V814 in immature mast cells IC2 induces the transformation of these cells, namely the acquisition of a growth independent of SCF and of a tumorigenic potential (Pia et al, Blood, 87). (8), 3117-3123, 1996).
  • Heparin belongs to the family of glycosaminoglycans (GAG), which groups linear polysaccharides containing a repetition of a disaccharide sequence consisting of an amino sugar (D-glucosamine or galactosamine) and a uronic acid (D-glucuronic acid). or L-iduronic).
  • GAG glycosaminoglycans
  • heparin which belongs, with heparan sulfate, to the sub-family of glucosaminoglycans
  • the amino sugar is D-glucosamine.
  • Uronic acid is either glucuronic acid (GIc) or iduronic acid (Ido).
  • Glucosamine can be N-acetylated, N-sulfated and O-sulfated.
  • heparin refers to highly sulphated polysaccharides in which more than 80% of the glucosamine residues are N-sulphated and the number of O-sulphate is greater than that of the N-sulphates.
  • the sulfate / carboxylate ratio is generally greater than 2 for heparin.
  • the structure of heparin is in fact very heterogeneous, and there are chains that can contain very different ratios.
  • heparin is synthesized as a proteoglycan mainly by mast cells.
  • the first step in heparin synthesis is the formation of the serglycine protein core, consisting of a repetition of serine and glycine residues.
  • the elongation of the heparin chain is done by adding a tetrasaccharide, then by successive additions of glucosamines and uronic acids, regularly alternated.
  • the proteoglycan thus formed undergoes numerous sequential transformations: N-deacetylation, N-sulfation, epimerization of D-glucuronic acid, and O-sulfation. However, this complete maturation takes place only on part of the proteoglycan, which generates a great structural variability of the heparin, responsible for its heterogeneity.
  • the polysaccharide chains are then cleaved from serglycine by an endoglucuronidase. These chains then have a molecular weight between 5000 and 30,000 Da. They form complexes with basic proteases and are thus stored in the mast cell granules. Heparin is excreted only during degranulation mastocytosis.
  • the present invention relates to cultures or lines of porcine mast cells characterized in that they produce heparin-type molecules comprising tetrasaccharides lia They glu.
  • these cultures or lines produce detectable amounts of tetrasaccharides lia They glu.
  • these cultures or lines produce heparin-like molecules containing tetrasaccharides which are present in amounts of at least 0.3%, 0.5%, 1% or 1.5% of the total saccharides.
  • these porcine mast cell cultures or lines produce heparin-like molecules having an anti-Xa activity greater than at least 50 IU / mg, preferably greater than 75 IU / mg, at 100 IU / mg or at 150 IU / mg.
  • these porcine mast cell cultures or lines produce heparin-like molecules having an anti-IIa activity of at least 50 IU / mg, preferably greater than 75 IU / mg, at 100 IU / mg or at 150 IU / mg.
  • heparin-type molecules comprising at least 30% of Is disaccharides (preferably at least 40%, more preferably at least 50%).
  • the lines according to the present invention are modified so as to overexpress an enzyme acting on the sulfation of heparin-like molecules.
  • said lines comprise an exogenous nucleic acid encoding an enzyme acting on the sulfation of heparin-like molecules.
  • the stable overexpression of an enzyme acting on the sulfation of heparin-like molecules makes it possible to increase the sulfation of the heparinic compounds, and consequently their biological activity.
  • the enzyme acting on the sulfation of heparin-like molecules is a 3-OST and particularly advantageously a 3OST1.
  • the enzyme acting on the sulfation of the heparin-type molecules is preferably the porcine 3OST1 having the sequence SEQ ID No. 6, and encoded by the sequence SEQ ID N5.
  • genes of other species coding for the expression of 3-0 sulfatase activity and having an identity of at least 80%, 90%, 95% or 99% identity.
  • nucleotides with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 5 Nucleic acids hybridizing under conditions of high stringency with a nucleic acid of sequence SEQ ID NO: 5 can also be used.
  • the porcine mast cell lines are modified so as to express a c-kit protein having a mutation or a deletion which makes it possible to overcome the SCF.
  • said lines comprise an exogenous nucleic acid encoding a c-kit protein having a mutation or a deletion.
  • the c-kit having a mutation or a deletion is advantageously a c-kit protein having a mutation at a position equivalent to that of the murine G559 c-kit.
  • He can be a protein c-kit with a mutation in a position equivalent to that of the c-kit G559 Wall nj j t e]
  • the murine G559 c-kit carrying a point mutation, preferentially that responsible for the modification of the glycine valine, having the sequence SEQ ID No. 2, and encoded by the sequence SEQ ID N 0 I II may also be the porcine G559 c-kit having the sequence SEQ ID No. 4, and encoded by the sequence SEQ ID No. 3.
  • nucleotide nucleic acid sequence SEQ ID No. 3 can be used. Nucleic acids hybridizing under conditions of high stringency with a nucleic acid of sequence SEQ ID No. 3 can also be used.
  • the Applicant has observed a heparin profile of the cells expressing the improved murine G559 c-kit compared to the cells not expressing the murine G559 c-kit, ie a different constitution of the heparin-like molecules produced by these cells.
  • c-kit protein having a point mutation responsible for the modification of aspartic acid to valine 814 or 816 respectively in mice and in humans.
  • the present invention relates to one of the porcine mast cell lines deposited with the Collection of Microorganism Cultures of the Institut Pasteur on October 17, 2001 under No. I-2734, I-2735 or I-2736 modified to express a c-kit protein with a mutation or deletion.
  • these lines comprise an exogenous nucleic acid encoding an enzyme acting on the sulfation of heparin-like molecules.
  • culture here refers, in general, to a cell or a set of cells cultured in vitro. A culture developed directly from a cell or tissue sample taken from an animal is referred to as "primary culture".
  • line is used from the moment when at least one passage, and generally several consecutive passages in subculture have been successfully performed, and designates any culture that is derived (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and
  • nucleic acid is used to refer to a DNA or an RNA.
  • nucleotide or amino acid sequences within the meaning of the present invention, can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence or polypeptide in the comparison window may thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleobase or amino acid residue is observed for the two (nucleic or peptide) sequences compared and then dividing the number of positions at which there is identity between the two bases. or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity can be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4 of February 1998 and BLAST 2.0.6 of September 1998), using exclusively the default parameters (S. F Altschul et al., J. Mol Biol., 1990 215: 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res 1997 25: 3389-3402).
  • the data used may be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under conditions of high stringency, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • hybridization conditions described above can be adapted as a function of the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or of the type of marking chosen, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions may for example be adapted to the teaching in the book of Hames and HIGGlNS (1985 ⁇ NucIeic acid hybridization: a practical approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) or in the work of F.AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY).
  • the present application is further related to a method for producing heparin-like molecules comprising culturing porcine mast cell cultures or lines as described above.
  • the lines according to the present invention are preferably cultured in a defined culture medium (MEM ⁇ / DMEM, RPMI, IMDM, etc.).
  • a defined culture medium MEM ⁇ / DMEM, RPMI, IMDM, etc.
  • the media can also be supplemented with bovine serum at a concentration of between 0.5% and 20% (v / v).
  • bovine serum in the culture media can be replaced by the use of a serum-free culture medium such as AIMV (INVITROGEN) so as to reduce the protein concentration of the medium and the risks associated with the use thereof.
  • AIMV AIMV
  • compounds of animal origin KAMBE et al., J. Immunol Methods, 240, 101-10, 2000).
  • Mast cells can be cultured using the techniques developed for the mass culture of eukaryotic cells, as described for example by Griffiths et al. (Animal CeII Biology, Eds Spier and Griffiths, Academy Press, London, vol.3, 179-220, 1986). Bioreactors with a capacity greater than several m 3 can be used as described by PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian CeII Culture, Eds Feder and Tolbert, Academy Press, Orlando, USA, 1985), or by MIZRAHI (Process Biochem, August, 9-12, 1983).
  • the culture can also be carried out in suspension or on a microcarrier according to the technique described by VAN WEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967). It is also possible to use batch culture systems, which are frequently used for eukaryotic cell cultures, because of their greater simplicity of implementation on an industrial scale (VOGEL and TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2 ⁇ d edition, Noys Publication, Westwood, New Jersey, USA, 1997). The cell densities obtained with these systems are generally between 10 6 and 5 x 10 6 cells / ml.
  • the productivity of the batch cultures can be advantageously increased by removing a portion of the bioreactor cells (70% to 90%) for the GAG extraction and heparin isolation operations and retaining the remaining cells within the same bioreactor to initiate a new culture.
  • the optimum parameters of the cell growth phase can be distinguished, from those allowing a greater accumulation of GAGs and heparin within the cells.
  • Continuous perfusion type culture systems with or without cell retention, can also be used (VELEZ et al., J. Immunol Methods, 102 (2), 275-278, 1987, CHAUBARD et al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000).
  • perfused culture systems that allow the cells to be retained inside the reactor, and that result in growth and production that is greater than that obtainable in batch.
  • the retention can be carried out by means of spin-filter, hollow fiber or solid matrix retention systems (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992, VELEZ et al., J. Immunol Methods, 102 (2), 275-278, 1987).
  • the cell densities obtained are generally between 10 7 and 5 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the bio-reactor culture makes it possible, through the use of online measurement sensors, to better control the physico-chemical parameters of cell growth: pH, pO2, Red / Ox, growth substrates such as vitamins, amino acids, carbon substrates (eg glucose, fructose, galactose), metabolites such as lactate or ammonia, etc.
  • the cells are harvested and separated from the culture medium, generally by centrifugation or filtration.
  • centrifugation systems can be used, for example those described by VOGEL and TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2 ⁇ d Edition, Noys Publication, Westwood, New Jersey, USA).
  • the tangential microfiltration can be carried out using membranes whose porosity is less than the mean diameter of the cells (5 to 20 ⁇ m) while allowing the passage of the other compounds in solution / suspension. .
  • the speed of the tangential flow and the pressure applied to the membrane will be chosen so as to generate little shear force (Reynolds number less than 5000 sec -1 ) in order to reduce membrane clogging and preserve the integrity of the cells during the separation operation.
  • membranes can be used, for example, spiral membranes (AMICON, MILLIPORE), flat membranes or hollow fibers (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
  • membranes whose porosity, charge or grafting makes it possible to carry out a separation and a first purification vis-à-vis any contaminants that may be present in the culture medium, such as cellular proteins, DNA , viruses or other macromolecules.
  • the heparin would have been released from the intracellular content, by degranulation or lysis of all or part of the mast cells, and is present in the culture medium at the time of the separation step.
  • the separation of the cells is combined with an ultrafiltration step on one or more membranes whose arrangement and porosity makes it possible to concentrate the heparin and to separate it from the other species present in the medium, by
  • the cut-off threshold of the membranes is preferably between 1000 and 5 kDa.
  • Membrane systems similar to those used for micro-filtration may be used, for example, spiral membranes, flat membranes or hollow fibers. It is advantageous to use membranes which make it possible to carry out a separation and a purification of heparin, because of their charge properties or the grafting of ligands having an affinity for heparin (for example antibody, ATIII, lectin).
  • the recovery of heparin from the mast cells can also be done after degranulation or lysis of the cells.
  • Degranulation can be caused by the binding of specific ligands to the receptors present on the surface of mast cells, for example the attachment of allergen-type agents (such as Fc fragment of IgE or analogs of this fragment) to the receptors.
  • allergen-type agents such as Fc fragment of IgE or analogs of this fragment
  • IgE mast cells Other agents may also induce degranulation of mast cells.
  • These agents can be classified into several categories such as cytotoxic agents, enzymes, polysaccharides, lectins, anaphylatoxins, basic compounds (compound 48/80, substance P, etc.), calcium (ionophore A23187, ionomycin, etc. ). [D. Lagunoff and T. W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23: 331-51].
  • the use of degranulation agent can be carried out repeatedly on the same cells maintained in culture. In this mode of production productivity is significantly increased by simplifying the harvesting process from the supernatant and by keeping the cells in culture.
  • mast cell degranulation can be induced, for example, by treatment of 2.10 6 cells / ml of mast cells with the ionophore A23187 at concentrations of between 1 and 100 ⁇ g / ml and reaction times. action varying from 1 minute to 4 hours.
  • the lysis of mast cells can be induced, for example, by osmotic shock using hypotonic or hypertonic solutions, by thermal shock (freezing / thawing), by mechanical shock (for example sonication or pressure variation), by action of agents.
  • thermal shock for example sonication or pressure variation
  • mechanical shock for example sonication or pressure variation
  • enzymatic lysis papain, trypsin, ...) or by combination of two or more of these methods.
  • the cell lysate can be subjected to one or more enzymatic digestions (pronase, trypsin, papain, etc.);
  • the heparin-protein bonds can be hydrolysed in an alkaline medium, in the presence of sulphates or chlorides;
  • the present invention also relates to heparin preparations that can be obtained from mast cell cultures by implementing a method according to the invention.
  • heparin preparations according to the invention which have biological properties comparable to those of the heparin preparations obtained in the prior art from animal tissues, can be used in all usual heparin applications.
  • Figure 1 Chemical structures of isaccharides Is, They NIs and IVs corresponding to sulfated N disaccharides of heparin, homologous disaccharides acetylated the IIa, IHa and.lva as well as tetrasaccharides IIa glu and Ha IVs glu.
  • Figures 2 molecular analysis of cultures MCpcDNA3.1 / Hygro and
  • Figure 2B RT-PCR performed in absence (-) or in the presence (+) of reverse transcriptase on 1 RNA extracted from control cultures MCpcDNA3.1 / Hygro (1) or cultures MCpBXL2015 (2) (C: control plasmid DNA pBXL2015).
  • Figure 3A Growth of MCpcDNA3.1 / Hygro Control Cells and Cells
  • FIG. 3B Comparison of the growth of MCpcDNA3.1 / Hygro control cells in the presence of SCF with MCpBXL2015 cells in medium without SCF.
  • Figure 5 Growth curve of the mother PM125 culture and clones PMC125 pBXL2033.
  • Figure 6 Study of the stability of proteoglycan production over time by clone PMC125 pBXL2033 19-D4. The mucus, extracted and analyzed under the same conditions as the cells is placed as a control.
  • the present invention is illustrated by the following implementation examples. These examples are purely illustrative and should not be considered as limiting.
  • Mast cells can be engineered by the introduction of an exogenous nucleic acid using, for example, transfection, electroporation, nucleoporation or infection techniques which will result in transient or stable expression of the nucleic acid.
  • ⁇ DN can be integrated into the cellular genome or maintained as an episome.
  • Stably transfected cells can be obtained using the nucleoporation method described below, by applying, 24 to 72 hours after the nucleoporation, a selection pressure (hygromycin, geneticin, blasticidine, puromycin or zeocin).
  • a selection pressure hygromycin, geneticin, blasticidine, puromycin or zeocin.
  • the resistance to the selection agent is conferred by the integration of the plasmid carrying the gene of interest and the resistance gene.
  • This method is used preferentially because it makes it possible to target the DNA directly in the nucleus.
  • mast cells in the exponential phase, preferably after 3 or 4 days of culture, are centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes and taken up in 100 ⁇ l of nucleofection solution (Amaxa, Kit 8351). 2 to 4 ⁇ g of pcDNA3.1-eGFP, a plasmid encoding GFP, are then added to the cell suspension. The cells are then transferred to the electroporation cuvette and subjected to electric shock by the use of a specific program (such as U14, U23 and U28 AMAXA).
  • a specific program such as U14, U23 and U28 AMAXA
  • the cells are then transferred into 2 ml of complete medium preheated to 37 ° C. and then incubated at 37 ° C., 5% CO 2.
  • the cells are harvested for fixation with paraformaldehyde (Prolabo) 1%. For this, the entire culture is centrifuged for 5 min at 1000 rpm. After removal of the supernatant, the cells are washed in 4 ml of 1x PBS and centrifuged again. The cell pellet is then taken up in 1 ml of paraformaldehyde 1%. The cells thus fixed are then analyzed by cytometer (Cytomics FC 500, Beckman Coulter)
  • the nucleoporation conditions described above make it possible to transfect porcine mast cells with a transfection efficiency of between 30% and 50% while obtaining a good cell viability, greater than 50%.
  • recombinant and deleted retroviral vectors can be used for replication.
  • pseudo-typed vectors can be used with the envelope glycoprotein of the vesicular stomatitis virus (VSV-G) which allows the production of pantropic retro viral vectors capable of infecting porcine cells.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus
  • the retroviral vector carrying the gene of interest to be expressed or integrated into the porcine mastocyte is initially produced with the aid of the packaging cell such as GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), which possesses the genetic elements for the production of the vector (gag and pol) with the exception of the gene for the production of the pseudo-typed envelope protein (env-VSV-G).
  • the packaging cells are cotransfected with the plasmid encoding the VSV-G envelope gene and a retroviral plasmid encoding the gene of interest under control of a promoter with or without selection gene.
  • the GP-293 cells are cultured 48 hours to 72 hours before transfection in order to be in the exponential phase of growth.
  • the culture medium is changed by fresh medium (15-20 ml per 10 6 cells), then 1 to 2 ml of solution containing the mixture of plasmid VSV-G (5 to 20 ⁇ g per 10 6 cells) and the plasmid carrying the gene of interest (10 to 30 ⁇ g per 10 6 cells) in pH7 calcium phosphate buffer are added dropwise into the culture medium (1 to 2 ml (Promega)
  • the cells are then incubated for 16-24 hours at 37 ° C or preferably at 32-35 ° C.
  • the culture medium is changed again with fresh medium.
  • the cells are incubated for an additional 48 hours at 32-35 ° C.
  • the culture supernatant containing the neo-formed retro-viral vectors is harvested.
  • Part of the packaging cell infection supernatant is aliquoted and frozen at -80 ° C., the other part is mixed with the mast cell culture medium in exponential growth growth phase.
  • mast cells in culture are centrifuged and resuspended in a medium containing 50% fresh medium and 50% infection supernatant.
  • Mast cells are incubated for 24 hours at 32-35 0 C, then the medium is changed again with fresh medium.
  • cytofluorimetry 48 to 72 hours after infection of the mast cells, samples are taken for cytofluorimetry analysis in the case of the control of infection with the fluorescent reporter gene GFP (Green Fluorescent Protein) or by PCR for infections with the gene of interest .
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the populations of transfected cells are then selected by adding in the culture medium the cytotoxic agent (Hygromycin, puromycin, G418, Zeocyne) for which only the mast cells transfected with the retro-viral vector carrying the gene of interest and the gene of resistance continue to grow.
  • the cytotoxic agent Hygromycin, puromycin, G418, Zeocyne
  • the selection agent can be removed from the culture medium while maintaining the expression of the gene of interest.
  • the retroviral vector produced in this way does not replicate in the host mast cell and therefore there is no production of replicative vectors.
  • the mast cells were transformed with the mutated c-kit gene.
  • the murine c-kit gene carrying a point mutation responsible for the modification of valine 559 to glycine was used.
  • the mast cells used for transfection are derived from a culture of porcine mast cells obtained from fetal liver as described in patent application WO 03/035853. This 1-2735 mast cell line was maintained in culture for 929 days in the presence of cytokines.
  • Mast cells are cultured in MEM ⁇ medium supplemented with 15% fetal calf serum (Hyclone), 2 mM glutamine (Invitrogen), 10 nM pGE2 (Sigma), 2 ng / ml rpIL-3 (Biotransplant) and 80 ng / ml rpSCF (Biotransplant).
  • This culture medium is called complete medium 1.
  • the cells are incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 and inoculated at 2.10 5 C / ml every 3-4 days.
  • the murine plasmid pEF-BOS-ckit G559 was obtained by cloning the XbaI fragment of the murine ckit gene mutated in the plasmid pEF-BOS (described by Mizushima and Nagata, Nucleic Acid).
  • the c-kit gene carries a point mutation responsible for the modification of valine 559 to glycine (gene noted c-kit G559 ). This mutation is analogous to the mutants c-kit G556 in pigs and c-kit G560 in humans.
  • the murine plasmid pEF-BOS-ckit G559 was digested with XbaI to obtain mutated murine cK12 G559 cDNA.
  • the cDNA fragment was cloned into the plasmid pcDNA3.1 (Invitrogen) at the XbaI site.
  • the plasmid obtained, after complete sequencing of the cDNA, was named pBXL2008.
  • Plasmid pBXL2008 was digested with XbaI to obtain the mutated murine ckit G559 cDNA.
  • the cDNA fragment was cloned into the plasmid pcDNA3.1 / Hygro (Invitrogen) at the XbaI site.
  • the resulting plasmid is called pBXL2015.
  • the cDNA fragment comprises the sequence SEQ ID NO :
  • the DNA preparations for the transfections were carried out with the kit "Endofree plasmid maxi” (Quiagen). Transfection-selection of a hygromycin resistant population
  • transfection medium MEM ⁇ supplemented with 2 mM glutamine, 10 nM PGE2, 80 ng / ml rpSCF and 2 ng / ml rplL3
  • 30 ⁇ g of pcDNA3.1 / Hygro or pBXL2015 are then added to the cell suspension.
  • the cells are then transferred to the electroporation cuvette and subjected to an electric shock of 960 ⁇ F, 340 V (Gene Pulser, Biorad).
  • the cells After electroporation, the cells are transferred into 5 ml of complete medium 1 preheated to 37 ° C. and then incubated at 37 ° C., 5% CO 2. 48 hours after transfection, the cells are digitized, centrifuged and inoculated at 2 ⁇ 10 5 C / ml in selection medium (complete medium 1 supplemented with hygromycin
  • a hygromycin-resistant cell population is obtained 16 days after application of the hygromycin selection.
  • Cells transfected stably with the plasmid pcDNA3.1 / Hygro are named MCpcDNA3.1 / Hygro; those stably transfected with plasmid pBXL2015 are named MCpBXL2015.
  • the cell cultures are maintained in culture in the selection medium.
  • Detection of the murine ckit G559 gene in MCpBXL2015 cells The detection of the murine ckit G559 gene was carried out by PCR from genomic DNA extracted from the MCpcDNA3.1 / Hygro and MCpBXL2015 cultures, using primers making it possible to specifically amplify the gene. murine without amplifying the endogenous porcine gene.
  • the genomic DNA was extracted from 5 ⁇ 10 6 cells from the MCpcDNA3.1 / Hygro and MCpBXL2015 cultures according to the Quiagen Dneasy Tissue kit protocol.
  • the detection of the expression of the ckit G559 gene was carried out by RT-PCR.
  • RNA was extracted from 10 7 cells from the MCpcDNA3.1 / Hygro and MCpBXL2015 cultures according to the Quiagen Rneasy mini kit protocol. 30 ⁇ g of RNA was then digested with 20 U of DNase I for 1 hour at 37 ° C. and then purified according to the "Cîeanup" protocol of the Quiagen Rneasy mini kit.
  • RNAs 2 .mu.l of these RNAs was reverse transcripted into cDNA with the AMV RT reverse transcriptase (Roche) using, as primer, the oligonucleotide of sequence SEQ ID No. 9 5'-gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv -3 '.
  • the PCR was performed on 1 .mu.l of cDNA under the conditions described in the previous paragraph.
  • the functionality of the ckit G559 was evaluated by analyzing the ability of cells to grow in a medium lacking SCF.
  • the control MCpcDNA3.1 / Hygro cells are not able to grow in such a medium: there is a stop growth followed by a large cell death (Figure 3A).
  • MCpBXL2015 cells there is an initial period of about three weeks during which growth is low ( Figure 3A). This latency period can be explained by the fact that not all cells, despite their resistance to hygromycin, express a functional G559 ckit murine receptor, which translates into a disability. to grow in the absence of SCF. After this latency phase, a population of MCpBXL2015 cells able to grow in the absence of SCF appears. This subpopulation was amplified after counting and seeding at 2.10 5 C / ml every 3-4 days for at least 11 weeks. Under these conditions, after seeding at 2.10 5 C / ml, the maximum cell density reached is between 4 to 10.10 5 cells / ml with an exponential phase doubling time of between 24 and 48 hours.
  • MCpBXL2015 cells in the absence of SCF, is identical to that of the control cells, MCpcDNA3.1 / Hygro, in medium supplemented with SCF (FIG. 3B).
  • the expression of the murine ckit G559 gene thus makes it possible to dispense with the SCF while maintaining the same level of growth.
  • the samples are treated as follows: Proteolysis: The cell samples, 2x10 6 cells, are centrifuged and rinsed twice in PBS buffer. Each pellet is taken up in 100 ⁇ l of distilled water added with 10 ⁇ l of alkalase (Novozymes) and then heated for 5 hours at 60 ° C. with stirring.
  • Proteolysis The cell samples, 2x10 6 cells, are centrifuged and rinsed twice in PBS buffer. Each pellet is taken up in 100 ⁇ l of distilled water added with 10 ⁇ l of alkalase (Novozymes) and then heated for 5 hours at 60 ° C. with stirring.
  • proteolysis step makes it possible to release the intracellular content and to dissociate the protein-polysaccharide bonds.
  • GAGs GlycoaminoGlycans
  • the GAGs are depolymerized with a mixture of heparinases I, 11 and III (Grampian enzymes). Each heparinase solution is adjusted to 0.5 IU / ml in phosphate buffer. Heparinase solution I, II, III is prepared by mixing 1/3 volume to volume of each heparinase solution. For 100 ⁇ l of sample to be analyzed, add
  • the samples are then analyzed by HPLC on Spherisorb SAX 5 ⁇ m, 250x3mm, Thermohypersil column.
  • 50 ⁇ l of sample are injected by analysis, the buffer of the mobile phase is composed of 2.5 mM Sodium Di Hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4, Prolabo) whose pH is adjusted to 2.9 with ortho-phosphoric acid (H 3 PO 4, Prolabo ).
  • the elution of the constituent disaccharides of the GAGs extracted from the cell samples is carried out in a gradient of 0 to 100% in 50 minutes of 2.5 mM Na 2 HPO 4 buffer and 1 M of perchlorate (NaClO 4, Prolabo).
  • the disaccharides are detected by their retention time and compared to a standard heparin sample (Aventis) in UV at 234 nM.
  • the MCpBXL2015 cells were cloned by the limiting dilution technique in medium without SCF. For this, 10 96-well plates were inoculated with 0.3 cells / 100 ⁇ l / well. Only clones with satisfactory 96-well plate growth were retained and amplified. Once at confluence, the clones were recovered and then seeded in a 48-well plate with 500 ⁇ l of medium and then in 6-well plate with 2 ml of medium and finally in F25 with 5 ml of medium. At the end of this amplification, nine clones were obtained and amplified after counting and seeding at 2.10 5 C / ml every 3-4 days.
  • the final choice of the clone was made after an analysis of the growth and composition of mast cell proteoglycans.
  • the clone MC pBXL2015 6-G4 was retained. This clone was frozen under the name of PMC 125.
  • the mast cells used are derived from the PMC125 culture described in Example 3.
  • the mast cells are cultured in MEM ⁇ medium supplemented with 15% fetal calf serum (Hyclone), 2 mM glutamine (Invitrogen), 2 ng / ml rplL-3 (Biotransplant). This culture medium is called culture medium 2.
  • the cells are incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 and passed every 3-4 days.
  • the plasmid HS3ST1-pE-IRES-neo2- coding for porcine 3-OST1 has been described in patent application PCT / FR04 / 00902 filed in the name of AVENTIS PHARMA SA. As a reminder, the plasmid HS3ST1-pE-IRES-neo2 was obtained as following. Isolation and sequencing of the 3 'coding sequence of the porcine 3-OST gene
  • the partial sequence of the porcine gene encoding 3-OST is available in an EST library (GenBank accession number BF075483). Alignment of this sequence with the human sequence shows that about 650 bp of the 3 'coding region is missing.
  • the missing portion of the porcine 3-OST gene was identified by combining RT-PCR and 3'-RACE using as RNA source porcine liver RNA isolated according to the Trizol kit protocol (Invitrogen)
  • RNA in cDNA was carried out following the protocol of the First Strand Synthesis Kit Sytem (Invitrogen), using as primer a mixture of the oligonucleotides BS02 and BS03 of respective sequences SEQ ID No. 5 ' GCA GCA GCC ACG TCG GG-3 'and SEQ ID No. 11 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3'.
  • the sequence of this fragment was used to generate 2 primers BS21 and BS22 to isolate, by 3'-RACE, the entire 3 'region.
  • the 3 'region of the gene encoding 3-OST was then amplified by 2 successive PCRs.
  • the first PCR was performed on 2 .mu.l of cDNA, obtained previously, with the BS21 sense primer of sequence SEQ ID No. 5'-GCA CCC CCA CGA GAT CGA C-3 'and a CDSIII antisense primer.
  • 30 thermal cycles were applied (10 sec of denaturation at 94 ° C., 30 sec of hybridization at 60 ° C. and 120 sec of elongation at 68 ° C.).
  • the second PCR was then carried out under the same conditions as the first PCR with 1 ⁇ l of product obtained from the first PCR using the BS22 sense primer of SEQ ID No. 16 5'-CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3 'sequence and the CDSIlI antisense primer.
  • RNA 2 ⁇ g were reverse transcribed into cDNA according to the protocol of the First Strand Synthesis Sytem kit of Invitrogen, using as primer a dT 24 oligonucleotide.
  • the gene encoding 3-OST was then amplified by two-step PCR.
  • the first PCR allowed to amplify the gene including a portion of the 3 'non-coding sequence of the gene, the second PCR then allowed to amplify the coding sequence using primers compatible with the Gateway system (Invitrogen)
  • the first PCR was carried out on 2 .mu.l of cDNA with a BS10 sense primer of the 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3 'sequence hybridizing specifically in the 5' noncoding region of the porcine 3-OST gene and a 5'-CAC CTA GTG TAC ACCACA ATT TAC-3 'anti-sense sequence BS30 primer specifically hybridizing 3' at the level of the RTU.
  • 35 thermal cycles were applied (10 sec of denaturation at 98 ° C., 30 sec of hybridization at 64 ° C. and 150 sec of elongation at 68 ° C.)
  • a second PCR is then carried out on 1 .mu.l of the PCR product in order to specifically amplify the coding phase.
  • the PCR program used is identical to that used for the first PCR.
  • the 1 kb PCR product was then cloned according to the procedure of the Gateway cloning technology kit, Invitrogen in the pE-IRES-neo2 episomal vector.
  • the porcine gene sequence was verified by sequencing.
  • the nucleotide sequence obtained is the sequence SEQ ID No. 5.
  • the deduced protein sequence is the sequence SEQ ID No. 6.
  • the porcine 3OST1 gene was amplified by PCR from plasmid HS3ST1-pE-IRES-neo2 in the presence of a C21755 sense primer of sequence SEQ ID No. 19 5'-CGC GGA TCC CAG CAT GGC CGC GCT GCT CC -3 and C21756 antisense primer of sequence SEQ ID NO: 5 CTA GTC TAG ATT AGT GCC AGT CAA ATG TTC -3 'according to Advantage 2GC PCR kit protocol (Clontech). After the 25 thermal cycles (30 sec of denaturation at 94 ° C., 45 sec of hybridization at 55 ° C.
  • the PCR reaction is purified according to the Quiaquick PCR kit protocol. Quiagen purification. The entire PCR product is then digested for 4 hours at 37 ° C. with BamHI and XbaI (Biolabs). The digestion product is then purified, after migration on 1% TBEIx agarose gel, according to the protocol of Quiaquick gel extraction Quiagen kit. The PCR product thus digested is cloned into the BamHI-Xba I open pcDNA3.1 / Hygro vector.
  • Plasmid pBXL2032 was digested with XbaI-BamHI to obtain 3OST1 porcine cDNA.
  • the cDNA fragment was cloned into the plasmid pcDNA3.1 (Invitrogen) opened by XbaI-BamHI.
  • the plasmid thus obtained was named pBXL2033.
  • the cells are digitized, centrifuged and inoculated at 2 ⁇ 10 5 C / ml in selection medium (culture medium 2 supplemented with geneticin (Invitrogen) at a concentration of 0.8 mg / ml).
  • selection medium culture medium 2 supplemented with geneticin (Invitrogen) at a concentration of 0.8 mg / ml.
  • a population resistant to geneticin was obtained 20 days after application of the selection.
  • PMC125 cells stably transfected with the plasmid pcDNA3.1 are named PMC125pcDNA3.1; those stably transfected with plasmid pBXL2033 are named PMC125pBXL2033.
  • the cell cultures are maintained in culture in the selection medium. Characterization, in HPLC, of proteoglycans contained in cultures
  • 3-OST1 The functionality of 3-OST1 was assessed by analyzing the level of sulfation of the proteoglycans produced by the control mast cells PMC125 pcDNA3.1 and mast cells PMC125 pBXL2033. The level of sulfation can be monitored by quantifying the amount of sulfalating developer llallas tetrasaccharide.
  • proteoglycans produced by the PMC125pcDNA3.1 control cells do not contain detectable amounts of llallsglu tetrasaccharide (Table 3).
  • proteoglycans synthesized by PMC125pBXL2033 cells contain 0.9% llallsglu indicative of a significant increase in the level of sulfation in these cultures.
  • the reaction takes place in three stages:
  • the amount of Paranitroaniline released is inversely proportional to the amount of heparin.
  • the anti-Xa or Anti-lla quantity is measured relative to a calibration line established with the standard SPIM (Standard International Heparin).
  • SPIM Standard International Heparin
  • the sensitivity of the method is 0.006 IU / ml.
  • the biological activity is expressed in IU / mg taking into account the quantification of disaccharides obtained by HPLC.
  • the biological activity of samples identical to those analyzed in HPLC 1 was determined.
  • proteoglycans synthesized by the PMC125pcDNA3.1 control cells do not exhibit any detectable biological activity.
  • the analysis of the proteoglycan activity produced by PMC125pBXL2033 cells reveals the presence of anti-Xa and anti-11a biological activity of between 60 and 80 IU / mg (Table 3). It is noted that at this stage of the culture, that is to say four days after seeding, the ratio between the two activities is close to 1, which is characteristic of the heparin resulting from extraction from the intestinal mucosa of pork.
  • PMC125 pBXL2033 cells were cloned by the limiting dilution technique. For this, 20 96-well plates were inoculated with 0.3 cells / 100 ⁇ l / well. Only clones with satisfactory 96-well plate growth were retained and amplified. Once at confluence, the clones were recovered and then seeded in a 24-well plate with 0.5 or 1 ml, in a 12-well plate with 2 ml of medium and then in a 6-well plate with 4 ml of medium and finally in F25 with 10 ml. of middle. At the end of this amplification, 156 clones were obtained and amplified after counting and inoculation at 2.10 5 C / ml every 3-4 days.
  • a first analysis of the synthesized proteoglycans was performed by HPLC to identify clones exhibiting sulfation activity. At the end of this first study, only 25 of the 156 clones tested were positive in HPLC. These clones were then analyzed for biological activity of the synthesized proteoglycans. At the end of this second analysis, only nineteen clones were retained. The nineteen clones selected at the end of the two analyzes produce proteoglycans with an increased level of sulfation.
  • Table 1 Analysis, by HPLC, of proteoglycans synthesized by MCpcDNA3.1 / Hygro in the presence of SCF and by MCpBXL2015 in a SCF-deficient medium.
  • Table 2 Analysis, by HPLC, of the proteoglycans synthesized by the uncloned MCPBXL2015 parent culture and the various clones obtained by limiting dilution, in a SCF-deficient medium.
  • Table 3 Analysis of the structure and biological activity of proteoglycans synthesized by cultures PMC125pcDNA3.1 and PMC125pBXL2033.
  • Table 5 Analysis of the biological activity of the proteoglycans synthesized by clones PMC125pBXL2033.

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Abstract

La présente demande a pour objet des lignées de mastocytes porcins dont la croissance est indépendante des facteurs de croissance. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine bioactive comprenant la mise en culture de ces lignées de mastocytes.

Description

LIGNEES DE MASTOCYTES PORCINS PRODUISANT DES MOLECULES DE TYPE HEPARINE
La présente demande a pour objet des lignées de mastocytes porcins dont la croissance est indépendante des facteurs de croissance. Elle est en outre relative à un procédé de production de molécules de type héparine bioactive comprenant la mise en culture de ces lignées de mastocytes.
Les mastocytes sont des cellules du système immunitaire, dérivés de précurseurs hématopoïétiques, qui interviennent dans la réponse inflammatoire, notamment dans les phénomènes d'allergie et d'hypersensibilité. Ils sont localisés dans le tissu conjonctif, notamment au niveau de la peau, des muqueuses intestinales et respiratoires.
Les mastocytes se présentent sous la forme de cellules arrondies d'un diamètre compris entre environ 5 à 25 μm et possèdent un noyau arrondi, unique, central ou excentré. Ils sont aussi caractérisés par la présence de nombreuses granulations cytoplasmiques méta-chromatiques. Ces granules renferment diverses espèces moléculaires ayant une activité pro¬ inflammatoire telles que l'histamine, la sérotonine, des protéoglycanes tels que l'héparine ou le chondroïtine sulfate, des enzymes, des cytokines et des facteurs chimioattractants des éosinophiles et des neutrophiles. Ces espèces sont libérées lors de l'activation mastocytaire. Après activation, une réponse secondaire se met en place durant laquelle a lieu la synthèse des médiateurs tels que les leucotriènes, les prostaglandines, le PAF (platelet activating factor), des interleukines (IL4, IL5, IL6, IL10, IL12 et IL 13), des cytokines (TGF beta, IFN gamma, GM-CSF) et des chimiokines (MCP-1 ,IL8, RANTES). L'ensemble de ces espèces participe au déclenchement d'un processus inflammatoire et à la mise en place d'une réponse immunitaire spécifique dépendante des lymphocytes T.
Des cultures de mastocytes ont déjà été obtenues chez l'homme, la souris et le porc. Chez le porc, des lignées de mastocytes porcins ont été établies par la mise en culture de cellules souches obtenues à partir de foie fœtal. Elles ont fait l'objet de la demande de brevet WO 03/035853 déposée aux noms de l'INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) et de l'ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE MAISONS ALFORT (ENVA). Trois lignées ont fait l'objet de dépôts auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 respectivement sous les n° I-2734, 1-2735 et I-2736. Ces cellules, immortalisées spontanément, ont été maintenues en culture pendant plus de 170 générations en présence de facteurs de croissance comme le rpSCF et le rplL3. Dans ces conditions, ces cellules sont capables de synthétiser des composés de type héparine. Ces lignées de mastocytes produisent des quantités importantes de molécules de type héparine.
La demande de brevet WO 03/035886 ayant pour objet un procédé de production d'héparine à partir de ces lignées a été déposée au nom d'Aventis Pharma S.A..
Chez le porc aussi Emery et al (Expérimental Hematology, 24, 927-935, 1996) ont maintenu, durant 7 semaines, des cultures de cellules obtenues à partir de moelle osseuse. Néanmoins il apparaît que les cultures obtenues sont des mélanges de divers types cellulaires et non des cultures homogènes ou des lignées de mastocytes. De plus ces cultures contiennent des cellules non-différenciées en cultures homogènes de mastocytes.
Ashraf et al (Veterinary Parasitology; 29, 134-158, 1988) ont isolé des mastocytes de porcs à partir de la muqueuse intestinale sans maintenir de cultures amplifiables. En outre la caractérisation des mastocytes isolés révèle l'absence d'héparine. Razin et al (J. Biol. Chem., 257, 7229-7236, 1982) décrivent l'obtention de mastocytes de souris en utilisant des milieux de culture contenant de I'IL3.
Wang et al (Cire. Res., 84, 74-83, 1999) décrivent l'isolement de mastocytes séreux obtenus à partir de cavités pleurales et péritonéales de rat. Diverses espèces moléculaires sont produites mais uniquement quand les mastocytes sont co-cultivés avec des cellules de muscle lisse aortique de rat. La demande WO99/26983 décrit des travaux proches, et est très peu précise quant à l'application à d'autres espèces.
Chez la souris des lignées cellulaires ont été établies (Montgomery et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11327-11331 , 1992 et demande WO90/14418) mais à partir de mastocytomes. Ces tumeurs sont extrêmement rares chez le porc. Chez l'homme l'obtention de cultures de mastocytes s'est révélée difficile. Elle a tout d'abord été permise par l'utilisation de système de co-culture avec des fibroblastes (Ishizaka et al, Current Opinion in Immunology, 5, 937-943, 1993). D'autres auteurs sont ensuite parvenus à obtenir des mastocytes à partir de cellules intestinales et à maintenir ces cellules en culture pendant environ 6 mois en présence de SCF (Bischoff et al, J. Immunol., 159, 5560-5567, 1997).
Les auteurs de ces différents articles n'ont reportée qu'une faible production de composés de type héparine, quand toutefois elle a été mesurée.
La plupart des cultures de mastocytes ont besoin de facteurs de croissance tel que le SCF pour une croissance optimale. Le SCF induit, suite à sa fixation sur son récepteur ckit, des réponses cellulaires variées comme la prolifération, (a différentiation, etc. L'étude de mastocytomes murin et humain a permis d'identifier des mutations ou délations du gène c-kit responsables de I'activation constitutive du récepteur c-kit (c'est à dire sans fixation du SCF). L'expression du gène c-kit muté au niveau du V814 dans des mastocytes immatures IC2 induit la transformation de ces cellules à savoir l'acquisition d'une croissance indépendante du SCF et d'un potentiel tumorigène (Pia et al, Blood, 87(8), 3117-3123, 1996).
L'héparine appartient à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides linéaires contenant une répétition d'une séquence disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique).
Dans Ie cas de l'héparine, qui appartient, avec l'héparane sulfate, à la sous-famille des glucosaminoglycanes Ie sucre aminé est la D-glucosamine. L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (GIc), soit l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N- acétylée, N-sulfatée et O-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme "héparine" des polysaccharides hautement sulfatés dans lesquels plus de 80% des résidus glucosamine sont N-sulfatés et le nombre de O-sulfate est plus important que celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/carboxylate est généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la structure de l'héparine est en fait très hétérogène, et il existe des chaînes pouvant contenir des rapports très différents.
Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée sous forme d'un protéoglycane essentiellement par les mastocytes.
La première étape de la synthèse de l'héparine est la formation du noyau protéique serglycine, constitué d'une répétition de résidus serine et glycine. L'élongation de la chaîne d'héparine se fait par ajout d'un tétrasaccharide, puis par ajouts successifs de glucosamines et d'acides uroniques, régulièrement alternés.
Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses transformations séquentielles: N- déacétylation, N-sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et O-sulfatation. Toutefois, cette maturation complète n'a lieu que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une grande variabilité structurale de l'héparine, responsable de son hétérogénéité. Les chaînes de polysaccharides sont ensuite clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et 30.000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases basiques et sont ainsi stockées dans les granules des mastocytes. L'héparine est excrétée uniquement lors de la dégranulation des mastocytθs.
L'héparine joue un rôle biologique important, notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent anticoagulant et antithrombotique. La majeure partie de l'héparine utilisée est isolée à partir de la muqueuse intestinale du porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur les différents procédés de préparation de l'héparine, cf. DUCLOS, « L'Héparine : fabrication, structure, propriétés, analyse »; Ed. Masson, Paris, 1984). L'analyse de la composition en disaccharides de l'héparine de porc après dépolymérisation par les héparinases I1 II et III, et chromatographie permet de différencier l'héparine des. autres glycosaminoglycanes. On distingue notamment huit principaux disaccharides (figure 1). L'analyse HPLC permet aussi de détecter la présence des tétrasaccharides Ha]]SgIu et llalVsglu (le surlignage symbolise une 30 sulfatation du disaccharide). La présence de ces tétrasaccharides est directement corrélée à la présence de site affin à I1ATHI. En effet, la 30 sulfatation du site affin à l'ATIII conduit à une digestion incomplète de ce site et donc à l'apparition des tétrasaccharides HaNsglu et llajVsglu. La 30 sulfatation du site affin à l'ATIII permet d'obtenir une héparine biologiquement active.
Les études mentionnées ci dessus ont permis l'isolement de lignées productrices. Il est néanmoins nécessaire de les améliorer afin de permettre leur utilisation industrielle. Il est en particulier souhaitable de rendre la croissance de ces lignées indépendante des facteurs de croissance et d'améliorer Ia bioactivité des molécules produites. La demanderesse a montré de manière surprenante qu'il est possible d'améliorer ces deux aspects par la transformation de lignée de mastocytes par des protéines c-kit mutantes et d'obtenir, par la surexpression de la protéine 3OST1 , des productions de molécules de type héparine présentant une bioactivité compatibles avec une production industrielle.
La présente invention a pour objet des cultures ou lignées de mastocytes porcins caractérisées en ce qu'elles produisent des molécules de type héparine comprenant des tétrasaccharides lia Ils glu. De manière avantageuse ces cultures ou lignées produisent des quantités détectables de tétrasaccharides lia Ils glu. De manière préférentielle ces cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine contenant des tétrasaccharides lia Ils glu dans des quantités d'au moins 0,3 %, 0,5 %, 1 % ou encore 1,5 % des saccharides totaux. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux ces cultures ou lignées de mastocytes porcins produisent des molécules de type héparine présentant une activité anti-Xa supérieure à au moins 50 Ul/mg, préférentiellement supérieure à 75 Ul/mg, à 100 Ul/mg ou à 150 Ul/mg.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux ces cultures ou lignées de mastocytes porcins produisent des molécules de type héparine présentant une activité anti lia supérieure à au moins 50 Ul/mg, préférentiellement supérieure à 75 Ul/mg, à 100 Ul/mg ou à 150 Ul/mg.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de telles cultures ou lignées produisent des molécules de type héparine comprenant au moins 30% de disaccharides Is (préférentiellement au moins 40%, encore plus préférentiellement au moins 50%).
Selon un mode de mise en œuvre préférentiel, les lignées selon la présente l'invention sont modifiées de manière à surexprimer une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.
De manière avantageuse îesdites lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine. La surexpression stable d'une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine permet d'augmenter la 30 sulfatation des composés hépariniques, et par conséquence leur activité biologique.
De manière avantageuse, l'enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine, est une 3-OST et de manière particulièrement avantageuse une 3OST1. L'enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine est préférentiellement la 3OST1 porcine présentant la séquence SEQ ID N°6, et codé par la séquence SEQ ID N5.
Alternativement, il est possible d'utiliser des gènes d'autres espèces codant pour l'expression de l'activité 3-0 sulfatase et présentant une identité d'au moins 80%, 90%, 95% ou 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°5. Des acides nucléiques s'hybridant en conditions de forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°5 peuvent aussi être utilisés.
De manière avantageuse les lignées de mastocytes porcins sont modifiées de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion permettant de s'affranchir du SCF. De manière avantageuse lesdites lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une protéine c-kit présentant une mutation ou une délation. Le c-kit présentant une mutation ou une délétion est avantageusement une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin. Il peut être ainsi une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murjnj te]|Θ gUe qU'une protéine c-kit G556 porcin ou c-kit G560 humain. Il est préférentiellement le c-kit G559 murin, portant une mutation ponctuelle, préférentiellement celle responsable de la modification de la valine en glycine, présentant la séquence SEQ ID N°2, et codé par Ia séquence SEQ ID N0I II peut être aussi le c-kit G559 porcin présentant la séquence SEQ ID N°4, et codé par la séquence SEQ ID N°3.
Du fait de la conservation inter espèce du gène c-kit, les gènes murins, humains, bovins ou tout autre gène présentant une identité d'au moins 80%, 90%, 95% ou 99%, d'identité en nucléotides avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 peut être utilisé. Des acides nucléiques s'hybridant en conditions dθ forte stringence avec un acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 peuvent aussi être utilisés.
De manière surprenante la demanderesse a observé un profil héparinique des cellules exprimant le c-kit G559 murin amélioré par rapport aux cellules n'exprimant pas le c-kit G559 murin, c'est à dire une constitution différente des molécules de type héparine produites par ces cellules.
Il est aussi possible d'utiliser une protéine c-kit présentant une mutation ponctuelle responsable de la modification de l'acide aspartique en valine 814 ou 816 respectivement chez la souris et chez l'homme. Enfin, on peut aussi utiliser le gène murin c-kit délété au niveau des acides aminés TQLPYDH 573 à 579, chez le porc cette délétion est analogue aux acides aminés 570 à 576, chez l'homme 574-580.
Plus particulièrement la présente invention est relative à l'une des lignées de mastocytes porcins déposées auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 sous les n° I-2734, I-2735 ou I-2736 modifiée de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion. Préférentiellement ces lignées comprennent un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine. Le terme « culture » désigne ici, de manière générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées in vitro. Une culture développée directement à partir d'un prélèvement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal est dénommée « culture primaire ».
Le terme « lignée » est employé à partir du moment où au moins un passage, et généralement plusieurs passages consécutifs en sous-culture ont été effectués avec succès, et désigne toute culture qui en est issue (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and
Developmental Biology, 26, 91-101 , 1990).
Le terme acide nucléique est employé pour désigner un ADN ou un ARN.
Avantageusement il est un ADN complémentaire ou génomique. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN.
A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de mars 1996, BLAST 2.0.4 de février 1998 et BLAST 2.0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence « requête » de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. La séquence requête et les bases de. données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible. Par « conditions d'hybridation de forte stringence » au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes :
1- Pré-hybridation des membranes et:
-Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (10mg/ml)+ 40 μl ADN placentaire humain (10mg/mi)
- Dénaturer 5 mn à 960C, puis plonger dans la glace le mélange.
- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés. - Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot I, selon la quantité de répétitions.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 950C. - Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.
3- Hybridation :
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages :
- Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer. - 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65°C.
- 2 fois 15 minutes à 65°C SSC 1X et SDS 0,1% à 65°C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nuciéotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier. Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGlNS (1985,κNucIeic acid hybridization : a practical approach", Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F.AUSUBEL et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).
La présente demande est de plus relative à un procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture de cultures ou lignées de mastocytes porcins tels que décrits ci-dessus.
Les lignées selon la présente invention sont de préférence cultivés dans un milieu de culture défini (MEMα/DMEM, RPMI, IMDM, ...).
Les milieux peuvent également être supplémentés avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre 0,5% et 20% (v/v).
L'addition de sérum bovin dans les milieux de culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à réduire la concentration protéique du milieu et les risques associés, à l'utilisation de composés d'origine animale (KAMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 2000).
Les mastocytes peuvent être cultivés en utilisant les techniques développées pour la culture en masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par GRIFFITHS et al. (Animal CeII Biology, Eds. Spier et Griffiths, Académie Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986). On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale Mammalian CeII Culture, Eds. Feder et Tolbert, Académie Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process Biochem, Août, 9-12, 1983).
La culture peut également être réalisée en suspension ou sur micro-support selon la technique décrite par VAN WEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967). On peut également utiliser des systèmes de culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour les cultures de cellules eucaryotes, du fait de leur plus grande simplicité de mise en œuvre à l'échelle industrielle (VOGEL et TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2πd édition, Noyés Publication, Westwood, New Jersey, U. S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et 5 x 106 cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être avantageusement augmentée en prélevant une partie des cellules du bioréacteur (70% à 90%) pour les opérations d'extraction des GAGs et d'isolement de l'héparine et en conservant les cellules restantes au sein du même bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer les paramètres optimum de la phase de croissance cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation de GAGs et d'héparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent également être utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD ét al., Gen. Eng. News, 20, 18-48, 2000).
Dans le cadre de Ia présente invention on peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés permettant la rétention des cellules à l'intérieur du réacteur, et aboutissant à une croissance et une production supérieure à celle pouvant être obtenue en batch. La rétention peut être effectuée par l'intermédiaire de systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-filter), fibres creuses ou matrice solide (WANG et al., Cytotechnology, 9, 41-49, 1992 ; VELEZ et al., J. Immunol. Methods, 102(2), 275-278, 1987)
Les densités cellulaires obtenues sont généralement comprises entre 107 et 5 x 107 cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance cellulaire : pH, pO2, Red/Ox, substrats de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats carbonés (par exemple glucose, fructose, galactose), métabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
II peut être envisagé d'augmenter quantitativement et qualitativement le contenu en molécules de type héparine des mastocytes suite à un traitement avec le sodium butyrate (Nakamura et al (Biochim.Biophys.Acta. 627, 60-70, 1980).
Après 3 à 14 jours de culture, de préférence après 3 à 5 jours, les cellules sont récoltées et séparées du milieu de culture, généralement par centrifugation ou filtration.
Différents systèmes de centrifugation peuvent être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2πd Edition, Noyés Publication, Westwood, New Jersey, U.S.A.).
Alternativement ou en combinaison avec la centrifugation, on peut effectuer la séparation par microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à 20μm) tout en permettant le passage des autres composés en solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à générer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds inférieur à 5000 sec"1) afin de réduire Ie colmatage des membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant l'opération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées, par exemple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE), des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON, MILLIPORE, SARTORIUS, PALL, GF).
5 On peut aussi choisir des membranes dont la porosité, la charge ou le greffage permet d'effectuer une séparation et une première purification vis-à-vis d'éventuels contaminants pouvant être présents dans le milieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN, virus ou autres macromolécules.
L'utilisation de membranes de porosité plus réduite peut aussi être envisagée dans le cas
10. où l'héparine aurait été libérée du contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout ou partie des mastocytes, et est présente dans le milieu de culture au moment de l'étape de séparation. Dans ce cas, la séparation des cellules est combinée à une étape ultrafiltration sur une ou plusieurs membranes dont l'agencement et la porosité permet de concentrer l'héparine et de la séparer des autres espèces présentes dans le milieu, en
15 fonction de la taille et du poids moléculaire, et éventuellement de la charge électrique ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en œuvre, le seuil de coupure des membranes est de préférence compris entre 1000 et 5 kDa. On peut utiliser des systèmes de membranes similaires à ceux employés pour la micro-filtration, par exemple, membranes spirales, 0 membranes planes ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser des membranes permettant d'effectuer une séparation et une purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de charge ou du greffage de ligands présentant une affinité pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine).
Toutefois, on préférera généralement utiliser des méthodes de production et de récolte 5 des cellules permettant de conserver l'héparine dans le contenu intracellulaire.
La récupération de l'héparine à partir des mastocytes peut aussi se faire après dégranulation ou lyse des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la fixation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents à la surface des mastocytes, par exemple la fixation d'agents de type 0 allergène (tels que fragment Fc des IgE ou analogues de ce fragment) sur les récepteurs
IgE des mastocytes. D'autres agents peuvent aussi induire une dégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être classés en plusieurs catégories telles que les agents cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques (composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T . W. Martin. 1983. Agents that release histamine from mast cells. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur les mêmes cellules maintenues en culture. Dans ce mode de production la productivité est augmentée de façon significative par la simplification du procédé de récolte à partir du surnageant et par le maintien en culture des cellules. Dans le cas particulier de l'ionophore A23187, la dégranulation des mastocytes peut être induite par exemple par traitement de 2.106 cellules/ml de mastocytes avec l'ionophore A23187 à des concentrations comprises entre 1 à 100 μg/ml et des temps d'action variant de 1 minute à 4 heures.
La lyse des mastocytes, peut être induite, par exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermique (congélation/décongélation), par choc mécanique (par exemple sonication ou variation de pression), par action d'agents chimiques (NaOH, THESIT™, NP40™, TWEEN 20™, BRIJ- 58™, TRITON X™-100,...) ou par lyse enzymatique (papaïne, trypsine,...) ou par combinaison de deux ou plusieurs de ces méthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité ci-dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine :
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc..) ;
- les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ;
- on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs-protéines.
On peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en œuvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
Les figures de la présente demande sont les suivantes :
• Figure 1 : structures chimiques des dïsaccharides Is, Ils NIs et IVs correspondant aux disaccharides N sulfatés de l'héparine, des disaccharides homologues acétylés la lia, IHa et.lva ainsi que des tétrasaccharides lia Ils glu et Ha IVs glu. • Figures 2 : analyse moléculaire des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et
MCpBXL2015.Figure 2A- PCR génomique.Figure 2B- RT-PCR réalisée en absence (-) ou en présence (+) de Reverse transcriptase sur de I1ARN extrait de cultures contrôles MCpcDNA3.1/Hygro (1) ou de cultures MCpBXL2015 (2).(C : ADN plasmidique pBXL2015 témoin). • Figure 3A : croissance des cellules contrôle MCpcDNA3.1/Hygro et des cellules
MCpBXL2015 en milieu sans SCF. Figure 3B : Comparaison de la croissance des cellules témoins MCpcDNA3.1/Hygro en présence de SCF avec les cellules MCpBXL2015 en milieu sans SCF.
• Figure 4 : Courbe de croissance de la culture MCpBXL2015 mère et des clones MCpBXL2015.
• Figure 5 : Courbe de croissance de la culture PM125 mère et des clones PMC125 pBXL2033.
• Figure 6 : Etude de la stabilité de la production de protéoglycanes au cours du temps par le clone PMC125 pBXL2033 19-D4. Le mucus, extrait et analysé dans les mêmes conditions que les cellules est placé comme témoin. La présente invention est illustrée par les exemples de mise en œuvre qui suivent. Ces exemples sont purement illustratifs et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Modification génétique des mastocytes
Les mastocytes peuvent être modifiés génétiquement par l'introduction d'un acide nucléique exogène en utilisant par exemple des techniques de transfection, d'électroporatlon, de nucléoporation ou d'infection ce qui résultera en l'expression transitoire ou stable de l'acide nucléique introduit. Dans le cas d'une expression stable, l'ÂDN peut être intégré dans le génome cellulaire ou être maintenu comme épisome.
1 Transfection par nucléoporation et électroporation.
Des cellules transfectées de manière stable peuvent être obtenues en utilisant la méthode de nucléoporation décrite ci-dessous, en appliquant, 24 à 72 heures après la nucléoporation, une pression de sélection (hygromycine, généticine, blasticidine, puromycine ou zeocine). La résistance à l'agent de sélection est conférée par l'intégration du plasmide porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance.
Nucléoporation
Cette méthode, est utilisée préférentiellement car elle permet de cibler l'ADN directement dans le noyau.
1 à 2.106 mastocytes, en phase exponentielle, préférentiellement après 3 ou 4 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 μl de solution de nucléofection (Amaxa, Kit 8351). 2 à 4 μg de pcDNA3.1-eGFP, plasmide codant pour la GFP, sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique par l'utilisation d'un programme spécifique (comme U14, U23 et U28 AMAXA)
Les cellules sont ensuite transférées dans 2 ml de milieu complet préchauffé à 370C puis incubées à 37°C, 5%CO2.
24 à 48 heures après la transfection, les cellules sont récoltées pour être fixées au paraformaldéhyde (Prolabo) 1 %. Pour cela, la totalité de la culture est centrifugée 5 min à 1000 rpm. Après élimination du surnageant, les cellules sont lavées dans 4 ml de PBS 1x puis centrifugées à nouveau. Le culot cellulaire est ensuite repris dans 1 ml de paraformaldéhyde 1 %. Les cellules ainsi fixées sont ensuite analysées au cytomètre (Cytomics FC 500, Beckman Coulter)
Les conditions de nucléoporation décrites ci-dessus permettent de transfecter les mastocytes de porc avec une efficacité de transfection comprise entre 30 à 50 % tout en obtenant une bonne viabilité cellulaire, supérieure à 50%.
Electroporation
1 à 5.106 cellules, en phase exponentielle, sont mises en contact avec 1 à 30 μg d'ADN. Les cellules, transférées dans une cuvette d'électroporation 4 mm, sont incubées 5 min dans la glace avant d'être électroporées à un voltage compris entre 150 V et 400 V avec une capacitance de 500 ou 960 μF (Gène Puiser II, Biorad) Après electroporation , les cellules sont à nouveau incubées 5 min dans la glace pour être finalement transférées dans 5 ml de milieu de culture complet et incubées à 370C, 5%CO2. Le processus de sélection de cellules ayant intégrées le transgène de façon stable utilise la même technique que décrit ci-dessus en utilisant la résistance conférée par l'intégration du plasmide à un agent de sélection.
2 Transfection par des vecteurs viraux, utilisation de vecteurs retro-vîraux pantropiques.
Alternativement aux méthodes de transfection par electroporation et nucléoporation, on peut utiliser des vecteurs retro-viraux recombinants et délétés pour la réplication. On peut par exemple utiliser des vecteurs pseudo typés avec la glycoprotéine d'enveloppe du vesicular stomatitis virus (VSV-G) qui permet la production de vecteurs retro-viraux pantropiques, capable d'infecter des cellules porcines.
Dans ce mode de transfection, le vecteur rétro-viral porteur du gène d'intérêt à exprimer ou intégrer dans le mastocyte porcin est produit dans un premier temps à l'aidé du cellule d'empaquetage telle que GP-293 (Clontech protocol ref PT 3132-1), qui possède les éléments génétique pour la production du vecteur {gag et pol) à l'exception du gène pour la production de la protéine d'enveloppe pseudo-typée (env- VSV-G).
Lors de la production du vecteur rétro-viral, les cellules d'empaquetage sont co- transfectées avec le plasmide codant pour le gène d'enveloppe VSV-G et un plasmide rétro-viral codant pour le gène d'intérêt sous contrôle d'un promoteur avec ou sans gène de sélection.
Pratiquement, les cellules GP-293 sont mises en culture 48h à 72 heures avant la transfection afin d'être en phase exponentielle de croissance. Le jour de la transfection, le milieu de culture est changé par du milieu frais (15-20 ml pour 106 cellules), puis 1 à 2 ml de solution contenant le mélange du plasmide VSV-G (5 à 20μg pour 106 cellules) et du plasmide porteur du gène d'intérêt (10 à 30 μg pour 106 cellules), en tampon pH7 phosphate de calcium sont ajoutés goutte à goutte dans le milieu de culture (1 à 2ml (Promega)
Les cellules sont ensuite remises à incuber pendant 16 à 24 heures à 37°C ou préférablement à une température comprise entre 32 et 35°C. Le milieu de culture est changé à nouveau avec du milieu frais. Les cellules sont incubées pendant 48 heures supplémentaires à 32-35 0C. A la fin de la période d'incubation, le surnageant de culture contenant les vecteurs rétro-viraux néo-formés est récolté. Une partie du surnageant d'infection des cellules d'empaquetage est aliquoté et congelé à -800C, l'autre partie est mélangée au milieu de culture des mastocytes en phase exponentielle de croissance de croissance. En pratique les mastocytes en culture sont centrifugés et resupendus dans un milieu contenant 50% de milieu frais et 50% de surnageant d'infection. Les mastocytes sont mis à incuber pendant 24 heures à 32-35 0C, puis le milieu est changé à nouveau par du milieu frais.
48 à 72 heures après l'infection des mastocytes, des échantillons sont prélevés pour analyser par cytofluorimetrie dans le cas du témoin d'infection avec le gène rapporteur fluorescent GFP (Green Fluorescent Protein) ou par PCR pour les infections avec le gène d'intérêt. Par cytofluorimetrie la mesure de l'efficacité de transfection est supérieure à 20% des cellules totales.
Les populations de cellules transfectés sont ensuite sélectionnées en ajoutant dans le milieu de culture l'agent cytotoxique (Hygromycine, puromycine, G418, Zeocyne) pour lequel seuls les mastocytes transfectés avec le vecteur retro-viral porteur du gène d'intérêt et du gène de résistance continuent à pousser. Par cette méthode le gène d'intérêt est intégré et s'exprime de manière stable.
Après sélection et clonage des populations, l'agent de sélection peut être enlevé du milieu de culture tout en conservant l'expression du gène d'intérêt. Le vecteur rétroviral produit de cette façon ne se réplique pas dans le mastocyte hôte et il n'y' a donc pas production de vecteurs réplicatifs.
Alternativement, on peut aussi utiliser des vecteurs pour lesquels l'expression est soumise à une induction du promoteur régulant l'expression du gène d'intérêt par un composé ajouté au moment voulu dans le milieu de culture. EXEMPLE 2: Génération d'une lignée capable de croître en absence de SCF par expression stable du gène c-kitG559 murîn
Afin d'obtenir des mastocytes de porc dont la croissance serait indépendante du SCF à long terme, les mastocytes ont été transformés avec le gène c-kit muté. Pour cela, on a utilisé le gène c-kit murin portant une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 559 en glycine (gène noté c-kitG559).
Les mastocytes utilisés pour la transfection sont issus d'une culture de mastocytes porcins obtenus à partir de foie fœtal comme décrit dans la demande de brevet WO 03/035853. Cette lignée de mastocytes 1-2735 a été maintenue en culture pendant 929 jours en présence de cytokines.
Les mastocytes sont cultivés en milieu MEMα complémenté avec 15% de sérum de veau fœtal (Hyclone), 2 mM glutamine (Invitrogen), 10 nM pGE2 (Sigma), 2 ng/ml rpIL-3 (Biotransplant) et 80 ng/ml rpSCF (Biotransplant). Ce milieu de culture est nommé milieu complet 1. Les cellules sont incubées à 370C sous 5% de CO2 et ensemencées à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.
Le plasmide pEF-BOS-ckitG559 murin a été obtenu par clonage du fragment Xbal du gène ckit murin muté dans le plasmide pEF-BOS (décrit par Mizushima et Nagata, Nucleic Acid
Res., 18(17):5322, 1990) ouvert à Xbal.
Le gène c-kit porte une mutation ponctuelle responsable de la modification de la valine 559 en glycine (gène noté c-kitG559). Cette mutation est analogue aux mutants c-kitG556 chez le porc et c-kitG560 chez l'homme.
Le plasmide pEF-BOS-ckitG559 murin a été digéré par Xbal pour obtenir I'ADNc murin ckitG559 muté. Le fragment d'ADNc a été clone dans le plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen) au niveau du site Xbal. Le plasmide obtenu, après séquençage complet de I'ADNc, a été nommé pBXL2008.
Le plasmide pBXL2008 a été digéré par Xbal pour obtenir I'ADNc murin ckitG559 muté. Le fragment d'ADNc a été clone dans le plasmide pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) au niveau du site Xbal. Le plasmide résultant est appelé pBXL2015.
Le fragment d'ADNc comprend la séquence SEQ ID N0I Les préparations d'ADN pour les transfections ont été réalisées avec le kit « Endofree plasmid maxi » (Quiagen). Transfection-Sélectîon d'une population résistante à l'hygromycine
5.106 mastocytes, en phase exponentielle, après 3 jours de culture, sont centrifugés à
1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 μl de milieu de transfection (MEMα complémenté avec 2mM glutamine, 10 nM PGE2, 80 ng/ml rpSCF et 2 ng/ml rplL3). 30 μg de pcDNA3.1/Hygro ou de pBXL2015 sont ensuite ajoutés à Ia suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique 960 μF, 340 V (Gène Puiser, Biorad).
Après l'électroporation, les cellules sont transférées dans 5 ml de milieu complet 1 préchauffé à 37°C puis incubées à 370C, 5%CO2. 48 heures après la transfection, les cellules sont numérées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml en milieu de sélection (milieu complet 1 supplémenté avec de l'hygromycine
(Invitrogen) à une concentration de 0,2 mg/ml).
Une population cellulaire résistante à l'hygromycine est obtenue 16 jours après application de la sélection à l'hygromycine. Les cellules transfectées stablement avec le plasmide pcDNA3.1/Hygro sont nommées MCpcDNA3.1/Hygro ; celles transfectées stablement avec le plasmide pBXL2015 sont nommées MCpBXL2015.
Les cultures cellulaires sont maintenues en culture dans le milieu de sélection.
Caractérisation moléculaire
Détection du gène ckitG559 murin dans les cellules MCpBXL2015 La détection du gène ckitG559 murin a été réalisée par PCR à partir d'ADN génomique extrait des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015, en utilisant des amorces permettant d'amplifier spécifiquement Ie gène murin sans amplifier le gène porcin endogène.
L'ADN génomique a été extrait à partir de 5.106 cellules issues des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 selon le protocole du kit Dneasy Tissue de Quiagen.
100 ng de ces ADN génomique ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens C19810 de séquence SEQ ID N°7 5'- GCC GAG GCC ACT CGC -3' et d'une amorce anti-sens C19814 de séquence SEQ ID N°8 5'- AGC CAT GTA CCG TCA CGC TG -3' d'après le protocole du kit Advantage 2GC PCR (Clontech). Après les 25 cycles thermiques (30 sec de dénaturation à 940C, 45 sec d'hybridation à 580C et 45 sec d'élongation à 680C), la réaction PCR a été analysée sur un gel d'agarose 2% TBE1X pour détecter le fragment amplifié de 325 pb. Dans ces conditions on observe un produit PCR d'environ 350 pb à partir de l'ADN génomique issu de la culture MCpBXL2015 et non pas avec l'ADN génomique issu de la culture MCpcDNA3.1/Hygro ce qui démontre la présence du gène ckitG559 murin (figure 2A).
Détection de l'expression du gène murïn ckitG559 dans les cellules MCpBXL.2015
La détection de l'expression du gène ckitG559 a été réalisée par RT-PCR.
L'ARN a été extrait à partir de 107 cellules issues des cultures MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 selon le protocole du kit Rneasy mini de Quiagen. 30 μg d'ARN a ensuite été digéré avec 20 U de DNase I 1 heure à 370C puis purifié selon le protocole « Cîeanup » du kit Rneasy mini de Quiagen.
2 μl de ces ARN a été reverse transcript en ADNc avec la reverse transcriptase RT AMV (Roche) en utilisant comme amorce l'oligonucléotide de séquence SEQ ID N°9 5'-gac cac gcg tat cga tgt cga ctt ttt ttt ttt ttt ttv-3'. La PCR a été réalisée sur 1 μl d'ADNc dans les conditions décrites dans le paragraphe précédent.
Dans ces conditions on observe un produit issu de la RT-PCR d'environ 350pb à partir de l'ARN issu de la culture MCpBXL2015 et non pas avec l'ARN issu de la culture MCpcDNA3.1/Hygro ce qui démontre que le gène ckitG559 murin est effectivement exprimé dans les cellules (Figure 2B).
Caractérisation de la croissance en absence de SCF
La fonctionnalité du ckitG559 a été évaluée en analysant la capacité des cellules à croître en milieu dépourvu de SCF.
Pour cela, 5 à 6 semaines après la transfection, une partie des cellules MCpcDNA3.1/Hygro et MCpBXL2015 a été ensemencée à 2.105 C/ml en milieu dépourvu de SCF. Deux fois par semaine et pendant trois semaines, le milieu est renouvelé avec du milieu frais.
Les cellules témoins MCpcDNA3.1/Hygro ne sont pas capables de pousser dans un tel milieu : on observe un arrêt de la croissance suivi d'une mort cellulaire importante (Figure 3A). Pour les cellules MCpBXL2015, on observe une période initiale d'environ trois semaines pendant laquelle la croissance est faible (Figure 3A). Cette période de latence peut s'expliquer par le fait que toutes les cellules n'expriment pas, malgré leur résistance à l'hygromycine, un récepteur murin ckitG559 fonctionnel ce qui se traduit par une incapacité à croître en absence de SCF. Après cette phase de latence, une population de cellules MCpBXL2015 capables de pousser en absence de SCF apparaît. Cette sous population a été amplifiée après numération et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours pendant au moins 11 semaines. Dans ces conditions, après ensemencement à 2.105 C/ml, la densité cellulaire maximale atteinte est comprise entre 4 à 10.105 cellules/ml avec un temps de doublement en phase exponentielle compris entre 24 et 48 heures.
La croissance des cellules MCpBXL2015, en absence de SCF, est identique à la celle des cellules contrôles, MCpcDNA3.1/Hygro, en milieu supplémenté en SCF (Figure 3B). L'expression du gène ckitG559 murin permet donc de s'affranchir du SCF tout en conservant le même niveau de croissance.
Caractérisatïon, en HPLC, des protéoglycanes contenus dans les cultures
L'étude de la croissance des cellules MCpBXL2015, dans un milieu carence en SCF, démontre que l'expression du récepteur ckitG559 permet de s'affranchir du SCF. Nous avons aussi étudié l'impact du retrait du SCF sur la production de protéoglycanes par les mastocytes.
Après cinq semaines de culture en absence de SCF, des échantillons de la culture MCpBXL2015 ont été prélevés pour analyser la composition en protéoglycanes des mastocytes selon le protocole décrit par Linhardt et al (Biomethodes, 9, 183-197, 1997).
Les échantillons sont traités de la façon suivante : Protéolyse : Les échantillons cellulaires, 2x106 cellules, sont centrifugés et rincés deux fois en tampon PBS. Chaque culot est repris dans 100μl d'eau distillée additionnés de 10μl d'alcalase (Novozymes) puis chauffé pendant 5 heures à 6O0C sous agitation.
Puis les échantillons sont dilués avec 200μI de tampon Tris 1OmM pH 7.0 (Prolabo) 0.5M
NaCI (Prolabo) avant d'être centrifugés pendant 10 minutes à 10.000 tr/min. L'étape de protéolyse permet de libérer le contenu intracellulaire et de dissocier les liaisons protéines-polysaccharides.
Extraction : Le surnageant de chaque échantillon est purifié par échange d'ions sur résine ammonium quaternaire SAX en format plaque 96 puits, 100mg/2ml
(Thermohypersil).. Après fixation et lavage en tampon Tris pH7, NaCI 0.5M, les Glyco- aminoglycans (GAGs) sont élues par 500 μl de tampon Tris pH7.0, NaCI 3M. Dessalage/concentration :
Les échantillons sont ensuite dessalés sur colonne de gel perméation (NAP-5,
Pharmacia) Après élution dans un volume de 1 ml, les échantillons sont concentrés par lyophilisation, puis repris dans 130μl d'eau distillée.
Dépolymérisation.
Pour l'analyse HPLC, les GAGs sont dépolymérisés par un mélange d'héparinases I, 11 et III (Grampian enzymes) Chaque solution d'héparinase est ajustée à 0.5UI/ml en tampon phosphate. La solution d'héparinases I, II, III est préparée en mélangeant 1/3 volume à volume de chaque solution d'héparinase. Pour 100 μl d'échantillon à analyser, on ajoute
15μl du mélange d'héparinase et 10μl de tampon acétate contenant 0.73 ml d'acide acétique 100% (Prolabo) 12.5mg d'albumine bovine (Sigma) et 39.5 mg d'acétate de calcium (Prolabo) pour 30 ml d'eau distillée.
Analyse HPLC.
Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC sur colonne Waters spherisorb SAX 5μm, 250x3mm, Thermohypersil. 50 μl d'échantillon sont injectés par analyse, le tampon de la phase mobile est composé de 2.5mM de Sodium Di Hydrogeno Phosphate (Na2HPO4, Prolabo) dont le pH est ajusté à 2.9 avec de l'acide ortho-phosphorique (H3PO4, Prolabo). L'élution des disaccharides constitutifs des GAGs extraits des échantillons cellulaires est réalisé dans un gradient de 0 à 100% en 50 minutes de tampon Na2HPO4 2.5 mM et 1 M de perchlorate (NaCIO4, Prolabo). Les disaccharides sont détectés par leur temps de rétention et par rapport à un échantillon d'héparine standard (Aventis) en UV à 234 nM.
Lorsque les MCpBXL2015 sont cultivées en absence de SCF, le profil héparinique est amélioré par rapport aux cellules témoin cultivées en présence de SCF. Sans que la demanderesse ne soit liée par une théorie particulière il est possible d'expliquer ce phénomène soit par la sélection cellulaire réalisée lors de l'obtention des cellules poussant en absence de SCF, soit par une différence de maturation des mastocytes en présence ou non de SCF. En effet, le SCF permet aux cellules de proliférer mais intervient aussi dans la différentiation cellulaire.
EXEMPLE 3 : Obtention d'un clone MCpBXL2015 par clonage par dilution limite
Les cellules MCpBXL2015 ont été clonées par la technique de dilution limite en milieu dépourvu de SCF. Pour cela, 10 plaques de 96 puits ont été ensemencées avec 0,3 cellule/100 μl/puits. Seuls les clones présentant une croissance en plaque 96 puits satisfaisante ont été retenus et amplifiés. Une fois à confluence, les clones ont été récupérés puis ensemencés en plaque 48 puits avec 500 μl de milieu puis en plaque 6 puits avec 2 ml de milieu et enfin en F25 avec 5 ml de milieu. A l'issue de cette amplification, neuf clones ont été obtenus et amplifiés après numération et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.
Le choix final du clone a été réalisé après une analyse de la croissance et de la composition en protéoglycanes des mastocytes.
Une étude comparative de la croissance a été réalisée à partir de la culture mère MCpBXL2015 et des neuf clones obtenus. L'ensemble des clones présente une croissance comparable à celle de la culture MCpBXL2015 non clonée (Figure 3). Après quatre jours de culture, des échantillons ont été prélevés afin d'analyser la composition en protéoglycanes des différents clones.
D'après les résultats HPLC résumés dans le tableau 2, les polysacharrides synthétisés par chaque clone présentent des caractéristiques de type héparine avec des variations dans les quantités relatives de chaque disaccharide constitutifs de la chaîne héparinique (par exemple, la proportion de disaccharide Is varie de 5 à 30 % selon les clones). Néanmoins, tous les clones, comme la population non clonée MXpBXL2015, présentent un niveau de 30 sulfatation situé en dessous du seuil de détection (tétrasaccharide llallsqlu non détectable).
En se basant sur les critères de productivité et de qualité pour la production d'héparinoides, le clone MC pBXL2015 6-G4 a été retenu. Ce clone a été congelé sous le nom de PMC 125.
EXEMPLE 4: Génération d'une lignée indépendante du SCF et possédant une activité de 30 sulfatation augmentée
Afin d'augmenter l'activité biologique des composés de type héparine issus des cultures de mastocytes, il est possible de surexprimer de façon stable le gène codant pour la 3- OST-1 (3 O-sulfatase-1). Dans cet exemple, nous avons utilisé le gène porcin.
Les mastocytes utilisés sont issus de la culture PMC125 décrite dans l'exemple 3.
Les mastocytes sont cultivés en milieu MEMά complémenté avec 15% de sérum de veau fœtal (Hyclone), 2 mM glutamine (lnvitrogen), 2 ng/ml rplL-3 (Biotransplant). Ce milieu de culture est nommé milieu de culture 2. Les cellules sont incubées à 370C sous 5% de CO2 et passées tous les 3-4 jours.
Le plasmide HS3ST1-pE-IRES-neo2- codant pour la 3-OST1 porcine a été décrit dans la demande PCT/FR04/00902 déposée au nom d'AVENTIS PHARMA S.A. Pour rappel le plasmide HS3ST1-pE-IRES-neo2 a été obtenu comme suit. Isolement et séquençage de la séquence 3' codante du gène 3-OST porcin
La séquence partielle du gène porcin codant pour la 3-OST est disponible dans une banque EST (GenBank accession number BF075483). L'alignement de cette séquence avec la séquence humaine montre qu'il manque environ 650 pb de la région codante en 3'.
La portion manquante du gène 3-OST porcin a été identifiée en combinant la RT-PCR et le 3'-RACE en utilisant comme source d'ARN, des ARN de foie de porc isolés d'après le protocole du kit Trizol (Invitrogen)
La transcription inverse de 2 μg d'ARN totaux en ADNc a été effectuée en suivant le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem (Invitrogen), en utilisant comme amorce un mélange des oligonucléotides BS02 et BS03 de séquences respectives SEQ ID N°10 5'- GCA GCA GCC ACG TCG GG-3' et SEQ ID N°11 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC- 3'.
2 μl de ces ADNc ont ensuite été amplifiés par PCR en présence d'une amorce sens BS05 de séquence SEQ ID N°12 5'-CGG NGA CCG CCT NAT CAG-3' et d'une amorce anti-sens BS06 de séquence SEQ ID N°13 5'-TCA GTG YCA GTC RAA TGT TC-3' avec la KOD hot start Polymerase (Novagen). Après les 30 cycles thermiques (15 sec de dénaturation à 980C, 30 sec d'hybridation à 60°C et 30 sec d'élongation à 68°C), le fragment amplifié de 277 pb a été clone dans le vecteur pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit) puis séquence.
La séquence de ce fragment a été utilisée pour générer 2 amorces BS21 et BS22 pour isoler, par 3'-RACE, la totalité de la région 3'.
Dans le cadre du 3'-RACE, 1 μl d'ARN porcin de foie a été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce l'oligodT CDSIlI de séquence SEQ ID N°14 (5'-ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG TVN-3').
La région 3' du gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par 2 PCR successives. La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc, obtenu précédemment, avec l'amorce sens BS21 de séquence SEQ ID N°15 5'-GCA CCC CCA GAT CGA CCC C-3' et une amorce anti-sens CDSIII. 30 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 94°C, 30 sec d'hybridation à 6O0C et 120 sec d'élongation à 680C). La seconde PCR a ensuite été réalisée dans les mêmes conditions que la première PCR avec 1 μl de produit issu de la première PCR en utilisant l'amorce sens BS22 de séquence SEQ ID N°16 5'- CAA ACT CCT CAA TAA ACT GCA CG-3' et l'amorce anti-sens CDSIlI.
Le séquencage du produit PCR ainsi obtenu à l'issue du 3'-RACE a permis d'identifier la séquence 3' de la 3-OST porcine ainsi qu'environ 250 pb de la région non codante.
Isolement de la phase codante complète du gène 3-QST porcin.
Afin de cloner la phase codante complète de Ia 3-OST porcine, une nouvelle expérience de RT-PCR a été réalisée en utilisant les informations obtenues dans la première étape. La source d'ARN est la même que dans l'étape précédente.
2 μg d'ARN ont été reverse transcrit en ADNc d'après le protocole du kit First Strand Synthesis Sytem de Invitrogen, en utilisant comme amorce un oligonucléotide dT24.
Le gène codant pour la 3-OST a été ensuite amplifié par PCR en deux étapes. La première PCR a permis d'amplifier le gène y compris une portion de la séquence 3' non codante du gène, la seconde PCR a ensuite permis d'amplifier la séquence codante en utilisant des amorces compatibles avec le système Gateway (Invitrogen)
La première PCR a été réalisée sur 2 μl d'ADNc avec une amorce sens BS10 de séquence 5'-AGG CCC GTG ACA CCC ATG AGT-3' s'hybridant spécifiquement dans la région 5' non codante du gène 3-OST porcin et une amorce BS30 anti-sens de séquence 5'-CAC CTA GTG TAC ACC ACA ATT TAC-3' s'hybridant de façon spécifique en 3' au niveau de l'UTR. 35 cycles thermiques ont été appliqués (10 sec de dénaturation à 98°C, 30 sec d'hybridation à 64°C et 150 sec d'élongation à 680C)
Une seconde PCR est ensuite réalisée sur 1 μl du produit PCR afin d'amplifier spécifiquement la phase codante. Pour cela, nous utilisons l'amorce sens BS31 de séquence SEQ ID N°17 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTC AGC ATG GCC GCG CTG CTC 3' et l'amorce anti-sens BS32 de séquence SEQ ID N°18 5' GGG ACC ACT TTG TAC AAG AAA GCT GGG TTT AGT GCC AGT CAA ATG TTC TGC C 3'. Le programme PCR utilisé est identique à celui utilisé pour la première PCR. Le produit PCR de 1 kb a ensuite été clone d'après la procédure du kit Gateway cloning technology, Invitrogen dans le vecteur épisomal pE-IRES-neo2. La séquence du gène porcin a été vérifiée par séquencage. La séquence nucléotidique obtenue est la séquence SEQ IDN°5. La séquence protéique déduite est la séquence SEQ IDN°6 .
Obtention du plasmide pBXL2033 Le gène 3OST1 porcin a été amplifié par PCR à partir du plasmide HS3ST1-pE-IRES- neo2 en présence d'une amorce sens C21755 de séquence SEQ ID N°19 5'- CGC GGA TCC CAG CAT GGC CGC GCT GCT CC -3' et d'une amorce anti-sens C21756 de séquence SEQ ID N°20 5'- CTA GTC TAG ATT AGT GCC AGT CAA ATG TTC -3' d'après le protocole du kit Advantage 2GC PCR (Clontech). Après les 25 cycles thermiques (30 sec de dénaturation à 94°C, 45 sec d'hybridation à 550C et 45 sec d'élongation à 68°C), la réaction PCR est purifiée d'après le protocole du kit Quiaquick PCR purification de Quiagen. La totalité du produit PCR est ensuite digéré 4 heures à 37°C par BamHI et Xbal (Biolabs). Le produit de digestion est ensuite purifié, après migration sur gel d'agarose 1% TBEIx, d'après le protocole du kit Quiaquick gel extraction de Quiagen. Le produit PCR ainsi digéré est clone dans le vecteur pcDNA3.1/Hygro ouvert à BamHI-Xbal.
Le plasmide obtenu, après séquençage complet de l'ADNc, a été nommé pBXL2032. Le plasmide pBXL2032 a été digéré par Xbal-BamHI pour obtenir l'ADNc porcin 3OST1. Le fragment d'ADNc a été clone dans le plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen) ouvert par Xbal- BamHI. Le plasmide ainsi obtenu a été nommé pBXL2033.
Les préparations d'ADN pour les transfections ont été réalisées avec le kit « Endotoxin free plasmid » (Quiagen).
Transfection-Sélection d'une population résistante à la généticine 5.106 mastocytes, en phase exponentielle, après 3 jours de culture, sont centrifugés à 1000 rpm 5 minutes et repris dans 100 μl de solution de nucléoporation 8351 (Amaxa). 4μg de pcDNA3.1 ou de pBXL2033 sont ensuite ajoutés à la suspension cellulaire. Les cellules sont alors transférées dans la cuvette d'électroporation et soumises à un choc électrique : programme U-28 (Nucleofector, Amaxa). Après l'électroporation, les cellules sont transférées dans 2 ml de milieu de culture 2 préchauffé à 370C puis incubées en plaque 6 puits à 37°C, 5%CO2. 48 heures après la transfection, les cellules sont numérées, centrifugées et ensemencées à 2.105 C/ml en milieu de sélection (milieu de culture 2 supplémenté avec la généticine (Invitrogen) à une concentration de 0,8 mg/ml). Une population cellulaire résistante à la généticine a été obtenue 20 jours après application de la sélection. Les cellules PMC125 transfectées de manière stable avec le plasmide pcDNA3.1 sont nommées PMC125pcDNA3.1 ; celles transfectées de manière stable avec le plasmide pBXL2033 sont nommées PMC125pBXL2033. Les cultures cellulaires sont maintenues en culture dans le milieu de sélection. Caractérisation, en HPLC, des protéoglycanes contenus dans les cultures
La fonctionnalité de la 3-OST1 a été évaluée par l'analyse du niveau de 30 sulfatation des protéoglycanes produits par les mastocytes contrôles PMC125 pcDNA3.1 et les mastocytes PMC125 pBXL2033. Le niveau de 3O sulfatation peut être suivi en quantifiant la quantité de tétrasaccharide llallsglu révélateur de la 30 sulfatation.
Pour cela, trois semaines après l'application de la sélection, des échantillons ont été prélevés 4 jours après ensemencement des cultures à 2.105 C/ml. Les protéoglycanes produits par les cellules témoin PMC125pcDNA3.1 ne contiennent pas de quantités détectables de tétrasaccharide llallsglu (tableau 3). En revanche, les protéoglycanes synthétisés par les cellules PMC125pBXL2033 contiennent 0,9% de llallsglu révélateur d'une augmentation significative du niveau de 30 sulfatation dans ces cultures.
Ces résultats démontrent que la 3OST1 porcine surexprimée dans les mastocytes est fonctionnelle c'est à dire qu 'elle induit une 3-0 sulfatation. L'activité biologique de ces échantillons a ensuite été examinée. Pour cela, une mesure de l'activité anti-Xa et anti-lla a été réalisée.
Caractérisation de l'activité biologique des protéoglycanes contenus dans la culture
L'inactivation des facteurs Xa et lia est caractéristique de l'héparine et permet de la différencier de l'héparane sulfate et du dermatane. La méthode utilisée est celle décrite dans la monographie de la pharmacopée Européénene 3ieme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes :
1 : ATIII + héparine [ ATIII - Héparine]
2 : [ATlII - Héparine] + Facteur en excès [ATIII-Heparine-Facteur] + Facteur résiduel
3 : Facteur résiduel + Substrat chromophore Para-nitroaniline coloré
La quantité de Paranitroaniline libérée est inversement proportionnelle à la quantité d'héparine.
La quantité anti-Xa ou Anti-lla est mesurée par rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard SPIM ( Standard International Héparine) La sensibilité de la méthode est de 0.006UI/mI.
L'activité biologique est exprimée en Ul/mg en tenant compte de Ia quantification des disaccharides obtenue par HPLC. L'activité biologique d'échantillons, identiques à ceux analysés en HPLC1 a été déterminée.
Les protéoglycanes synthétisés par les cellules témoin PMC125pcDNA3.1 ne présentent pas d'activité biologique détectable. En revanche, l'analyse de l'activité des protéoglycanes produits par les cellules PMC125pBXL2033 révèle la présence d'activité biologique anti-Xa et anti-lla comprise entre 60 à 80 Ul/mg (Tableau 3). On remarque que, à ce stade de la culture c'est à dire quatre jours après l'ensemencement, le ratio entre les deux activités est proche de 1, ce qui est caractéristique de l'héparine issue de l'extraction à partir de la muqueuse intestinale de porc.
Ces résultats démontrent plus avant l'efficacité d'expression de la 3OST1 résultant en l'apparition de llallsglu et l'activité biologique antiXa.
EXEMPLE 4 : Obtention d'un clone MCpBXL2033 par clonage par dilution limite
Les cellules PMC125 pBXL2033 ont été clonées par la technique de dilution limite. Pour cela, 20 plaques de 96 puits ont été ensemencées avec 0,3 cellule/100 μl/puits. Seuls les clones présentant une croissance en plaque 96 puits satisfaisante ont été retenus et amplifiés. Une fois à confluence, les clones ont été récupérés puis ensemencés en plaque 24 puits avec 0,5 ou 1 ml, en plaque 12 puits avec 2 ml de milieu puis en plaque 6 puits avec 4 ml de milieu et enfin en F25 avec 10 ml de milieu. A l'issue de cette amplification, 156 clones ont été obtenus et amplifiés après numération et ensemencement à 2.105 C/ml tous les 3-4 jours.
Une première analyse des protéoglycanes synthétisés a été réalisée par HPLC pour identifier les clones présentant une activité de 30 sulfatation. A l'issue de cette première étude, seuls 25 clones parmi les 156 testés étaient positifs en HPLC. Ces 25 clones ont ensuite été analysés pour déterminer l'activité biologique des protéoglycanes synthétisés. A l'issue de cette seconde analyse, seuls dix neuf clones ont été conservés. Les dix neuf clones sélectionnés à l'issue des deux analyses produisent des protéoglycanes présentant un niveau de 30 sulfatation augmenté
Une étude comparative de la croissance a été réalisée à partir de la culture mère PMC125pBXL2033 et de douze clones obtenus.
Pour tous les clones étudiés on observe une prolifération cellulaire (Figure 5).
A l'issue de la courbe de croissance, des échantillons ont été prélevés pour analyser les protéoglycanes des différents clones. L'analyse des protéoglycanes synthétisés par les clones en HPLC montrent que tous les clones produisent des protéoglycanes ayant en commun une 30 sulfatation mais variant dans leur composition (Tableau 4). De même, l'activité biologique anti-Xa des protéoglycanes varie, selon les clones analysés, entre 17 et 100 Ul/mg (Tableau 5).
En considérant les critères de croissance, de qualité des protéoglycanes produits, le clone PMC125 pBXL2033 19-D4 a été retenu.
La stabilité du clone PMC125pBXL2033 19-D4 a été suivie pendant près de cinq mois. Ce suivi a montré que, des paramètres tels que la productivité (déterminé par analyse HPLC), le niveau de 30 sulfatation (déterminée par le suivi du tétrasaccharide IlaHsgJu) et l'activité biologique du produit étaient stables pendant cette période tout comme la croissance cellulaire (Figure 6).
Tableau 1 : Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par les MCpcDNA3.1/Hygro en présence de SCF et par les MCpBXL2015 dans un milieu carence en SCF.
Tableau 2 : Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par la culture mère non clone MCpBXL2015 et des différents clones obtenus par dilution limite, en milieu carence en SCF.
HPLC Activité biologique
Ilallsqlu Anti Xa (Ul/mg) Anti lia (Ul/mg) Xa/lla
PMC125pcDNA3.1 < 0,1 Non détectable Non détectable -
PMC125pBXL2033 0,9 60 80 0,8
Tableau 3 : Analyse de la structure et de l'activité biologique des protéoglycanes synthétisés par les cultures PMC125pcDNA3.1 et PMC125pBXL2033.
UJ
Tableau 4 : Analyse, par HPLC, des protéoglycanes synthétisés par les clones PMC125pBXL2033.
Tableau 5 : Analyse de l'activité biologique des protéoglycanes synthétisés par les clones PMC125pBXL2033.

Claims

REVENDICATIONS
1. Culture ou lignée de mastocytes porcins caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine comprenant des tétrasaccharides lia Ils glu.
2. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anϋ-Xa supérieure à au moins 50 Ul/mg.
3. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle produit des molécules de type héparine présentant une activité anti lia supérieure à au moins 50 Ul/mg.
4. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle surexprime une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.
5. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.
6. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3- OST.
7. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3-
OST1.
8. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une 3- OST1 porcine.
9. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.
10. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin.
11. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce qu'elle exprime une protéine c-kit G559 murin, c-kit G556 porcin ou c-kit G560 humain.
12. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.
13. Culture ou lignée de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une protéine c-kit présentant une mutation à une position équivalente à celle du c-kit G559 murin.
14. Lignée de mastocytes porcins caractérisée en ce qu'elle est l'une des lignées de mastocytes porcins déposée auprès de la Collection de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur le 17 octobre 2001 sous les n° I-2734, I-2735 ou I-2736 modifiée de manière à exprimer une protéine c-kit présentant une mutation ou une délétion.
15. Lignée de mastocytes porcins selon la revendication 14 caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique exogène codant une enzyme agissant sur la sulfatation des molécules de type héparine.
16. Procédé de production de molécules de type héparine comprenant la mise en culture d'une culture ou lignée de mastocytes porcins de mastocytes porcins selon l'une des revendications 1 à 15.
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