JPH02200189A - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコートする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドを有する遺伝子に関する。

インターロイキ７２（以下、ｒｌＬ−２Ｊと略記する。

）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶
性たんばく　（一般には「リンホカイン」として知られ
ている）である（Ｍｏｒｇａｎら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　凹、　１００７〜１００８（１９７
６）、　Ｇ１１ｌｔｓら、Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．、１２０．　２０２７〜２０３３（１
９７８））、ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節でき、
抗原特異的なエフェクターニーリンパ球のｉｎ　ｖｉＬ
ｒｏにおける長期培養を可能ならしめることができる（
Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅｒ腸、１５４〜１５６
　（１９７７）　）。またＩＬ−２は、胸腺細胞の分裂
の促進（Ｃｈｅｎ、ら、　Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１
．＋２２＋　２２１〜２２４（１９７７）、　５ｈａ−
ら、　Ｊ、Ｉｎｕｉｕｎｏｌ、、　１２０．　１９６７
〜１９７３　（１９７Ｂ）　）、ヌードマウスの肺細胞
の培養系での細胞障害性１９２８球活性（Ｗａｇｎｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８４＋２７８〜２８０．　（１９
８０）　）や抗−５ＲＢＣプラ一ク形成細胞反応の誘導
（Ｇｉｌｌｉｓら、　　Ｊ、　ＥｘｐｌＭｅｄ、　１４
９．１９６０〜１９６８　（１９７９））等の関連する
他の生物活性をもつことが明らかにされている。従って
、このリンパ球調節因子は液体免疫や細胞性免疫反応を
増強したり免疫不全状態を正常な液体や細胞性免疫の状
態に回復させるのに有用である。これらの明らかにされ
たＩＬ−２の免疫学的活性は、ＩＬ−２が悪性腫瘍、細
菌またはウィルス感染、免疫不全、自己免疫疾患等（Ｐ
ａｐｅｒｍａｓ　ｔｅｒら、　Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｈａｒｍ、。

５０７、　（１９８０））に対する医科免疫療法に有用
であることを示している。インターフェロンと同様に、
ＩＬ−２はナチュラルキラー細胞活性を増強することが
示されてきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く
示唆している。更に、ＩＬ−２は単クローン性の活性化
Ｔ細胞の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分子
機構、Ｔ細胞機能の分化機構、Ｔ細胞の抗原リセブター
の機構を研究する上で重要な役割を担っていることを示
している。また、ＩＬ−２は単りローン性Ｔ細胞を長期
培養することにより、他の種々の分野で有用な様々なＴ
細胞由来のリンホカインを製造するためにも使用できる
。更に、ＩＬ〜２の産生とリンパ球のＩＬ−２に対する
応答性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、
免疫異常の臨床診断に有用である。

ＩＬ−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス、ラ
ットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造
されてきた（Ｇｊｌｌｌｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６
８＋１５４〜１５６．　（１９７７））、　Ｆａｒｒａ
ｒら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋１２１＋１３５３〜１
３６０．　（１９７８）　、　Ｇｔｌｌｉｓら、　Ｊ、
　ｒｍｍｕｎｏｌ、、１２（Ｌ２０２７〜２０３３．　
（１９７Ｂ）　）。ヒトの末梢血リンパ球をマイトジェ
ンで刺激することにより（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２４．１９５４〜１９６２．（
１９８０））、Ｇ１１ｌｉｓらはＴリンホーマ細胞株か
らのマウスＩＬ−２の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２５．２５７０〜２５７８（１
９８０））とヒト白血病細胞株からのヒＩ−ＩＬ−２の
製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、
、１５２．１７０９〜１７１９．　　（１９８０））を
報告している。

Ｇ１１ｌｉｓらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒト
ＩＬ−２を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒ）ＩＬ−２しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のＩＬ−２を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒトＴ
白血病細胞株は少量のヒ）ＩＬ−２に酷似した他の生理
活性物質も産生ずるので、ＩＬ−２をこれらの他の免疫
活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する細
胞毒物質（ｔｏｘｉｃ　１ｅｃｔｉｎ）と分離するには
かなりの困難が伴う。

ＩＬ−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えＤＮＡ　（デオキシリボ核酸の略）
法（Ｇｒａｙら、　Ｎａｔｕｒｅ　２９５．５０３〜５
０８゜（１９８１）、　Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２Ｂ４．３１６〜３２０　（１９８０）。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５
．　　（１９８０））が好ましいと思われる。しかしな
がら、本発明の以前には組換えＤＮＡ法によってＩＬ−
２を製造する試みは成功していなかった。例えば、組換
えＤＮＡ体によってＴＬ−２を産生ずる生命体を作成し
ようとする試みは、恐ら（ＩＬ−２ポリペプチドをコー
ドする遺伝子が未だクローン化されていなかったために
成功していないという事が、“日経バイオテクノロジー
、第１９号、　１９８２年７月５日“′に報告されてい
た。

従って、ＩＬ−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えＤＮＡ体が渇望されてきた。また
、組換えＤＮＡ体を有する生細胞株と、その細胞株を使
ってＩＬ−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。

本発明の目的はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を創出したことにある。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性をもつ
、次のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を提供するものである。

Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＩＮ　ＬｅｕＧＩＮ　Ｌｅｕ
　Ｇｌｕ　）Ｉｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｍｅｔｌｌｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｇ
ｌｙ　Ｉｌｅ　ＡｓＮ　ＡｓＮ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓ
Ｎ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｈｒ　ＰｈｅＬｙｓ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＭｅｔ　Ｐｒｏ　
Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌ
ｙｓ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＧＩＮ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　
ＧｌｕＧｌｕ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＮ　Ｐｈｅｌｌｉ
ｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ａｓ
ｐ　　Ｌｅｕ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　ＡｓＮ　　ｌ１
ｅＡｓＮ　Ｖａｌ　　ＩＩｓ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　
Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａ
ｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ＾１ａ　Ｔｈｒ　　Ｉｌ
ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ａｒｇ
　Ｔｒｐ　ｌ１ｅＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩＮ　Ｓ
ｅｒ　ｌｉｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒ本発明の遺伝子を利用することによって、ＩＬ２はＩ
Ｌ−２活性を有するポリペプチドを産生ずべくコードさ
れた遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベクター
ＤＮＡの挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子のコ
ードシーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に位
置するＤＮＡによってＩＬ−２を産生ずべく形質転換さ
せた原核生物細胞株、特にエシェリヒア・コリを培地に
浮遊培養（好気的）することによって製造される。

本発明のＩＬ−２ポリペプチドをコードしたクローン化
遺伝子は、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ず
る能力をもつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞
に由来するＩＬ−２に相当するメツセンジャー　ＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ　；“ＲＮＡ”はリボ核酸の略、以下”Ｉ
Ｌ−２ｍＲＮＡ”という）を相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ
）に逆転写することによって得られる。得られた２重鎖
ｃＤＮＡ　（ｓｓ−ｃＤＮＡ）は−重鎖ｃＤＮＡ　（ｄ
ｓ−ｃＤＮＡ）に変換させることができる。

ｃＤＮＡを調製するための鋳型として用いるｍＲＮ＾は
、ＩＬ−２ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から単
離することができる。単離されたＲＮＡはポリアデニル
化され（ＧｉＬＬｉｓら、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｔｃａ
ｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋１６７〜２０９　（１９８２）
）　、ポリアデニル化されたＲＮ八は、例えばシａ＃Ｍ
密度勾配遠心法によって１１〜１２Ｓ画分に分画するこ
とができる。１３ｓのｍＲＮＡにＩＬ　−２ｎ＋ＲＮＡ
活性が現われることがあるが、この場合は１１〜１２　
ＳｍＲＮＡの凝集物であることが考えられる。

ｍＲＮＡの供給源となるＩＬ−２を産生ずることができ
る哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核
球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなＴ１７８球で良い。

細胞にＩＬ−２産生能を与えたり、またはＩＬ−２活性
を増強するために、ナイロンカラム処理、抗血清と補体
処理、密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトース
オキシダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様
々な酵素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法で前処理
しても良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下
で培養後得られるクローン化Ｔリンパ球もａｅＲＮＡの
供給源として用いることができ、これはより好ましいＴ
−リンパ球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来する
Ｔ１７８球それ自体または上記の方法で前処理または変
異したそれらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細
胞株またはクローニングされた形質転換細胞株もｍＲＮ
Ａの供給源として好ましい。明らかに、クローン化した
細胞株は通常クローン化前の親株に比較して多量のＩＬ
−２ｍＲＮＡを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞
とＯＥＭ。

Ｍｏ１ｔ　４Ｆ、　ＢＷ５１４７のごとき腫瘍細胞株を
融合することによって得られたＴ細胞ハイブリドーマも
また本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞である
。この場合のリンパ球由来細胞は、（１）ＩＬ−２の自
発産生細胞および（２）ＩＬ−２産生を補助する他の細
胞の存在下または非存在下に培養液中にマイトジェンが
導入され存在している時のみＩＬ−２を産生ずる細胞を
含む。

ＴＬ−２自発産生細胞においてＩＬ　−２ｍＲＮＡを誘
導するために、ＩＬ−２自発産生細胞は、細胞培養の分
野でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在
下のみでＩＬ−２を産生ずる細胞においてｍＲＮＡを産
生ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血
清を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリア
ルインスティテユート１６４０（以下、“ＲＰＭＩ　１
６４０”と略す。）、ダルベラコラ変法イーグル培地（
以下“ＤＭＥＭ”と略す。）またはクリック培地のごと
き培地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペ
ニシリン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、Ｌ
−グルタミン。

ヘペス緩衝液１または炭酸水素ナトリウムのような種々
の添加物を細胞培養の分野で一般に使われる濃度で加え
ても良い。好ましい細胞濃度は０．５〜４Ｘ１０’細胞
／緘である。ｍＲＮＡの活性化とＩＬ−２の産生を誘導
するために適当な刺激剤が加えられる。この適当な刺激
剤の中には、マイトジェン、ノイラミニダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼ、塩化亜鉛の如き亜鉛化合物または
プロティンＡ、ストレプトリジン−〇の如き細菌由来の
リンパ球活性化因子が含まれる。刺激された細胞は回収
され、洗浄される。マイトジェン刺激の際、マクロファ
ージまたはプントリティック細胞を共存させるとやはり
ｍＲＮＡを活性化し、あるいは活性化ｍＲＮＡの収量を
増大させ得る。同様にＲａｊｉ、　１）ａｕｄｉ。

Ｘ５６２．ＢＡＬＬ−１の如きＢリンパ球またはＢリン
パ球細胞株に由来する細胞株を共存させてもｍＲＮＡは
活性化され、または活性化ｍＲＮＡの収量を増大させ得
る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。−ＲＮＡの供給源を調製する
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養による継代を行なう場合に
は、従来Ｔ細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。

これらの培地には哺乳動物の血清、血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。ｍＲＮＡの活性化のため
の培養時間は、ｍＲＮＡを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。

この時間は、通常ＩＬ−２の培地中への産生が開始され
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したＩＬ−２ｄＮ
Ａが分解されることがある。ＩＬ〜２産生細胞の活性化
に際し、ＰＭＡまたはＴＰＡの如きホルボールエステル
類を１０〜５０ｎｇ／ｍｌ添加して活性化レベルを上昇
させることもできる。

ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性化のための上記工程はｐ）１７．
０〜７．４．温度範囲３２〜３８°Ｃの飽和水蒸気の環
境下で行なわれる。

ＩＬ−２を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）ＩＬ−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立癌センター／ハイデルヘルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／　ａｌｌの細胞密度でク
リック培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射
速度で合計８．０００レントゲンのＸ線照射を行なう。

この後、本細胞を０．１細胞／２００μ！培地の細胞密
度で９６穴の平底マイクロタイタープレート（「ファル
コン３０７２Ｊ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリ
ック培地中で３週間３７°Ｃにて５％ＣＯ２インキュベ
ーター中にて培養する（限′界希釈法によるクローニン
グ）。細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、
細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌ
ンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜２Ｘ１０６
個／ｄの細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含ま
ない無血清合成培地に懸濁して２日間培養し、本培養上
清を遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリポ
アフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行なった。こ
のようにして得た培養上清のＩＬ−２活性を測定するこ
とによってＩＬ−２を自発産生ずるＸ線処理変異株が選
択され、かつクローニングされた。

（０）ヒト末梢血単核細胞よりＩＬ−２産生株の取得ヒ
トの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度勾
配遠心法により末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと略す）
。を採取する。本ＰＢＬをｌＸｌｏｂ個／　ｍｌの細胞
密度で５％ｐｃｓを含むクリック培地に懸濁し、各２Ｉ
ｄ宛２４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここに
フィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ　／
　ｄの終末濃度になるように１００μ！添加し、上述の
条件下に４８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し
、再び１×１０’個／ｄの細胞密度でクリック培地１　
ｔｎｌに接種する。さらに、コンカナバリンＡ（以下、
ＣｏｎＡと略す。）２．５μｇ／ｄで４８時間刺激した
ヒト牌細胞から調製したコンディショニングした培地１
戚を加え、該コンディショニングした培地５０％を含む
培地を３日毎に取り換えて、ＰＢＬからのヒトＴリンパ
球を長期継代培養する。このように長期継代培養して得
たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディシ
ョニングした培地に由来するヒト牌細胞の存在下、クロ
ーニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こう
して得られたクローン化１９７８球をｌＸｌ０’個／成
の細胞密度に１０μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（
以下、ＰＨＡと略す。）の存在下、２４穴のタンク培養
プレート中のＲＰＭＩ　１６４０培地１／ｄに接種し、
２４時間、３７°Ｃで７．５％ＣＯ□インキュベーター
中にて培養した。本培養上清を遠心分離操作で分離し、
次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化を行な
った後、ＩＬ−２産生ヒト正常下リンパ球クローンを同
定するために、ＩＬ−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でＩＬ−２を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むＢＰＭＩ　１６４０培地中にてＣｏｎ
Ａ　　１０　ｕ　ｇ／ｄやＰＨＡ　２．５　ｕ　ｇ／ｄ
の存在下に２４時間培養すると、１０〜４，０００単位
／−のＩＬ−２を産生ずることができる。また、これら
ヒト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンＡ。

ピシバニール存在下に培養しても、ＩＬ−２を産生する
。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりＩＬ−２を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ４Ｆや前述の限界希釈
法でクローン化されたジュルカット細胞の１つのクロー
ン、ジェルカット９９株は、上述のごときレクチンやマ
イトジェンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間培養
してもＩＬ−２を産生しない。ところが、この間モノ力
インの１種であるインターロイキン１を５〜１０ｕ／ｍ
βまたは５０％のに５６２やラージ（Ｒａｊ　ｉ）細胞
を共存させて３７℃、２４時間培養すると、ＩＬ−２を
確認しうる量（１０”１００　ｕ／ｍｅ）産生ずる。

このようにして活性化された細胞よりＩＬ　−２ｍＲＮ
Ａを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、ＮＰ　−４０、ＳＤＳ、Ｔｒｉ
ｔｏｎ−ｘｉｏｏ、デオキシコール酸などの界面活性剤
を添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホモ
ゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞
を部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際にＲ
ＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中に
ＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニ
ル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカー
ボネートバナジウム複合体などを添加しておくのが好ま
しい。また、場合に応じては、抗ＩＬ−２抗体を用いて
ＩＬ−２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これより
ｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行ない得る
。

また、ｐｏｌｉ＾を含むｍＲＮ＾の精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを担体とするポ
リＵ−セファロースなどのアフィニティ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。

上記の如くして得られたｍＲＮＡがＩＬ−２徊ＲＮＡ活
性を有するものであることを確認するためには、ｍＲＮ
Ａを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗ＩＬ
−２ペプチド単りローン性抗体を用い該翻訳蛋白を同定
する等の方法を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡは通常
、アフリカッメガエル（造ｙ徂ｕｌａｅｖｔｓ）の卵に
マイクロインジェクションすることによりＣＧｕｒｄｏ
ｎら、　Ｎａｔｕｒｅ、　％ｌ、１７７〜１８２（１９
７２））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シ
ステムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される
。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１１ｉｓら（Ｇｉｌｌｉｓら
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　Ｗ、　２０２７〜２０３３（１９
７Ｂ））によって基本的には述べられているミクロ検定
法によって確認できる。この検定法では、Ｇ１１ｌｔｓ
らによって確立された方法に従って作成した細胞障害性
Ｔリンパ球細胞株（以下、ＣＴＬＬと略す。）のＩＬ−
２に依存細胞のＤＮＡ合成上昇（ＩＬ　−２ｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏ
ｎ）を指標としている。即ち、４Ｘ１０３個のＣＴＬＬ
細胞を２％のＦｅ２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１０
０μｌに懸濁し、１００μｌの連続希釈した翻訳産物と
共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。３７°
Ｃ，５％ＣＯｔ下で２０時間培養した後、細胞を０．５
μＣｉ／ウエルの３Ｈ−ＴｄＲで４時間ラベルし、自動
細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回
収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。

この検定により、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬ
細胞が投与量に依存して’Ｈ−ＴｄＲを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるＩＬ−２量を明確
に計算することができる。

ＩＬ−２は１９２８球の増殖を促す活性を有するので、
ＩＬ−２活性を１９２８球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、５個のＣＴＬＬ細胞を２％のＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ　１００μｌに懸濁し、１００μｌの
連続希釈した翻訳産物と共に９６穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。７２〜９６時間、３７°Ｃ，５％ＣＯ
８下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微鏡
下で計測する。対照群として１００Ｕ／ｄ、ＩＯＵ／−
のＩＬ−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数と比
較して検体のＩＬ−２活性を求める。

二のようにして最も高活性の両分から得られたＩＬ−２
ｍＲＮＡはｄｓ−ｃＤＮＡを合成するための鋳型として
用い、ｄｓ　−ｃＤＮＡはベクターＤＮＡと結合させる
。

ｃＤＮＡの合成は従来の方法によって行なう。

まず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーと
してｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的なｓｓ　−
ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いてｄｓ−ｃＤＮＡ
を合成する。

このようにして得られたｄｓ　−ｃＤＮＡと原核生物で
複製できるレプリコンを含むベクターＤＮＡから組み換
えＤＮＡ体が作られる。しかる後、この組み換えＤＮＡ
体は宿主細胞に組み込まれる。

このｄｓ−ｃＤＮＡ及び原核生物で増殖し得るベクター
ＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ
処理、化学合成りＮＡ断片の追加、ｄｓ−ｃＤＮＡやベ
クターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつけるためにＧ
、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される。こ
れらの連結可能なりＮＡは、例えばＡＴＰ共存下にＴ４
ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ合せることが
出来る。

このようにして調製された組換えＤＮＡ体によってクロ
ーン化されたｃＤＮＡを増巾させるため又はＩＬ−２ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。

ＩＬ−２生産のための適当な原核生物宿主としてはエシ
ェリヒア・コリ、バチルス・ズブチリスなどが含まれる
。宿主細胞胞中でのＤＮＡ増中のためにはエシェリヒア
・コリを宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞
とすることも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥＫ型プ
ラスミドベクター（ストリンゼント型）としてｐｓｃｌ
ｏｌ、　ｐＲＫ３５３．　ｐＲに６４６．　ｐＲＫ２４
Ｂ、　ｐ叶４１など、、ＥＫタイププラスミドベクター
（リラックストタイプ）　　：　Ｃｏ１Ｅ１．　ｐＶＨ
５１，ｐＡｃ１０５．　Ｒ３Ｆ２１２４゜ｐｃＲｌ、　
ｐＭＢ９．　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
４，ρＢＲ３２５゜ρＢＲ３２７，ｐＢＲ３２Ｂ、　ｐ
ＫＹ２２８９．　ｐＫＹ２７００．　ｐＫＮ８０．　ｐ
ＫＣ７゜ｐＫＢ１５８．　　ｐＭに２００４．　　ｐＡ
ｃＹｃｌ、　　ｐＡｃＹｃ１８４．　　ｄｕｌ等、、λ
ｇｔタイプファージベクター：λｇｔ、λＣ１λｇｔ、
λＢ。

λＷＥＳ、λＣ１λ−ＥＳ、λＢ、λＺＪｖｊｒ、＋　
　λＢ＋、　　λＡＬＯ，λＢ。

λＷＥＳ、Ｔｓ６２２．λＤａｍ等が含まれている。一
般に、ｐＢＲ３２２はエシェリヒア・コリ用ベクターと
してしばしば利用されてきたが、この場合量も良いクロ
ニング部位はＰｓｔｌならびにｆｆｃｏＲ１部位である
。

組換えＤＮＡ体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常
よく用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの
如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取り込むこと
の出来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を
回収後、良く知られているＣａＣ１，法によって形質転
換出来る。形質転換反応液中にＭｇＣｆｚ又はＲｂＣｆ
ｆを共存させれば形質転換効率は向上する。また、宿主
細胞のプロトプラスト調製後形質転換させることも可能
である。

ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１）プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細胞
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１ｌ−１２ｓ画分
として部分精製したＩＬ−２ｍＲＮＡを調製し、この部
分精製ｍＲＮＡを鋳型として３２ｐ−放射性５ｓ−ｃＤ
ＮＡを合成する。アルカリ処理にて鋳型ｍＲＮＡを除去
後、単離されたｃＤＮＡは、抗原刺激しない哺乳動物細
胞から抽出され、部分精製した１１−１２　ＳｍＲＮＡ
でハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズしなか
ったｃＤＮＡとハイブリダイズしたｃＤＮＡはハイドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画する。

ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリダイズし
たｃＤＮＡをそれぞれプローブＡ１及びプローブＢと呼
ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロ
セルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のＤＮＡ
をアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ及び
Ｂをそれぞれ、二つの異った濾紙上でＤＮＡとハイブリ
ダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを行っ
てプローブＡと陽性に反応する組換え体（プラス）、プ
ローブＢと僅か又は全熱反応しない組換え体（マイナス
）を選別する（呑口ら；　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐ、　Ａｃａｄ、、　Ｖ１５５Ｂ　　４６４〜４６
９（１９７９）。

（２）第２の方法は、例えば１０００〜１０，０００の
組換体クローンを２〜３０ないし２〜３００クローン宛
のクローングループに大別し、それぞれのクローングル
ープをそれぞれ常法によって培養しプラスミドＤＮＡ５
を調製する。次いで、これらプラスミドＤＮＡ５を例え
ば熱変性してｓｓ　−ｃＤＮＡをニトロセルロース濾紙
上に固定し、活性化ＩＬ−２−ｍＲＮＡを含有する哺乳
動物細胞から調製されたｍＲＮＡと相補的にハイブリダ
イゼーションを行う。あるいはまた、ＩＬ−２ｎ＋ＲＮ
Ａを含有するｍＲＮＡ　（混合物）を熱変性したプラス
ミドＤＮＡ　（混合物）とハイブリダイズさせるとＤＮ
Ａ−＋５ＲＮＡハイブリツドがニトロセルロース濾紙上
に固定される。この濾紙を１ｍＭの１１ＥＰＥｓ、ある
いは１０＋＋＋Ｍの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄
し、濾紙上に吸着されたｍＲＮＡを０．５ｍＭ　［１Ｄ
ＴＡ；０．１χＳＤＳ溶液含有液で例えば９５°Ｃ，ｄ
Ｔ１分間処理して抽出する。精製ｍＲＮＡはこれをｏｌ
ｉｇ。

−セルロースカラムクロマトグラフィーにて溶出回収ス
る。次いで、ｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞に
マイクロインジェクションして蛋白質に翻訳してＩＬ−
２活性を確認する。あるいはｍＲＮＡに依存性の網状赤
血球系又は小麦胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞合成系を用
いてこのｍＲＮＡを蛋白に翻訳させ、抗■ルー２抗体を
用いてＩＬ−２−活性を分析することが出来る。これら
の方法によってＩＬ−２活性が検出されたグループをさ
らに少数の組換え体クローンを含有する群に類別し最終
的にはＩＬ−２ＤＮＡを有する単一クローンが得られる
まで繰返し実施する。

ＩＬ−２産生能のある組換え体よりＩｔ、−２ポリペプ
チドをコードするｃＤＮＡを得るには、先ずトランスフ
ォーマント中の組換えＤＮＡ体を分離し、これを制限酵
素エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られ
るＤＮＡ分画より組込まれたｃＤＮＡ画分を分離する。

ＰＩＬ−２−５０Ａを組換えたＤＮＡよりＩＬ−２ポリ
ペプチドをコードするＰｓｔｌ　ＤＮＡインサートの全
ヌクレオチド配列は、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅ
ｒｔ法（Ｍｅ　ｔｈ　。

ｆ！ｎｚｙｍ、　６５．４９９〜５６０．（１９８０）
）；ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法（Ｓｏ＋
ｉｔｈ、　Ａ、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈ。

Ｂｎｚｙｙｓ、　６５．５６０〜５８０．（１９８０）
）にて決定された。

ｃＤＮ＾ＤＮＡインサート酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ
）に示すごとく、このｃＤＮＡはそれぞれＢｓｔＮｌ、
　Ｘｂａ　Ｉ　、　ＢｓｔＮ　Ｉなる制限酵素エンドヌ
クレアーゼで切断される構造を有する。

本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つの大きなオー
ブンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のＡＴＧ配列（Ｋｏ
ｚａｋ、　Ｍ、　Ｃｅ１１．１５．１１０９〜１１２３
（１９７８））は、５″一端から４８−５０ヌクレオチ
ド位に存在し、読み終り配列ＴＧＡが存在するヌクレオ
チド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのＡＴＧにつ
ながっている。ｍＲＮＡの３’　　ｐｏｌｙ（Ａ）末端
に相当するＡのつながりがｃＤＮ八末へに見出され、通
常真核生物ｍＲＮＡのほとんどに見出される６個からな
るヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ　（７７１−７７６位）が
先に位置する。

（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　Ｎ、Ｊ、　＆　Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅ　Ｃ，Ｇ、、　Ｎａｔｕｒｅ　ｌｕ＋２１１−２１
４．　（１９７６）） ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は第２図（
ｂ）（アミノ酸配列ｌ）のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列■のポリペプチドは１５３個のアミノ酸から
なり、その分子量は１７６３１．７ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（ＢｌｏｂｅｌＧ、、　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｓｙｍ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　Ｊ
３．９〜３６（１９７９））、上記演えき１Ｌ−２ポリ
ペプチドのＮ末端領域はやはり疎水性である。本領域は
成熟ＩＬ−２の分泌時に切断されるシグナルペプチドの
役割を果しているであろう。切断は２０−２１位のＳｅ
ｔとＡｌａ間で起るか２１−２２位間の＾Ｉａ−Ｐｒｏ
間で切断され、アミノ酸配列■および■を有するポリペ
プチドを生成する。何故ならば同様な切断位置は今迄知
られたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されているか
らである（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｓｙ
ｍｐ、　Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　３３．９〜３６（１，９７９））、従って
、成熟ＩＬ−２ポリペプチドは１３３ないし１３２個の
アミノ酸から成り、分子量は１５４２０．５または１５
３４９．４ダルトンと算出される。本分子量値はジュル
カット細胞から得られたヒ目Ｌ−２蛋白の分子量（１５
０００ダルトン）として報告されたものを対比される（
Ｇｉｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｒｅｖ、＋　６３＋　６７”２０９　（１９８
２）　）。また実施例３に示すごとく塩基配列１１１〜
１１３位にあるＯＣＴ配列から始まるＤＮＡ画分、即ち
、２２位に位置す゛るＰｒｏから始まるポリペプチドに
対するコード（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列ＩＩＩ）
はＩＬ−２活性を有するポリペプチドを表現しているこ
とが確認された。塩基配列１０７〜１１０位にあるＧＣ
Ａから始まるＤＮＡ画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸
配列■に示すごとく、２１位に位置するＡｌａから始ま
るポリペプチドをコードするＤＮＡ画分は、実施例６に
示すごと＜　ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを表現
していることが確認された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（呑
口ら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５（１９８０）、大
野、呑口、＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７゜５３０５〜５３０９（１９
８１）；　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２
９５．５０１〜５０８　（１９８１）　）。この多形現
象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換さ
れる場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変ら
ない場合もある。ヒ目Ｌ　−２・ｃＤＮＡの場合、ｐＩ
Ｌ−２−５０Ａ　ｃＤＮＡの５０３位のＡ残基がＧ残基
で置き換えられた他のｃＤＮＡクローン（ｐＴＬ−２−
５０３）も検出できる。ｐＩＬ２−５０Ａ　ｃＤＮＡと
は塩基配列が異なるその他のｃＤＮＡクローンの存在も
期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明の遺伝子は、第
２（ａ）図に示された塩基配列を有するＤＮＡ　。

４８−５０位のＡＴＧ配列から始まり、５０４〜５０６
位にある少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有す
るＤＮＡ５．１０８−１１０位のＧＣＡ配列から始まり
、ＧＣＡ配列から少くともＡ・とＴＩＺｔ’Ｊに至る連
続塩基配列を有するＤＮ＾、また１１１−１１３位のＣ
ＣＴ配列から少（ともＡ’（：Ｔ配列に至る連続塩基配
列を有するＤＮＡを包含する。本発明の遺伝子はまた、
５０４〜５０６位のＡＣＴ配列に終り、１位のＡに始ま
るＤＮＡ、４Ｂ−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、　１
０８−１１０位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡ又は１１１
−１１３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。更
に本発明の遺伝子は、５０７〜５０９位のＴＧＡ配列に
終り、１位のＡに始まるＤＮＡ、４８〜５０位の＾ＴＧ
配列で始まるＤＮＡ、　１０８〜１１０位のＧＣＡ配列
で始まるＤＮＡまたはｌｌｌ−１１３位のＣＣＴ配列で
始まるＤＮＡを包含する９更に本発明の遺伝子は、８０
１位のＣで終り、１位のＡで始まるＤＮＡ、　４８−５
０位のＡＴＧで始まるＤＮ八、　１０８−１１０位のＧ
ＣＡで始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位のＣＣＴ配
列で始まるＤＮＡを包含する。本発明の遺伝子はまたｐ
ｏｌｙ（Ａ）で終り、４８−５０位のΔＴＧコードンか
ら始まるＤＮＡ、　１０Ｂ−１１０位のＧＣＡ配列で始
まるＤＮＡまたは１１１−１１３位のＣＣＴ配列で始ま
るＤＮＡを含む。また、本発明の遺伝子は、アミノ酸配
列ｒ、ｎ、　ｎｒに相当する塩基配列を有する遺伝子を
含む。アミノ酸配列Ｉの中で１個ないしそれ以上のアミ
ノ酸を欠くポリペプチド、あるいはアミノ酸配列Ｉの中
の１個ないしそれ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上
のアミノ酸で置換されたポリペプチドはＩＬ−２活性を
有することもあり、従ってこの様なポリペプチドをコー
ドする遺伝子は本発明の遺伝子として使える。同様にア
ミノ酸配列１．■または■に対して１個ないしそれ以上
のアミノ酸を表現し得る１個ないしそれ以上の塩基を余
分に結合した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、
ポリペプチドのＩＬ−２活性発現に邪魔しない限り本発
明の遺伝子の中に包含される。

ＩＬ−２としてのポリペプチド機能を阻害する追加アミ
ノ酸配列を有する修飾領域であっても新たに追加された
領域が容易に除去出来るものならば本発明の遺伝子とし
て利用出来る。同じことはアミノ酸配列！、ＩＩおよび
■に対応する遺伝子のアミノ酸配列Ｉ、■および■のＣ
−末端にアミノ酸追加をコードするＤＮＡが３°−末端
に追加結合せしめたＤＮＡの場合にも言える。

上記の如くして得られた本発明の遺伝子を利用してＩＬ
−２を生産するには、まず本発明の遺伝子を含有する組
換えＤＮＡ体を作り、次いで該組換えＤＮＡ体により宿
主細胞を形質転換し、該形質転換された生物細胞を培地
で培養すればよい。

生細胞中でＩＬ−２産生をする組換えＤＮＡ体は、次の
各種方法で作られる０例えば、ＩＬ−２・ｃＤＮＡをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つｃＤＮＡ片
を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の前あるいは後にＩＬ−
２をコードする配列の上流゛に挿入することが出来る。

ＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現し、ＩＬ−２−ポリペプチド
を産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通りで
ある。

（１）エシェリヒア・コリによるＩＬ−２−ｃＤＮＡの
発現 エシェリヒア・コリ中でＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現させ
るには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを含有するバイ
ブリドプラスミドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢＩＯＩに感染させ、ヒ）ＩＬ−２
活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる。

本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもｃＤＮ
Ａに適当に接続されていればＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現
する。この様なｃＤＮＡの発現例は以下のとおりである
。

ＩＬ−２をコードするクローン化ｃＤＮＡは第２図に示
される様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当
するＮ−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟ＩＬ−２ポ
リペプチドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成熟ＩＬ−２ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡ部分を発現させることが望ましく、ＩＬ−２
シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはない
。

（ｉ）　　プラスミドベクターｐＴｒＳ−３の構築ｐＴ
ｒＳ−３は、エシェリヒア・コリＴｒｐプロモーターを
含み、ｐＴｒＳ−３のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位（ＳＤ配列）は既に報告されている（Ｇ、
　Ｍｉｏｚｚａｒｉ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３＋１４５７〜１４６６
　（１９７８）　）、ＳＤ配列の下流１３塩基対にある
ＡＴＧコードンの存在も報告されている（Ｎｉｓｈｆ　
ｅｔａｌ、生化学５４．　Ｎα８．６７６　（１９８２
））。このプラスミドベクターはまた、ＡＴＧ開始配列
（第３図）の下流に一つのＳｐｈ　　ｒ部位を含んでい
る。

ＩＬ−２・ｃＤＮＡを発現させるため、先ずプラスミド
をｓｐｈ　　Ｉで消化しエシェリヒア・コリＤＮＡポリ
メラーゼＩ　（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント
）または、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラー
ゼＩで処理し３゛−位突き出し末端を除去する（第４図
（ａ））。プラスミドｐｌＬ−２−５０八をＰｓｔ　　
Ｉおよび）ＩｇｉＡ　Ｉで２回消化し、より大きいｃＤ
ＮＡ画分を単離する。

次いでＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（フレノウフラグメント）又はバクテリオファージ↑
４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して３゛−突き出し末端
を切りはなす。この処理をしたｃＤＮＡは１３２個のア
ミノ酸のＩＬ−２ポリペプチドをコードする（第４（ａ
）図）。このｃＤＮＡを上述のごとく前処理したｐＴｒ
Ｓ−３プラスミドＤＮＡに結合せしめ、ＡＴＧ開始コー
ドンをＩＬ−２ｃＤＮＡのＣＣＴ（Ｐｒｏ）配列につな
ぎ合せる。こうしてプラスミドｐＴ　ＩＬ−２−２２が
得られる。Ｔｒｐプロモーター配列とｐＴ　ＩＬ−２−
２２のＩＬ−２ｃＤＮ＾配列の結合は第４（ａ）図に示
す。

プラスミドｐＴ　ＩＬ−２〜２２はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなる
ＩＬ−２ポリペプチド合成を指令する。

（ｉｉ）成熟ＩＬ−２はプロリンの代りにＮ−末端アミ
ノ酸としてアラニン（２１位）を含むこともあり、１３
３個のアミノ酸から成るＩＬ−２ポリペプチド合成を指
示するプラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドｐＴｒＳ　−３はＳＤ配列とＡＴＧ配列との
間に１つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位がある（第３図）。本
プラスミドはＣｌａ　　ＩとＳａｌ　　Ｉで切断される
。プラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　ｌで部分分
解し、エシェリヒア・コリＩ）ＮＡポリメラーゼＩで処
理し、最も長いＤＮＡを単離する。次いでＤＮＡを制限
酵素Ｘｈｏ　　［切断部位を含む合成りＮＡリンカ−と
結合させ、ＩＬ−２をコードする配列の３゛−側下流に
ＤＮＡリンカ−を導入したプラスミドｐｌＬ−２−５Ｏ
Ａ（Ｘｈｏ）を含むクローンを単離する。プラスミドｐ
ＴＬ−２−５ＯＡ　（Ｘｈｏ）を先ｆｆ１ｇ１ＡＩで切
断し、エシェリヒア・コリ　フレノウフラグメントまた
はＴ４　ＤＮ＾ポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ　　Ｉで
消化すればｃＤＮＡ画分が単離できる。

このｃＤＮＡフラグメントをＣ１ａ　　ＩおよびＳａｌ
　　Ｉで前処理したｐＴｒＳ−３ＤＮＡに結合させ第４
（ｂ）図の如く合成りＮＡにつなげる。かくしてＡｌａ
からスタートする１３３個のアミノ酸から成るＩＩ、−
２ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプ
ラスミドｐＴＩＬ−２−２１が得られる。（第４（ｂ）
図）。同様なことはＸｈｏ　　Ｉリンカ−を使用しな（
とも作られる。

（ｉｉｉ　）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大
きさのＩＬ−２ポリペプチドはｐＴｒＳ−３発現プラス
ミドベクターを用いても作られる。以下に示すごとく、
ｐｌＬ−２−５ＯＡにクローンされたＩＬ−２ｃＤＮＡ
はヌクレオチド結合部位８１−８５に唯一つだけＤｄｅ
部分を有する。プラスミドｐｌＬ−２−５０八（Ｘｈｏ
）を、Ｄｂｅ　Ｉで切断し、ｃＤＮＡのより大きい区分
を含有するＤＮＡ画分を単離する。本画分はｐＢＲ３２
２より３０００塩基対を有するＤＮＡを含んでいる（第
４（ｃ）図）。

ＤＮＡ画分をエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１で処理し
、次いでＸｈｏ　　Ｉで切断する。ここで得られたＤＮ
ＡをＳｐｈ　　Ｉで切断したｐＴｒＳ−３と結合せしめ
、に１ｅｎｏ−フラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理し次いでＳａｌ　　Ｉで消化する（第４（
ｃ）図）。つなぎ合せたＤＮＡをエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１に感染させ、ヒトＩＬ−２を発現するクロー
ンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒト
ＩＬ−２を発現する筈である。何故ならばヒトＩＬ−２
ＯＮ−末端領域に相当するＤＮＡは種々切断除去される
からである。かくしてＩＬ−２ｃＤＮＡを含有するｐＴ
ＩＬ−２−１４と１５が得られる。

（ｉｖ）　ＩＬ　−２ｃＤＮＡはまたｐＫＴ　２１Ｂ　
（ＴａｌｍａＨｅより提供を受けた；　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ［、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ＋７７、　Ｐ
、３３６９〜３３７３　（１９８０）　）を用いても発
現可能である。プラスミドｐＫＴ　２１８はＰｓｔ　　
Ｉで切断し、ｐＨ，２−５０八をｈｉＡ　ＩとＰｓｔ　
　Ｉで切断（第５図）して得たＩＬ−２ｃＤＮＡ挿入部
分とつなぎ合わせる。出来上ったプラスミドｐＫＩＬ−
２−２１は第５図に示したように、蛋白合成開始の始発
位に配列を有している。

したがって、このプラスミドｐＫＩＬ−２−２１はＩＬ
−２の１３３個のアミノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る（最初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される）。

（ｖ　）　ｐ−ＢＲ・３２２にｔｕｆＢに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスミドｐＴｕＢｌｐ−５の発
現は既に行なわれている（呑口ら、生化学５３９６６（
１９８１））。

このプラスミドは一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含み、
第６図に示すごとく本切断部位はＳＯ配列の２塩基対だ
け下流に位置する。ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴ
Ｇ始発配列の間にある一つのＣ１ａ　　’ｉ切断部位を
含み、同時にこのＣ１ａ　　Ｉ部位はｐＴｒＳ−３とＩ
Ｉ、−２ｃＤＮＡを用いて発現用プラスミドを作る過程
で壊されないので細菌ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプ
ロモーターで置き換えることは極めて簡単である。従っ
てヒト１Ｌ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモーターの制御
下で発現される。例えばｐＴＩＬ−２−２２をＣ１ａ　
　ＥとＰｖｕ　Ｕで切断し、ＩＬ　　２　ｃＤＮＡを含
むＤＮＡ画分を分離する。

次いでこの両分をｐＴｕＢＩＰ−５でつなぎ合わせ、Ｃ
１ａ　　ＩとＰｖｕ　Ｉ［で予め切断後、第６図に図示
される様にプラスミドｐＴｕ［Ｌ−２−２２が造成され
る。ＩＬ−２活性はプラスミドｐｌ’ｕｌＬ−２−２２
を含むエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩの抽出液に検出で
きる。

（ｖｉ）例えばｐＴＩＬ−２−２１を使っても、また基
本的にはｐＴｒＳ−３を用いて達成したすべての発現用
ブラスミドを用いることによっても同様に造成できる。

また例えばｐＴｕＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉで切断
し、Ｂａ１３１またはＳｔまたはＤＮＡポリメラーゼ■
　（エシェリヒア・コリ）にてＤＮＡの塩基対２−３個
を除去または補充し再度プラスミドをつなげることによ
ってＳＤおよびＡＴＧ配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

次いで、組換えＤＮＡ体を挿入したエシェリヒア・コリ
、バチルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物
細胞を培養して組換えＤＮＡ体を増巾し、またははＩＬ
−２ポリペプチドを生産する。この培養は通常の方法で
行なわれる。

細胞内または細胞外に生産された１Ｌ−２は硫安沈澱、
塩類除去のための透析（常圧または減圧下）。

ゲル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰ　
Ｌ　Ｃと略記）、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆相ク
ロマトグラフィー）、及び色素結合担体、ＴＬ−２に対
するモノクローナル抗体を結合した活性化セファロース
４Ｂ又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるアフィ
ニティクロマトグラフイー等、公知の方法によって回収
することができる。

ＩＬ−２の単離精製法はＷａ　ｔｓｏｎらＵ、　Ｅｘｐ
、　Ｍｅｄ、。

１５０、８４９−８６１（１９７９）、　Ｇｔｌｌｉｓ
　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２４、１９５４−１９６２（１９８０）、　Ｍｏｃｈ
ｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３９．１８５−２
０１（１９８０）、　ＷｅｌｔｅＫ　ｅｔ　ａＬ、　Ｊ
、　Ｋｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５６．４５４−４６４（
１９８２））によって報告されている。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるＩＬ−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
ＩＬ−２活性を有する。分子量は約１５０００ダルトン
でありＩＬ−２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｃｅｎｔｅｒ）の様な免疫吸着剤の有無にかかわらず完
全に中和され、またはモノクローナル抗ＩＬ−２抗体で
沈澱した。免疫電気泳動において、ＩＬ−２ポリペプチ
ドは、対応する抗ｒＬ−２抗体に対して唯１個の沈降線
を示す。ＩＬ−２活性は２−メルカブトエタノールで還
元後も安定であり、ＤＮＡ５ｅ及びＲＮＡ５ｅ処理して
も、又５６°Ｃ２３０分熱処理しても安定である。活性
はｐＨ２〜９で安定である。この様にして生産されたＩ
Ｌ−２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障
害性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強
め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細
胞障害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、ＹＡＣ
−１細胞やＲＬ　　１細胞に対するナチュラルキラー細
胞の活性化の増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ヒｌ−Ｔ細胞系白血病細胞株であるジェルカ
ット細胞（日本、西独および米国では自由に入手可能で
ある）をｌＯ％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ　１６４０培地に
けん濁し、Ｘ線照射装置Ｅｘｓ　１５０／３００−４（
東芝・日本）により５０秒間、室温で１０，０００レン
トゲンに達するまで照射した。その後照射された細胞は
上述の培地中、初期細胞密度１×１０Ｓ個／ｄで５％炭
酸ガス、３７゛Ｃのインキュベーター中で５日間培養し
た。

この変異細胞（０，２個／穴）を９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７°Ｃの
インキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ　　５０　ｕ　ｇ／　ｔｒｄｔ存在下で初期
細胞密度１×１０ｂ個／戚で２４時間培養した。そして
ｒＬ−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１
２９）　（以後”Ｊ−１１１”と称する）と命名された
ヒｌ−Ｔ細胞株が親株のジュルカットからクローン化、
選択され、この細胞のルー２産生能は親株の４０倍に増
加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジェルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２）Ｊ−１１’ｌ細胞（ＩＸＩＯ５個／ｄ）を無血清
合成培地ＲＩＴ　Ｃ５５−９（Ｓａｔｏ、　Ｔ、　ｅｔ
　ａｌ、、、　Ｈｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１３４．１２７−１３４．（１
９８２））　１００１００Ｏに接種し、ローラー培養ボ
トル（フアシヨン３０２７）内で３７°Ｃ１４日間培養
し、増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞
を再び４Ｘ１０’個／ｄとなるよう上述のＣｏｎＡ　２
５μｇ／ｐｉ含有培地に接種した。ローラー培養ボトル
（ファルコン）４バツチの各々に細胞を接種した培養液
１ｏｏｓを入れ、６時間回転培養した。

（３）このようにＣｏｎＡ　２５μｇ／−で６時間刺激
したジュルカット細胞（１，２ｘ１０６）は生理食塩−
リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略す）８．ＯＯＯｍｆに懸
濁した。この細胞は遠心操作により２回洗浄し、ヌクレ
アーゼ阻害剤であるリボヌクレオシドーバナデイル複合
体（１０ｍＭ）を含有するＲ３Ｂ溶液（１０成トリス−
塩酸緩衝液、ｐＨ１，５，１０ｄ　ＮａＣｆｆ１．１、
５　ｍＭ　ＭｇＣＩｌ　ｚ）　８００ＩＩ！１に再懸濁
した。その後、界面活性剤ＮＰ−４０を最終濃度０．０
５％となるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を３．
００Ｏｒｐｍ。

５分、４　’Ｃ下で遠心し分離した。５ＯＳ（０，５％
）及びＥＤＴＡ　（５＋ａＭ）を上清液へ加え、細胞質
１？ＮＡを上清液と同量のフェノールを加え抽出した。

フェノールによる抽出を３回繰返した後、ＲＮＡは２倍
量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心により
集め、ｐＨ７，５の１０＋＋＋Ｍトリス−塩酸に溶解し
た。得られたＲＮＡ量は１９６■であった。

ｍＲＮＡの分画はオリゴ（ｄＴ）　−セルロース（Ｐ、
　Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｔｙ９ｅ　７）のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
２０ｍＭトリス−塩酸、０．５ＭＮａＣｊ２．　１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含むｐＨ７，５の溶
液であり、溶出はカラムを緩衝液（２０１１ＩＭトリス
ー塩酸、ｐＨ７，５，０、５Ｍ　Ｎａ（Ｊ！　、　　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７；　５　）で交互に行った。溶出により得ら
れたｍＲＮＡは３，６■であった。次にこの得られた１
ＩＩＲＮＡ　２．４■を蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ
）リス−塩酸、１　ｍＭ　ＢＤＴＡ、０．２　Ｍ　Ｎａ
Ｃｊ２を含むｐＨ７，５の溶液中で蔗糖密度勾配５−２
５％、２６．０００ｒｐＩＩ＋で４°Ｃ下２４時間）に
より分画した。　ｍＲＮＡの１１から１２３が分画阻１
２．１３．１４へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ、
６０μｇであった。

（４）ＮｃＬ１３の分画に得られたｍＲＮＡをアフリカ
ツメカニルーσｅｎｏ以坦り！佳註の卵母細胞へ注入し
た（　５０　ｎｇ　ｍＲＮＡ／卵母細胞）、この卵母細
胞の培養液をＩＬ−２活性測定した。表１に示す如く、
３Ｈ−チミジン（’Ｈ−ＴｄＲ）の取込みの上昇及び活
性化Ｔリンパ球数の増加が確認され、明らかにこの分画
中のｍＲＮＡはヒ）　ＩＬ　−２ｓ＋ＲＮＡを含んでい
る事が立証された。

表１ （ａ） 分画１３の翻 訳生成物 ×　　８ Ｘ３２ １４．６８３ １０．１６５ （ｂ） 分画１３の翻　　Ｘ２　　　　１１５　　　４０訳生成
物　　　　Ｘ１６　　　　　５５＊　単位は標準ＩＬ−
２（１０単位／ｄ）　ノ３ｏ−ＴｄＲ取込み量と比較す
る事により算出した。

（５）その後ＩＬ−２ｍＲＮＡを含む１１〜１２Ｓ　ｍ
ＲＮＡのＮ（Ｌ１３分画からｉｎ　ｖｔｔｒｏでｃＤＮ
八を合成した。

組換え体ＤＮＡはプラスミドベクターｐＢＲ３２２と構
成した。組、換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに形質
転換し、ＩＬ−２ｃＤＮＡクローンを獲得したクローン
を以下に示す如き方法により選択した。

（５−１）　５０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）、３０ａ＋Ｍ　ＮａＣｊ！、　６１ｍＭ　ＭｇＣ
ｆｆ１ｚ　、５ｍＭジチオスレイトール（以後ＤＴＴ　
ト略す）　、０．５ｍＭ（７）各ｄＡＴＰＳｄＧＴＰ、
ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ　（ｄＣＴＰは″ｚｐ放射標識し
たものを含ム）、０．７μｇオリゴ（ｄＴ）　ｉ。、１
０μｇ　ｍＲＮＡ及び１５単位ＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、
　’ｅ４．　Ｂｅａｒｄ）を混合し、４１℃下で９０分
保った。反応終了後、ＤＮＡはフェノール処理後エタノ
ール沈澱物として回収し、このＤＮＡを２０ｍＭ　　ト
リスおよび１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，５の溶液
に溶解した。

５ｓ−ｃＤＮＡ　２．５μｇが合成された。本反応液よ
りｍＲＮＡを除くために反応液にＮａＯＨ溶液を加えて
０、３３　Ｎ　ＮａＯＨ溶液とし、室温にて１５時間置
き、次いでｐＨ７，５のＩＭ）リス−塩酸緩衝液を同量
加えて中和しセファデックスＧ−５０カラムをカラムを
通した。回収されたｃＤＮＡは１．８μｇであった。

（５−２）５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ＴＩＩＭ　ＭｇＣ１ｔ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ、　０
．７５ｎ＋Ｍの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰＳｄ
ＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３Ｈで標識したものを含む）　、
１．８　ｐ　ｇ　５ｓ−ｃＤＮＡおよび８単位ポリメレ
ースＩ　（ＢＲＬ、米国）を混ぜ１５時間、１５℃で反
応を行った。反応終了後ＤＮＡをフェノール及びクロロ
ホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。１．１
０μｇのｄｓ　−ｃＤＮＡが生成した。５（１ｍＭ酢酸
ソーダ（ｐＨ４，５）　、０．２　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍ
Ｍ　ＺｎＣ１ｚおよび１．１０μｇ二本鎖ｃＤＮＡの混
合物を３７゛Ｃで３０分間インキュベートした後０９２
５単位のヌクレアーゼＳ、（三井、日本）を加え、さら
に１５分間インキュベートした。反応終了後、フェノー
ル処理を２回行った反応生成物をセファデックスＧ−５
０へ供し、二本鎖ｃＤＮＡ　０．５５　ｕ　ｇを得た。

（５−３）Ｏ，１４Ｍカコジル酸カリウム、３０ＩＩＩ
Ｍトリス塩基、０．１　ｍＭ　ＤＴＴ、　　１　ｍＭ　
ＣｏＣ１ｚ、０．６４ｍＭ　”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性
２．７　Ｘ　１０　ｈｃｐｓ／ｎ　ｍｏｌ）、０、５５
　ｕ　ｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡおよび５単位のターミナルト
ランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、３７℃で７分間
インキュベートした後フェノール処理し、次いでセファ
デックスＧ−５０カラムに供し、エタノール沈澱物とし
て０．５０μｇ　ＤＮＡを得た。回収したこのＤＮＡは
約５０個のｄＣＭＰ残基が両３°末端に付加されている
事が判明した。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　１０μｇを制限酵素用■で切断し
たのちｄＣＴＰのかわりにｄＧＴＰを用いたこと以外は
前述のｄｓ−ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖を付加したときに用
いた方法と全く同じ条件により、切断したＤＮＡ０両３
″末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。

（５−４）　５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）０
、　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＤＥＴＡ、　０．０５
　ｕ　ｇ　ｄＧＭＰ残基付加ｐＢＲ３２２および０．Ｏ
１ｕｇｄＣＭＰ１μ付加ｃＤＮＡをまず６５　’Ｃで２
時間、次いで４６’Ｃで１２０分間、さらに３７°Ｃで
６０分間、そして室温で６０分間インキュベートした。

エシェリヒア・コリｚ　１７７６（Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｍ
　＋　Ｒ，ｅｔａｌ。ｔｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｎ＋ｂｊｎａｎｔ　ＤＮＡ
Ｔ（豊、　　八、　　５ｃｏｔｔ　　＆　　Ｒ，Ｈｅｒ
ｎｅｒ　　ｅｄ、）　　Ａｃａｄｅａ＋ｔｃ　　Ｐｒｅ
ｓｓ。

（１９７７））を５０ＩＩｄｌのし培地（１００μｇ／
ｍｌのジアミノピメリン酸、５０　ｕ　ｇ／Ｉｌｌ！の
チミジン、１％トリプトファン、０．５％酵母エキス、
０．５％ＮａＣｉｔおよび０．１％グルコースを含む）
に接種し培養液の吸光度が５６２μｍで０．３付近にな
るまで３７°Ｃで振とう培養した。培養終了後、培養液
を３０分間Ｏ℃に保持し、菌体を遠心分離により集め、
５ＩＩＩＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）、０．１Ｍ　Ｎ
ａＣｆ、５ｍＭＭｇＣｊｌ！、および１０ｍＭ　ＲｂＣ
１を含む溶液２５ｄで２回洗浄した。

得られた菌体を５１１μＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）
、０．２５Ｍ　　ＫＣＩ、　５ＲＩＭ　ＭｇＣ１ｚ　、
０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣｆｚおよび１０ｍＭ　ＲｈＣｌ３
を含む溶液２０ａｇに懸濁し、０゛Ｃで２５分間静置後
、菌体を集め上記と同じ溶液ｌＩｎ１に菌体を再懸濁し
、得られた菌体懸濁液の０．２ｍｌに上記組換え体ＤＮ
八を入れ、０°Ｃで６０分間静置した。その後り培地０
．７−を加え３７°Ｃで３０分間振とう培養した。こう
して得られた培養液（０，ｌｄ）を１００μｇ／ｒｄジ
アミノピメリン酸、５０μｇ／ｍ１．チミジンおよび１
５μｇ／ｄテトラサイクリンを含むＬ培地の１．５％寒
天培地上に一面に塗抹し、３７°Ｃで２日間インキュベ
ートした。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その各グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）１００μｇ　／　ｄのジアミノピメリン
酸、５０μｇ／ｄのチミジンおよび１０Ｍｇのテトラサ
イクリンを含むし培地２００　ｍｌに接種し、３７゛Ｃ
で５〜７時間振とう培養した。次に最終濃度１７０μｇ
　／　ｍＲとなるように加えられたクロラムフェニコー
ルを含む新たなし培地２００戚を加え、さらに−晩培養
した。

このようにして増強されたプラスミドＤＮＡを常法に従
い精製した。

ＴＬ−２ｃＤＮ八を有するクローンはｍＲＮＡハイフ゛
リダイゼーションートランスレーションアッセイ（以後
Ｈ−Ｔアッセイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したＤＮＡ（２５μｇ）を制限酵素肛回世により開
裂しフェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよ
びクロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ８
０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミド４０ｄに
溶解した。

反応液を変性させるため９０°Ｃで５分間加熱後１０　
Ｘ５ＳＣ（１，５Ｍ　ＮａＣｊ！、０．１５Ｍ　　クエ
ン酸ソーダ）でＬ３ｍｌに希釈した。その後、本ＤＮＡ
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを８０°Ｃで
３時間乾燥させ、５０％ホルムアミド、２０ｍＭ　Ｐｉ
ｐｅｓ（ｐＨ６，５）、０．７５　Ｍ　ＮａＣｆｆ１．
５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．２％ＳＤＳ及びＪ−１１１細
胞由来のｐｏｌｙ　（Δ）　ｍＲＮへ２５０μｇを含む
溶液中で３７°Ｃ１１８時間インキュベートし、濾紙上
に固定されたＤＮＡとＩＬ−２ｍＲＮＡをハイブリダイ
ズした。

次にその濾紙を６５°Ｃで３回ｐＨ６，５のｌｏｍＭＰ
ｉｐｅｓ、　０．１５　Ｍ　ＮａＣ１溶液、１ｍＭ　Ｐ
ｉｐｅｓ、　　１０ｍＭ　ＮａＣ１溶液で洗浄し０．５
　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＤＳ溶液で９５゛Ｃ１
１分間処理し濾紙からハイブリダイズしたｍＲＮＡを回
収した。

このようにして抽出したｍＲＮＡを常法に従ってオリゴ
ｄＴ−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を
測定した。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の３Ｈ−ＴｄＲ取込みによるアッセイで４８
単位／ｄのＩＬ−２活性陽性を示した。

一方他のグループは明らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同し組成のし培地２００−へ接種し、３７℃で５
〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニコール
含有のＬ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドＤＮＡを増強後、プラスミド
ＤＮＡを同様に標準法に従って精製した。Ｉｆ　ｉ　ｎ
　ｄｉで各プラスミドＤＮＡ約５μｇを開裂後、各プラ
スミドを同様にニトロセルロース濾紙へ固定した。

その濾紙をＩＬ−２ｍＲＮＡとハイブリダイズし、ハイ
ブリダイズしたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞
へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を測定するた
め回収した。

表２に示す如（、ｐ３−１６と表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドＤＮＡのみが陽性のＩＬ−２活
性を示した。それ故、本クローンがＩＬ−２ｃＤＮＡを
有するクローン（Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ｚ　１７７６／ｐ
３−１６ＡＪ１１９９５　（ＦＥＲ月−ＢＰ−２２５）
）と同定された。このようにプラスミドＤＮＡ５ｐ３−
１６はＩＬ−２ｍＲＮＡと特異的ハイブリッドを形成す
る能力のあるＤＮＡ（Ｉｔ、−２遺伝子）を確かに有し
ている事が確認された。

表２ （ａ） ｍＲＮＡの翻訳 生成物 ×　　２ ×３２ ２０．４５３ ２０．９６１ （ｂ） ｍＲＮＡ”の翻訳 生成物 ×　　２ ×３２ ＊　プラスミドρ３−１６からのｃＤＮＡとハイブリダ
イズしたｍＲＮ八 プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡインサートは制限酵素
Ｘｂａ　　ｒにより１部位で、又Ｂｓｔ　ＮＩにより２
部位（Ｘｂａ　Ｉ開裂部位の上流及び下流）で切断され
るという特徴を示した。しかしながら、プラスミドｐ３
−１６は約６５０塩基対より構成されるｃＤＮＡインサ
ートを含んでおり、これは明らかに１１〜１２Ｓの大き
さのＩＬ−２ｍＲＮＡの一部分に相当するものである。

それ故、他のｃＤＮＡライブラリーを、鋳型としてＩＬ
−２ｍＲＮＡを用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄｅｔ
　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋
　ＶＯＩ　Ｍ、　り２５５１＋（１９８１））に従って
作製した。−末鎖ｃＤＮ＾（１，６μｇ）を、ｄＣ肝残
基を付加したＩＬ−２ｍＲＮＡ４μｇを用いて合成し、
そしてｄｓ−ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼＩ（にｌ
ｅｎｏｗ断片）によりプライマーとしてオリゴ（ｄＧ）
１２＝Ｉ８を用いる事により合成した。６８０塩基対Ｄ
ＮΔサイズマーカー（ｓｆｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）より長
いｃＤＮＡ（０，６μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法によっ
て得られ、標準的なＧ−Ｃティリング法によりρＢＲ３
２２のＰｓｔ　１部位へ挿入出来た。

組換えＤＮＡ体によるエシェリヒア・コリ　ｌ１７７６
の形質転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ｐ３−１６　
ｃＤＮＡインサートを用いたＧｒｕｎｓｔｅｆ−Ｈｏｇ
ｎｅｓｓのハイブリダイゼーション法により約２０００
コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラスミ
ドｐｌＬ　２−５ＯＡを含有するコロニー及び形質転換
されたクローン（エシェリヒア・コリ　χ　１７７６／
ｐｌＬ　２−５ＯＡ、八Ｊ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ
−２２６）　）を同定した。ｐＩＬ２−５０へのｃＤＮ
Ａインサートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたニジＳリヒア・コリ　ｌ１７７６／ｐｌ
Ｌ２−５ＯＡからのＩＬ−２ベプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドＤＮＡを通常法に
従い、菌体からＤＮＡを単離後制限酵素Ｐｓｔ　　１に
より切断した。この処理により生成する２つのＤＮＡ断
片のうちより小さな断片はＩＬ−２ペブタ・ｆドをコー
ドしているＤＮＡ遺伝子であった。ρＩＬ２−５ＯＡか
らのＰｓｔ　　Ｉインサートの完全なヌクレオチド配列
はＭａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａｘ
ａｍ、　Ａ、　Ｗ、　ｅｔａｌ、、　Ｅｎｚｙｍ、　６
５．、４９９−５６０．１９８０）により決定した。全
構造を第２図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルヵット細胞か
らクローン化された構成的ＩＬ−２産生細胞株Ｊ−Ａ　
ｌ８８６　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１３０）は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度１×１０ｂ個／ＩＲｆｌテ新鮮な合成培地ＲＩＴＣ−
５５−９に再懸濁し、培養開始８時間後に、実施例１で
詳細に示したステップに従って３ＸＩＯ９個の細胞から
１１〜１２３分画としてのＩＬ−２，ＲＮＮ油抽出ため
に使用された。

ｄｓ−ｃＤＮＡは実施例１と同様に合成され、６００塩
基対より長いｃＤＮＡ（２，４μｇ）が蔗糖密度勾配遠
心法による分画により得られた。次にこのｃＤＮＡをタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを
用い、ｄＣＭＰ残基で伸長し、その５０ｎｇがｄＧＭＰ
で伸長したＰｓｔ　　Ｉ切断ｐＢＲ３２２２５０ｎｇと
アニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
　ｌ１７７６に形質転換され、約４，０００クローンの
トランスホーマントが得られた。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法に従い、プ
ローブとして用いたプラスミド３−１６　ｃＤＮＡと相
補的な３個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトＩＬ
２遺伝子を有するクローンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトＩＬ−２の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスミドｐＴ　ＩＬ２−２２は第４（ａ）図で図解さ
れている如く、一連の改変の方法によりｐＴｒＳ−３（
Ｎｉｓｈｉ　Ｔ、＋Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｔ、　ａｔ　
ａｌ、、　５ＥＩＫＡＧＡＫ［Ｉ　５３．９６７、　（
１９８１）。

同５４．６７６＜１９８２））及びＩＬ−２ｃＤＮＡを
含むｐｌＬ２−５ＯＡから構築した。プラスミドｐＴｒ
Ｓ−３はＴｒｐプロモーターとｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｉ部位とりａＩ部位の間に５ｈｊｎｅ　Ｄａｌｇａｒｎ
ｏ　（以後ＳＯと略号する）の領域の挿入を含む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のＳｐｈ
　　１部位と同様にＳＤ配列の下流１３ｂｐにＡＴＧイ
ニシェーションコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するＤＮＡ配列がＡＴＧコード
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３のＩＩ消化に引続き
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって生成され
る。それ故プラスミドｐＴｒＳ−３（３０μｇ）は制限
酵素力値　１で、常法により切断され、引続きフェノー
ル、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回収さ
れ両末端が７４　ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフラッ
シュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりＤＮＡ（２１，４μｇ）を
回収した。他方ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むｐｌＬ２−５Ｏ
Ａ　３８０μｇはＰｓＬ　Ｉにより切断され、ＩＬ２ｃ
ＤＮ＾インサートはアガロースゲル電気泳動により単離
された。ｃＤＮＡインサート（１１μｇ）はムｉＡＩに
より切断され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによって処理
され、大きい方の部分のＤＮＡｌ０μｇがアガロースゲ
ル電気泳動により単離された。本性に従って１３２個の
アミノ酸をコードするｃＤＮＡ　（７゜２μｇ）が得ら
れ、このＤＮＡ断片はプラントエンドを有していた（第
４（ａ）図）。

次に、このようにして得られたｃＤＮＡ断片をＡＴＧ配
列の丁度下流で、前もって４１により消化されたＴ４　
ＤＮＡポリメラーゼにより処理されたｐＴｒＳ−３ベク
ターへ連結した。このように連結したプラスミドはそれ
から、常法に従いエシェリヒア・コリ１１８１０１へ形
質転換された。この連結は次のようにして行った。ＩＬ
　−２ｃＤＮＡ（０，４ｕ　ｇ　）の前述の大きい方の
断片およびｐＴｒＳ−３ベクターＤＮＡ　０．２μｇを
６．６　ｍＭ　ＭｇＣｉ　！＋　１　ｏ＋Ｍ　ＡＴＰお
よびｌ　Ｏｄ　ＤＴＴを含むｐＨ７，５の６６ｍＭ）リ
ス−塩酸中で７４　ＤＮＮツリガーゼ０８単位と共に混
合し、混合物を４°Ｃ２−晩反応させた。アンピシリン
を含むし培地寒天プレート上に出現するトランスホーマ
ントの中で、１３２個のアミノ酸をコードしているＩＬ
−２ｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを持つコロニーをそ
の場でコロニーハイブリダイゼーションアッセイ法によ
り選択した。こうして選択したコロニーを再び培養（ｌ
ｏａｆ）Ｌ、リゾチーム処理および凍結。

融解による処理によりプラスミドＤＮＡを調製した。

このプラスミドＤＮＡをＰｓｔ　　Ｉとυ徂１で切断し
、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動により分
析し、ｃＤＮＡがｐＴｒＳ−３のＡＴＧ配列の後に正し
い方向で凍結しているｐＴＩＬ−２−２２を同定した。

ｐｔｌＬ−２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は２５μｇ／ｌａｒ！ストレプトマイシ
ンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むχ培地（
２，５％バクトドリブトン、１％酵母エキス、０．１％
グルコース、　　２０ａ＋Ｍ　ＭｇＳＯ４，５０ｍＭト
リス−塩酸、　ｐＨ７，５）　１０　ｔａｌｌ中で３７
°Ｃで一晩生育させた。ついで培養懸濁液１信２を同じ
χ培地（１００ｍｆ）へ接種し、３７°Ｃで培養した。

６５０ｍＢの０．Ｄ、がおよそ１．５−２．０に達した
時点で３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えた。

インデューサーの添加３時間後に、細胞を集め、２０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，５、３０ｔａＭ　ＮａＣ１を
含む）で洗浄し、同じ緩衝液８　ｍｆｔ中に再び懸濁゛
した。

↑ｒｐプロモーターの効果的な機能発現のために、ＩＡ
Ａの如きインデューサーを最終濃度５０μｇ／ｒｓｌに
なるように添加した。かくして細菌細胞中に産生される
蛋白をソニック処理（０℃、２分間）またはりゾチーム
（８μｇ）消化（０°Ｃ２２０分）に引き続き凍結融解
を３回行う事により抽出した。

この方法により、一般的にＩＬ−２は細胞から抽出され
た。抽出されたＩＬ−２活性は１０，０００から１２０
．０００単位／ｒｓｌ！の範囲であった。

ｐＴＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ）ＩＢＩＯ
Ｉ（八Ｊ１２００９）はＦＥＩ？Ｍ−ＢＰ２４５として
寄託されテイル。

実施例４ ＩＬ　　２　ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴｕｌＬ２
−２２はｐＴｕＢＩＰ−５（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ
、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｅｆｋａｇａｋｕ、　５３＋９
６６、１９８１）および実施例３に示したｐＴＩＬ２−
２２から第６図に図解した方法により構築された。プラ
スミドｐＴｕＢＩＰ−５はｐＢＲ３２２中にｔｕｆＢの
プロモーター配列が挿入されている。このプラスミドは
また単一のり、ａ　　Ｉ部位を含んでおり、これは第６
図に示した如りＳＤ配列の２ｂｐ下流に位置している。

ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴＧイニシェーション
コードンの間にＣ１ａ　　Ｉ部位を含んでおり、このＣ
１ａ　　１部位は実施例３に記載した如（ｐＴｒＳ−３
およびＩＬ−２ｃＤＮＡを用いる事による発現プラスミ
ド構築中に破壊されないことから、Ｔｒｐプロモーター
をｔｕｆＢプロモーターに置き換える事はきわめて簡単
であり、その結果ｒＬ−２ｃＤＮ八はｔｕｆＢプロモー
ターの制御下で発現される。

それ故、プラスミドｐＴＩＬ２−２２　（３０ｕ　ｇ　
）は制限酵素Ｃ１ａ　　ＩとＰＶＬＩ　ＩＩにより通常
の方法で切断された。ｒＬ　　２　ｃＤＮＡを含む断片
（約２．２　ｋｂ）はアガロースゲル電気泳動により単
離精製され、３μｇのＤＮＡが回収された。他方、ｐＴ
ｕＢＩＰ−５ベクタ一２０μｇが同様にＣ１ａ　　Ｉと
Ｐｖｕ　ＩＩにより切断され、アンピシリン耐性遺伝子
を含む大きい方の断片（約３．４　ｋｂ）がアガロース
ゲル電気泳動により単離精製され、ＤＮＡ　３．５μｇ
が回収された。

次にこのようにして得られた２個の断片は１つはｔｕｆ
Ｂプロモーターを含み（約３．４ｋｂ）、他方はＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んでおり（約２．２　ｋｂ）以下に示す
如く連結した。

ＩＬ−２ｃＤＮ＾（１゜２μｇ）を含む断片およびｔｕ
ｆＢプロモーターを含む断片０．３μｇを６．６ｍＭ　
ＭｇＣｆｚｌｍＭＡＴＰおよびｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴを含
むｐＨ？、５の６６ｍＭトリス−塩酸中で、Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼ０．８単位と混合し、４°Ｃで一晩反応した
。次にこのようにして連結したプラスミドは常法に従い
エシェリヒア・コリＨＢ　１０１へ形質転換された。

アンピシリンを含むし培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のｐＴｕｌＬ２２２の如
＜　ＩＬ　−２ｃＤＮＡ部分を含む組み換え体ＤＮＡを
持つ８個のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡは実
施例３に記載された如く調製された。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＪＩ８１
０１を３７℃でＬ培地（１００ｍｆ）中で培養した。

６５０ｍ、ｃｚの０．０．がおよそ０．５−１．０に達
した時、菌体を集め、３０ｍＭ　ＮａＣ１を含む２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，５）で洗浄し、同じ緩衝液２
　ｍｌ！中に再び懸濁した。このようにして産生じた蛋
白は実施例３と同様に抽出された。抽出液中のＩＬ−２
活性は６．０００から５６，０００単位／…ｉの範囲で
あった。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＨＢ　
１０１（ＡＪ１２０１０）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４６と
して寄託されている。

実施例５ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＬ２−２２
はｐＧＬｌｏｌ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｔ、　Ｍ、　ａｎ
ｄ　Ｌａｕｃｅｒ　Ｇ、　Ｄ、、　Ｍａｔｈ　Ｅｎｚｙ
ｍ、＋６８＋　４７３−４８３．（１９７９）、Ｇａ１
ｌ　Ｌａｕｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、　１．　Ｎｏ、　２．１３９
〜１４７（１９８１）、　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

７７、　Ｎｏ、　９．５２３０〜５２３３（１９８０）
、Ｅｇｏｎ　Ａａ＋ａｎｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ、　２５．１６７〜１７８（１９８３））と実
施例３に示されたｐＴＩＬ２−２２とから構築された。

すなわち、Ｉａｃプロモーターを含むプラスミドｐＧＬ
　１０１（２０μｇ）が制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで常法に
より切断され、引続きフェノール、クロロホルム処理お
よびエタノール沈澱法により１７μｇのＤＮＡが回収さ
れた。他方、ｐｔｌＬ２−２２　（７５μｇ）の方はり
ａｌおよびＳａｌ　　Ｉで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりＩＬ−２ｃＤＮＡが含むＤＮＡ断片２．２μ
ｇを回収した。この断片はＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ
ノウ断片）で処理する事によりフラッシュにされた。次
にこのようにして得られた２個の断片（０，２５μｇお
よび０．Ｃ６ａｇ）を実施例４と同じ方法でＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼ１．０単位でもって連結した。かくしてこの
連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１に形質転換された。トランスホーマントの中
で、ＩＬ−２ｃＤＮ＾を含むＣ１ａ　　Ｉ　−５ａｌ　
　Ｉ断片の挿入を有するトランスホーマント３ｔｐラベ
ルしたＩＬ−２ｃＤＮ八をブローフ゛として選択した。

次にこれ等のトランスホーマントを、アンピシリン２５
μｇ／ｒａｊ２を含む１０ａ＋ｊ！のχ培地中で培養し
、実施例３で記載した方法によりプラスミドＤＮＡを調
製した。かくして匡プロモーターの丁度下流にＩＬ−２
ｃＤＮＡの開始配列ＡＴＧを有するプラスミドＤＮＡは
Ｐｓｔ　　ＩおよびＸｂａ　　１での切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られたｐＧＩＬ
２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１０１は２５
６ｇ／ｒｓｌアンピシリンおよび２５ａｇ／ｍＩ！スト
レプトマイシンを含有する■５培地１００ｍｆに接種し
培養した。６５０ｍμの０．０．が約０．５に達した時
イソプロピルーβ−Ｄ〜チオガラクトピラノサイド（Ｉ
ＰＴＧ）を１ｍＭの濃度で加え、１時間後に菌体を集め
、実施例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製し
た。抽出液のＩＬ−２活性は６，０００から８０，００
０単位／ｍ１２の範囲であった。

ρＧＴＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ｌＩ［ｌ
　１０１（ＡＪ１２０１１）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４７
として寄託されている。

実施例６ プラスミドｐＴｒＳ−３（１０μｇ）を先ず制限酵素」
　１で切断しＳａｌ　　Ｉ部位をＤＮ＾ポリメラーゼ（
フレノウ断片）あるいはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理
によりフランシェ（ｆｌｕｓｈ）にした。

り旦Ｉで切断後、Ｔｒｐプロモーター領域を有する大き
い方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動によ
り単離精製し、ＤＮＡ　３　ＩＩ　ｇを回収した。

他方、ｐｌＬ２−５ＯＡのＰｓｔ　　ｌ切断により得ら
れるｃＤＮＡインサート１１μｇがＩＡ　Ｉで切断され
、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方の断片
がアガロースゲル電気泳動により単離、精製された。こ
のようにしてＩＬ−２の１３２個のアミノ酸をコードす
るｃＤＮ＾ＤＮＡ断片２μｇ得られた。次に、ｔｒＰプ
ロモーター（上記）を含む断片０．４５μｇＩＬ−２ｃ
ＤＮＡを含む）ＩｇｉＡＩ−カルＩ断片０．５μｇおよ
び合成オリゴヌクレオチド（５”）ＣＧＡＴＡＡＧＣＴ
ＡＴＧＧＣＡ（３′）と（３°）ＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣ
ＣＧＴ　（５’　）　（各々２０　ｐｍｏｌｅ）は両方
とも５′末端でリン酸化されているが、これ等を実施例
３に記載されている方法と同（５方法でＴ４Ｄ　Ｎ　Ａ
　リガーゼ１単位で連結した（第４図（ｂ））。このよ
うに連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリＨＢ　
１０１に形質転換された。出現したトランスホーマント
の中で、目標とするトランスホーマントは次のようにし
て選択した。まず最初に、■し一２ＣＤＮＡおよび合成
オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズ可能なトラ
ンスホーマントがコロニーハイブリダイゼーション法に
よ／）選択された。次に、ＡＴＧＧＣＡ配列の丁度下流
に第２図（ａ）の１１１から１１３の位置のＣＴＴ配列
から始まるＤＮＡ断片（ＣＣＴＡＣＴ・・・・・・・・
・）が挿入されているプラスミドＤＮＡを持ったトラン
スホーマントをＰｓｔ　　Ｉ　、Ｘｂａ　ｌ切断個所を
検定することにより選択した。

ｐＴｌｌ２−２１ａまたはｐＴｌｌ２−２１ｂを含む上
記のトランスホーマントを実施例３に示す方法によりＬ
培地中で培養し、そして実施例３に示す方法により分析
した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いＩＬ−
２活性が認められた。Ｉ）ＴＩＬ２−２１ａを有するエ
シェリヒア・コリ　ＩＩ８１０１（ＡＪ　１２０１３）
およびｐＴｌｌ、２−２１ｂを有するエシェリヒア・コ
リ（八Ｊ　１２０１４）を有するエシェリヒア・コリＨ
Ｂ　１０１はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ　２４８．ＦＥＲ
Ｎ−ＢＰ　２４９として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ　
ｚ　１７７６およびＩ（Ｂ　１０１（Ｂｏｙｅｒ　Ｉｔ
、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１．４５９．（１９６
９））は公知であり、容易に入手可能である。更につけ
加えれば、トランスホーマント中の組換えＤＮＡ体を遊
離させるためにＬ培地で３７°Ｃでトランスホーマント
を培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分子ｌＨすれば寄託したトランスホー
マントから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターｐ１１Ｒ３２２（例えばベセスダリ
サーチラボラトリーから購入可能）　、　ｐＣＥ−１，
ｐＴｒＳ３およびｐＧｔ、　１０１は公知であり容易に
入手可能である。更に、常法によりトランスホーマント
中の組換え体プラスミドを分離することによってさらに
それぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラ
スミドベクターを分離することによって寄託されたトラ
ンスホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来
る。ｐＴｒＳ−３およびρＴｕＢＩＰ−５はそれぞれエ
シェリヒア・コリＦＥＲパーＰ６７３５（ＢＰ　３２８
）およびエシェリヒア・コリＡＴＣＣ３１８７ｇとして
寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第２図（ｂ）はＩＬ−２活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列■、■および■を示す。 第３図はプラスミドベクターｐＴｒＳ−３を示す。 第４図（ａ）、第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベク
ターとしてｐＴｒＳ−３を使用している組換えＤＮＡ５
（ｐＴＩＬ２〜２２．　ｐＴＩＬ２−２１．　ｐＴＩＬ
２−１４およびｐＴＩＬ２〜１５）の構成を示すフロー
チャートである。第５図はベクターとしてｐＫＴ　２１
Ｂを使用している組換えＤＮＡ（ｐＸＩＬ２−２１）の
構成を示すフローチャートである。第６図はベクターと
してρ↑ＵＢＩＰ−５を使用している組換えＤＮＡ（ｐ
ＴｕｌＬ２−２２）の構成を示すフローチャートである
。 図中、”Ａ”どＧ”、“Ｃ″および′Ｔ”はデオキシア
デニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸お
よびチミジル酸をそれぞれ表わす。 特許出願人　財団法人　癌　研　究　会々叩 弔 図 ＜０ 弔 図 区 ぐ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン２活性をもつ、次のアミノ
   酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】