JPH0335795A - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドの製造法に関する。

インターロイキン２（以下、ｒｌＬ−２Ｊと略記する。

）は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチン
あるいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶
性たんばく　（一般には「リンホカイン」として知られ
ている）である（Ｍｏｒｇａｎ　ら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｊｊ％、　１００７〜１００８（１
９７６）　＋　Ｇ１１ｌｉｓら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１２０．　２０２７〜２０３３
（１９７８））、ＩＬ−２はリンパ球の反応性を調節で
き、抗原特異的なエフェクターＴ−リンパ球のｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏにおける長期培養を可能ならしめることができ
る（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅ。

垣、１５４〜１５６　（１９７７）　）。またＩＬ−２
は、胸腺細胞の分裂の促進（Ｃｈｅｎら、　Ｃｅ１ｌ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋２２＋　２２１〜２２４（１９７７
）、　５ｈａ−ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１
２０．１９６７〜１９７３　（１９７８）　）　、ヌー
ドマウスの肺細胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活
性（Ｗａｇｎｅｒら、　Ｎａ　ｔｕｒｅ＋　２８．４４
＋２７８〜２８０．　（１９８０）　）や抗−５ＲＢＣ
プラ一ク形戒細胞反応の誘導（Ｇｉｌｌｉｓら、　　Ｊ
、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１４９．１９６０〜１９６８
　（１９７９））等の関連する他の生物活性をもつこと
が明らかにされている。従って、このリンパ球調節因子
は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり免疫不全状態
を正常な液体や細胞性免疫の状態に一回復させるのに有
用である。これらの明らかにされたＩＬ−２の免疫学的
活性は、ＩＬ−２が悪性腫瘍、細菌またはウィルス感染
、免疫不全、自己免疫疾患等（Ｐａｐｅｒ＋＋ａｓｔｅ
ｒら、　Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、＋５０７
、　（１９８０））に対する医科免疫療法に有用である
ことを示している。インターフェロンと同様に、ＩＬ−
２はナチュラルキラー細胞活性を増強することが示され
てきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く示唆し
ている。更に、ＴＬ−２は単クローン性の活性化Ｔ細胞
の保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分子機構、
Ｔ細胞機能の分化機積、′ｒ細胞の抗原リセプターの機
構を研究する上で重要な役割を担っていることを示して
いる。また、ＩＬ−２は単りローン性Ｔ細胞を長期培養
することにより、他の種々の分野で有用な様々なＴ細胞
由来のリンホカインを製造するためにも使用できる。更
に、ＩＬ−２の産生とリンパ球のＩＬ−２に対する応答
性は、免疫学的機能の重要なパラメーターであり、免疫
異常の臨床診断に有用である。

１１、−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス、
ラットあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製
造されてきた（Ｇｔ１口Ｓら＋　Ｎ　ａ　ｔ　ｕ　ｒ　
ｅ　＋　釘濾＋１５４〜１５６．　（１９７７））　、
　Ｆａｒｒａｒら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋■４＋
１３５３〜１３６０．（１９７８）、　Ｇ１１ｌｉｓら
、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋１２０＋２０２７〜２０
３３．　（１９７８））。ヒトの末梢血リンパ球をマイ
トジェンで刺激することにより（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２４．１９５４〜１９６２．（
１９８０））、Ｇ１１ｌｉｓらはＴリンホーマ細胞株か
らのマウスＩＬ−２の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　
　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏ１．、　１２５．２５７０〜２５７
８（１９８０））とヒト白血病細胞株からのヒトＩＬ−
２の製造（Ｇｉｌｌｉｓら、　Ｊ、　ｔｉｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、、　１５２．１７０９〜１７１９．　　（１９８０
））を報告している。

Ｇ１１ｌｉｓらによる上記の技法は、細胞培養法を用い
てマイトジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒト
ＩＬ−２を製造する方法に関するものである。しかしな
がら、この方法では低濃度のヒトＩＬ−２しか産生され
ないのが難点で、大量の培養液から微量のＩＬ−２を得
るために、複雑な精製工程を必要とする。更に、ヒｌ−
Ｔ白血病細胞株は少量のし）ＩＬ−２に酷似した他の生
理活性物質も産生ずるので、ＩＬ−２をこれらの他の免
疫活性を有する分子と分離、あるいは時として共存する
細胞毒物質（ｔｏｘｉｃ　Ｉｅｃｔｉｎ）と分離するに
はかなりの困難が伴う。

ＩＬ−２を製造する他の方法として、インターフェロン
のような他の生理活性ヒト由来たんばくを製造するため
に用いられた組換えＤＮＡ　（デオキシリボ核酸の略）
法（Ｇｒａｙら、　Ｎａｔｕｒｅ　牝、　５０３〜５０
８゜（１９８１）、　Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ
　’１ＪＪ３．３１６〜３２０　（１９８０）Ｔａｎ　
ｉｇｕｃｈ　ｉら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５．　
　（１９８０））が好ましいと思われる。しかしながら
、本発明の以前には組替えＤＮＡ法によってＩＬ−２を
製造する試みは成功していなかった。例えば、組桑えＤ
ＮＡ体によってＩＬ−２を産生ずる生命体を作成しよう
とする試みは、恐ら（ＩＬ−２ポリペプチドをコードす
る遺伝子が未だクローン化されていなかったために成功
していないという事が、“日経バイオチクノロジー、第
１９号、　１９８２年７月５日”に報告されていた。

従って、ｒＬ−２をコードするクローン化遺伝子とその
遺伝子を持った組換えＤＮＡ体が渇望されてき−た。ま
た、組換えＤＮＡ体を有する生細胞様と、その細胞株を
使ってＩＬ−２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明自となる。

本発明の目的はＩＬ−２活性を有するポリペプチドの製
造法を創出したことにある。

すなわち、本発明は原核細胞に適合しうるプラスミドベ
クターのＤＮＡ鎖の上流より、それぞれ原核細胞内で機
能するプロモーター、リボゾーム結合部位、翻訳開始コ
ドンおよびヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドをコードする遺伝子がこの順序で配列された組換え
ＤＮＡ体により形質転換された原核生物の細胞を培地中
で培養することを特徴とする糖類を伴わず、ヒト由来の
他の蛋白質を含有しないヒトインターロイキン２活性を
もつポリペプチドの製造法を提供するものである。

本発明により製造されるポリペプチドとしては、ヒトイ
ンタ７０イキン２活性を有するものであればいずれでも
よい。

該ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドの
例としては、たとえば分子中に次のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが挙げられる。

Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　ＧＩＮ　　
ＬｅｕＧＩＮ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　ｔｌｉｓ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇ
ＩＮ　　Ｍｅｔｌｌｅ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｇｌｙ　ｌｉ
ｅ　ＡｓＮ　ＡｓＮ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＮ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＴｙｒＭｅｔ　Ｐｒｏ
　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　
Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＧＩＮ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
　ＧｌｕＧｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡｓＮ　ＰｈｅＨｉｓ
　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　
Ｔｉｅ　Ｓｅｒ　ＡｓＮ　ＴｌｅＡｓＮ　Ｖａｌ　Ｉｌ
ｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒＡｌａ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　
Ｌｅｕ　ＡｓＮ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ｌ１ｅＴｈｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｃｙｓ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ上記ヒトインターロイキン２
活性を有するポリペプチドの具体例としては、たとえば
次のアミノ酸配列を有するものなどが挙げられる。

Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　ＧＩＮ　　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　　ｌｉｅ　　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ・Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ Ｐｈｅ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ １１ｅ　　ＡｓＮ　　Ｖａｌ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ。

Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｐｒ。

ＧＩＮ　　Ｌｅｕ　　ＧＩＮ ＧＩＮ　　Ｍｅｔ　　ｌ１ｅ ＡｓＮ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　ＧＩＮ　　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　　ｌｉｅ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｇｌｕ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ ＡｓＮ　Ｇｌｙ　　１ｉｅ Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ ｌｉｅ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ １１ｅ　　Ｖａｔ　　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅａ Ｌｅａ Ｌｅａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ５Ｎ Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｇｌｕ　　ｔｌｉｓ ＡｓＮ　　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　　Ａｒｇ Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ Ｌｅａ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ ＡｓＮ　　ＡｓＮ　Ｔｙｒ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ａｌａ　　ＧＩＮ　　Ｓｅｒ Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ｌ１ｅ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｌａ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ １１ｅ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅａ １ｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅａ ５Ｎ Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ ＡｓＮ　　ＡｓＮ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ａｓｐ ＡｓＮ　Ｔｙｒ Ｔｈｒ　　ＧＩＮ Ｌｅｕ　　ＧＩＮ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　　１ｌｉｓ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ ５ｅｒ　　ＡｓＮ Ｇｌｙ　　５ｅｒ Ａｓｐ　　Ｇｌｕ Ａｒｇ　　Ｔｒｐ Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　　ＧＩＮ Ｌｅｕ　　ＧＩＮ Ｌｙｓ　　ＡｓＮ Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　ＧＩＮ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ ｒｌｅ　　ＡｓＮ　　Ｖａｔ Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ Ｔｈｒ。

もしくは Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ Ｌｅａ　ＧＩＮ　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ １１ｅ　ＡｓＮ　Ｖａｌ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ しｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｈｅ　　Ｖａｔ　　Ｌｅｕ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ ｌｉｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　ＧＩＮ　５ｅｒ Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｇｌｕ　　ｔｌｉｓ　　Ｌｅｕ ＡｓＮ　Ｇｌｙ　　ｌ１ｅ Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ 目ｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　ＧＩＮ Ａｓｐ　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ １１ｅ　　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ ＬＹ３　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　ＡｓＮ １１ｅ　　Ｓｅｒ　　ＡｓＮ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ ＡｓＮ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ ＡｓＮ　　ＡｓＮ Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　　ＧＩＮ Ａｓｐ　Ｌｅｕ Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　ＧＩＮ Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＧＩＮ Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ、、ＡｓＮ Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　　ＡｓＮ Ｔｉｅ　　Ｓｅｒ　　ＡｓＮ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒ Ｇｒｕ　　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　
　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　　Ａｓｐ　ＧｌｕＴｈｒ　
　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　
　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｒｇ　　Ｔｒｐｌ
ｌｅ　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＧＩＮ　　Ｓｅｒ　
　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　ＬｅｕＴ
ｈｒ　　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｈ
ｉｓＬｅｕ　ＧＩＮ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　Ｌｅ
ｕ　　Ａｌａ　ＧＩＮ　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　ＡｓＮＰ
ｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ＡｓＮ１１ｅ　ＡｓＮ　
Ｖａｔ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ
　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓ
ｐ　ＧｌｕＴｈｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　
Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　
Ａｒｇ　　Ｔｒｐｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇ
ＩＮ　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　
　ＬｅｕＴｈｒ 本発明により製造されるポリペプチドとし°ζは、上記
アミノ酸配列の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠
くポリペプチド；上記アミノ酸配列の中の１個ないしそ
れ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチド；上記アミノ酸配列に対して１個
ないしそれ以上のアミノ酸が追加されたポリペプチドで
あってもよい。

本発明における原核生物の細胞としてはエシェリヒア属
に属するものが好ましく、さらにエシェリヒア・コリに
属するものが好ましい。

本発明によって、ＩＬ−２はＩＬ−２活性を有するポリ
ペプチドを産生ずべくコードされた遺伝子の挿入と、細
胞の中で複製され得るベクターＤＮＡの挿入で組換え法
により修飾され、該遺伝子のコードシーケンスが、プロ
モーターシーケンスの下流に位置するＤＮＡによってＩ
Ｌ−２を産生ずべく形質転換させた原核生物細胞株、特
にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養（好気的）する
ことによって製造される。

ＩＬ−２ポリペプチドをコードしたクローン化遺伝子は
、ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを産生ずる能力を
もつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由来す
るＩＬ−２に相当するメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
；”ＲＮＡ”はリボ核酸の略、以下”ＩＬ−２ｍＲＮＡ
”という）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写するこ
とによって得ても良い。得られた一重鎖ｃＤＮＡ（ｓｓ
−ｃＤＮＡ）は２重鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）に変
換させることができる。

ｃＤＮＡを調製するための鋳型として用いるｍＲＮＡは
、ＩＬ−２ポリペプチドを産生ずる哺乳動物細胞から単
離することができる。単離されたＲＮＡはポリアデニル
化され（ＧｉＬＬｉｓら、　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｊｃａ
Ｉ　Ｒｅｖ、１６ｕ。

１６７〜２０９　（１９８２））　、ポリアデニル化さ
れたＲＮＡは、例えばシー！糖蜜度勾配遠心法によって
１１〜１２ｓ画分に分画することができる。Ｌ３Ｓのｍ
ＲＮＡにＩＬ　　２　ｍＲＮＡ活性が現われることがあ
るが、この場合は１１〜１２　ＳｍＲＮＡの凝集物であ
ることが考えられる。

本発明に用いるｍＲＮＡの供給源となるＩＬ−２を産生
ずることができる哺乳動物細胞は、哺乳動物より摘出で
きる末梢血単核球、扁桃腺細胞、肺臓細胞のようなＴ−
リンパ球で良い。細胞にＩＬ−２産生能を与えたり、ま
たはＩＬ−２活性を増強するために、ナイロンカラム処
理、抗血清と補体処理。

密度勾配分画、ノイラミニダーゼとガラクトースオキシ
ダーゼの組合せ処理、トリプシン処理のような様々な酵
素処理、Ｘ線照射など従来知られた方法で前処理しても
良い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下で培養
役得られるクローン化Ｔリンパ球もｍＲＮＡの供給源と
して用いることができ、これはより好ましいＴ−リンパ
球である。白血病やリンパ腫細胞株に由来するＴリンパ
球それ自体または上記の方法で前処理または変異したそ
れらの誘導体などの形質転換されたリンパ球細胞株また
はクローニングされた形質転換細胞株もｍＲＮＡの供給
源として好ましい。明らかに、クローン化した細胞株は
通常クローン化前の親株に比較して多量のＩＬ　−２ｍ
ＲＮＡを含んでいる。上記したリンパ球由来細胞とＣＥ
Ｍ、　Ｍｏ１ｔ　４Ｆ、　ＢＷ５１４７のごとき腫瘍細
胞株を融合することによって得られたＴ細胞ハイブリド
ーマもまた本発明に使用するのに好ましい哺乳動物細胞
である。この場合のリンパ球由来細胞は、（１）ｒＬ−
２の自発産生細胞および（２）Ｉｔ、−２産生を補助す
る他の細胞の存在下または非存在下に培養液中にマイト
ジェンが導入され存在している時のみＩＬ−２を産生ず
る細胞を含む。

ＩＬ−２自発産生細胞においてＴＬ　−２ｍＲＮＡを誘
導するために、ＩＬ−２自発産生細胞は、細胞培養の分
野でよく知られた方法で培養される。マイトジェン存在
下のみでＩＬ−２を産生ずる細胞においてｍＲＮＡを産
生ずる場合は、培養した細胞は培地で良く洗った後、血
清を含むかまたは含まないローズウエルパークメモリア
ルインスティテユート１６４０（以下、“ＲＰＭＩ　１
６４０”と略す。）、ダルベラコラ変法イーグル培地（
以下”ＤＭＥＭ”と略す。）またはクリック培地のごと
き培地に再び浮遊する。これらの細胞培養培地には、ペ
ニシリン、ストレプトマイシンまたは他の抗生物質、Ｌ
−グルタミン、ヘペス緩衝液、または炭酸水素ナトリウ
ムのような種々の添加物を細胞培養の分野で一般に使わ
れる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度は０．５〜
４Ｘ１０”細胞／−である。ｍＲＮＡの活性化とＩｌ、
−２の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられる
。この適当な刺激剤の中には、マイトジェン。

ノイラミニダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ。

塩化亜鉛の如き亜鉛化合物またはプロティンＡ。

ストレプトリジン−〇の如き細菌由来のリンパ球活性化
因子が含まれる。刺激された細胞は回収され、洗浄され
る。マイトジェン刺激の際、マクロファージまたはプン
トリティック細胞を共存させるとやはりｍＲＮＡを活性
化し、あるいは活性化ｍＲＮＡの収量を増大させ得る。

同様にＲａｊｉ、　’Ｄａｕｄｉ、　Ｋ５６２゜ＢＡＬ
Ｌ−１の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に由来
する細胞株を共存させてもｍＲＮＡは活性化され、また
は活性化ｍＲＮＡの収量を増大させ得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養により、または組織適合
動物の体内で維持される。ｍＲＮＡの供給源を調製する
ためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養による継代を行なう場合に
は、従来Ｔ細胞の生育を促進することが知られている培
地であればどのような培地にもこれら細胞は生育する。

これらの培地には哺乳動物の血清、血清成分または血清
アルブミンを添加しても良い。ｍＲＮＡの活性化のため
の培養時間は、ｍＲＮＡを生成するための活性化に必要
な時間に対応する。

この時間は、通常ＩＬ−２の培地中への産生が開始され
るまでに必要な時間と対応している。好ましい時間は、
マイトジェン等の刺激剤を添加してから３〜１２時間で
ある。培養時間が長すぎる場合、生成したＩＬ−２ｍＲ
ＮＡが分解されることがある。■し一２産生細胞の活性
化に際し、ＰＭＡまたはＴＰＡの如きホルボールエステ
ル類を１０〜５０ｎｇ／Ｉｄ添加して活性化レベルを上
昇させることもできる。

ＩＬ２ｍＲＮＡ活性化のための上記工程はｐｌ＋７．０
〜７．４．温度範囲３２〜３８°Ｃの飽和水蒸気の環境
下で行なわれる。

ＩＬ−２を産生ずる哺乳動物細胞を取得し培養する方法
を以下に述べる。

（イ）ＩＬ−２自発産生株の取得 ヒｌ−Ｔリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細
胞（フレンド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／ア
メリカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイ
ツ国立点センター／ハイデルベルヒ／西、ドイツ等で自
由に手に入る。）をｌ×ｌＯｈ個／ＩＩｉの細胞密度で
クリック培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照
射速度で合計８．０００レントゲンのＸ線照射を行なう
。この後、本細胞を０．１細胞７２００μｉ培地の細胞
密度で９６穴の平底マイクロタイタープレート（「ファ
ルコン３０７２」）に添加し、５％牛脂児血清を含むク
リック培地中で３週間３７°Ｃにて５％ＣＯｚインキュ
ベーター中にて培養する（限界希釈法によるクローニン
グ）、細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、
細胞が底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌ
ンク社製培養プレートに移し、クリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜２Ｘ１０’
個／成の細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含ま
ない無血清合成培地に懸濁して２日間培養し、本培養上
清を遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μのξリボ
アフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なった。こ
のようにして得た培養上清のＩＬ−２活性を測定するこ
とによってＩＬ−２を自発産生ずるＸ線処理変異株が選
択され、かつクローニングされた。

（ＩＩ）ヒト末梢血単核細胞よりＩＬ−２産生株の取得
ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと略す
）、を採取する。本ＰＢＬをｌＸｌ０”個／ｄの細胞密
度で５％ＦＣＳを含むクリック培地に懸濁し、各２−宛
２４穴のヌンクの培養プレートに接種する。ここにフィ
トヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社製）を５μｇ／ｄの終
末濃度になるように１ＯＯｕＩ！、添加し、上述の条件
下に４８時間培養し、次いで細胞を培養液で洗浄し、再
びｌ×１０’個／−の細胞密度でクリック培地１　ｔｔ
ｒｆｌに接種する。さらに、コンカナバリンＡ（以下、
ＣｏｎＡと略す、）２．５μｇ　／　ｍｌで４８時間刺
激したヒト牌細胞から調製したコンディショニングした
培地ＩＩＩ＆を加え、該コンディショニングした培地５
０％を含む培地を３日毎に取り換えて、ＰＢＬからのヒ
トＴリンパ球を長期継代培養する。このように長期継代
培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希釈法で
コンディショニングした培地に由来するヒト牌細胞の存
在下、クローニングを行ない、かつ同様に細胞増殖を行
なう、こうして得られたクローン化Ｔリンパ球を１×１
０６個／　ｔｔｒｌの細胞密度に１０μｇ　／　ｍ（ｌ
のフィトヘマグルチニン（以下、ＰＨＡと略す。）の存
在下、２４穴のタンク培養プレート中のＲＰ旧１６４０
培地ｌＩｄに接種し、２４時間、３７°Ｃで７．５％Ｃ
Ｏ，インキュベーター中にて培養した。本培養上清を遠
心分離操作で分離し、次いで０．２２μのごリボアフィ
ルターで無菌化を行なった後、ＩＬ−２産生ヒト正常下
リンパ球クローンを同定するために、ＩＬ−２活性検定
を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でＩＬ−２を生産するヒトリン
パ球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や血
清１〜２％を含むＢＰＭＩ　１６４０培地中にてＣｏｎ
Ａ　　１０　ＩＩ　ｇ　／−やｐＨ八２へ５μｇ／ｄの
存在下に２４時間培養すると、ｌＯ〜４．０００単位／
−のＩＬ−２を産生ずることができる。また、これらヒ
ト悪性化細胞は塩化亜鉛、プロティンＡ。

ピシバニール存在下に培養しても、ＩＬ−２を産生ずる
。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりＩＬ−２を産生
ずる細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ４Ｆや前述の限界希釈
法でクローン化されたジュルカット細胞の１つのクロー
ン、ジェルカフ１９９株は、上述のごときレクチンやマ
イトジェンを広い濃度範囲で加えて２４〜７２時間培養
してもＩＬ−２を産生じない。ところが、この間モノ力
インの１種であるインターロイキン１を５〜１０ｕ／ｍ
Ｒまたは５０％のに５６２やラージ（Ｒａｊｉ）細胞を
共存させて３７°Ｃ２２４時間培養すると、ＩＬ−２を
確認しうる量（１（１〜Ｌ　ＯＯｕ／ｍｌ）産生ずる。

このようにして活性化された細胞よりＩＬ　−２ｍＲＮ
Ａを抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行
なえばよい。たとえば、ＮＰ　　４０．　ＳＯ３，Ｔｒ
ｉｔｏｎ−Ｘ１００．デオキシコール酸などの界面活性
剤を添加して細胞を部分的または完全に分解するか、ホ
モゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細
胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶化する。その際に
ＲＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中
にＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビ
ニル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカ
ーボネート、バナジウム複合体などを添加しておくのが
好ましい、また、場合に応じては、抗ＩＬ−２抗体を用
いてＩＬ−２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これ
よりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行ない
得る。

また、ｐｏｌｉＡを含むｍＲＮＡの精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、セファロース２Ｂを担体とするポ
リＵ−セファロースなどのアフィニテイ・カラムあるい
はバッチ法による精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画、
アガロースゲル電気泳動法等によって行なうことができ
る。

上記の如くして得られたｍＲＮＡがＩＬ　　２ｍ１ＲＮ
＾活性を有するものであることを確認するためには、ｍ
ＲＮＡを蛋白に翻訳させ、その生理活性を調べるか、抗
」Ｌ−２ペプチド単クロ一ン性抗体を用い該翻訳蛋白を
同定する等の方法を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡは
通常、アフリカッメガエル（ｋ辿坐旺１ａｅｖｉｓ）の
卵にマイクロインジェクションすることにより（Ｇｕｒ
ｄｏｎら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２３３．１７７〜１８２
（１９７２））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞
翻訳システムを使用することにより対応する蛋白に翻訳
される。

ＩＬ−２活性は、先にＧ１１１ｉｓら（Ｇｉｌｌｉｓら
、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　月段、　２０２７〜２０３３（１
９７Ｂ））によって基本的には述べられているミクロ検
定法によって確認できる。この検定法では、Ｇ１１ｌｉ
ｓらによって確立された方法に従って作成した細胞障害
性Ｔリンパ球細胞株（以下、ＣＴＬＬと略す。）のＩＬ
−２に依存細胞のＤＮ＾合威合算上昇Ｌ　−２ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ）を指標としている。即ち、４Ｘ１０’個のＣＴＬ
Ｌ細胞を２％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１
００ｕｆに懸濁し、１００ｕｆの連続希釈した翻訳産物
と共に９６穴の平底マイクロプレートに接種する。３７
°Ｃ，５％ＣＯ，下で２０時間培養した後、細胞を０．
５μＣｉ／ウエルのＨ−ＴｄＲで４時間ラベルし、自動
細胞ハーベスタ−を用いて帯状ガラス繊維上に細胞を回
収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シンチレーション
法で測定する。

この検定により、ＩＬ−２存在下に培養されたＣＴＬＬ
細胞が投与量に依存して”Ｈ−ＴｄＲを取込むことが判
明し、このことから検体中に含まれるＩＬ−２量を明確
に計算することができる。

ＩＬ−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有するので、
ＩＬ−２活性をＴリンパ球の増殖を指標として測定する
ことができる。即ち、５個のＣＴＬＬ細胞を２％のＦＣ
Ｓを含むＤＭＥＭ１００ｕｊ！に懸濁し、１００μｌの
連続希釈した翻訳産物と共に９６穴の平底マイクロプレ
ートに接種する。７２〜９６時間、３７°Ｃ，５％ＣＯ
□下で培養した後、活性化し増殖した細胞の数を顕微鏡
下で計測する。対照群として１ｏｏｕ、’Ｍｌ、ＩＯＵ
／−のＩＬ−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数
と比較して検体のＩＬ−２活性を求める。

このようにして最も高活性の両分から得られたＩＬ−２
ｍＲＮＡはｄｓ　−ｃＤＮＡを合成するための鋳型とし
て用い、ｄｓ　−ｃＤＮＡはベクターＤＮＡと結合させ
る。

ｃＤＮＡの合或は従来の方法によって行なう。

まず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーと
してｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰの
存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的なｓｓ　−
ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解
除去した後、今度は一単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写
酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いてｄｓ　−ｃＤ
ＮＡを台底する。

このようにして得られたｄｓ　−ｃＤＮＡと原核生物で
複製できるレプリコンを含むベクターＤＮＡから組み換
えＤＮＡ体が作られる。しかる後、この組み換えＤＮＡ
体は宿主細胞に組み込まれる。

このｄｓ　−ｃＤＮＡ及び原核生物で増殖し得るベクタ
ーＤＮＡは、これらを結合させる前にエキソヌクレアー
ゼ処理、化学合成ＤＮＡ断片の追加、　ｄｓ−ｃＤＮＡ
やベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつけるため
にＧ、Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理によって修飾される
。これらの連結可能なＤＮＡは、例えばＡＴＰ共存下に
Ｔ４ファージのＤＮＡライゲースによってつぎ合せるこ
とが出来る。

このようにして調製された組換えＤＮＡ体によってクロ
ーン化されたｃＤＮＡを増巾させるため又はＩＬ−２ポ
リペプチドを製造するために生細胞を形質転換する。

ＩＬ−２生産のための宿主細胞として、本発明ではバチ
ルス・ズブチリスなどの原核生物細胞またはエシェリヒ
ア・コリを用いる。宿主細胞中でのＤＮＡ増巾のために
はエシェリヒア・コリを宿主とすることが出来るが、そ
の他の宿主細胞とすることも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはＥ″に型
プラスミドベクター（ストリンゼント型）としてｐｓｃ
ｌｏｌ、　ｐＲＫ３５３．　ｐＲＫ６４６．　ｐＲＫ２
４Ｂ、　ｐＤＦ４１など、、ＥＫタイププラスミドベク
ター（リラックスドタイブ）　　：　Ｃｏ１Ｅ１．　ｐ
ＶＨ５１，ｐＡｃ１０５．　Ｒ５Ｆ２１２４゜ｐｃＲｌ
、１Ｍ８９．　ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３
２４，ｐＢＲ３２５゜ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２Ｂ、　
ｐＫＹ２２８９．　ｐＫＹ２７００．　ｐＫＮ８０．　
ｐＫｃ？。

ｐＫＢ１５Ｂ、　ｐＭＫ２００４．　ｐＡｃＹｃｌ、　
ｐＡｃＹｃ１８４．　ｄｕｌ等、、λｇｔタイプファー
ジベクター：λｇｔ、λｃ、λｇｔ、λＢ。

λＷＥＳ、λＣ，λ−ＥＳ、λＢ、λＺＪｖｉｒ、、　
　λＢ＋ｌ　　λＡＬＯ，λＢ。

λＷＥＳ、Ｔｓ６２２．λＤａＩ１１等が含まれテイル
。一般ニ、ｐＢＲ３２２はエシェリヒア・コリ用ベクタ
ーとしてしばしば利用されてきたが、この場合最も良い
クローニング部位はＰｓ　ｔｌならびにＥｃｏＲ１部位
である。

ＭＪ、換えＩＩＩＩＩＡ体を用いた宿主細胞の形質転換
には、通常よく用いられる次の方法がある。エシェリヒ
ア・コリの如き原核生物が宿主の場合、このＤＮＡを取
り込むことの出来るコンピテント細胞は対数増殖期にお
ける細胞を回収後、床く知られているＣａＣＩｌｘ法に
よって形質転換出来る。形質転換反応液中にＭｇＣｊｌ
！、又はＲｂＣｆを共存させれば形質転換効率は向上す
る。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後形質転換さ
せることも可能である。

ＩＬ−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何
れかを用いて形質転換後分離可能である。

（１）プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細胞
抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて１ｌ−１２Ｓ画分
として部分精製したＩＬ−２＊ＲＮＡを調製し、この部
分精製ｍＲＮＡを鋳型として２Ｒｐ−放射性５ｓ−ｃＤ
ＮＡを合成する。アルカリ処理にて鋳型＋ｓＲＮＡを除
去後、単離されたｃＤＮＡは、抗原刺激しない哺乳動物
細胞から抽出され、部分精製した１１１２　Ｓｎ＋ＲＮ
＾でハイブリダイズする。引続いてハイブリダイズしな
かったｃＤＮＡとハイブリダイズしたｃＤＮＡはハイド
ロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画する
。ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリダイズ
したｃＤＮ＾をそれぞれプローブＡ、及びプローブＢと
呼ぶ。何れの組換え体も同一の方法によりそれぞれニト
ロセルロース濾紙上で生育させる。そして、細胞のＤＮ
Ａをアルカリ処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ及
びＢをそれぞれ、二つの異った濾紙上でＤＮＡとハイブ
リダイズさせる。その後、オートラジオグラフィーを行
ってプローブＡと陽性に反応する組換え体（プラス）、
プローブＢと僅か又は全熱反応しない組換え体（マイナ
ス）を選別する（各日ら；　Ｐｒｏｃ。

Ｊａｐ、　Ａｃａｄ、、　Ｖ１５５Ｂ　　４６４〜４６
９（１９７９）。

（２）第２の方法は、例えば１０００〜１０．０００の
組換体りＰ−ンを２〜３０ないし２〜３００クローン宛
のクローングループに大別し、それぞれのクローングル
ープをそれぞれ常法によって培養しプラスミドＤＮＡ５
を調製する。次いで、これらプラスミドＤＮＡ５を例え
ば熱変性して５ｓ−ｃＤＮＡをニトロセルロース濾紙上
に固定し、活性化ＩＬ−２−ｍＲＮＡを含有する哺乳動
物細胞から調製されたｍＲＮＡと相補的にハイプリダイ
ゼーシゴンを行う。あるいはまた、ＩＬ−２ｍＲＮＡを
含有するｍＲＮＡ　（混合物）を熱変性したプラスミド
ＤＮＡ　（混合物）とハイブリダイズさせるとＤＮＡ　
−ｍＲＮＡハイブリッドがニトロセルロース濾紙上に固
定される。この濾紙を１ｍＭの１１ＥＰＥｓ、あるいは
１０ｍＭの食塩水のごとき低塩類緩衝液で洗浄し、濾紙
上に吸着されたｍＲＮＡを０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．
　Ｉ　Ｘ　ＳＤＳ溶液含有液で例えば９５°Ｃ１１分間
処理して抽出する。精製ｍＲＮＡはこれをｏｌｉｇ。

ｄＴ−セルロースカラムクロマトグラフィーにてン容出
回収する。次いで、ｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母
細胞にマイクロインジェクションして蛋白質に翻訳して
ＩＬ−２活性を確認する。あるいはｍＲＮＡに依存性の
網状赤血球系又は小麦胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞合成
系を用いてこのｍＲＮＡを蛋白に翻訳させ、。

抗ＩＬ−２抗体を用いてＩＬ−２−活性を分析すること
が出来る。これらの方法によってＩＬ−２活性が検出さ
れたグループをさらに少数の組換え体クローンを含有す
る群に類別し最終的にはＩＬ−２ＤＮＡを有する単一ク
ローンが得られるまで繰返し実施する。

ＩＬ−２産生能のある組換え体よりＩＬ−２ポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを得るには、先ずトランスフォ
ーマント中の組換えＤＮＡ体を分離し、これを制限酵素
エンドヌクレアーゼで切断する。切断によって得られる
ＤＮＡ分画より組込まれたｃＤＮＡ画分を分離する。

ｐｌＬ−２−５０Ａを組換えたＤＮＡよりＩＬ−２ポリ
ペプチドをコードするＰｓｔｌ　ＤＮＡインサートの全
ヌクレオチド配列は、Ｍａｘａｎ＋　ａｎｄ　Ｇ１１ｂ
ｅｒｔ法（Ｍｅｔｈ。

［Ｕｎｚｙｍ、　ｆ１５．４９９〜５６０．（１９８０
））；ならびにニブオキシヌクレオチド鎖末端法（Ｓｍ
ｉｔｈ、＾、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍｅｔｈ。

Ｕｎｚｙｍ、　Ｆ４．５６０〜５８０．　（１９８０）
　）にて決定された。

ｃＤＮＡインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ
）に示すごとく、このｃＤＮＡはそれぞれＢｓｔＮｌ、
χｈａ　Ｔ　、　ＢｓｔＮ　Ｉなる制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断される構造を有する。

本ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列は一つの大きなオー
プンリーディングフレームを保有する。真核生物の読み
取り開始配列となることの多い第一のＡＴＧ配列（Ｋｏ
ｚａｋ、　Ｍ、　Ｃｅｌ！、　１５．１１０９〜１１２
３（１９７８））は、５”一端から４８−５０ヌクレオ
チド位に存在し、読み終り配列ＴＧＡが存在するヌクレ
オチド位５０７−５０９迄１５２の配列がこのＡＴＧに
つ太がっている。ｍＲＮＡの３’　−ｐｏｌｙ　（Ａ）
末端に相当するＡのつながりがｃＤＮＡ末端に見出され
、通常真核生物ｍＲＮＡのほとんどに見出される６個か
らなるヌクレオチドＡＡＴＡＡＡ（７７１−７７６位）
が先に位置する。

（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　Ｎ、Ｊ、　＆　Ｂｒｏｗｎｌ
ｅｅ　Ｃ，Ｇ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２６３゜２１１−２
１４．　（１９７６）） ｃＤＮＡによってコードされる７５ノ酸配列は第２図（
ｂ）（アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、しかもア
ミノ酸配列■のポリペプチドは１５３個のアミノ酸から
なり、その分子量は１７６３１．７ダルトンと計算され
る。今日迄知られている分泌蛋白の殆んどに見られると
報告されているように（ＢｌｏｂｅｌＧ、　ｅｔ　ａｌ
、　５ｙｔｓ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　３
３．９〜３６（１９７９））、上記演えきＩＬ−２ポリ
ペプチドのＮ末端領域はやはり疎水性である。本領域は
戒ＰＩＬ−２の分泌時に切断されるシグナルペプチドの
役割を果しているであろう。切断は２０−２１位のＳｅ
ｔとＡｌａ間で起るか２１−２２位間の＾１ａ−Ｐｒｏ
間で切断され、アミノ酸配列■および■を有するポリペ
プチドを生成する。何故ならば同様な切断位置は今迄知
られたその他の分泌蛋白にもしばしば見出されているか
らである（Ｂｌｏｂｅｌ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｓｙ
ｍｐ、　Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　３３．９〜３６（１９７９））、従って、
或ｙ６ｒＬ−２ポリペプチドは１３３ないし１３２個の
アミノ酸から成り、分子量は１５４２０．５または１５
３４９．４ダルトンと算出される。本分子量値はジュル
カソト細胞から得られたヒトＩＬ−２蛋白の分子（４１
（１５０００ダルトン）として報告されたものを対比さ
れる（Ｇｉ！ｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、、　６３＋　６１〜２０９　（
１９８２）　）。また実施例３に示すごとく塩基配列１
１１〜１１３位にあるＣＣＴ配列から始まるＤＮＡ画分
、即ち、２２位に位置するＰｒｏから始まるポリペプチ
ドに対するコード（第２（ｂ）図中のアミノ酸配列■）
はＩＬ−２活性を有するポリペプチドを表現しているこ
とが確認された。塩基配列１０７〜１１０位にあるＧＣ
Ａから始まるＤＮＡ画分、即ち第２（ｂ）図のアミノ酸
配列Ｈに示すごとく、２１位に位置するＡｌａから始ま
るポリペプチドをコードするＤＮＡ画分は、実施例６に
示すごと（ＩＬ−２活性を有するポリペプチドを表現し
ていることが確認された。

有核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（各
日ら、　Ｇｅｎｅ　１０．１１〜１５（１９８０）　、
大野、呑口、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋　７７５３０５〜５３０９（１９
８１）；　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２
９５．５０１〜５０Ｂ　（１９８１）　）。この多形現
象によって、蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換さ
れる場合もあれば、塩基配列の変化はあっても全く変ら
ない場合もある。ヒトＩＬ　−２・ｃＤＮＡの場合、ｐ
ｌＬ−２−５０ＡｃＤＮ＾０５０３位のＡ残基がＧ残基
で置き換えられた他のｃＤＮＡクローン（ｐＩＬ−２−
５０３）も検出できる。ｐｌＬ−２−５０Ａ　ｃＤＮＡ
とは塩基配列が異なるその他のｃＤＮＡクローンの存在
も期待できる。

上記説明からも明らかなごとく、本発明に係る遺伝子は
、第２（ａ）図に示された塩基配列を有するｌ）Ｎ八、
４８−５０位のＡＴＧ配列から始まり、５０４〜５０６
位にある少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有す
るＤＮＡ５．１０８−１１０位のＧＣＡ配列から始まり
、ＧＣＡ配列から少くともＡＣ丁配列に至る連続塩基配
列を有するＤＮＡ、また１１１−１１３位のＣＣＴ配列
から少くともＡＣＴ配列に至る連続塩基配列を有するＤ
ＮＡを包含する。本発明に係る遺伝子はまた、５０４〜
５０６位のＡＣＴ配列に終り、１位のＡに始まるＤＮＡ
　、　４８−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、　１０８
−１１０位のＧＣ＾配列で始まるＤＮＡ又は１１１−１
１３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。更に本
発明に係る遺伝子は、５０７〜５０９位のＴＧＡ配列に
終り、１位の八に始まるＤＮＡ、４８〜５０位のＡＴＧ
配列で始まるＤ［ＩＡ、　１０８〜１１０位のＧＣＡ配
列で始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位のＣＣＴ配列
で始まるＤＮＡを包含する。更に本発明に係る遺伝子は
、８０１位のＣで終り、■位のＡで始まるＤＮＡ、　４
Ｂ−５０位のＡＴＧで始まるＤＮＡ、　１．０８−１１
０位のＧＣＡで始まるＤＮＡまたは１１１−１１３位の
ＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを包含する。

本発明に係る遺伝子はまたｐｏｌｙ（Ａ）で終り、４Ｂ
−５０位のＡＴＧ配列から始まるＤＮＡ、　１０Ｂ−１
１０位のＧＣＡ配列で始まるＤＮＡまたは１ｉｔ−１１
３位のＣＣＴ配列で始まるＤＮＡを含む。また、本発明
は、アミノ酸配列１．ＩＩ。

■に相当する塩基配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸
配列■の中で１個ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリ
ペプチド、あるいはアミノ酸配列Ｉの中の１個ないしそ
れ以上のアミノ酸が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置
換されたポリペプチドはＩＬ−２活性を有することもあ
り、従ってこの様なポリペプチドをコードする遺伝子は
本発明に係る遺伝子として使える。同様にアミノ酸配列
１．ＩＩまたは■に対して１個ないしそれ以上のアミノ
酸を表現し得る１個ないしそれ以上の塩基を余分に結合
した遺伝子であっても追加されたアミノ酸が、ポリペプ
チドのＩＬ−２活性発現に邪魔しない限り本発明の中に
包含される。ＩＬ−２としてのポリペプチドａ能を阻害
する追加アミノ酸配列を有する修飾領域であっても新た
に追加された領域が容易に除去出来るものならば本発明
に係る遺伝子として利用出来る。同じことはアａノ酸配
列１．ＩＩおよび■に対応する遺伝子のアミノ酸配列１
．ＩＩおよび■のＣ−末端にア多ノ酸追加をコードする
ＤＮＡが３゛−末端に追加結合せしめたＤＮＡの場合に
も言える。従って、この樺なポリペプチドをコードする
遺伝子の利用は、本発明に包含される。

生細胞中でＩＬ−２産生をする組換えＤＮＡ体は、次の
各種方法で作られる。例えば、ＩＬ−２・ｃＤＮＡをコ
ードする配列を発現ベクターのプロモーター配列下流に
挿入する。あるいはプロモーター配列を持つｃＤＮＡ片
を発現ベクターのｃＤＮＡ挿入の前あるいは後にＩＬ−
２をコードする配列の上流に挿入することが出来る。

ＩＬ　−２−ｃＤＮＡを発現し、ＩＬ−２−ポリペプチ
ドを産生ずる原核生物の造成法を詳述すれば以下の通り
である。

（１）　　エシェリヒア・コリによるＩＬ−２−ｃＤＮ
Ａの発現 エシェリヒア・コリ中でＩＬ−２−ｃＤＮＡを発現させ
るには、先ずｃＤＮＡを各種細菌プロモーターと結合せ
しめた後、プロモーター下流にｃＤＮＡを含有するバイ
ブリドプラス逅ドを作る。このプラスミドを、例えばエ
シェリヒア・コリＨＢＩＯＩに感染さセ、ヒトＩＬ−２
活性を有する蛋白を生合成する細菌がクローンされる０
本来細菌のプロモーターならば如何なるものでもｃＤＮ
Ａに適当に接続されていればＩＬ　　２−ｃＤＮＡを発
現する。この様なｃＤＮＡの発現例は以下のとおりであ
る。

ＩＬ−２をコードするクローン化ｃＯＮＡは第２図に示
される様な１５３個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードする。本ポリペプチドの２０個のアミノ酸に相当
するＮ−末端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌
蛋白の特徴でもある。この様な疎水性配列はシグナル配
列と称し分泌過程で切断される。故に、成熟ＩＬ−２ポ
リペプチドは、１５３個のアミノ酸より少ない筈である
。このことから、成熟ＩＬ−２ポリペプチドをコードす
るｃＤＮ＾ＤＮＡ発現させることが望ましく、ＩＬ−２
シグナル配列相当部分を発現させるのは望ましくはない
。

（ｉ）　　プラスミドベクターｐＴｒＳ−３の構築ｐＴ
ｒｓ−３は、エシェリヒア・コリＴｒｐブロモークーを
含み、ｐＴｒＳ−３のリーダーペプチドのためのリポソ
ーム結合部位（ＳＤ配列）は既に報告されている（Ｇ、
　Ｍｉｏｚｚａｒｉ　ａｎｄ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３＋１４５７〜１４６６
　（１９７８）　）、ＳＤ配列の下流１３塩基対にある
＾ＴＧコードンの存在も報告されている（Ｎｉｓｈｉ　
ｅｔａｌ、生化学５４．　Ｎａ８．６７６　（１９Ｂ２
））、　コ（Ｄプラスミドベクターはまた、ＡＴＧ開始
配列（第３図）の下流に一つのｓｐｈ　　１部位を含ん
でいる。

ＩＬ−２・ｃＤＮＡを発現させるため、先ずプラスミド
をｓｐｈ　　１で消化しエシェリヒア・コリＤＮＡポリ
メラーゼ■（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント）
または、バクテリオファージＴ４　ＯＮＡポリメラーゼ
■で処理し３°−位突き出し末端を除去する（第４図（
ａ））。プラスミドｐＩＬ−２−５ＯＡをＰｓｔ　Ｉお
よびｔｌｇｉＡＩで２回消化し、より大きいｃＤＮＡ画
分を単離する。

次いでＤＮＡをエシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼ
■　（フレノウフラグメント）又はバクテリオファージ
Ｔ４　ＯＮＡポリメラーゼで処理して３”−突き出し末
端を切りはなす。この処理をしたｃＤＮＡは１３２個の
アミノ酸のＩＬ−２ポリペプチドをコードする（第４（
ａ）図）、このｃＤＮＡを上述のごとく前処理したｐＴ
ｒＳ　−３プラス果ドＤＮＡに結合せしめ、＾ＴＧ開始
コードンをＩＬ−２ｃＤＮ＾のＣＣＴ　（Ｐｒｏ）配列
につなぎ合せる。こうしてプラスξドｐＴＩＬ−２−２
２が得られる。↑ｒｐプロモーター配列とｐＴＩＬ−２
−２２のＩＬ−２ｃＤＮＡ配列の結合は第４（ａ）図に
示す。

プラスミドルｉ　ＩＬ〜２−２２はエシェリヒア・コリ
によりプロリンから始まる１３２個のアミノ酸からなる
ＩＬ−２ポリペプチド合或を指令する。

（１１）成熟ＩＬ−２はプロリンの代りにＮ−末端ア主
ノ酸としてアラニン（２１位）を含むこともあり、１３
３個のアミノ酸から戒るＩＬ−２ポリペプチド合威を指
示するプラスミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドｐＴｒＳ　　３はＳＤ配列とＡＴＧ配列との
間に１つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位がある（第３図）。本
プラスミドはＣ１ａ　　ＩとＳａｔ　　Ｉで切断される
。プラスミドｐｌＬ−２−５０八をＰｓｔ　Ｉで部分分
解し、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩで処理
し、最も長いＤＮ＾を単離する。次いでＤＮＡを制限酵
素Ｘｈｏ　　Ｉ切断部位を含む合成ＤＮＡリンカーと結
合させ、ＩＬ−２をコードする配列の３°−側下流にＤ
ＮＡリンカ−を導入したプラスごドＰＩＬ−２−５ＯＡ
（Ｘｈｏ）を含むクローンを単離する。プラスミドｐｌ
Ｌ−２−５ＯＡ（Ｘｈｏ）を先ずｌ１ｇ１Ａ　Ｉで切断
し、エシェリヒア・コリ　フレノウフラグメントまたは
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏ　Ｉで消化
すればｃＤＮＡ画分が単離できる。

このｃＤＮＡフラグメントをＣ１ａ　　ＩおよびＳａｔ
　　Ｉで前処理したｐＴｒＳ−３ＤＮＡに結合させ第４
（ｂ〉図の如く合成ＤＮＡにつなげる。かくしてＡｌａ
からスタートする１３３個のアミノ酸から威るＩＬ−２
ポリペプチドをエシェリヒア・コリ中で合成させるプラ
スミドｐＴＩＬ−２−２１が得られる。（第４（ｂ）図
）。同様なことはＸｈｏ　　Ｉリンカ−を使用しなくと
も作られる。

（ｉｉｉ）異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大き
さのＩＬ−２ポリペプチドはｐＴｒＳ−３発現プラスミ
ドヘクターを用いても作られる。以下に示すごと＜　、
ｐＩＬ−２−５０ＡにクローンされたＩＬ−２ｃＤＮＡ
はヌクレオチド結合部位８１−８５に唯一ツタケＤｄｅ
部分を有する。プラスミドｐｌＬ−２−５ＯＡ　（Ｘｈ
ｏ）を、Ｄｂｅ　Ｉで切断し、ｃＤＮＡのより大きい区
分を含有するＤＮＡ画分を単離する。木画分はｐＢＲ３
２２より３０００塩基対を有するＤＮＡを含んでいる（
第４（Ｃ）図）。

ＤＮＡ画分をエクソヌクレアーゼＢａｌ　３１で処理し
、次いでＸｈｏ　Ｔで切断する。ここで得られたＤＮＡ
をｓｐｈ　　Ｉで切断したｐＴｒＳ−３と結合せしめ、
に１ｅｎｏ−フラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポリメラ
ーゼで処理し次いでＳａｌ　　Ｉで消化する（第４（Ｃ
）図）。つなぎ合せたＤＮＡをエシェリヒア・コリＪＩ
Ｂ　Ｌｏｔに感染させ、ヒ１−ＩＬ−２を発現するクロ
ーンを検索する。これらのクローンは色色な大きさのヒ
トＩＬ−２を発現する筈である。何故ならばヒトＩＬ−
２のＮ−末端領域に相当するＤＮＡは種々切断除去され
るからである。かくしてＩＬ−２ｃＤＮＡを含有するｐ
ＴＩＬ−２−１４■ と１５が得られる。

（ｉｖ）　ＩＬ−２ｃＤＮＡはまたｐＫＴ　２１８　（
Ｔａｌｍａｇｅより提供を受けた；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

出、　Ｐ、３３６９〜３３７３　（１９８０）　）を用
いても発現可能である。プラスミドｐＫＴ　２１ＢはＰ
ｓｔ　　Ｉで切断し、ｐｒｔ。

−２−５ＯＡをＨｇｉΔ■とＰｓｔ　　Ｉで切断（第５
図）して得たＩＬ−２ｃＤＮ＾挿入部分とつなぎ合わせ
る。出来上ったプラスミドｐＫＩＬ−２−２１は第５図
に示したように、蛋白合成開始の始発位に配列を有して
いる。

したがって、このプラスξドｐＫＩＬ−２−２１はＩＬ
−２の１３３個のアくノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ
酸からなる両者が融合したポリペプチドからなり、これ
をエシェリヒア・コリ中で合成することが出来る筈であ
る（Ｒ初のメチオニンはエシェリヒア・コリでは切断除
去される〉。

（ｖ　）　ｐ−ＢＲ・３２２にｔｕｆＢに対するプロモ
ーター配列を挿入したプラスごドｐＴｕＢｌｐ−５の発
現は既に行なわれている（呑口ら５生化学５３９６６（
１９８１））。

このプラス壽ドは一つのＣ１ａ　　Ｉ切断部位を含み、
第６図に示すごとく本切断部位はｓＤ配列の２塩基対だ
け下流に位置する。ｐＴｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴ
Ｇ始発配列の間にある一つのＣ１ａ　　Ｌ切断部位を含
み、同時にこのＣ１ａ　　１部位はｐＴｒＳ−３とＩＬ
−２ｃＤＮＡを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊
されないので細菌ＴｒｐプロモーターをｔｕｆＢプロモ
ーターで置き換えることは極めて簡単である。従ってヒ
トＩＬ−２ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモーターの制御下で
発現される。例えばｐＴＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉ
とＰｖｕ　　Ｉｆで切断し、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＤ
ＮＡ画分を分離する。

次いでこの画分をｐＴｕＢＩＰ−５でつなぎ合わせ、Ｃ
１ａ　　ＩとＰｖｕ　ＩＩで予め切断後、第６図に図示
される様にプラスミドｐＴｕｌＬ−２−２２が造成され
る。ＩＬ−２活性はプラス稟ドｐＴｕｌＬ−２−２２を
含むエシェリヒア・コリＩＩ　８１０１の抽出液に検出
できる。

（ｖｉ）例えばｐＴＩＬ−２−２１を使っても、また基
本的にはｐＴｒＳ−３を用いて達成したすべての発現用
プラスミドを用いることによっても同様に造成できる。

また例えばｐＴｕ　ＩＬ−２−２２をＣ１ａ　　Ｉで切
断し、Ｂａｔ３１またはＳＩまたはＤＮＡポリメラーゼ
■　（エシェリヒア・コリ）にてＤＮＡの塩基対２−３
個を除去または補充し再度プラスミドをつなげることに
よってＳＤおよびＡＴＧ配列の距離を至適の長さにする
ことも可能である。

組換えＤＮＡ体を挿入したエシェリヒア・コリまたはバ
チルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細胞
を培養して組換えＤＮＡ体を増巾し又はＩＬ−２ポリペ
プチドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる
。

細胞内または細胞外に生産されたＩＬ−２は硫安沈澱、
塩類除去のための透析（常圧または減圧下）。

ゲル濾過、クロマトグラフィー、等電点平板上濃縮、ゲ
ル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（以下ＩＩ　
Ｐ　Ｌ　Ｃと略記）、（イオン交換、ゲル濾過並びに逆
相クロマトグラフィー）、及び色素結合担体、ＩＬ−２
に対するモノクローナル抗体を結合した活性化セファロ
ース４Ｂ又はレクチン結合セファロース４Ｂ等によるア
フィニティクロマトグラフィー等、公知の方法によって
回収することができる。

ＩＬ−２の単離精製法はＷａ　ｔｓｏｎら（Ｊ、　Ｈｘ
ｐ、　Ｍｅｄ、。

１５０、８４９−８６１（１９７９Ｌ　Ｇ１１ｌｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．。

月口、　　１９５４−１９６２（１９８０）、　Ｍｏｃ
ｈｉｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３３．　１８５
−２０１（１９８０）、　　Ｗｅｌｔｅ。

Ｋ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｋｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１５
６．４５４−４６４（１９Ｂ２））によって報告されて
いる。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動物細胞から作られるＴＬ−２について知られ
ているものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示し
ＩＬ−２活性を有する。分子量は約１５０００ダルトン
でありＩシー２活性は、Ｉｇｓｏｒｂ（ｔ！ｎｚｙ＋ｓ
ｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）の様な免疫吸着剤の有無にかかわら
ず完全に中和され、またはモノクローナル抗ＩＬ−２抗
体で沈澱した。免疫電気泳動において、ＩＬ−２ポリペ
プチドは、対応する抗ＩＬ−２抗体に対して唯１個の沈
降線を示す。ＩＬ−２活性は２−メルカプトエタノール
で還元後も安定であり、ＤＮＡ５ｅ及びＲＮＡ５ｅ処理
しても、又５６°Ｃ２３０分熱処理しても安定である。

活性はｐｉ（２〜９で安定である。この様にして生産さ
れたＩＬ−２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（
細胞障害性Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分
裂を強め、更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特
異的細胞障害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、
ＹＡＣ−１細胞やｌ’１Ｌｓ１細胞に対するナチュラル
キラー細胞の活性化の増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１）　　ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカッ
ト細胞（日本、西独および米国では自由に人手可能であ
る）を１０％ＦＣ５を含むＲＰＭＩ　１６４０培地にけ
ん濁し、Ｘ線照射装置Ｅｘｓ　１５０／３００−４（東
芝・日本）により５０秒間、室温で１０，０００レント
ゲンに達するまで照射した。その後照射された細胞は上
述の培地中、初期細胞密度ｌＸｌ０’個／成で５％炭酸
ガス、３７°Ｃのインキュベーター中で５日間培養した
。

この変異細胞（０，２個／穴）を９６穴の平底のマイク
ロプレートの１０穴にまき、５％炭酸ガス、３７°Ｃの
インキュベーター中で２１日間培養した。

生育してくる穴から得られるクローンはクローン量を増
加させるため新たな培地へ移し、その増加したクローン
はＣｏｎＡ　　５０　ｕ　ｇ／ｄ存在下で初期細胞密度
ｌＸｌ０”個／ｌｌ１１で２４時間培養した。そしてＩ
Ｌ−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジェルカット−１１１（ＡＴＣＣＣＲＬ８１
２９）　（以後“Ｊ−１１１”と称する）と命名された
ヒトＴ細胞株が親株のジュルカットからクローン化、選
択され、この細胞のＩＬ−２産生能は親株の４０倍に増
加していた。

このクローン化したＪ−１１１細胞株は通常条件下で増
殖し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとん
ど同じであった。

（２）Ｊ−１１１細胞（ｌ×１０Ｓ個／Ｉｒ１１）を無
血清合成培地ＲＩＴ　Ｃ５５−９（Ｓａｔｏ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１３８．１２７−１３４．（１
９８２））　１０００−に接種し、ローラー培養ボトル
（ファルコン３０２７）内で３７°Ｃ１４日間培養し、
増殖した細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再
び４Ｘ１０’個／　ｍｌとなるよう上述のＣｏｎ＾２５
μｇ／ｍｌ含有培地に接種した。ローラー培養ボトル（
ファルコン）４バツチの各々に細胞を接種した培養液１
００ｄを入れ、６時間回転培養した。

（３）このようにＣｏｎＡ　２５ｇｇ７ｍ１で６時間刺
激したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０”）は生理食塩
−リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略す）　８．０ＯＯｄに
懸濁した。この細胞は遠心操作により２回洗浄し、ヌク
レアーゼ胆害剤であるリボヌクレオシドーバナデイル複
合体（１０ｍＭ）を含有するＲＳＢ溶液（１０戚トリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ７，５、Ｉ　ＯｍＭ　ＮａＣ１！、
、１、５ｍＭ　ＭｇＣ１２）　８００ｄに再懸濁した。

その後、界面活性剤ＮＰ−４０を最終濃度０．０５％と
なるように加え、ゆっくり混合し、細胞核を３．０００
ｒｐ１ｍ。

５分、４°Ｃ下で遠心し分離した。５ＤＳ（０，５％）
及びＥＤＴＡ　（５ｍＭ）を上清液へ加え、細ＩＩ逸質
ＲＮ＾を上清液と同量のフェノールを加え抽出した。フ
ェノールによる抽出を３回繰返した後、ＲＮＡ　４よ２
倍量のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心によ
り集め、ｐＨ７，５の１０ｍＭトリス−塩酸に溶解した
。得られたＩ？ＮＡｉは１９６■であった。

ｍＲＮへの分画はオリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、　
Ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋　Ｔｙｐｅ　７）のアフィ
ニティークロマトグラフィーを使用し行った。吸着液は
２０ｍＭトリス−塩酸、０．５ＭＮａＣｆｆ１．１　ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳを含むｐｌ＋７．５
の溶液であり、溶出はカラムを緩衝液（２０ａ＋Ｍ）リ
ス−塩酸、ｐＨ７，５，０，５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　
ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７，５）で交互に行った。溶出により得られたｍＲＮＡ
は３．６ｍｇであった。次にこの得られたｍＲＮＡ　２
．４１１１ｇを蔗糖密度勾配遠心法（５０ｍＭ）リス−
塩酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　　ＮａＣ１を含
むｐＨ７，５の溶液中で蔗糖密度勾配５−２５％、２６
．００Ｏｒｐｍで４°Ｃ下２４時間）により分画した。

ｍＲＮＡの１１から１２Ｓが分画Ｎａ１２．１３．１４
へ分画され、各々５９μｇ、４６μｇ、６０ｄｇであっ
た。

（４）Ｎａ１３の分画に得られたｍＲＮＡをアフリカッ
メガエル７　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞−・注入した（
５０ｎｇｍＲＮ＾／卵母細胞）、この卵母細胞の培養液
をＩＬ−２活性測定した。表１に示す如く、３）（−チ
ミジン（−Ｈ−↑ｄＲ）の取込みの上昇及び活性化Ｔ　
ＩＪンパ球数の増加が確認され、明らかにこの分画中の
ｍＲＮＡはヒトＩＬ−２ ｍＲＮＡを含んでいる事が立証 された。

表 ！ （ａ） 分画１ ３の翻 × １４．６８３ ２ 訳生底物 ×３２ １０．１ ５ （ｂ） 分画１ ３の翻 × ■ 訳生成物 ×１６ ５ ＊　単位は標ＪＬ−２（１０単位／−）の３）１−Ｔｄ
Ｒ取込み量と比較する事により算出した。

（５）その後ＩＬ−２ｍＲＮＡを含むｌ　ｌ〜Ｉ　２Ｓ
　ｍＲＮＡのは１３分画からｉｎ　ｖｉｔｒｏｒｃＤＮ
Ａを台底した。

組換え体ＤＮＡはプラス５ドベクターＰＢＲ３２２と構
成した。組換え体ＤＮＡをエシェリヒア・コリに形質転
換し、ｒＬ−２ｃＤＮ＾クローンを薙得したクローンを
以下に示す如き方法により選択した。

（５１）５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
３０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭジ
チオスレイトール（以後ＤＴＴと略す）、０．５ｍＭの
各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴｒ’、ｄＣＴＰ、　ｄＴＴＰ　（
ｄＣＴＰは３２ｐ放射標識したものを含む）、０．１μ
ｇ　オリゴ（ｄＴ）　ｌｏ、１０ｕｇｍＲＮＡ及び１５
単位ＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、　Ｗ、　Ｂｅａｒｄ）を混
合し、４１°Ｃ下で９０分保った。反応終了後、ＤＮＡ
はフェノール処理後エタノール沈澱物として回収し、こ
のＤＮＡを２０ｄ）リスおよび１　ｍＭＨＤＴＡを含む
ｐｌ＋７．５の溶液に溶解した。

５ｓ−ｃＤＮ４２．５μｇが合成された。本反応液より
ｍＲＮＡを除くために反応液にＮａ０Ｉｌ溶液を加えて
０、３３　Ｎ　ＮａＯＨ溶液とし、室温にて１５時間置
き、次いでｐＨ７，５のＬＭ）リス−塩酸緩衝液を同量
加えて中和しセファデックスＧ−５０カラムをカラムを
通した。回収されたｃＤＮＡは１．８μｇであった。

（５２）５０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐｉｆ　７．５　
）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊｌ＃　、１０ｎ＋Ｍ　ＤＴＴ、
０．７５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ％ｄ
ＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３Ｈで標識したものを含む）　、
１．８　ｐ　ｇ　５ｓ−ｃＤＮＡおよび８単位ポリメレ
ースＩ　（ＢＲＬ、米国）を混ぜ１５時間、１５°ｃで
反応を行った。反応終了後ＤＮＡをフェノール及びクロ
ロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。ｉ、
１０μｇのｄｓ　−ｃＤＮＡが生成した。５０ｍＭ酢酸
ソーダ（ｐＨ４，５）　、０．２　Ｍ　ＮａＣｌ！、、
１ｍＭＺｎ（、ｅｘおよび１．１０　ｕ　ｇ二本鎖ｃＤ
ＮＡの混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベートした
後０．２５単位のヌクレアーゼＳｔ（三井、日本）を加
え、さらに１５分間インキュベートした。反応終了後、
フェノール処理を２回行った反応生成物をセファデック
スＧ−５０へ供し、二本鎖ｃＤＮＡ　Ｏ，５５ＩＩ　ｇ
を得た。

（５−３）０．１４Ｍカコジル酸カリウム、３０ｍＭ　
　ト’Ｊス塩基、０．１　ｒｍＭ　ＤＴＴ、　　１　ｍ
Ｍ　ＣｏＣ１ｚ、０．６４ｍＭ　”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比
活性２．７　Ｘ　１０　’　ｃｐｓ／ｎ　ｍｏｌ）、０
、５５１！　ｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡおよび５単位のター主
ナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混合し、３７°Ｃ
で７分間インキエベートした後フェノール処理し、次い
でセファデックスＧ−５０カラムに供し、エタノール沈
澱物として０．５０μｇ　ＤＮＡを得た。回収したこの
ＤＮＡは約５０個のｄＣＭＰ残基が両３°末端に付加さ
れている事が判明した。

ｐＢＲ３２２ＯＮＡ　　１０μｇを制限酵素焉匹■で切
断したのちｄＣＴＰのかわりにｄＧＴＰを用いたこと以
外は前述のｄｓ　−ｃＤＮＡにｄＣＭＰ鎖を付加したと
きに用いた方法と全く同じ条件により、切断したＤＮＡ
の両３゛末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。

（５−４）　５０ｍＭ　　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）
０、１　Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＤＥＴＡ、　０．０５
　ｕ　ｇ　ｄＧＭＰ残基付加ｐＢＲ３２２および０．−
０１　ａ　ｇ　ｄＣＭＰ残基付加ｃＤＮＡをまず６５°
ｃで２時間、次いで４６°Ｃで１２０分間、さらに３７
℃で６０分間、そして室温で６゜分間インキエベートし
た。

エシェリヒア・コリＺ　１７７６（Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｍ
＊　Ｒ，ｅｔａｌ、、　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ
。

（Ｗ、　Ａ、　５ｃｏｔｔ　＆　Ｒ，Ｗｅｒｎｅｒ　ｅ
ｄ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

（１９７７））を５０戚のＬ培地（１００μｇ／成のシ
ア旦ノビメリン酸、５０μｇ　／　ｒｒｄｌのチミジン
、１％トリプトファン、０．５％酵母エキス、０．５％
ＮａＣ４２および０．１％グルコースを含む）に接種し
培養液の吸光度が５６２μｍで０．３付近になるまで３
７°Ｃで振とう培養した。培養終了後、培養液を３０分
間Ｏ′Ｃに保持し、菌体を遠心分離により集め、５−　
トリス−塩酸（ｐ）Ｉ　７．６）、０．１　Ｍ　ＮａＣ
ｊ！　。

５ｓ＋ＭＭｇＣｊ！ｘおよび１０ｍＭ　Ｒｈ（／！を含
む溶液２５−で２回洗浄した。

得られた菌体を５ｍＭ）リス−塩酸（ｐｌ！　７．６　
）、０．２５Ｍ　　ＫＣｊ！、　５ｍｌ’ｌ　Ｆ’Ｉｇ
Ｃ１ｔ　、　０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣ１ｔおよび１０＋ａ
Ｍ　ＲｂＣｊ！を含む溶液２０ｄに懸濁し、０°Ｃで２
５分間静置後、菌体を集め上記と同じ溶液１．ｄに菌体
を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の０．２ａｄ！に上記
組換え体ＤＮＡを入れ、Ｏ″Ｃで６０分間静置した。そ
の後り培地０．１ｍｌを加え３７°Ｃで３０分間振とう
培養した。こうして得られた培養液（０，１ｄ）を１０
０μｇ／−シアミノピメリン酸、５０μｇ／−チミジン
および１５μｇ／ｒｎｌｌテトラサイタリンを含むＬ培
地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７°Ｃで２
日間インキエベートした。

（５−５）出現した４３２のコロニーを１８のグループ
に分け、（その各グループは２４の異なるバクテリアク
ローンを含む）ｌ’ｏｏμｇ／１ｎｌｌのシアミノピメ
リン酸、５０μｇ／ｍ１のチミジンおよび１０μｇのテ
トラサイクリンを含むＬ培地２００−に接種し、３７゛
Ｃで５〜７時間振とう培養した。次に最終濃度１７０μ
ｇ／ｄとなるように加えられたクロラムフェニコールを
含む新たなＬ培地２００ｄを加え、さらに−晩培養した
。

このようにして増強されたプラスミドＤＮＡを常法に従
い精製した。

ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するクローンはＩｎＲＮＡハイブ
リダイゼーションートランスレーションアッセイ（以後
Ｈ−Ｔアッセイと略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したＤＮＡ（２５μｇ）を制限酵素１１ｉｎｄｌｌ
ｌにより開裂しフェノールで３回、フェノール−クロロ
ホルムおよびクロロホルムで各々処理し、エタノールで
沈澱させ８０％エタノールで洗浄し、８０％ホルムアミ
ド４０−に溶解した。

反応液を変性させるため９０°Ｃで５分間加熱後１０　
Ｘ５ＳＣ（１，５Ｍ　ＨａＣｌ、０．１５Ｍ　　クエン
酸ソーダ）で１．３ｍｌに希釈した。その後、本ＤＮＡ
をニトロセルロース濾紙上に固定し、これを８０″Ｃで
３時間乾燥させ、５０％ホルムアミド、２０　ｍＭ　Ｐ
ｉｐｅｓ（ｐＨ６，５）、０．７５　Ｍ　ＮａＣ１，５
ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ、０．２％ＳＯＳ及びＪ−１１１細胞
由来のｐｏｌｙ　（Ａ）　ｍＲＮＡ２５０μｇを含む重
点中で３７°Ｃ１１８時間インキュベートし、濾紙上に
固定されたＤＮＡとＩＬ−２ｍＲＮ＾をハイブリダイズ
した。

次にその濾紙を６５°Ｃで３回ｐｌ＋６．５の１０ａ＋
ＭＰｉｐｅｓ、　　ｏ、　１５　Ｍ　　ＮａＣ１溶液、
１ｍＭ　Ｐｉｐｅｓ＋　　１０ｍＭＮａｃｆ溶液で洗浄
し０．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＯ３溶液で９
５°Ｃ，１分間処理し濾紙からハイブリダイズしたｍＲ
ＮＡを回収した。

このようにして抽出したｍＲＮＡを常法に従ってオリゴ
ｄＴ−セルロースカラム上で精製し、アフリカッメガエ
ル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を
測定した。

各々２４クローンからなる１８グループのうちの１グル
ープが前述の３８−ＴｄＲ取込みによるアッセイで４８
単位／ｄのＩＬ−２活性陽性を示した。

一方他のグループは明らかに陰性であった。

次に、陽性のグループに属する２４の各単一コロニーを
既述と同じ組成のＬ培地２００　ｍｌへ接種し、３７°
Ｃで５〜７時間好気的に培養し、同様にクロラムフェニ
コール含有のＬ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスミドＤＮＡを増強後、プラスミド
ＤＮＡを同様に標準法に従って精製した。ｔｌｉｎｄ量
で各プラス壽ドＤＮＡ約５μｇを開裂後、各プラスミド
を同様にニトロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙を
ＩＬ　−２ｍＲＮＡとハイブリダイズし、ハイブリダイ
ズしたｍＲＮＡをアフリカッメガエル卵母細胞へ注入し
、翻訳された蛋白のＩＬ−２活性を測定するため回収し
た。

表２に示す如（、ｐ３−１６と表示した単一コロニーか
ら精製されたプラスミドＤＮＡのみが陽性のＩＬ−２活
性を示した。それ故、本クローンがＩＬ−２ｃＤＮＡを
有するクローン（旦、　ｃｏｌｉ　　ｚ　１７７６／ｐ
３−１６ＡＪ１１９９５　（ＦＥＲＭ−ＢＰ−２２５）
）と同定された。このようにプラスミドＤＮＡ、　ｐ３
−１６はＩＬ　　２　ｍＲＮＡと特異的ハイブリッドを
形成する能力のあるＤＮＡ（ＩＬ−２遺伝子）を確かに
有している事が確認された。

／ ／ ／ 表 （ａ） ｍＲＮＡの翻訳 × ２０．４５３ ８ 生成物 ×３２ ２０．９６ （ｂ） ｍＲＮＡ” の翻訳 × ８ ２ 生成物 ×３２ ２ ＊ グラ。スミ ドル３−１６からのｃＤＮＡとハイブリダイズしたｍＲ
ＮＡ プラスミドル３−１６のｃＤＮＡインサートは制限酵素
Ｘｂａ　　ｌにより１部位で、又Ｂｓｔ　ＮＩにより２
部位（Ｘｂａ　　Ｉ開裂部位の上流及び下流）で切断さ
れるという特徴を示した。しかしながら、プラスミドル
３−１６は約６５０塩基対より構成されるｃＤＮＡイン
サートを含んでおり、これは明らかに１１〜１２Ｓの大
きさのＩＬ−２ｍＲＮＡの一部分に相当するものである
。それ故、他のｃＤＮＡライブラリーを、鋳型としてＩ
Ｌ−２ｍＲＮＡを用い、Ｌａｎｄ等の方法（Ｌａｎｄｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　ＶＯＩ　Ｍｌ　ｐ２５５１．（１９８１））に従っ
て作製した。−本鎖ｃＤＮＡ（１，６μｇ）を、ｄＣＭ
Ｐ残基を付加したＩＬ２ｍＲＮ八４μｇをへいて合成し
、そしてｄｓ　−ｃＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ■（
Ｋｌｅｎｏｗ断片）によりプライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｇ）１２＝１８を用いる事により合成した。６８０塩基
対ＤＮＡサイズマーカー（ｓｉｚｅ　ｍａｒｋｅｒ）よ
り長いｃＤＮＡ（０，６μｇ）は蔗糖密度勾配遠心法に
よって得られ、標準的なＧ−Ｃティリング法によりｐＢ
Ｒ３２２のＰｓｔ　１部位へ挿入出来た。

組換えＤＮＡ体によるエシェリヒア・コリ　χ１７７６
の形質転校後、その場所でプローブとしてニック翻訳さ
れた（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）ｐ３−１６　
ｃＤＮ＾インサートを用いたＧｒｕｎｓ　ｔｅｉｎ−Ｈ
ｏｇｎｅｓｓのハイブリダイゼーション法により約２０
００コロニーを選別し、およそ８５０塩基対を含むプラ
スミドｐｌＬ　２−５０＾を含有するコロニー及び形質
転換されたクローン（エシェリヒア・コリ　χ　１７７
６／ｐｌＬ　２−５ＯＡ、　ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ
−ＢＰ−２２６））を同定した。ｐｌＬ２−５ＯＡのｃ
ＤＮＡインサートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリ　χ１７７６／ｐｌ
Ｌ２−５ＯＡからのＩＬ−２ペプタイドをコードしてい
る遺伝子を単離するため、プラスミドＤＮＡを通常法に
従い、菌体からＤＮＡを単離後制限酵素Ｐｓｔ　　１に
より切断した。この処理により生成する２つのＤＮＡ断
片のうちより小さな断片はＩＬ−２ペプタイドをコード
しているＤＮＡ遺伝子であった。　ｐｌＬ２−５ＯＡか
らのＰｓｔ　　Ｉインサートの完全なヌクレオチド配列
はＭａｘａ＠ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａ
Ｉｌｌ、＾、　Ｗ、　ｅｔａｔ、、　Ｂｎｚｙｍ、　６
５＋、　４９９−５６０．１９８０）により決定した。

全構造を第２図（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的ＩＬ−２産生細胞株Ｊ−Ａ　
１８８６　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１３０）は同様にロー
ラー培養ボトルで生育した。生育した細胞は初期細胞密
度ｌＸｌ０６個／ｄで新鮮な合成培地ＲＩＴＣ−５５−
９に再Ｑ濁し、培養開始８時間後に、実施例ｔで詳細に
示したステップに従って３Ｘ１０”個の細胞から１１〜
１２３分画としてのＩＬ−２，ＲＮＡ抽出のために使用
された。

ｄｓ−ｃＤＮＡは実施例１と同様に合成され、６００塩
基対より長いｃＤＮＡ（２，４μｇ）が蔗糖密度勾配遠
心法による分画により得られた。次にこのｃＤＮＡをタ
ーξナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを
用い、ｄＣＭＰ残基で伸長し、その５０＾ｇがｄＧＭＰ
で伸長したＰｓｔ　　Ｉ切断ｐＢＲ３２２２５０＾ｇと
アニールされた。

生成したハイブリッドプラスミドはエシェリヒア・コリ
　χ１７７６に形質転換され、約４．０００クローンの
トランスホーマントが得られた。

ＧｒｕｎｓＬｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法に従い、プ
ローブとして用いたプラスミド３−１５　ｃＤＮＡと相
補的な３個のクローンが選択された。すなわち、このよ
うにして選択された形質転換されたクローンはヒトＩＬ
−２遺伝子を有するクローンである。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトＩＬ−２の合成を指令す
るプラスミドを以下の如き方法で構築した。

プラスごドｐ’ｒ　ｒ＋、２−２２は第４（ａ）図で図
解されている如く、一連の改変の方法によりｐＴｒＳ−
３（Ｎｉｓｈｊ　Ｔ、。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　Ｔ、　ｅｔ　ａｌｌＳＥＩＫＡＧ
ＡＫＵ　５３．９６７、　（１９８１）。

同５４．６７６（１９８２））及びＩＬ−２ｃＤＮＡを
含むｐｌＬ２−５ＯＡから構築した。プラスミドｐＴｒ
Ｓ−３はＴｒｐプロモーターとｐＢＲ３２２のＥｃｇ　
Ｒ１部位とＣ１ａ　　１部位の間に５ｈｉｎｅ　Ｄａｌ
ｇａｒｎｏ　（以後ＳＤと略号する）の領域の挿入を含
む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のＳｐｈ
　　ｒ部位と同様にＳＤ配列の下流１３ｂｐにＡＴＧイ
ニシェーションコードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するＤＮＡ配列がＡＴＧコート
ンの丁度下流の部位に挿入されるとそのベクターはこの
蛋白を生産するには非常に効果的である。

このＡＴＧコードンはｐＴｒＳ−３の５Ｂ４Ｔ消化に引
続きＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって生成
される。それ故プラスξドｐＴｒＳ−３　（３０μｇ）
は制限酵素胎　１で、常法により切断され、引続きフェ
ノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱法により回
収され両末端が７４　ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフ
ラッシュにされた。

次に、同様の方法によりフェノール、クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりＤＮＡ（２１，４μｇｊを
回収した。他方ＩＬ　　２　ｃＤＮＡを含むｐｌＬ２−
５ＯＡ　３８０μｇはＰｓｔ　　Ｉにより切断され、Ｉ
Ｌ−２ｃＤＮＡインサートはアガロースゲル電気泳動に
より単離された。ｃＤＮ＾インサーｔ−（１１μｇ）は
）ＩｇｉＡ　Ｔにより切断され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラ
ーゼによって処理され、大きい方の部分のＤＮＡｌ０μ
ｇがアガロースゲル電気泳動により単離された。本性に
従って１３２個のア果ノ酸をコードするｃＤＮＡ　（７
，２μｇ）が得られ、このＤＮＡ断片はプラントエンド
を有していた（第４（ａ）図）。

次に、このようにして得られたｃＤＮＡ断片をＡＴＧ配
列の丁度下流で、前もって４ｉにより消化されたＴ４　
ＤＮＡポリメラーゼにより処理されたｐＴｒＳ−３ベク
ターへ連結した。このように連結したプラスミドはそれ
から、常法に従いエシェリヒア・コリＨＢ　１０１へ形
質転換された。この連結は次のようにして行った。　Ｉ
Ｌ　−２ｃＤＮＡ（０，４ｕ　ｇ　）の前述の大きい方
の断片およびｐＴｒＳ−３ベクターＤＮＡ　０．２　ｕ
　ｇを６．６　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、Ｉ　ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ
およびｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴを含むｐＨ７，５の６６ｍ１
１トリス−塩酸中でＴ４　ＤＮ＾リガーゼ０．８単位と
共に混合し、混合物を４°Ｃ２−晩反応させた。アンピ
シリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するトランス
ホーマントの中で、１３２個のア果ノ酸をコードしてい
るＩＬ−２ｃＤＮＡ部分を含むプラスミドを持つコロニ
ーをその場テコロニーハイブリダイゼーションアッセイ
法により選択した。こうして選択したコロニーを再び培
＃（１０ＩＩＩｊｌりシ、リゾチーム処理および凍結。

融解による処理によりプラスミドＤＮＡを調製した。

このプラスミドＤＮＡをハ±ＩとＸｂａ　　Ｉで切断し
、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動により分
析し、ｃＤＮＡがｐＴｒｓ−３のＡＴＧ配列の後に正し
い方向で凍結しているｐＴＩＬ−２−２２を同定した。

ｐＴＩＬ−２−２２を含むエシェリヒア・コリＪＩ８１
０１を微生物の増殖のために知られている通常法の下に
培養した。細胞は２５μｇ／ｌａｎストレプトマイシン
および２５μｇ／ｌａｌのアンピシリンを含むχ培地（
２，５％バクトドリブトン、１％酵母エキス、０．１％
グルコース、　　２０＋＋Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ、　　５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸、　ｐＨ７，５）　　１０　＠ｌ中で３
７°Ｃで一晩生育させた。ついで培養Ｍ濁液１　ｍＡ！
を同じχ培地（１００１ｍｌ）へ接種し、３７°Ｃで培
養した。

６５０ｒｒｌの０．Ｄ、がおよそ１．５−２．０に達し
た時点で３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えた
。

インデューサーの添加３時間後に、細胞を集め、２０＋
Ｍトリス−塩酸（ｆｌＨ７，５、３０ｍＭ　ＮａＣｊ！
を含む）で洗浄し、同じ緩衝液Ｂ　ｒａｎ中に再び懸濁
した。

Ｔｒｐプロモーターの効果的な機能発現のために１、Ｉ
ＡＡの如きインデューサーを最終濃度５０μｇ／ｍｌに
なるように添加した。かくして細菌細胞中に産生される
蛋白をソニック処理（０”Ｃ，２分間）またはりゾチー
ム（８μｇ）消化（０”Ｃ，２０分）に引き続き凍結融
解を３回行う事により抽出した。

この方法により、−ｉ的にＩＬ−２は細胞から抽出され
た。抽出されたＩＬ−２活性はｉｏ、ｏｏｏから１２０
．０００単位／ｍｌの範囲であった。

’　ｐＴＩＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＩＢ
　１０１（へＪ１２００９）はＦｌ！ＲＭ−ＢＰ２４５
として寄託されている。

実施例４ ＩＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴｕｌＬ２−２
２はｐＴｕＢＩＰ−５（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｓｅｉｋａｇａｋｕ＋　５３＋９６６
、１９８１）および実施例３に示したｐＴＩＬ２−２２
から第６図に図解した方法により構築された。プラスミ
ドｐＴｕＢＩＰ−５はｐＢＲ３２２中にｔｕｆＢのプロ
モーター配列が挿入されている。このプラスミドはまた
単一のＣ１ａ　　１部位を含んでおり、これは第６図に
示した如＜ＳＤ配列の２ｂｐ下流に位置している。ｐＴ
ｒＳ−３もまたＳＤ配列とＡＴＧイニシェーシゴンコー
ドンの間にＣ１ａ　　１部位を含んでおり、このＣ１ａ
　　１部位は実施例３に記載した如＜　ｐＴｒＳ−３お
よびＩＬ−２ｃＤＮ＾を用いる事による発現プラスミド
構築中に破壊されないことから、Ｔｒｐプロモーターを
ｔｕｆＢプロモーターに置き換える事はきわめて簡単で
あり、その結果ＩＬ　　２　ｃＤＮＡはｔｕｆＢプロモ
ーターの制御下で発現される。

それ故、プラスミドｐＴｒＬ２−２２　（３０μｇ）は
制限酵素Ｃ１ａ　　ＩとＰｖｕ　ＩＩにより通常の方法
で切断された。ＩＬ−２ｃＤＮＡを含む断片（約２．２
　ｋｂ）はアガロースゲル電気泳動により単離精製され
、３μｇのＤＮＡが回収された。他方、　ｐＴｕＢＩＰ
　　５ベクタ一２０μｇが同様にＣ１ａ　　Ｉと±■に
より切断され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方
の断片（約３．４　ｋｂ）がアガロースゲル電気泳動に
より単離精製され、ＤＮＡ　３．５μｇが回収された。

次にこのようにして得られた２個の断片は１つはｔｕｆ
Ｂプロモーターを含み（約３．４ｋｂ）、他方はＩＬ−
２ｃＤＮＡを含んでおり（約２．２　ｋｂ）以下に示す
如く連結した。

ＩＬ　−２ｃＤＮＡ（１，２μｇ　）を含む断片および
ｔｕｆＢプロモーターを含む断片０．３μｇを６．６ｍ
ＭＭｇＣｊ２ｚ１ｍＭＡＴＰおよび１０ｍＭ　ＤＴＴを
含むｐＨ７，５の６６ｍＭトリス−塩酸中で、Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ０．８単位と混合し、４°Ｃで一晩反応し
た。次にこのようにして連結したプラスもドは常法に従
いエシェリヒア・コリＨＢ　ｌｏｔへ形質転換された。

アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のｐＴｕＩＬ２−２２の
如（ＩＬ　−２ｃＤＮＡ部分を含む組み換え体ＤＮＡを
持つ８個のコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡは実
施例３に記載された如く調製された。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１を３７°ＣでＬ培地（１００ｍｆ）中で培養した。

６５０ｍｕの０．Ｄ、がおよそ０．５−１．０に達した
時、菌体を集め、３０ｍＭ　ＮａＣ／！を含む２０ｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５’）で洗浄し、同じ緩衝液２
　ｍｌ中に再び懸濁した。このようにして産生した蛋白
は実施例３と同様に抽出された。抽出液中のＩＬ−２活
性は６，０００から５６，０００単位／ａｒｌの範囲で
あった。

ｐＴｕｌＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１
０１（ＡＪ１２０１０）はＦＥＲＭ−ＢＰ　２４６とし
て寄託されている。

実施例５ ｒＬ−２ｃＤＮＡを有するプラスξドｐＧＩＬ２−２２
はｐｃｉ。

１０１（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｔ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｌａ
ｕｃｅｒ　Ｇ、　Ｄ、、　Ｍａｔｈ　Ｅｎｚｙｍ。

６８＋　４７３−４８３．（１９７９）、Ｇａ１ｌ　Ｌ
ａｕｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　Ｌ、　Ｎα２．１３９〜
１４７（１９８１）、　Ｔ。

Ｔａｎｉｇｕｃｈｊ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａＬｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋７７＋　Ｎ
Ｏ，９＋　５２３０〜５２３３（１９８０）、Ｅｇｏｎ
　Ａ＋＋＋ａｎｎ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ、　２５．１６．７〜１７Ｂ（１９８３））と
実施例３に示されたｐＴｒＬ２−２２とから構築された
。

すなわち、ｌａｃプロモーターを含むプラスミドＤＮＡ
　１０１（２０ｐ　ｇ　）が制限酵素Ｐｖｕ　Ｉｆで常
法により切断され、引続きフェノール、クロロホルム処
理およびエタノール沈澱法により１７μｇのＤＮＡが回
収された。他方、ｐＴＩＬ２−２２　（７５μｇ）の方
はＣ１ａ　　ＩおよびＳａｌ　　ｉで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりＩＬ−２ｃＤＮＡが含むＤＮＡ断
片２．２μｇを回収した。この断片はＤＮＡポリメラー
ゼ■（フレノウ断片）で処理する事によりフラッシュに
された０次にこのようにして得られた２個の断片（０，
２５μｇおよび０，６６μｇ）を実施例４と同じ方法で
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１．０単位でもって連結した。か
くしてこの連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒ
ア・コリＨＢ　１０１に形質転換された。トランスホー
マントの中で、ＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＣＪ、１１−９
ａｌ　　Ｉ断片の挿入を有するｌ・ランスホーマント３
２ｐラベルしたＩＬ−２ｃＤＮＡをプローブとして選択
した。次にこれ等のトランスホーマントを、アンピシリ
ン２５μｇ／ｒ１．を含む１０ｍｊ２のχ培地中で培養
し、実施例３で記載した方法によりプラスミドＤＮＡを
調製した。かくしてｌａｃプロモーターの丁度下流にＩ
Ｌ−２ｃＤＮＡの開始配列ＡＴＧを有するプラスミドＤ
ＮＡはハエ■および旦υ丁での切断部位を検定する事に
より得られた。このようにして得られたｐＧＩＬ２−２
２を含むエシェリヒア・コリＨＢ　１０１は２５μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび２５μｇ７ｍｌストレプトマイ
シンを含有するＬ培地１００ｍ１に接種し培養した。６
５０ｍμの０．０．が約０．５に達した時イソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を１
ｍＨの濃度で加え、１時間後に菌体を集め、実施例４に
記載した方法に従って菌体抽出液を調製した。抽出液の
Ｉシー２活性は６．０００から８０．ＯＱＯ単位／ｍｅ
の範囲であった。

ｐＧＴＬ２−２２を含むエシェリヒア・コリ　ＩＩＢ　
１０１（ＡＪ１２０１１）はＦＩＥＲＭ−ＢＰ　２４７
として寄託されている。

実施例６ プラスミドｐＴｒｓ−３（１０μｇ）を先ず制限酵素ｌ
ａ１．Ｉで切断し１ａ１１部位をＤＮＡポリメラーゼ（
フレノウ断片）あるいはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理
によりフランシュ（ｆｌｕｓｈ）にした。

Ｃ１ａ　　Ｉで切断後、Ｔｒｐプロモーター領域を有す
る大きい方の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳
動により単離精製し、ＤＮＡ　３μｇを回収した。

他方、ｐＴＬ２−５０＾のハエ１切断により得られるｃ
ＤＮＡインサートｌｌｕｇがｔｌｇｉＡＩで切断され、
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方の断片が
アガロースゲル電気泳動により単離、精製された。この
ようにしてＩＬ−２の１３２個のアミノ酸をコードする
ｃＤＮＡ断片が７．２μｇ得られた。次に、ｔｒＰプロ
モーター（上記）を含む断片０．４５μｇ。

ＩＬ　−２ｃＤＮＡを含むｌＩｇｉＡＩ−Ｐｓｔ　（断
片０．５　ｔｔ　ｇおよび台底オリゴヌクレオチド（５
’　）ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡ（３′）と（３
’）ＴＡＴＴＣＧＡＴＡＣＣＧＴ（５’）　（各々２０
　ｐｍｏｌｅ）は両方とも５゛末端でリン酸化されてい
るが、これ等を実施例３に記載されている方法と同じ方
法でＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で連結した（第４図（ｂ
））。このように連結されたプラスミドはエシェリヒア
・コリＨＢ　１０１に形質転換された。出現したトラン
スホーマントの中で、目標とするトランスホーマントは
次のようにして選択した。まず最初に、ＩＬ２　ｃＤＮ
Ａおよび台底オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイ
ズ可能なトランスホーマントがコロニーハイブリダイゼ
ーション法により選択された０次に、ＡＴＧＧＣＡ配列
の丁度下流に第２図（ａ）の１１１から１１３の位置の
ＣＴＴ配列から始まるＤＮＡ断片（ＣＣＴＡＣＴ・・・
・・・・・・）が挿入されているプラスミドＤＮＡを持
ったトランスホーマントをＰｓｔ　　ｒ　、Ｘｂａ　１
切断個所を検定することにより選択した。

ｐＴＩＬ２−２１ａまた。はｐＴＩＬ２−２１ｂを含む
上記のトランスホーマントを実施例３に示す方法により
Ｌ培地中で培養し、そして実施例３に示す方法により分
析した時トランスホーマントの菌体抽出物には高いＩＬ
−２活性が認められた。　ｐＴＩＬ２−２１ａを有する
エシェリヒア・コリＪＩ８１０１（ＡＪ　１２０１３）
およびｐＴＩＬ２−２１ｂを有するエシェリヒア・コリ
（ＡＪ　１２０１４）を有するエシェリヒア・コリＨＢ
　１０１はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ　２４８．ＦＥＲＭ
−ＢＰ　２４９として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主、エシェリヒア・コリ　
ｚ　１７７６およびＨＢ　１０１（ｌｌｌｏｙｅｒ　Ｈ
，Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　ｉＬ、　４５９．（１９
６９））は公知であり、容易に入手可能である。更につ
け加えれば、トランスホーマント中の組換えＤＮＡ体を
遊離させるためにＬ培地で３７℃でトランスホーマント
を培養し、テトラサイクリンおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターρＢＲ３２２（例えばベセスダリサ
ーチラボラトリーから購入可能）　、　ｐＣＥ−１，ｐ
Ｔｒｓ−３およびｐＧＬ　１０１は公知であり容易に人
手可能である。更に、常法によりトランスホーマント中
の組換え体プラスミドを分離することによってさらにそ
れぞれの実施例での説明から当然に明らかな如くプラス
ミドベクターを分離することによって寄託されたトラン
スホーマントからプラスミドベクターを得る事が出来る
。ｐＴｒＳ−３およびｐＴｕＢＩＰ−５はそれぞれエシ
ェリヒア・コリＦＥＲＭ、、Ｐ６７３５（ＢＰ　３２Ｂ
）およびエシェリヒア・コリＡＴＣＣ３１８７９として
寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はＩＬ−２活性を有するポリペプチドをコードし
たクローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによ
る切断マツプを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子
の塩基配列を示し、第２図（ｂ）はＩＬ−２活性を有す
るポリペプチドのアミノ酸配列１．ＩＩおよび■を示す
。 第３図はプラスミドベクターｐＴｒＳ−３を示す。 第４図（ａ）１第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベク
ターとしてｐＴｒＳ−３を使用している組換えＤＮＡ５
（ｐＴＩＬ２−２２．　ｐ↑ＩＬ２−２１．　ｐＴＩＬ
２−１４およびｐＴＩＬ２−１５）の構成を示すフロー
チャートである。第５図はベクターとしてｐＫ７２１８
を使用している組換えＤＮＡ（ｐＫＩＬ２−２１）の構
成を示すフローチャートである。第６図はベクターとし
てｐＴＵＢＩＰ−５を使用している組換えＤＮＡ　（ｐ
ＴｕｌＬ２−２２）の構成を示すフローチャートである
。 図中、“Ａ″、“Ｇ”、“Ｃｍおよび“Ｔ”はデオキシ
アデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸
およびチミジル酸をそれぞれ表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 原核細胞に適合しうるプラスミドベクターのＤＮＡ鎖の
   上流より、それぞれ原核細胞内で機能するプロモーター
   、リボゾーム結合部位、翻訳開始コドンおよびヒトイン
   ターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺
   伝子がこの順序で配列された組換えＤＮＡ体により形質
   転換された原核生物の細胞を培地中で培養することを特
   徴とする糖類を伴わず、ヒト由来の他の蛋白質を含有し
   ないヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドの
   製造法。