JPH0698000B2 - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドを有する遺伝子に関する。

インターロイキン２（以下、「IL−２」と略記する。）
は、以前はＴ細胞増殖因子と呼ばれており、レクチンあ
るいは抗原で活性化されたＴ細胞より産生される可溶性
たんぱく（一般には「リンホカイン」として知られてい
る）である（Morganら,Snience,193,1007〜1008（197
6）,Gillisら,J.Immunol.,120,2027〜2033（1978）.IL
−２はリンパ球の反応性を調節でき、抗原特異的なエフ
エクターＴ−リンパ球のin vitroにおける長期培養を可
能ならしめることができる（Gillisら,Nature,268,154
〜156（1977））。またIL−２は、胸腺細胞の分裂の促
進（Chenら,Cell Immunol.,22,221〜224（1977）,Shaw
ら,J.Immunol.,120,1967〜1973（1978）），ヌードマウ
スの脾細胞の培養系での細胞障害性Ｔリンパ球活性（Wa
gnerら,Nature,284,278〜280,（1980））や抗−SRBCプ
ラーク形成細胞反応の誘導（Gillisら,J.Exp.Med.149,1
960〜1968（1979））等の関連する他の生成活性をもつ
ことが明らかにされている。従って、このリンパ球調節
因子は液体免疫や細胞性免疫反応を増強したり免疫不全
状態を正常な液体や細胞性免疫の状態に回復させるのに
有用である。これらの明らかにされたIL−２の免疫学的
活性は、IL−２が悪性腫瘍，細菌またはウイルス感染，
免疫不全，自己免疫疾患（Papermasterら,Adv.Immunopn
arm.,507,（1980））に対する医科免疫療法に有用であ
ることを示している。インターフェロンと同様に、IL−
２はナチュラルキラー細胞活性を増強することが示され
てきたが、これは悪性腫瘍治療への有用性を強く示唆し
ている。更に、IL−２は単クローン性の活性化Ｔ細胞の
保持を可能とし、この事は、Ｔ細胞分化の分子機構,T細
胞機能の分化機構,T細胞の抗原リセプターの機構を研究
する上で重要な役割を担っていることを示している。ま
た、IL−２は単クローン性Ｔ細胞を長期培養することに
より、他の種々の分野で有用な様々なＴ細胞由来のリン
ホカインを製造するためにも使用できる。更に、IL−２
の産生とリンパ球のIL−２に対する応答性は、免疫学的
機能の重要なパラメーターであり、免疫異常の臨床診断
に有用である。

IL−２は従来の技術では、マイトジェンでマウス，ラッ
トあるいはヒトのリンパ球を刺激することにより製造さ
れてきた（Gillisら,Nature,268,154〜156,（1977））,
Farrarら,Immunol.,121,1353〜1360,（1978）,Gillis
ら,J.Immunol.,120,2027〜2033,（1978））。ヒトの末
梢血リンパ球をマイトジェンで刺激することにより（Gi
llisら,J.Immunol.,124,1954〜1962,（1980））、Gilli
sらはＴリンホーマ細胞株からのマウスIL−２の製造（G
illisら,J.Immunol.,125,2570〜2578（1980））とヒト
白血病細胞株からのヒトIL−２の製造（Gillisら,J.Ex
p.Med.,152,1709〜1719,（1980）） を報告している。

Gillisらによる上記の技法は、細胞培養法を用いてマイ
トジェンで活性化されたＴ白血病細胞株からヒトIL−２
を製造する方法に関するものである。しかしながら、こ
の方法では低濃度のヒトIL−２しか産性されないので難
点で、大量の培養液から微量のIL−２を得るために、複
雑な精製工程を必要とする。更に、ヒト白血病細胞株は
少量のヒトIL−２に酷似した他の生理活性物質も産生す
るので、IL−２をこれらの他の免疫活性を有する分子と
分離、あるいは時として共存する細胞毒物質（toxic le
ctin）と分離するにはかなりの困難が伴う。

IL−２を製造する他の方法として、インターフェロンの
ような他の生理活性ヒト由来たんぱくを製造するために
用いられた組換えDNA（デオキシリボ核酸の略）法（Gra
yら,Nature 295,503〜508,（1981）,Nagataら,Nature 2
84,316〜320（1980）,Taniguchiら,Gene 10,11〜15,（1
980））が好ましいと思われる。しかしながら、本発明
の以前には組換えDNA法によってIL−２を製造する試み
は成功していなかった。例えば、組換えDNA法によってI
L−２を産生する生命体を作成しようとする試みは、恐
らくIL−２ポリペプチドをコードする遺伝子が未だクロ
ーン化されていなかったために成功していないという事
が、“日経バイオテクノロジー，第19号,1982年７月５
日”に報告されていた。

従って、IL−２をコードするクローン化遺伝子とその遺
伝子を持った組換えDNAが渇望されてきた。また、組換
えDNA体を有する生細胞株と、その細胞株を使ってIL−
２を製造する方法が渇望されてきた。

本発明の要旨は以下の記述から更に容易に明白となる。
本発明の目的受はIL−２活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を創出したことにある。

すなわち、本発明はヒトインターロイキン２活性をも
つ、次のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす
る遺伝子を提供するものである。なお、本明細書におい
てアミノ酸のうちGlnとAsnとそれぞれGINとAsNと記載す
ることがある。

本発明の遺伝子は、次の塩基配列からなる。

本発明の遺伝子を利用することによって、IL−２はIL−
２活性を有するポリペプチドを産生すべくコードされた
遺伝子の挿入と、細胞の中で複製され得るベクターDNA
の挿入で組換え法により修飾され、該遺伝子のコードシ
ーケンスが、プロモーターシーケンスの下流に位置する
DANによってIL−２を産生すべく形質転換させた原核生
物細胞株、特にエシェリヒア・コリを培地に浮遊培養
（好気的）することによって製造される。

本発明のIL−２ポリペプチドをコードしたクローン化遺
伝子は、IL−２活性を有するポリペプチドを産生する能
力をもつことによって特徴づけられる哺乳動物細胞に由
来するIL−２に相当するメッセンジャーRNA（mRNA;“RN
A"はリボ核酸の略，以下“IL−２ mRNA"という）を相
補的DNA（cDNA）に逆転写することによって得られる。
得られた２重鎖cDNA（ss−cDNA）は一重鎖cDNA（ds−cD
NA）に変換させることができる。

cDNAを調製するための鋳型として用いるmRNAは、IL−２
ポリペプチドを産生する哺乳動物細胞から単離すること
ができる。単離されたRNAはポリアデニル化され（GiLLi
sら,Immunological Rev.,63,167〜209（1892））、ポリ
アデニル化されたRNAは、例えばショ糖密度勾配遠心法
によって11〜12S画分に分画することができる。13SのmR
NAにIL−2mRNA活性が現われることがあるが、この場合
は11〜12SmRNAの凝集物であることが考えられる。

mRNAの供給源となるIL−２を産生することができる哺乳
動物細胞は、哺乳動物より摘出できる末梢血単核球，扁
桃腺細胞，脾臓細胞のようなＴ−リンパ球で良い。細胞
にIL−２産生能を与えたり、またはIL−２活性を増強す
るために、ナイロンカラム処理，抗血清と捕体処理，密
度勾配分画，ノイラミニダーゼとガラクトースオキシダ
ーゼの組合せ処理，トリプシン処理のような様々な酵素
処理,X線照射など従来知られた方法で前処理しても良
い。上記哺乳動物細胞をＴ細胞増殖因子存在下で培養後
得られるクローン化Ｔリンパ球もmRNAの供給源として用
いることができ、これはより好ましいＴ−リンパ球であ
る。白血病やリンパ腫細胞株に由来するＴリンパ球それ
自体または上記の方法で前処理または変異したそれらの
誘導体などの形質転換されリンパ球細胞株またはクロー
ニングされた形質転換細胞株もmRNAの供給源として好ま
しい。明らかに、クローン化した細胞株は通常クローン
化前の親株に比較して多量のIL−2mRNAを含んでいる。
上記したリンパ球由来細胞とCEM,Molt 4F,BW5147のごと
き腫瘍細胞株を融合することによって得られたＴ細胞ハ
イブリドーマもまた使用するのに好ましい哺乳動物細胞
である。この場合のリンパ球由来細胞は、（１）IL−２
の自発産生細胞および（２）IL−２産生を補助する他の
細胞の存在下または非存在下に培養液中にマイトジェン
が導入され存在している時のみIL−２を産生する細胞を
含む。

IL−２自発産生細胞においてIL−2mRNAを誘導するため
に、IL−２自発産生細胞は、細胞培養の分野でよく知ら
れた方法で培養される。マイトジェン存在下のみでIL−
２を産生する細胞においてmRNAを産生する場合は、培養
した細胞は倍地で良く洗った後、血清を含むかまたは含
まないローズウエルパークメモリアルインスティテュー
ト1640（以下、“RPMI 1640"と略す。），ダルベッコウ
変法イーグル培地（以下“DMEM“と略す。）またはクリ
ック培地のごとき倍地に再び浮遊する。これらの細胞培
養地には、ペニシリン，ストレプトマイシンまたは他の
抗生物質,L−グルタミン，ヘペス緩衝液，または炭酸水
素ナトリウムのような種々の添加物を細胞培養の分野で
一般に使われる濃度で加えても良い。好ましい細胞濃度
は0.5〜４×10⁶細胞/mlである。mRNAの活性化とIL−２
の産生を誘導するために適当な刺激剤が加えられる。こ
の適当な刺激剤の中には、マイトジェン，ノイラミニダ
ーゼ，ガラクトースオキシダーゼ，塩化合亜鉛の如き亜
鉛化合物またはプロテインA,ストレプトリシン−Ｏの如
き細胞由来のリンパ球活性化因子が含まれる。刺激され
た細胞は回収され、洗浄される。マイトジェン刺激の
際、マクロファージまたはデンドリティック細胞を共存
させるとやはりmRNAを活性化し、あるいは活性化mRNAの
収量を増大させ得る。同様にRaji,Daudi,K562,BALL−１
の如きＢリンパ球またはＢリンパ球細胞株に由来する細
胞株を共存させてもmRNAは活性化され、または活性化mR
NAの収量を増大させ得る。

哺乳動物細胞を増殖させるために、細胞は通常の条件下
でin vitroで細胞培養により、または組織適合動物の体
内で維持される。mRNAの供給源を調製するためにin vit
ro培養による継代を行なう場合には、従来Ｔ細胞の生育
を促進することが知られている培地であればどのような
培地にもこれら細胞を生育する。これらの培地には哺乳
動物の血清，血清成分または血清アルブミンを添加して
も良い。mRNAの活性化のための培養時間は、mRNAを生成
するための活性化に必要な時間に対応する。この時間
は、通常IL−２の培地中への産生が開始されるまでに必
要な時間と対応している。好ましい時間は、マイトジェ
ン等の刺激剤を添加してから３〜12時間である。培養時
間が長すぎる場合、生成したIL−2 mRNAが分解されるこ
とがある。IL−２産生細胞の活性化に際し、PMAまたはT
PAの如きホルボールエステル類を10〜50ng/ml添加して
活性化レベルを上昇させることもできる。

IL−2 mRNA活性化のための上記工程はpH7.0〜7.4,温度
範囲32〜38℃の飽和水蒸気の環境下で行なわれる。

IL−２を産生する哺乳動物細胞を取得し培養する方法を
以下に述べる。

（イ）IL−２自発産生株の取得 ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ，ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ，西ドイツ
国立癌センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×10⁶個/mlの細胞密度でクリック培地
中に懸濁させ、150レントゲン／分の照射速度で合計8,0
00レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本発明を0.
1細胞/200μ培地の細胞密度で96穴の平穴マイクロタ
イタープレート（「ファルコン3072」）に添加し、５％
牛胎児血清を含むクリック培地中で３週間37℃にて５％
CO₂インキュベーター中にて培養する（限界希釈法によ
るクローニング）。細胞の生育が認められた培養ウエル
中の細胞は、細胞が底面全体をおおう密度に到達する前
に24穴のヌンク社製培養プレートに移し、クリック培地
中にて５日間細胞を増殖させる。さらに、本細胞を１〜
２×10⁶個/mlの細胞密度にて血清も血清由来アルブミン
も含まない無血清合成培地に懸濁して２日間培養し、本
培養上清を遠心分離操作で分離し、次いで0.22μのミリ
ポアフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なった。
このようにして得た培養上清のIL−２活性を測定するこ
とによってIL−２を自発産生するＸ線処理変異株が選択
され、かつクローニングされた。

（ロ）ヒト末梢血単核細胞よりIL−２産生株の取得ヒト
の末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾配
遠心法により末梢血リンパ球（以下、PBLと略す）。を
採取する。本PBLを１×10⁶個/mlの細胞密度で５％FCSを
含むクリック培地に懸濁し、各2ml宛24穴のヌンクの培
養プレートに接種する。ここにフイトマグルチニン−Ｍ
（ギブコ社製）を５μg/mlの週末濃度になるように100
μ添加し、上述の条件下に48時間培養し、次いで細胞
を培養液で洗浄し、再び１×10⁵個/mlの細胞密度でクリ
ック培地1mlに接種する。さらに、コンカナバリンＡ
（以下、ConAと略す。）2.5μg/mlで48時間刺激したヒ
ト脾細胞から調製したコンディショニングした培地1ml
を加え、該コンディショニングした培地50％を含む培地
を３日毎に取り換えて、PBLからのヒトＴリンパ球を長
期継代培養する。このように長期継代培養して得たＴリ
ンパ球を、前述と同様の限界希釈法でコンディショニン
グした培地に由来するヒト脾細胞の存在下、クローニン
グを行ない、かつ同様に細胞増殖を行なう。こうして得
られたクローン化Ｔリンパ球を１×10⁶個/mlの細胞密度
に10μg/mlのフイトヘマグルチニン（以下、PHAと略
す。）の存在下、24穴のヌンク培養プレート中のRPMI 1
640培地1mlに接種し、24時間,37℃で7.5％CO₂インキュ
ベーター中にて培養した。本培養上清を遠心分離操作で
分離し、次いで0.22μのミリポアフィルターで無菌化を
行なった後、IL−２産生ヒト正常Ｔリンパ球クローンを
同定するために、IL−２活性検定を行なった。

（ハ）マイトジェン刺激でIL−２を生産するヒトリンパ
球由来悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−111株は、前記の無血清培地や血清
１〜２％を含むBPMI 1640培地中にてConA 10μg/mlやP
HA2.5μg/mlの存在下に24時間培養すると、10〜4,000単
位/mlのIL−２を産生することができる。また、これら
ヒト悪性化細胞は塩化亜鉛，プロティンA,ピシバニール
存在下に培養しても、IL−２を産生する。

（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生する因子の存在
下にマイトジェンで刺激することによりIL−２を産生す
る細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細胞Molt 4Fや前述の限界希釈法で
クローン化されたジュルカット細胞の１つのクローン，
ジュルカット99株は、上述のごときレクチンやマイトジ
ェンを広い濃度範囲で加えて24〜72時間培養してIL−２
を産生しない。ところが、この間モノカインの１種であ
るインターロイキン１を５〜10u/mlまたは50％のK562や
ラージ（Raji）細胞を共存させて37℃,24時間培養する
と、IL−２を確認しうる量（10〜100u/ml）産生する。

このようにして活性化された細胞よりIL−2mRNAを抽出
するには、細胞の種類を問わず常法によって行なえばよ
い。たとえば、NP−40,SDS,Triton−x100,デオキシコー
ル酸などの界面活性剤を添加して細胞を部分的または完
全に分解するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物理
的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊，可
溶化する。その際にRNaseによるRNAの分解を防ぐため
に、抽出液中にRNaseインヒビター、たとえばヘパリ
ン，ポリビニル硫酸，ベントナイト，マカロイド，ジエ
チルピロカーボネート，バナジウム複合体などを添加し
ておくのが好ましい。また、場合に応じては、抗IL−２
抗体を用いてIL−２合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよりmRNAを界面活性剤などで抽出する方法も行
ない得る。

また、poliAを含むmRNAの精製についてはオリゴdT−セ
ルロース，セファロース2Bを担体とするポリＵ−セファ
ロースなどのアフィニティ・カラムあるいはバッチ法に
よる精製法,SDG遠心法による分画，アガロースゲル電気
泳動法等によって行なうことができる。

上記の如くして得られたmRNAがIL−2mRNA活性を有する
ものであることを確認するためには、mRNAが蛋白に翻訳
させ、その生理活性を調べるか、抗IL−２ペプチド単ク
ローン性抗体を用い該翻訳蛋白を同定する等の方法を行
なえばよい。たとえばmRNAは通常、アフリカツメガエル
（Xenopus laevis）の卵にマイクロインジェクション
することにより（Gurdonら,Nature,233,177〜182（197
2））あるいは網状赤血球または小麦胚無細胞翻訳シス
テムを使用することにより対応する蛋白に翻訳される。

IL−２活性は、先にGillisら（Gillisら,J.Immunol.,12
0,2027〜2033（1978））によって基本的には述べらてい
るミクロ検定法によって確認できる。この検定法では、
Gillisらによって確立された方法に従って作成した細胞
障害性Ｔリンパ球細胞株（以下、CTLLと略す。）のIL−
２に依存細胞のDNA合成上昇（IL−2 dependent cellula
rproliferation）を指標している。即ち、４×10³個のC
TLL細胞を２％のFCSを含むRPMI−1640培地100μに懸
濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と共に96穴の平
底マイクロプレートに接種する。37℃,5％CO₂下で20時
間培養した後、細胞を0.5μCi/ウエルの³H−TdRで４時
間ラベルし、自動細胞ハーベスター用いて帯状ガラス繊
維上に細胞を回収し、細胞が取り込んだ放射能を液体シ
ンチレーション法で測定する。この検定により、IL−２
存在下に培養されたCTLL細胞が投与量に依存して³H−Td
Rを取込むことが判明し、このことから液体中に含まれ
るIL−２量を明確に計算することができる。

IL−２はＴリンパ球の増殖を促す活性を有するので、IL
−２活性をＴリンパ球の増殖を指標として測定すること
ができる。促ち、５個のCTLL細胞を２％のFCSを含むDME
M100μに懸濁し、100μの連続希釈した翻訳産物と
共に96穴の平底マイクロプレートに接種する。72〜96時
間,37℃,5％CO₂下で培養した後、活性化し増殖した細胞
の数を顕微鏡下で計測する。対照群として100U/ml,10U/
mlのIL−２を用い、この対照群の増殖した生細胞数と比
較して検体のIL−２活性を求める。

このようにして最も高活性の画分から得られたIL−2 mR
NAはds−cDNAを合成するための鋳型として用い、ds−cD
NAはベクターDNAと結合させる。cDNAの合成は従来の方
法によって行なう。

まず、mRANを鋳型し、オリゴdTをプライマーとして2AT
P,dGTP,dTTPの存在下で逆転写酵素によりmPNAと相補的
なss−cDNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNAを分解除
去した後、今度は単鎖cDNAを鋳型にして逆転写酵素ある
いはDNAポリメラーゼを用いてds−cDNAを合成する。

このようにして得られたds−cDNAと原核生物で複製でき
るレプリコンを含むベクターDNAから組み換えDNA体が作
られる。しかる後、この組み換えDNA体は宿主細胞に組
み込まれる。

このds−cDNA及び原核生物で増殖し得るベクターDNA
は、これらを結合させる前にエキソヌクレアーゼ処理，
化学合成DNA断片の追加,ds−cDNAやベクターDNAの末端
に連結可能な端末をつけるためにC,C−鎖を伸ばすなど
の各種処理によって装飾される。これらの連結可能なDN
Aは、例えばATP共存下にT4ファージのDNAライゲースに
よってつぎ合わせることが出来る。

このようにして調製された組換えDNA体によってクロー
ン化されたcDNAを増巾させるため又はIL−２ポリペプチ
ドを製造するために生細胞を形質転換する。

IL−２生産のための適当な原核生物宿主としてはエシェ
リヒア・コリ，パチルス・ズブチリスなどが含まれる。
宿主細胞中でのDNA増巾のためにはエシェリヒア・コリ
を宿主とすることが出来るが、その他の宿主細胞とする
ことも出来る。

適当なエシェリヒア・コリ用ベクターとしてはEK型プラ
スミベクター（ストリンゼント型）としてpsC101,pRK35
3,pRK646,pRK248,pDF41など.,EKタイププラスミドベク
ター（リラックスドタイプ）:Co1E1,pVH51,pAC105,RSF2
124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,PBR324,pBR325,pBR327,p
BR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK2004,pA
CYC1,pACYC184,dul等.,λgtタイプファージベクター：
λgt.λc,λgt.λB,λWES,λC,λWES.λB,λZJvir.,λ
Ｂ′，λALO,λB,λWES.Ts622,λDam等が含まれてい
る。一般に、pBR322はエシェリヒア・コリ用ベクターと
してしばしば利用されてきたが、この場合最も良いクロ
ーニング部位はPst1ならびにEcoR1部位である。

組換えDNA体を用いた宿主細胞の形質転換には、通常よ
く用いられる次の方法がある。エシェリヒア・コリの如
き原核生物が宿主の場合、このDNAを取り込むことの出
来るコンピテント細胞は対数増殖期における細胞を回収
後、よく知られているCaCl₂法によって形質転換出来
る。形質転換反応液中にMgCl₂又はRbClを共存させれば
形失転換効率は向上する。また、宿主細胞のプロトプラ
スト調製後形質転換させることも可能である。

IL−２遺伝子を保有する細胞は、次の２つの方法の何れ
かの用いて形質転換後分離可能である。

（１） プラス−マイナス法：抗原刺激した哺乳動物細
胞抽出液より蔗糖密度勾配遠心分離にて11−12S画分と
して部分精製したIL−2mRNAを調製し、この部分精製mRN
Aを鋳型として³²P−放射能ss−cDNAを合成する。アルカ
リ処理にて鋳型mRNAを除去後、単離されたcDNAは、抗原
刺激しない哺乳動物細胞ら抽出され、部分精製した11−
12SmRNAでハイブリダイズする。引続いてハイブリダイ
ズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcDNAはハイドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画する。
ハイブリダイズしなかったcDNAとハイブリダイズしたcD
NAをそれぞれプローブＡ、及びプローブＢと呼ぶ。何れ
の組換え体も同一の方法によりそれぞれニトロセルロー
ス濾紙上で生育させる。そして、細胞のDNAをアルカリ
処理にて濾紙上に固定する。プローブＡ及びＢをそれぞ
れ、二つの異った濾紙上でDNAとハイブリダイズさせ
る。その後、オートラジオグラフィーを行ってプローブ
Ａと陽性に反応する組換え体（プラス）、プローブＢと
僅か又は反応しない組換え体（マイナス）を選別する
（谷口ら;Proc.Jap.Acad.,V155B 464〜469（1979）． （２） 第２の方法は、例えば100〜10,000の組換体ク
ローンを２〜30ないし２〜300クローン宛のクローング
ループに大別し、それぞれのクローングループをそれぞ
れ常法によって培養しプラスミドDNAsを調製する。次い
で、これらプラスミドDNAsを例えば熱変性してss−cDNA
をニトロルセルロース濾紙上に固定し、活性化IL-2-mRN
Aを含有する哺乳動物細胞から調製されたmRNAと相補的
にハイブリダイゼーションを行う。あるいはまた、IL−
2 mRNAを含有するmRNA（混合物）を熱変性したプラスミ
ドDNA（混合物）とハイブリダイズさせるとDNA−mRNAハ
イブリッドがニトロセルロース濾紙上に固定される。こ
の濾紙を1mMのHEPES、あるいは10mMの食塩水のごとき低
塩類緩衝液で洗浄し、濾紙上に吸着されたmRASを0.5mM
EDTA;0.1％SDS溶液含有液で例えば95℃,1分間処理して
抽出する。精製mRNAはこれをoligodT−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにて溶出回収する。次いで、mRNA
をアフリカツメガエル卵母細胞にマイクロインジェクシ
ョンして蛋白質に翻訳してIL−２活性を確認する。ある
いはmRANAに依存性の網状赤血球系又は小麦胚のin vitr
o無細胞合成系を用いてこのmRNAを蛋白に翻訳させ、抗I
L−２抗体を用いてIL−２−活性を分析することが出来
る。これらの方法によってIL−２活性が検出されたグル
ープをさらに少数の組換え体クローンを含有する群に類
別し最終手にはIL−2 DNAを有する単一クローンが得ら
れるまで繰返し実施する。

IL−２産生能のある組換え体よりIL−２ポリペプチドを
コードするcDNAを得るには、先ずトランスフォーマント
中の組換えDNA体を分離し、これを制限酵素エンドヌク
レアーゼで切断する。切断によって得られるNNA分画よ
り組込まれたcDNA画分を分離する。

pIL−２−50Aを組換えたDNAよりIL−２ポリペプチドを
コードするPst1 DNAインサートの全ヌクレオチド配列
は、Maxam and Gilbert法（Meth.Enzym.65,499〜560,
（1980））；ならびに二デオキシヌクレオチド鎖末端法
（Smit,A.J.M.Meth.Enzym.65,560〜580,（1980））にて
決定された。

cDNAインサートの制限酵素エンドヌクレアーゼによる切
断図を第１図及び第２図（ａ）に示す。第２図（ａ）に
示すごとく、このcDNAはそれぞれBstN1,Xba I,BstN Iな
る制限酵素エンドヌクレアーゼで切断される構造を有す
る。

本cDNAインサートのDNA配列は１つの大きなオープンリ
ーディングフレームを保有する。真核生物の読み取り開
始配列となることの多い第一のATG配列（Kozak,M,Cell,
15,1109〜1123（1978））は、５′一端から48−50ヌク
レオチド位に存在し、読み終り配列TGAが存在するヌク
レオチド位507−509迄152の配列がこのATGにつながって
いる。mRNAの３′−poly（Ａ）末端に相当するＡのつな
がりがcDNA末端に見出され、通常真核生物mRNAのほとん
どに見出される６個からなるヌクレオチドAATAAA（771
−776位）が先に位置する。

（Proudfoot,N.J.＆ Brownlee C.G.,Nature 263,211-21
4,（1976）） cDNAによってコードされるアミノ酸配列は第２図（ｂ）
アミノ酸配列１）のごとく演えきでき、しかもアミノ酸
配列Ｉのポリペプチドは153個のアミノ酸からなり、そ
の分子量は17631.7ダルトンと計算される。今日迄知ら
れている分泌蛋白の殆んどに見られると報告されている
ように（Blobel G.et al,Sym.Soc.Exp.Med.,33,9〜36
（1979））、上記演えきIL−２ポリペプチドのＮ末端領
域はやはり疎水性である。本領域は成熟IL−２の分泌時
に切断されるシグナルペプチドの役割を果しているであ
ろう。切断は20−21位のSerとAla間で起るか21−22位間
のAla-Pro間で切断されるアミノ酸配列IIおよびIIIを有
するポリペプチドを生成する。何故ならば同様な切断位
置は今迄知られたその他の分日蛋白にもしばしば見出さ
れているからである（Blobel,G.et al,Symp.Soc.Exp.Me
d.,33,9〜36（1979））。従って、成熟IL−２ポリペプ
チドは133ないし132個のアミノ酸から成り、分子量は15
420.5または15349.4ダルトンと算出される。本分子量値
はジュルカット細胞から得られたヒトIL−２蛋白の分子
量（15000ダルトン）として報告されたものを対比され
る （Gillis .et al,Immunological Rev.,63,67〜209（198
22））。また実施例３に示すごとく塩基配列111〜113位
にあるCCT配列から始まるDNA画分、即ち、22位に位置す
るProから始まるポリペプチドに対するコード（第２
（ｂ）図中のアミノ酸配列III）はIL−２活性を有する
ポリペプチドを表現していることが確認された。塩基配
列107〜110位にあるGCAから始まるDNA画分、即ち第２
（Ｂ）図のアミノ酸配列IIに示すごとく、21位に位置す
るAlaから始まるポリペプチドをコードするDNA画分は、
実施例６に示すごとくIL−２活性を有するポリペプチド
を表現していることが確認された。

有該生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子でも知
られている様に多形現象を示すことが知られている（谷
口ら,Gene 10,11〜15（1980），大野，谷口.,Proc.Nat
l,Acad.Sci.USA,77,5305〜5309（1981）;Gray et al,Na
ture 295,501〜50（1981））。この多形現象によって、
蛋白生産物のアミノ酸のあるものが置換される場合もあ
れば、塩基配列の変化はあっても全く変らない場合もあ
る。ヒトIL−２・cDNAの場合、pIL-2-50A cDNAの503位
のＡ残基がＧ残基で置き換えられた他のcDNAクローン
（pIL-2-503）も検出できる。pIL-2-50A cDNAとは塩基
配列が異なるその他のcDNAクローンの存在も期待でき
る。

上記説明からも明らかごとく、本発明の遺伝子は、第２
（ａ）図に示された塩基配列するDNA,48−50位のATG配
列から始まり、504〜506位にある少くともACT配列に至
る連続塩基配列を有するDNAs,108-110位のGCA配列から
始まり、GCA配列から少なくともACT配列に至る連続塩基
配列を有するDNA,また111-113位のCCT配列から少なくと
もACT配列に至る連続塩基配列を有するDNAを包含する。
本発明の遺伝子はまた、504〜506位のACT配列に終り、
１位のＡに始まるDNA,48-50位のATGで始まるDNA,108-11
0位のGCA配列で始まるDNA又は111-113位のCCT配列で始
まるDNAを包含する。更に本発明の遺伝子は、507〜509
のTGA配列に終り、１位のＡに始まるDNA,48〜50位のATG
配列で始まるDNA,108〜110位のGCA配列で始まるDNAまた
は111-113位のCCT配列で始まるDNAを包含する。更に本
発明の遺伝子は、801位のＣで終り、１位のＡで始まるD
NA,48-50位のATGで始まるDNA,108-110位のGCAで始まるD
NAまたは111-113位のCCT配列で始まるDNAを包含する。
本発明の遺伝子はまたpoly（Ａ）で終り、48-50位のATG
配列から始まるDNA,108-110位のGCA配列で始まるDNAま
たは111-113位のCCT配列で始まるDNAを含む。また、本
発明の遺伝子は、アミノ酸配列I,II,IIIに相当する塩基
配列を有する遺伝子を含む。アミノ酸配列Ｉの中で１個
ないしそれ以上のアミノ酸を欠くポリペプチド、あるい
はアミノ酸配列Ｉの中の１個ないしそれ以上のアミノ酸
が１個ないしそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプ
チドはIL−２活性を有することもあり、従ってこの様な
ポリペプチドをコードする遺伝子は本発明の遺伝子とし
て使える。同様にアミノ酸配列I,IIまたはIIIに対して
１個ないしそれ以上のアミノ酸を表現し得る１個ないし
それ以上の塩基を余分に結合した遺伝子であっても追加
されたアミノ酸が、ポリペプチドのIL−２活性発現に邪
魔しない限り本発明の遺伝子の中に包含される。IL−２
としてのポリペプチド機能を阻害する追加アミノ酸配列
を有する修飾領域であっても新たに追加さた領域が容易
に除去出来るものならば本発明の遺伝子として利用出来
る。同じことはアミノ酸配列I,IIおよびIIIに対応する
遺伝子のアミノ配列I,IIおよびIIIのＣ−末端にアミノ
酸追加をコードするDNAが３′−末端に追加結合せしめ
たDNAの場合にも言える。

上記の如くして得られた本発明の遺伝子を利用してIL−
２を生産するには、まず本発明の遺伝子を含有する組換
えDNA体を作り、次いで該組換えDNA体により宿主細胞を
形質転換し、該形質転換された生物細胞を培地で培養す
ればよい。

生細胞中でIL−２産生をする組換えDNA体は、次の各種
方法で作られる。例えば、IL−２・cDNAをコードする配
列を発現ベクターのプロモーター配列下流に挿入する。
あるいはプロモーター配列を持つcDNA片を発現ベクター
のcDNA挿入の前あるいは後にIL−２をコードする配列の
上流に挿入することが出来る。

IL−２−cDNAを発現し、IL−２−ポリペプチドを産生す
る原核生物の造成法を詳述すれば以下の通りである。

（１） エシェリヒア・コリによるIL−２・cDNAの発現 エシェリヒア・コリ中でIL−２・cDNAを発現させるとき
には、先ずcDNAを各種細菌プロモーターと結合せしめた
後、プロモーター下流にcDNAを含有するハイブリドプラ
スミドを作る。このプラスミドを、例えばエシェリヒア
・コリHB101に感染させ、ヒトIL−２活性を有する蛋白
を生合成する細菌がクローンされる。本来細菌のプロモ
ーターならば如何なるものでもcDNAに適当に接続されて
いればIL−２−cDNAを発現する。この様なcDNAの発現例
は以下のとおりである。

IL−２をコードするクローン化cDNAは第２図に示される
様な153個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードす
る。本ポリペプチドの20個のアミノ酸に相当するＮ−末
端領域は極めて疎水性であり、殆んどの分泌蛋白の特徴
でもある。この様な疎水性配列はシグナル配列と称し分
泌過程で切断される。故に、成熟IL−２ポリペプチド
は、153個のアミノ酸より少ない筈である。このことか
ら、成熟IL−２ポリペプチドをコードするcDNA部分を発
現させることが望ましく、IL−２シグナル配列相当部分
を発現させるのは望ましくはない。

（ｉ） プラスミドベクターpTrs-3の構築 pTrs-3は、エシェリヒア・コリTrpプロモーターを含
み、pTrs-3のリーダーペプチドのためのリボソーユ結合
部位（SD配列）は既に報告されている（G.Miozzari and
Yanofsky J.Bacteriol.133,1457〜1466（1978））。SD
配列の下流13塩基対にあるATGコードンの存在も報告さ
れている（Nishi et al,生化学54,No.8.676（198
2））。このプラスミドベクターはまた、ATG開始配列
（第３図）の下流に一つのSph Ｉ部位を含んでいる。

IL−２・cDNAを発現させるため、先ずプラスミドをSph
Ｉで消化しエシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ
（クレノウ（klenow）フラグメント）または、バクテリ
オフォージT4 DNAポリメラーゼＩで処理し３′−位突き
出し末端を除去する（第４図（ａ））。プラスミドpIL-
2-50AをPst IおよびHgiA Iで２回消化し、より大きいcD
NA画分を単離する。次いでDNAをエシェリヒア・コリDNA
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグコメント）又はバクテ
リオファージT4 DNAポリメラーゼで処理し３′−突き出
し末端を切りはなす。この処理をしたcDNAは132個のア
ミノ酸のIL−２ポリペプチドをコードする（第４（ａ）
図）。このcDNAを上述のごとく前処理したpTrs−３プラ
スアミドDNAに接合せしめ、ATG開始コードンをIL−2cDN
AのCCT（Pro）配列につなぎ合せる。こうしてプラスミ
ドpT IL-2-22が得られる。trpプロモーター配列とpT IL
-2-22のIL−2cDNA配列の結合は第４（ａ）図に示す。

プラスミドpT IL-2-22はエシェリヒア・コリによりプロ
リンから始まる132個のアミノ酸からなるIL−２ポリペ
プチド合成を指令する。

（ii）成熟IL−２はプロリンの代りにＮ−末端アミノ酸
としてアラニン（21位）を含むこともあり、133個のア
ミノ酸から成るIL−２ポリペプチド合成を指示するプラ
スミドを以下の如く作ることができる。

プラスミドpTrs−３はSD配列とATG配列との間に１つのC
Ia I切断部位がある（第３図）。本プラスミドはCIa I
とSal Iで切断される。プラスミドpIL-2-50AをPst Iで
部分分解し、エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩで
処理し、最も長いDNAを単離する。次いでDNAを制限酵素
Xho I切断部位を含む合成DNAリンカーと結合させ、IL−
２をコードする配列の３′−側下流にDNAリンカーを導
入したプラスミドpIL-2-50A（Xho）を含むクローンを単
離する。プラスミドpIL-2-50A（Xho）を先ずHgiA Iで切
断し、エシェリヒア・コリ クレノウフラグメントまた
はT4 DNAポリメラーゼで処理し、Xho Iで消化すればcDN
A画分が単離できる。このcDNAフラグメントをCIa Iおよ
びSal Iで前記したpTrS-3- DNAに結合させ第４（ｂ）図
の如く合成DNAにつなげる。かくしてAlaからスタートす
る133個のアミノ酸から成るIL−２ポリペプチドをエシ
ェリヒア・コリ中で合成させるプラスムドpTIL-2-21が
得られる。（第４（ｂ）図）。同様なことはXho Iリン
カーを使用しなくとも作られる。

（iii） 異ったＮ−末端アミノ酸を有する異った大き
さのIL−２ポリペプチドはpTrS-3発現プラスミドクター
を用いても作られる。以下に示すごとく、PIL-2-50Aに
クローンされたIL−2 cDNAはヌクレオチド結合部位81−
85に唯一だけDde I部分を有する。プラスミドpIL-2-50A
（Xho）を、Dbe Iで切断し、cDNAのより大きい区分を含
有するDNA画分を単離する。本画分はpBR322より3000塩
基対を有するDNAを含んでいる（第４（ｃ）図）。DNA画
分をエクソヌクレアーゼBal 31で処理し、次いでXho I
で切断する。ここで得られたDNAをSph Iで切断したpTrS
-3と結合せしめ、KlenowフラグメントまたはT4 DNAポリ
メラーゼで処理し次いでSal Iで消化する（第４（ｃ）
図）。つなぎ合せたDNAをエシェリヒア・コリHB 101に
感染させ、ヒトIL−２を発現するクローンを検索する。
これらのクローンは色色な大きさのヒトIL−２を発現す
る筈である。何故ならばヒトIL−２のＮ−未満領域に相
当するDNAは種々切断除去されるからである。かくしてI
L−2 cDNAを含有するpTIL-2-14と15が得られる。

（iv）IL−2 cDNAはまたはpKT 218（Talmageより提供を
受けた;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,P.3369〜3373（198
0））を用いても発現可能である。プラスミドpKT 218は
Pst Iで切断し、pIL-2-50AをHgiAIとPst Iで切断（第５
図）して得たIL−2 cDNA挿入部分とつなぎ合わせる。出
来上ったプラスミドpKIL-2-21は第５図に示したよう
に、蛋白合成開始の始発位に配列を有している。したが
って、このプラスミドpKIL-2-21はIL−２の133個のアミ
ノ酸とβ−ラクタマーゼのアミノ酸からなる両者が融合
したポリペプチドからなり、これをエシェリヒア・コリ
中で合成することが出来る筈である（最初のメチオニン
はエシェリヒア・コリでは切断除去される）。

（ｖ）p-BR.322にtufBに対するプロモーター配列を挿入
したプラスミドpTuBlp-5の発現は既に行なわれている
（谷口ら，生化学53 966（1981））。このプラスミドは
一つのCla I切断部位を含み、第６図に示すごとく本切
断部位はSD配列の２塩基対だけ下流に位置する。pTrS-3
もまたSD配列とATG始発配列の間にある一つのCla I切断
部位を含み、同時にこのCla I部位はpTrS-3とIL−2 cDN
Aを用いて発現用プラスミドを作る過程で壊されないの
で細菌TrpプロモーターをtufBプロモーターで置き換え
ることは極めて簡単である。従ってヒトIL−2 cDNAはtu
fBプロモーターの制御下で発現される。例えばpTIL-2-2
2をCla IとPvu IIで切断し、IL−2 cDNAを含むDNA画分
を分離する。次いでこの画分pTuBlP-5でつなぎ合わせ、
Cla IとPvu IIで予め切断後、第６図に図示される様に
プラスミドpTuIL-2-22が造成される。IL−２活性はプラ
スミドpTuIL-2-22を含むエシェリヒア・コリHB101の抽
出液に検出できる。

（vi）例えばpTIL-2-21を使っても、また基本的にはpTr
S-3を用いて達成したすべての発現用プラスミドを用い
ることによっても同様に造成できる。また例えばpTuIL-
2-22をCla Iで切断し、Bal31またはSIまたはDNAポリメ
ラーゼＩ（エシェリヒア・コリ）にてDNAの塩基対２−
３個を除去または補充し再度プラスミドをつなげること
によってSDおよびATG配列の距離を至適の長さにするこ
とも可能である。

次いで、組換えDNA体を挿入したエシェリヒア・コリ，
バチルス・ズブチリスの如き形質転換された原核生物細
胞を培養して組換えDNA体を増巾し又はIL−２ポリペプ
チドを生産する。この培養は通常の方法で行なわれる。

細胞内または細胞外に生産されたIL−２硫安沈澱，塩類
除去のための透析（常圧または減圧下），ゲル濾過，ク
ロマトグラフィー，等電点平板上濃縮，ゲル電気泳動，
高速液体クロマトグラィー（以下HPLCと略記），（イオ
ン交換，ゲル濾過並びに逆相クロマトグラフィー），及
び色素結合担体、IL−２に対するモノクローナル抗体を
結合した活性化セファロース4B又はレクチン結合セファ
ロース4B等によるアフィニティクロマドグラフィー等，
公知の方法によって回収することができる。IL−２の単
離精製法はWatsonら（J.Exp.Med.,150,849-861（197
9）,Gillis et al,J.Immunol.,124,1954-1962（1980）,
Mochizuki et al,J.Immunol.,Methods 39,185-201（198
0）,Welte,K et al,J.Kxp.Med.156,454-464（1982））
によって報告されている。

かくして得られたポリペプチドはマイトジェン刺激によ
って哺乳動別細胞から作られるIL−２について知られて
いるものと同一の生化学的並びに生物学的挙動を示しIL
−２活性を有する。分子量は約15000ダルトンでありIL
−２活性は、Igsorb（Enzyme Center）の様な免疫吸着
剤の有無にかかわらず完全に中和され、またはモロクロ
ーナル抗IL−２抗体で沈澱した。免疫電気泳動におい
て、IL−２ポリペプチドは、対応する抗IL−２抗体に対
して唯１個の沈降線を示す。IL−２活性は２−メルカプ
トエタノールで還元後も安定であり、DNAse及びRNAse処
理しても、又56℃,30分熱処理しても安定である。活性
はpH2〜９で安定である。この様にして生産されたIL−
２はモノクローナルな機能を有するＴ細胞（細胞障害性
Ｔリンパ球）の増殖を促進し、胸腺細胞の分裂を強め、
更に抗原非存在下、メモリー状態から抗癌特異的細胞障
害Ｔリンパ球への分化を惹き起こす。また、YAC-1細胞
やRL １細胞に対するナチュラルキラー細胞の活性化の
増強に役立つ。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ （１） ヒトＴ細胞系白血病細胞株であるジュルカット
細胞（日本、西独および米国では自由に入手可能であ
る）を10％FCSを含むPRMI 1640培地にけん濁し、Ｘ線照
射装置Exs 150/300-4（東芝・日本）により50秒間、室
温で10,000レントゲンに達するまで照射した。その後照
射された細胞は上述の培地中、初期細胞密度１×10⁵個/
mlで５％炭酸ガス、37℃のインキュベーター中で５日間
培養した。

この変異細胞（0.2個／穴）を96穴の平底のマイクロプ
レートの10穴にまき、５％炭酸ガス、37℃のインキュベ
ーター中で21日間培養した。生育してくる穴から得られ
るクローンはクローン量を増加させるため新たな培地へ
移し、その増加したクローンはConA 50μg/ml存在下で
初期細胞密度１×10⁶個/mlで24時間培養した。そしてIL
−２活性は前述の方法に従って測定した。

この結果、ジュルカット−111（ATCC CRL 8129）（以後
“Ｊ−111"と称する）と命名されたヒト細胞株が親株の
ジュルカットからクローン化、選択され、この細胞のIL
−２生産能は親株の40倍に増加していた。

このクローン化したＪ−111細胞株は通常条件下で増殖
し、その増殖速度は通常のジュルカット細胞とほとんど
同じであった。

（２） Ｊ−111細胞（１×10⁵個/ml）を無血清合成培
地RIT C 55-9（Sato,T.et al.,Exp.Cell Res.,138,127-
134,（1982））1000mlに接種し、ローラー培養ボトル
（ファルコン3027）内で37℃、４日間培養し、増殖した
細胞を遠心分離により取得した。この細胞を再び４×10
⁶個/mlとなるように上述のConA 25μg/ml含有培地に接
種した。ローラー培養ボトル（ファルコン）４バッチの
各々に細胞を接種した培養液100mlを入れ、６時間回転
培養した。

（３） このようにCoaA 25μg/mlで６時間刺激したジ
ュルカット細胞（1.2×10⁶）は生理食塩−リン酸緩衝液
（以後PBSと略す）8.000mlに懸濁した。この細胞は遠心
操作により２回洗浄し、ヌクレアーゼ阻害剤であるリボ
ヌクレオシドーバナデイル複合体（10mM）を含有するRS
B溶液（10mlトリス−塩酸緩衝液、pH7.5、10mM NaCl、
1.5mM MgCl₂）800mlに再懸濁した。その後、界面活性剤
NP−40を最終濃度0.05％となるように加え、ゆっくり混
合し、細胞核を3,000rpm、５分、４℃下で遠心し分離し
た。SDS（0.5％）及びEDTA（5mA）を上清液へ加え、細
胞質RNAを上清液と同量のフェノールを加え抽出した。
フェノールによる抽出を３回繰返した後、RNAは２培量
のエタノールにより沈澱され、本沈澱物を遠心により集
め、pH7.5の10mMTトリス−塩酸に溶解した。得られたRN
A量は196mgであった。

mRNAの分画はオリゴ（dT）−セルロース（P.L.Biochemi
cals,Type 7）のアフィニティークロマドグラフィーを
使用し行った。吸着液は20mMトリス−塩酸、0.5M NaC
l、1mM EDTA及び0.5％SDSを含むpH7.5の溶液であり、
溶出はカラム緩衝液（20mMトリス−塩酸、pH7.5、0.05M
NaCl、1mM EDTA）で洗浄後、水と10mMトリス−塩酸
（pH7.5）で交互に行った。溶出により得られたmRNAは
3.6mgであった。次にこの得られたmRNA 2.4mgを蔗糖密
度勾配遠心法（50mM トリス−塩酸、1mM EDTA、0.2 M
NaClを含むpH7.5の溶液中で蔗糖密度勾配５−25％、26,
000rpmで４℃下24時間）により分画した。mRNAの11から
12Sが分画No.12、13、14へ分画され、各々59μｇ、46μ
ｇ、60μｇであった。

（４） No.13の分画に得られたmRNAをアフリカツメガ
エル（Xenopu Iaevis）の卵母細胞へ注入した（50ng mR
NA/卵母細胞）。この卵母細胞の培養液をIL−２活性測
定した。表１に示す如く、³H−チミジン（³H-TdR）の取
込みの上昇及び活性化Ｔリンパ球数の増加を確認され、
明らかにこの分画中のmRNAはヒトIL−2 mRNAを含んでい
る事が立証された。

（５） その後IL−2 mRNAを含む11〜25S mRNAのNo.13
分画からin vitroでcDNAを合成した。

組換え体DNAはプラスミドベクターpBR 322と構成した。
組換え体DNAをエシェリヒア・コリに形質転換し、IL−2
cDNAクローンを獲得したクローンを以下に示す如き方
法により選択した。

（５−１）50mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、30mM N
aCl、6mM MgCl₂、5mMジチオスレイトール（以後DTTと略
す）、0.05mMの各dATP、dGTP、dCTP、dTTP（dCTPは³²P
放射標識したものを含む）、0.7μｇオリゴ（dT）₁₀、1
0μg mRNA及び15単位AMV逆転写酵素（J.W.Beard）を混
合し、41℃下で90分保った。反応終了後、DNAはフェノ
ール処理後エタノール沈澱物として回収し、このDNAお2
0mMトリスおよび1mM EDTAを含むpH7.5の溶液に溶解し
た。

ss−cDNA2.5μｇが合成された。本反応液よりmRNAを除
くために反応液にNaOH溶液を加えて0.33N NaOH溶液と
し、室温にて15時間置き、次いでpH7.5の1Mトリス−塩
酸緩衝撃液を同量加えて中和しクファデックスＧ−50カ
ラムをカラムを通した。回収されたcDNAは1.8μｇであ
った。

（５−２）50mM リン酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgC
l₂、10mM DTT、0.75mMの各dATP、dGTP、dCT、dTTP（dCT
Pは³Hで標識したものを含む）、1.8μg cc-cDNAおよび
８単位ポリメレースＩ（BRL、米国）を混ぜ15時間、15
℃で反応を行った。反応終了後DNAをフェノール及びク
ロロホルム処理後エタノール沈澱物として回収した。1.
10μｇのds−cDNAが生成した。50mM酢酸ソーダ（pH4.
5）、0.2M MaCl、1m ZnCl₂および1.10μｇ二本鎖cDNAの
混合物を37℃で30分間インキュベートした後0.25単位の
ヌクレアーゼS₁（三井、日本）を加え、さらに15分間イ
ンキュベートした。反応終了後、フェノール処理を２回
行った反応生成物をセファデックスＧ−50へ供し、二本
鎖cDNA0.55μｇを得た。

（５−３）0.14Mカコジル酸カリウム、30mM トリス塩
基、0.1mM DTT、1mM CoCl₂、0.64mM³²P−dCTP（比活性
2.7×10⁶cpm/n mol）、0.55μg ds−cDNAおよび５単位
のターミナルトランスフェラーゼ（BRL）を混合し、37
℃で７分間インキュベートした後フェノール処理し、次
いでセファデックスＧ−50カラムに供し、エタノール沈
澱物として0.50μg DNAを得た。回収したことのDNAは約
50個のdCMPの残基が両３′末端に付加されている事が判
明した。

pBR 322 DNA 10μｇを制限酵素Pst Iで切断したのちdCT
PのかわりにdGTPを用いたこと以外は前述のds−cDNAにd
CMP鎖を付加したときに用いた方法と全く同じ条件によ
り、切断したDNAの両３′末端にdGMP鎖を付加した。

（５−４）50mM トリス−塩酸（pH7.5）0.1M NaCl、5mM
DETA、0.05μg dGMP残基付加pBR 322および0.01μg dC
MP残基付加cDNAをまず65℃で２時間、次いで46℃で120
分間、さらに37℃で60分間、そして室温60分間インキュ
ベートした。

エシェリヒア・コリ χ 1776（Curtiss III,R.et al.,
in Molecular Cloning of Recombinant DNA,（W.A.Scot
t＆R.werner ed.）Academic Press,（1977））を50mlの
Ｌ培地（100μg/mlのジアミノピメリン酸、50μg/mlの
チミジン、１％トリプトファン、0.5％酵母エキス、0.5
％NaClおよび0.1％グルコースを含む）に接種し培養液
の吸光度が562nmで0.3付近になるまで、37℃で振とう培
養した。培養終了後、培養液を30分間０℃に保持し、菌
体を遠心分離により集め、5mM トリス−塩酸（pH7.
6）、0.1M NaCl、5mM MgCl₂および10mM RbClを含む溶液
25mlで２回洗浄した。

得られた菌体を5mM トリス−塩酸（pH7.6）、0.25M KC
l、5mM MgCl₂、0.1M CaCl₂および10mM RbClを含む溶液2
0mlに懸濁し、０℃で25分間静置後、菌体を集め上記と
同じ溶液1mlに菌体を再懸濁し、得られた菌体懸濁液の
0.2mlに上記霧換え体DNAを入れ、０℃で60分間静置し
た。その後Ｌ培地0.7mlを加え37℃で30分間振とう培養
した。こうして得られた培養液（0.1ml）を100μg/mlジ
ミノピメリン酸、50μg/mlチミジンおよび15μg/mlテト
ラサイクリンを含むＬ培地の1.5％寒天培地上に一面に
塗抹し、37℃で２日間インキュベートした。

（５−５）出現した432のコロニーを18のグループに分
け、（その各グループは24の異なるバクテリアクローン
を含む）100μg/mlのジミノピメリン酸、50μg/mlのチ
ミジンおよび10μｇのテトラサイクリンを含むＬ培地20
0mlに接種し、37℃で５〜７時間振とう培養した。次に
最終濃度170μg/mlとなるように加えられたクロラムフ
ェニコールを含む新たなＬ培地200mlを加え、さらに一
晩培養した。

このようにして増強されたプラスミドDNAを常法に従い
精製した。

IL−2 cDNAを有するクローンmRNAハイブリダイゼーショ
ン−トランスレーションアッセイ（以後Ｈ−Ｔアッセイ
と略称する）により選択した。

ここで用いられたＨ−Ｔアッセイは以下に示す如く行っ
た。

純化したDNA（25μｇ）を制御酵素HindIIIにより開裂し
フェノールで３回、フェノール−クロロホルムおよびク
ロロホルムで各々処理し、エタノールで沈澱させ80％エ
タノールで洗浄し、80％ホルムアミド40mlに溶解した。

反応液を変性させるため90℃で５分間加熱後10×SSC
（1.5M NaCl、0.15M クエン酸ソーダ）で1.3mlに希釈
した。その後、本DNAをニトロセルロース濾紙上に固定
し、これを80℃で３時間乾燥させ、50％ホルムアミド、
20mM Pipes（pH6.5）、0.75M NaC、5mM EDTA、0.2％SdS
及びＪ−111細胞由来のpoly（Ａ）mRNA250μｇを含む溶
液中で37℃、18時間インキュベートし、濾紙上に固定さ
れたDNAとIL−2mRNAをハイブリダイズした。

次にその濾紙を65℃で３回pH6.5の10mM Pipes,0.15M Na
Cl溶液、1mM Pipes,10mM NaCl溶液で洗浄し0.5mM EDT
A、0.1％SDS溶液で95℃、１分間処理し濾紙からハイブ
リダイズしたmRNAを回収した。

このよううにして抽出したmRNAを常法に従ってオリゴdt
−セルロースカラム上で精製し、アフリカツメガエル卵
母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−２活性を測定し
た。

各々24クローンからなる18グループのうちの１グループ
が前述の³H−TdR取込みによるアッセイで48単位/mlのIL
−２活性陽性を示した。一方他のグループは明らかに陰
性であった。

次に、陽性のグループに属する24の各単一コロニーを既
述と同じ組成のＬ培地200mlへ接種し、37℃で５〜７時
間好気的に培養し、同様にクロマムフェニコール含有の
Ｌ培地をさらに添加した。

一晩培養して、プラスアミドDNAを増強後、プラスミドD
NAを同様に標準法に従って精製した。HindIIIで各プラ
スミドDNA約５μｇを開裂後、各プラスミドを同様にニ
トロセルロース濾紙へ固定した。その濾紙をIL−2mRNA
とハイブリダイズし、ハイブリダイジしたmRNAをアフリ
カツエガエル卵母細胞へ注入し、翻訳された蛋白のIL−
２活性を測定するため回収した。

表２に示す如く、p3−16と表示した単一コロニーから精
製されたプラスミドDNAのみが陽性のIL−２活性が示し
た。それ故、本クローンがIL−2cDNAを有するクローン
（Ｅ.coli χ 1776/p3−16AJ11995（FERM-BP-225））と
同定された。このようにプラスミドDNA、p3−16はIL−2
mRNAと特異的ハイブリッドを形成する能力のあるDNA
（IL−２遺伝子）を確かに有している事が確認された。

プラスミドp3−16のcDNAインサートは制限酵素Xba Iに
より１部位で、又Bst NIにより２部位（Xba I開裂部位
の上流及び下流）で切断されるという特徴を示した。し
かしながら、プラスミドp3−16は約650塩基対より構成
されるcDNAインサートを含んでおり、これは明らかに11
〜12Sの大きさのIL−2 mRNAの一部分に相当するもので
ある。それ故、他のcDNAライブラリーを、鋳型としてIL
−2 mRNAを用い、Land等の方法（Land等の方法（Land e
t al.Nucleic Acids Res.,vol9,p2551,（1981））に従
って作製した。一本鎖cDNA（1.6μｇ）を、dCMP残基を
付加したIL−2 mRNA 4μｇを用いて合成し、そしてds−
cDNAを、DNAポリメラーゼＩ（klenow断片）によりピラ
イマーとしてオリゴ（dG）12＝18を用いる事により合成
した。680塩基対DNAサイズマーカー（size marker）よ
り長いcDNA（0.6μｇ）は蔗糖密度遠心法によって得ら
れ、標準的なＧ−Ｃティリング法によりpBR322のPst I
部位へ挿入出来た。

組換えDNA体によるエシェリヒア・コリ χ 1776の形質
転換後、その場所でプローブとしてニック翻訳された
（nick-translated）p3-16 cDNAインサートを用いたGru
nstein-Hognessのハイブリダイゼーション法により約20
00コロニーを選別し、およそ850塩基対を含むプラスミ
ドpIL 2-50Aを含有するコロニー及び形質転換されたク
ローン（エシェリヒア・コリ χ 1776/pIL2-50A、AJ11
996（FERM-BP-226））を同定した。pIL2-50AのcDNAイン
サートの制限酵素切断図を第１図に示した。

形質転換されたエシェリヒア・コリ χ 1776/pIL2-50A
からのIL−２ペプタイドをコードしている遺伝子を単離
するため、プラスミドDNAを通常法に従い、菌体からDNA
を単離後制限酵素Pst Iにより切断した。この処理によ
り生成する２つのDNA断片のうちより小さな断片はIL−
２ペプタイドをコードしているDNA遺伝子であった。pIL
2-50AからのPst Iインサートの完全なヌクレオチド配列
はMaxam and Gilbertの方法（Maxam,A,W,etal.,Enzym,6
5,,499-560,1980）により決定した。全構造を第２図
（ａ）に示す。

実施例２ 実施例１に記載された方法に従ってジュルカット細胞か
らクローン化された構成的IL−２産生細胞株J-A 1886
（ATCC CRL 8130）は同様にローラー培養ボトルで生育
した。生育した細胞は初期細胞密度１×10⁶個/mlで新鮮
な合成培地RITC-55-9に再懸濁し、培養開始８時間後
に、実施例１で詳細に示したステップに従って３×10⁹
個の細胞から11〜12S分画としてのIL−2mRNA抽出のため
に使用された。

ds−cDNAは実施例１と同様に合成され、600塩基対より
長いcDNA（2.4μｇ）が蔗糖密度勾配遠心法による分画
により得られた。次にこのcDNAをターミナルデオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼを用い、dCMP残基で伸
長し、その50ngがdGMPで伸長したPst I切断pBR 322 250
ngとアニールされた。

生成したハイブリッドプラスアミドはエシェリヒア・コ
リ χ 1776に形質転換され、約4,000クローンのトラン
スホーマントが得られた。

Grunstein-Hognessの方法に従い、プローブとして用い
たプラスミド3-16 cDNAと相補的な３個のクローンが選
択された。すなわち、このようにして選択された形質転
換されたクローンはヒトIL−２遺伝子を有するクローン
である。

実施例３ エシェリヒア・コリ細胞でヒトIL−２の合成を指令する
プラスアミドを以下の如きき方法で構築した。

プラスミドpt IL−2-22は第４（ａ）図で図解されてい
る如く、一連の改変の方法によりpTrS-3（Nishi T.,Tan
iguchi T.et al.,SEIKAGAKU 53,967,（1981），同54,67
6（1982））及びIL−2 cDNAを含むpIL2-50Aから構築し
た。プラスミドpTrS-3はTrpプロモーターとpBR 322のEc
oRI部位とCla I部位の間にShine Dalgarno（以後SDと略
号する）の領域の挿入を含む。

本プラスミドはまた第３図で示した如く、単一のSph I
部位と同様にSD配列の下流13bpにATGイニシエーション
コードンを含んでいる。

言及している蛋白に対応するDNA配列がATGコードンの丁
度下流の部位に挿入されるとそのベクターは蛋白を生産
するのには非常に効果的である。このATGコードンはpTr
S-3のSph I消化に引続きT4 DNAポリメラーゼによる処理
によって生成される。それ故プラスミドpTrS-3（30μ
ｇ）は制限酵素Sph Iで、常法により切断され、引続き
フェノール，クロロホルム処理，エタノール沈澱法によ
り回収され両末端がT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラ
ッシュにされた。

次に、同様の方法によるフェノール，クロロホルム処理
及びエタノール沈澱法によりDNA（21.4μｇ）を回収し
た。他方IL−2 cDANを含むpIL2-50A 380μｇはPst Iに
より切断され、IL−2 cDNAインサートはアガロースゲル
電気泳動により単離された。cDNAインサート（11μｇ）
はHgiA Iにより切断され、T4 DNAポリメラーゼによって
処理され、大きい方の部分のDNA 10μｇがアガローゲル
電気泳動により単離された。本法に従って132個のアミ
ノ酸をコードするcDNA（7.2μｇ）が得られ、このDNA断
片はブランドエンドで有していた（第７（ａ）図）。

次に、このようにして得られたCDNA断片をATG配列の丁
度下流で、前もってSpH Iにより消化されたT4 DNAポリ
メラーゼにより処理されたpTrS-3ベクターへ連結した。
このように連結したプラスミドはそれから、常法に従い
エシェリヒア・コリHB 101へ形質転換された。その連結
は次のようにして行った。IL−2 cDNA（0.4μｇ）の前
述の大きい方の断片およびpTrS-3ベクターDNA0.2μｇを
6.6mM MgCl₂,1mM ATPおよび10mM DTTを含むpH7.5の66mM
トリス−塩酸中でT4 DNAリガーゼ0.8単位と共に混合
し、混合物を４℃，一晩反応させた。アンピシリンを含
むＬ培地寒天プレート上に出現するトランスホーマント
の中で、132個のアミノ酸をコードしているIL−2 cDAN
部分の含むプラスミドを持つコロニーをその場でコロニ
ーハイブリダイゼーションアッセイ法により選択した。
こうして選択したコロニーを再び培養（10ml）し、リゾ
チーム処理および凍結，融解による処理によりプラスミ
ドDNAを調整した。このプラスミドDNAをPst IとXba Iで
切断し、その結果の生成物をアガロースゲル電気泳動に
より分析し、cDNAがpTrS-3のATG配列の後に正しい方向
で凍結しているpTIL-2-22を同定した。

pTIL-2-22を含むエシェリヒア・ソリHB 101を微生物の
増殖のために知られている通常法の下に培養した。細胞
は25μg/mlストレプトマイシンおよび25μg/mlのアンピ
シリンを含むχ培地（2.5％バクトトリプトン,1％酵母
エキス,0.1％グルコース,20mM MgSO₄,50mMトリス−塩
酸,pH7.5）10ml中で37℃で一晩生育させた。ついで培養
懸濁液1mlを同じχ培地（100ml）へ接種し、37℃で培養
した。650mμのO.D.がおよそ1.5−2.0に達した時点で３
−インドールアクリルイ酸（IAA）を加えた。インデュ
ーサーの添加３時間後に、細胞を集め、20mMトリス−塩
酸（pH7.5,30mM NaClを含む）で洗浄し、同じ緩衝液8ml
中に再び懸濁した。

Trpプロモーターの効果的な機能発現のために、IAAの如
きインデューサーを最終濃度60μg/mlになるように添加
した。かくして細菌細胞中に産生される蛋白をソニック
処理（０℃,2分間）またはリゾチーム（８μｇ）消化
（０℃,20分）に引き続き凍結融解を３回行う事により
抽出した。この方法により、一般的にIL−２は細胞から
抽出された。抽出されたIL−２活性は10,000から120,00
0単位/mlの範囲であった。

pTIL2-22を含むエシェリヒア・コリ HB 101（AJ 1200
9）はFERM-BP245として寄託されている。

実施例４ IL−2 cDNAを有するプラスミドpTuIL2-22はpTuBIP-5（T
aniguchi,T.et al.,Seikagaku,53,966,1981）および実
施例３に示したpTIL2-22から第６図に図解した方法によ
り構築された。プラスミドpTuB1P-5はpBR322中にtufBの
プロモーター配列が挿入されている。このプラスミドは
また単一のCla I部位を含んであり、これは第６図に示
した如くSD配列の2bp下流に位置している。pTrS-3もま
たSD配列とATGイニシェーションコードンの間にCla I部
位を含んでおり、このCla I部位は実施例３に記載した
如くpTrS-3およびIL−2 cDNAを用いる事による発現プラ
スミド構築中に破壊されないことから、Trpプロモータ
ーをtufBプロモーターに置き換える事はきわめて簡単で
あり、その結果IL−2 cDNAはtufBプロモーターの制御下
で発現される。

それ故、プラスミドpTuIL2-22（30μｇ）は制限酵素Cla
IとPvu IIにより通常の方法で切断された。IL−2 cDNA
を含む断片（約2.2kb）はアガロースゲル電気泳動によ
り単離精製され、３μｇのDAAが回収れた。他方,pTuBlP
−５ベクター20μｇが同様にCla IとPvu IIにより切断
され、アンピシリン耐性遺伝子を含む大きい方の断片
（約3.4kb）がアガロースゲル電気泳動により単離精製
され、DNA3.5μｇが回収された。次にこのようにして得
られた２個の断片は１つはtufBプロモーターを含み（約
3.4kB）、他方はIL−2 cDNAを含んでおり（約2.2kb）以
下に示す如く連結した。

IL−2 cDNA（1.2μｇ）を含む断片およびtufBプロモー
ターを含む断片0.3μg6.6mM MgCl₂,1mM ATPおよび10mM
DTTを含むpH7.5の6.6mMトリス−塩酸中で、T4 DNAリガ
ーゼ0.8単位と混合し、４℃で一晩反応した。次にこの
ようにして連結したプラスミドは常法に従いエシェリヒ
ア・コリHB 101へ形質転換された。

アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に出現するト
ランスホーマントの中で第６図のpTuIL2−22の如くIL−
2 cDNA部分を含む組み換え体DNAを持つ８個のコロニー
が選択され、プラスミDNAは実施例３に記載された如く
調整された。

pTuIL2−22を含むエシェリヒア・コリ HB 101を37℃で
Ｌ培地（100ml）中で培養した。650mμのO.D.がおよそ
0.5−1.0に達した時、歯体を集め、30mM NaClを含む20m
Mトリス−塩酸（pH7.5）で洗浄し、同じ緩衝液2ml中に
再び懸濁した。このようにして産生した蛋白は実施例３
と同様に抽出された。抽出液中のIL−２活性は6,000か
ら56,000単位/mlの範囲であった。

pTuIL2−22を含むエシェリヒア・コリ HB 101（AJ1201
0）はFERM-BP 246として寄託されている。

実施例５ IL−2 cDNAを有するプラスミドpGIL2-22はpGL 101（Rob
erts,T.M.and Laucer G.D.,Meth Enzym.,68,473-483,
（1979）,Gail Lauer,et al,J.Mol.Appl.Genet.,１,No.
2,139〜147（1981）,T.Taniguchi,et al,Proc.Natl,Aca
d.Sci.USA,77,No.9,5230〜5233（1980）,Egon Amann,et
al,Gene,25,167〜178（1983））と実施例３に示された
pTIL2-22とから構築された。

すなわち、lacプロモーターを含むプラスミドpGL 101
（20μｇ）が制限酵素Pvu IIで常法により切断され、引
続きフェノール，クロロホルム処理およびエタノール沈
澱法により17μｇのDNAが回収された。他方、pTIL2-22
（75μｇ）の方はCla IおよびSal Iで切断し、アガロー
スゲル電気泳動によりIL−2 cDNAが含むDNA片2.2μｇを
回収した。この断片はDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断
片）で処理する事によりフラッシュにされた。次にこの
ようにして得られた２個の断片（0.25μｇおよび0.66μ
ｇ）を実施例４と同じ方法でT4 DNAリガーゼ1.0単位で
もって連結した。かくしてこの連結したプラスミドは常
法に従いエシェリヒア・コリ HB 101に形質転換され
た。トランスホーマントの中で、IL−2 cDNAを含むCla
I−Sal I断片の挿入を有するトランスホーマント³²Pラ
ベルしたIL−2 cDNAをプローブとして選択した。次にこ
れ等のトランスホーマントを、アンピシリン25μg/mlを
含む10mlのχ培地中で培養し、実施例３で記載した方法
によりプラスミドDNAを調製した。かくしてIacプロモー
ターの丁度下流にIL−2 cDNAの開始配列ATGを有するプ
ラスミドDNAはPst IおよびXba Iでの切断部位を検定す
る事により得られた。このようにして得られるたpGIL2-
22を含むエシェリヒア・コリHB 101は25μg/mlアンピシ
リンおよび25μg/mlアストレプトマイシンを含有するＬ
培地100mlに接種し培養した。650mμのO.D.が約0.5に達
した時イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクタピラノサイ
ド（IPTG）を1mMの濃度で加え、１時間後に菌体を集
め、実施例４に記載した方法に従って菌体抽出液を調製
した。抽出液のIL−２活性は6,000から80,000単位/mlの
範囲であった。

pGIL2-22を含むエシェリヒア・コリ HB 101（AJ12011）
はFERM−BP 247として寄託されている。

実施例６ プラスミドptrS-3（10μｇ）を先ず制限酵素Sal Iで切
断しSal I部位をDNAポリメラーゼ（クレノウ断片）ある
いはT4 DNAポリメラーゼ処理によりフラッシュ（flus
h）にした。

Cla Iで切断後、Trpプロモーター領域を有する大きい方
の断片を常法に従ってアガロースゲル電気泳動により単
離精製し、DNA 3μｇを回収した。

他方、pIL2-50AのPst I切断により得られるcDNAインサ
ート11μｇがHgiAIで切断され、T4 DNAポリメラーゼ処
理され、大きい方の断片がアガロースゲル電気泳動によ
り単離，精製された。このようにしてIL−２の132個の
アミノ酸をコードするcDNA断片が7.2μｇ得られた。次
に、trpプロモーター（上記）を含む断片0.45μg,IL−2
cDNAを含むHgiAI-Pst I断片0.5μｇおよび合成オリゴ
ヌクレオチド（５′）CGATAAGCTATGGCA（３′）と
（３′）TATTCGATACCGAT（５′）（各々20pmole）は両
方とも５′未満でリン酸化されているが、これ等を実施
例３に記載されている方法と同じ方法でT4 DNA リガー
ゼ１単位に連結した（第４図（ｂ））。このように連結
されたプラスミドはエシェリヒア・コリ HB 101に形質
転換された。出現したトランスホーマントの中で、目標
とするトランスホーマントは次のようにして選択した。
まず最初に、IL−2 cDNAおよび合成オリグヌクレオチド
の両方とハイブリダイズ可能なトランスホーマントがコ
ロニーハイブリダイゼーション法により選択された。
次、ATGGCA配列の丁度下流に第２図（ａ）の111から113
の位置のCTT配列から始まるDNA断片（CCTACT………）が
挿入されているプラスミドDAAを持ったトランスホーマ
ントをPst I,Xba I切断個所を検定することににより選
択した。

pTIL2-21aまｔはpTIL2-21bを含む上記のトランスホーマ
ントを実施例３に示す方法によりＬ培地中で培養し、そ
して実施例３に示す方法により分析した時トランスホー
マントの菌体抽出物には高いIL−２活性が認められた。
pTIL2-21aを有するエシェリヒア・コリ HB 101（AJ 120
13）およびpTIL2-21bを有するエシェリヒア・コリ（AJ
12014）を有するエシェリヒア・コリ HB 101はそれぞれ
FERM-BP 248,FERM-BP 249として寄託されている。

上記の実施例で用いられた宿主，エシェリヒア・コリ x
1776およびHB 101（Boyer H.W.et al.,J.Mol,Biol,41,
459,（1969）は公知であり、容易に入手可能である。更
につけ加えれば、トランスホーマント中の組換えDNAを
遊離させるためにＬ培地で37℃でトランスホーマントを
培養し、テトラサイクリングおよびアンピシリンに感受
性となった菌体を分離すれば寄託したトランスホーマン
トから宿主は容易に得られる。

プラスミドベクターpBR 322（例えばベセスダリサーチ
ラボラトリーから購入可能）,pCE-1,pTrS-3およびpGL 1
01は公知であり容易に入手可能である。更に、常法によ
りトランスホーマント中の組換え体プラスミドを分離す
ることによってさらにそれぞれの実施例での説明から当
然に明らかな如くプラスミドベクターを分離することに
よって寄託されたトランスホーマントからプラスミドベ
クターを得る事が出来る。pTrS-3およびpTuBlP-5はそれ
ぞエシシェリヒア・コリ FERM-P6735（BP 328）および
エシシェリヒア・コリ ATCC 31878として寄託されて
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図はIL−２活性を有するポリペプチドをコードした
クローン化遺伝子の制限酵素エンドヌクレアーゼによる
切断マップを示し、第２図（ａ）はクローン化遺伝子の
塩基配列を示し、第２図（ｂ）はIL−２活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列I,IIおよびIIIを示す。 第３図はプラスミドベクターpTrS-3を示す。第４図
（ａ），第４図（ｂ）および第４図（ｃ）はベクターと
してpTrS-3を使用している組換えDNAs（pTIL2-22,pTIL2
-21,pTIL2-14およびpTIL2-15）の構成を示すフローチャ
ートである。第５図はベクターとしてpkT 218を使用し
ている組換えDNA（pkIL2-21）の構成を示すフローチャ
ートである。第６図はベクターとしてpTUB1P-5を使用し
ている組換えDNA（pTulL2-22）の構成を示すフローチャ
ートである。 図中、“A",“G",“C"および“T"はデオキシアデニル
酸，デオキシグアニル酸，デオキシシチジル酸およびチ
ミジル酸をそれぞれ表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 9050−4Ｂ (72)発明者 松井 裕 神奈川県横浜市金沢区並木１丁目19―16― 101 (72)発明者 鹿島 信一 神奈川県横浜市旭区若葉台２―21―603 (72)発明者 羽室 淳爾 神奈川県横浜市戸塚区深谷町241―32

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトインターロイキン２活性をもつ、次の
   アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝
   子。
2. 【請求項２】次の塩基配列からなる特許請求の範囲第１
   項記載の遺伝子。