DK173788B1 - DNA-fragment, som koder for et polypeptid med interleukin-2-aktivitet, rekombinant DNA omfattende dette DNA-fragment, cellelinie transformeret med det rekombinante DNA og fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af denne cellelinie - Google Patents

Description

i DK 173788 B1

Den foreliggende opfindelse angår et DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, som har human interleukin-2-aktivitet, et rekombinant fremstillet DNA, som omfatter et sådant DNA-fragment, en eukaryotisk 5 eller prokaryotisk celle transformeret med et sådant rekombinant DNA, samt en fremgangsmåde til fremstilling af humant interleukin-2 ved anvendelse af en sådan transformeret celle.

Interleukin-2 (i det følgende betegnet IL-2), der tidligere er blevet betegnet T-celle-vækstfaktor, er et op-10 løseligt protein (almindeligt kendt som lymfokin) og fremstilles ud fra T-celler aktiveret med lectin eller et antigen (D.A. Morgan et al., Science 193, 1007-1008 (1976), S.

Gillis et al., J. Immunol. 120, 2027-2033 (1978)). Interleu-kin-2 (IL-2) er i stand til at modulere lymfocyt-reaktivitet 15 og fremme langtidsdyrkning in vitro af antigen-specifikke effektor-T-lymfocyter (S. Gillis et al., Nature 268, 154--156 (1977)). IL-2 er også kendt for at udvise andre relevante biologiske aktiviteter, såsom at fremme thymocyt-mito-genese (B.M. Chen et al., Cell. Immunol. 22^, 211-224 (1977), 20 j. Shaw et al., J. Immunol. 120, 1967-1973 (1978)), inducere cytotoksisk T-celle-reaktivitet (H. Wagner et al., Nature 284, 278-280 (1980)) og anti-SRBC-plaquedannelses-cellereak-tioner (S. Gillis et al., J. Exp. Med.149, 1960-1968 (1979)) i kulturer af miltceller fra nøgne mus. Følgelig er dette 25 lymfocyt-regulatoriske stof anvendeligt til at forstærke legemsvæske- og celle-immunreaktioner og til at føre en immun-defekt-tilstand tilbage til en normal legemsvæske- og celle--immuntilstand. Disse identificerede immunologiske aktiviteter af IL-2 tyder stærkt på, at IL-2 er anvendeligt til medi-30 cinsk immunoterapi mod immunologiske forstyrrelser omfattende neoplastiske sygdomme, bakterie- eller virusinfektioner, immun-defekt-sygdomme, autoimmun-sygdomme etc. (B. Papermaster et al., Adv. Immunopharm, 507 (1980)). Ligesom interferoner har IL-2 vist sig at forøge naturlig dræbercelle-aktivitet, hvilket an-35 tyder en mulig anvendelse ved behandling af neoplastiske sygdomme. Endvidere muliggør IL-2 vedligeholdelse af kulturer af

O

2 DK 173788 B1 funktionelle monoklone T-celler og synes således at spille en afgørende rolle ved undersøgelse af den molekylære natur af T-celle-differentiering og af mekanismen af differentierede T-cellefunktioner samt af mekanismen af T-celle-anti-5 genreceptorer. Det er også anvendeligt til fremstilling - ved langtidsdyrkning af monoklone T-celler - af mange andre T-celle-afledte lymfokiner, som er anvendelige inden for et stort antal områder. Desuden kan IL-2-produktion og reaktion på IL-2 af lymfocyter være vigtige parametre af immunologi-10 ske funktioner, der er anvendelige ved klinisk diagnose af immunitetsforstyrrelser.

TL-2 er ifølge kendt teknik blevet produceret ved at stimulere muse-, rotte- eller human-lymfocyter med et mitogen (S. Gillis et al., Nature 268, 154-156 (1977), J. Farrar 15 et al., J. Immunol. 121, 1353-1360 (1978), S. Gillis et al., J. Immunol·., 120, 2027-2033 (1978)) . Ved stimulation af mono-nukleære lymfocyter fra humant perifert blod med et mitogen (S, Gillis et al., J. Immunol. 124, 1954-1962 (1980)) har Gillis et al. rapporteret fremstilling af muse-IL-2 ud fra 20 muse-T-celle-lymfocellelinier (S. Gillis et al., J. Immunol.

125, 2570-2578 (1980)) og fremstilling af humant IL-2 fra en human leukæmicellelinie (S. Gillis et al., J. Exp. Med. 152, 1709-1719 (1980)).

I de ovenfor anførte artikler af Gillis et al. disku-25 teres metoden til fremstilling af humant IL-2 fra en mitogen-stimuleret human T-celle-leukæmicellelinie ved ce1lekulturme-toder. Imidlertid giver en sådan teknik uønsket lave koncentrationer af humant IL-2 og nødvendiggør komplekse rensningsprocedurer til opnåelse af blot små mængder IL-2 fra meget 30 store volumener kulturmedium. Da humane T-celle-leukæmicelle-linier producerer spormængder af mange andre biologiske aktive stoffer, der er analoge med humant IL-2, støder man på betydelige vanskeligheder ved isolering af IL-2 fra disse andre, immunologisk aktive molekyler eller ved isolering af IL-2 fra 35 de lejlighedsvis tilstedeværende, toksiske lectiner.

DK 173788 B1 3 o

Som alternativ kunne det forekomme at være ønskeligt at anvende rekombinant DNA-metoder (DNA er en forkortelse for deoxyribonukleinsyre), som anvendes til fremstilling af andre biologisk aktive humane proteiner, såsom interferoner 5 (P.W. Gray ét al., Nature 295, 503-508 (1981), S. Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980), T. Taniguchi et al., Gene 10, 11-15 "(T^SCT) , tiT~"fremstilling af IL-2. Imidlertid har forsøg på at fremstille IL-2 ved rekombinant DNA-metoder hidtil været uden held. Det er f.eks. rapporteret i "Nikkei Bio-10 technology (Japan), nr. 19, 5. juli 1982, at forsøg på at konstruere IL-2-producerende organismer ved hjælp af rekombinant DNA var uden held, sandsynligvis på grund af, at genet kodet for IL-2-polypeptid endnu ikke var blevet klonet.

Ved stimulering af en variantlinie af murint T-lympho-15 ma-IL-4 og ekstraktion af de stimulerede celler er der opnået RNA, som kunne translateres i Xenopus laevis-oocyter. De injicerede oocyter syntetiserede et materiale, som havde biologiske og biokemiske egenskaber af murint IL-2. (The Journal of Immunology, Vol. 127, No. 6 (1981), side 2432- 20 2435).

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 73, No. 9 (1976), side 3146-3150, beskriver en generel metode til kloning af eukaryotiske strukturgensekvenser ved poly(dT)/poly(dA)-haledannelses- og annealing-teknik.

IL-2 blev induceret i kulturer af humane perifere 2w blod-leukocyter ved kombineret behandling med 12-0-tetrade-canoylphorbol-13-acetat og Concanavalin A. Poly(A)-indeholdende mRNA blev isoleret fra kulturerne og fraktioneret ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering. Ved injektion i

Xenopus laevis-oocyter gav mRNA-præparatet anledning til 30 IL-2-aktivitet i den ovenstående kulturvaeske fra oocyterne (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.

109, No. 2 (1982), side 363-369).

Imidlertid har alle forsøg på at producere IL-2 ved rekombinant DNA-metoder været mislykkede. Problemerne, som 35 skal løses ifølge den foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe et DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, DK 173788 B1 4 som koder for IL-2, et rekombinant fremstillet DNA, sottT indeholder DNA-fragmentet, en cellelinie, som indeholder det ifékofflbinante DNA, og øn fremgangsmåde til fremstilling af IL-2 ved anvendelse af cellelinien.

5 Disse problemer løses ifølge opfindelsen med:

Et DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, som har human interleukin-2-aktivitet, hvor polypeptidet er valgt blandt følgende: a) et polypeptid, som har følgende aminosyresekvens: 10 rt«t-Tyr-Arg-M«t-6ln-Leu-teu-Ser*Cyi-IL«-Ali-teu-Ser-Leu- 20

Al»-(.eu-V«l-Thr-Asn-S*r-Ali-Pro-Thr-Ser-S«r-$er-Thr-Lys-

Ly*-Thr-6ln-l.evj-Gln-Leu-Glii-mj-L*u-C«u-l.«u*Asp-Leu-Gln- M«t-Ite'Leu-A*n-Gly-It«-Asn-Ain-Typ-Lyi-Asn-Pro-Lys-Leu-.jg Thr-Ar}-Het-Leu-Thr-Pne-Ly*~Phe-Tyr-Het-Pro-Cy*-Ly*-AU'

Thr-Glvi-Leu-Cys-Hi»-Leu-Gln-Cys-l.eu-Glu-Glu-Gl.u-t.eiJ_l.yi” Pro-Leu*Glu*5lu-V»V-t«u-Asn-l»#u-Al.i-Glft-S*f*,»y*'*sf'-Phe* Kii-Ltu*AP)-Pro-Af j-Ajj-liu*Ue*S»p*Aifi-Ile'*sn*Vil*n«* VAl-Leu-SLu-t«u-Ly*-5l.y*Sep-Glu*Thr-Thr'Phe-Met*Cyi*<5lu·’

Tyr-Al* -Asp-Glu-Thr-Al«-Thr-Ile-V»l - G l u- Phe - te u-A j n - A r g - 1 S3 20 T r p - I l e - T h r - P he - C y s - G l n - S e r - I l e - 11 e - S « r - Thr - Le u-Th r b) et polypeptid, som i forhold til a) mangler en eller flere aminosyrer, c) et polypeptid, hvori, i forhold til a), en eller flere 25 aminosyrer er erstattet, d) et fusionspolypeptid omfattende et polypeptid ifølge a), b) eller c) , hvori de additivt forbundne aminosyrer ikke interfererer med den biologiske interleukin-2-aktivitet eller let kan elimineres, 2q e) et polypeptid, som er et allelisk derivat af et polypeptid ifølge a).

Et DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, som har human interleukin-2-aktivitet, hvor polypeptidet, som der kodes for, er valgt blandt a) et polypeptid, som har følgende aminosyresekvens: 35 DK 173788 B1 5 X-7hr-S«r-Ser-Ser-Thr-(.ys-Lys*Thr-ei.rt-l.*u-5ln-l.eu*5l.u-

Ki**Leu-l.eu-l.*U“A*P"l-*u-ein-Het»Il*-i>eu-Asn-6ty-ll«-A*n-

Am-Tyr-l.ys-Asn-?ro-Lys-L«u-ThP'Arj-Ket-Leu-Thr-?he-I.y5* P he-Tyr-He r-Pro-lys-l.ys-Al*-rhr-Glu*L«u-l.ys-Hii-ievJ-Gln- 5 Cy*-Leu»eLu“eiu*eiu“l.eU“t.y*'Ppe“Ueu”Glu-eiu-V«l*l.*u-A*n- teu-Ati-Gln-Ser-lys-Ain-Phe-Hij-Leu-Arg-Pro-Arg-Ajp-teu-

Il«-Ser-Asn-He-Asn-V»l-Ile-V*l-l.eu-Gl.u-Leu-lyi-Gly-$er-

Slu-Thr-Thp-Pht-H*t-Cy#-5lu-Tyr-AU-Asp-etu-ThP-Ali-ThP-

Ile-V*I.*ei,u*Phe-Leu-Ajn-Af9-Trp-Ile-Thir-Phe-Cy*-ein-Ser-

Ile-Ile-S«r-Thr-Leu-Thr, 10 hvori X betyder Ala-Pro, Pro, Met-Ala-Pro eller Met-Pro, b) et polypeptid, som er et allelisk derivat af polypeptidet a) , c) et fusionspolypeptid omfattende et polypeptid ifølge a), 15 hvori de additivt forbundne aminosyrer ikke interfererer med den biologiske aktivitet eller let kan elimineres.

Et rekombinant fremstillet DNA, som omfatter et DNA- fragment ifølge opfindelsen i et vektor-DNA, der er i stand til at replikere i en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, 20 hvorved den kodende DNA-sekvens er placeret i en position nedenfor en promotor-sekvens.

En eukaryotisk eller prokaryotisk celle transformeret med et rekombinant DNA ifølge opfindelsen, samt en fremgangsmåde til fremstilling af humant inter- 25 leukin-2, som omfatter dyrkning i et kulturmedium af en eukaryotisk eller prokaryotisk celle transformeret med et rekombinant DNA til produktion af interleukin-2 og udvinding

af det producerede interleukin-2, hvor det rekombinante DNA

omfatter et DNA-fragment ifølge opfindelsen i et vektor-DNA

som er i stand til at replikere i cellen, og hvorved den 30 kodende sekvens af DNA-fragmentet er placeret i en position neden for en promotorsekvens.

35 DK 173788 B1 6

Opfindelsen og mange af de fordele, der ledsager den, forklares nærmere i den følgende detaljerede beskrivelse i sammenhæng med den vedføjede tegning, på hvilken fiq. 1 viser et restriktions-endonuclease-spaltnings-5 -billede af en klonet DNA-sekvens (også kort betegnet "gen") kodet til at producere et polypeptid, der har aktiviteten af IL-2 (i det følgende betegnet IL-2-polypeptid), fig. 2(a) viser basesekvensen af det klonede gen, fig. 2(b) viser aminosyresekvens I og aminosyrese-10 kvens II og III af polypeptiderne, der har IL-2-aktivitet, fig. 3 er et diagram, der viser konstruktionen af et rekombinant DNA (pCEIL-2), hvori det kodede gen er indføjet, fig. 4 viser plasmidvektoren pTrS-3, fig. 5(a), 5(b) og 5(c) er diagrammer, der viser konstruktionen af rekombinante DNA'er (pTIL2-22, pTIL2-21, 15 pTIL2-14 og pTIL2-15) ved anvendelse af pTrS-3 som en vektor, fig. 6 er et diagram, der viser konstruktionen af et rekombinant DNA (pKIL2-21) ved anvendelse af pKT218 som en vektor, fig. 7 er et diagram, der viser konstruktionen af et 20 rekombinant DNA pTUIL2-22) ved anvendelse af pTUBlP-5 som en vektor, og fig, 8 viser vektor-DNA'er, der er i stand til repli-kation i en Saccharomyces cerivisiae-celle.

25 30 35

O

7 DK 173788 B1 I figurerne betyder "A", "G”, "C" og "T" henholdsvis deoxyadenylsyre, deoxyguanylsyre, deoxycytidylsyre og thy-midylsyre.

Det klonede gen, der er kodet for et IL-2-polypeptid, 5 kan opnås ved transskription af messenger-RNA (inRNA, RNA er en forkortelse for ribonucleinsyre) svarende til IL-2 (i det følgende betegnet IL-2-mRNA) og hidrørende fra en pattedyrcelle, der er karakteriseret ved evnen til at producere et polypeptid, der har IL-2-aktivitet, til et komplementært DNA 10 (cDNA). Det fremkomne enkeltstrengede cDNA (ss-cDNA) kan omdannes til et dobbeltstrenget cDNA (ds-cDNA).

Det mRNA, der anvendes som "template" til fremstilling af cDNA, kan på konventionel måde isoleres fra en pattedyrcelle, der er i stand til at producere IL-2-polypeptid. Det 15 fraskilte RNA polyadenyleres (Gillis et al., Immunological Rew. 53^ 167-209 (1982)), og det polyadenylerede RNA kan fraktioneres ved f.eks. centrifugering i en saccharosegra-dient som et sediment på 11-12S. Lejlighedsvis vil mRNA på 13S udvise IL-2-mRNA-aktivitet, og i sådanne tilfælde formo-20 des det, at mRNA’et er en aggregeret form af 11-12S-mRNA.

Pattedyrcellerne, der er i stand til at producere IL-2, og som er kilden til mRNA ifølge opfindelsen, kan være T-lymfocyter, såsom mononukleaere celler fra perifert blod, tonsil-celler, miltceller eller lignende, der kan fås fra dyr 25 ved operation. Cellerne kan forbehandles på konventionel måde, f.eks. med en nylon-søjle, antiserum-komplement, densitetsgradientfraktionering, multipel enzymbehandling, såsom en kombination af neuraminidase og galactoseoxidase, ved røntgenstrålebestråling eller med trypsin, for at gøre cel-30 lerne IL-2-producerende eller forøge IL-2-aktiviteten. Klonede T-lymfocyter, der fås ud fra de nævnte pattedyrceller efter dyrkning i nærværelse af T-celle-vækstfaktor, kan også anvendes som kilde til mRNA og er de foretrukne lymfocyter. Omdannede lymfocytcellelinier, såsom T-lymfocyter, der fås 35 ud fra leukæmi- eller lymphomcellelinier selv eller fra der-

O

8 DK 173788 B1 af afledte celler, der er fremkommet ved forbehandling eller mutation ved de ovennævnte metoder, eller de klonede omdannede cellelinier foretrækkes som kilder til mRNA. Tydeligvis indeholder klonede cellelinier sædvanligvis stør-5 re mængder IL-2-mRNA i sammenligning med massen af "foræl-dre"-cellelinierne. T-celle-hybridomer, der er fremstillet ved fusion af de ovennævnte lymfocytafledte celler og tu-morcellelinier, såsom CEM, Molt 4F og BW-5147, er også foretrukne pattedyrcellelinier til anvendelse ved opfindel-10 sen. I sådanne tilfælde omfatter de lymfocytafledte cellelinier (1) konstitutionelle producenter af IL-2 og (2) sådanne, der kun er producenter af IL-2 i nærværelse af et mitogen indført i kulturen, enten i fraværelse eller nærværelse af andre co-IL-2-produktionsstimulerende celler.

15 For at danne IL-2-mRNA i konstitutivt IL-2-produce- rende celler, dyrkes de konstitutivt IL-2-producerende celler under betingelser, der er almindeligt kendte inden for området celledyrkning. Til dannelse af mRNA i celler, der kun producerer IL-2 i nærværelse af et mitogen, vaskes dyr-20 kede celler grundigt med kulturmedium og resuspenderes i et kulturmedium, såsom Rosewell Park Memorial Institute 1640 (i det følgende betegnet "RPMI 1640'*) , Dulbecco Modified Eagle Medium (i det følgende betegnet "DMEM") eller i Click's medium med eller uden serum. Disse kulturmedier kan supple-25 res med forskellige tilsætninger, såsom penicillin, streptomycin eller andre antibiotika, eller med frisk L-glutamin, Hepes-puffer og natriumhydrogencarbonat i koncentrationer, der er almindeligt anvendte inden for området celledyrkning.

Den foretrukne celletæthed kan være fra 0,5 til 4 x 10^ cel-30 ler/ml. Til at fremkalde aktivering af mRNA og produktion af IL-2 tilsættes der passende stimulerende midler. Sådanne egnede stimulerende midler omfatter mitogener, neuraminidase, galactoseoxidase, zinkderivater som zinkchlorid eller lymfocytaktiverende stoffer hidrørende fra mikroorganismer, så-35 som protein A, streptolysin-0. De stimulerede celler fra-

O

9 DK 173788 B1 skilles og vaskes. Samtidig tilstedeværelse af makrofager eller dendritceller under mitogenstimuleringen kan også aktivere mRNA eller kan forøge mængden af aktiveret mRNA. Ligeledes kan tilstedeværelsen af cellelinier afledt af B-lym-5 focyter eller B-lymfocyt-linier, såsom Raji, Daudi, K562 og

Ball-1, aktivere mRNA eller forøge mængden af aktiveret mRNA.

Til formering af pattedyrcellerne holdes de i en in vitro-cellekultur eller i med hensyn til celleforenelighed passende dyr under normale betingelser. Når cellerne holdes 10 i in vitro-kultur til fremstilling af kilden til mRNA, kan de dyrkes i ethvert af de kulturmedier, der har vist sig at støtte væksten af T-celler. Disse kulturmedier kan suppleres med pattedyrserum, serumkomponenter eller serumalbumin. Dyrkningsperioden til aktivering af mRNA vil svare til det 15 tidsrum, der er nødvendigt til at aktivere cellerne til at danne mRNA. Dette tidsrum falder sædvanligvis sammen med det tidsrum, der er nødvendigt for at starte udskillelsen af IL-2 i kulturmediet. Det foretrukne tidsrum kan være fra 3 til 12 timer efter tilsætning af et stimulerende middel, så-20 som et mitogen. En for stor forlængelse af dyrkningsperioden kan lejlighedsvis medføre nedbrydning af det dannede IL-2-mRNA, Under forløbet af aktiveringen af IL-2-produce-rende celler kan phorbolestere, såsom PMA eller TPA, fortrinsvis anvendes i en koncentration fra 10 til 50 ng/ml til for-25 øgelse af aktiveringsniveauet.

Den ovenfor beskrevne proces til aktivering af IL-2--mRNA kan gennemføres ved temperaturer i området 32-38°C i en fugtig atmosfære og ved en pH-værdi på ca. 7,0-7,4.

Procedurerne til opnåelse og dyrkning af pattedyrcel-30 ler, der er i stand til at producere IL-2, forklares i det følgende.

(1) Tilvejebringelse af konstitutivt IL-2-producerende cellelinier.

En Jurkat-cellelinie af humane leukæmiske T-celler 35 (der kan fås frit fra Fred Hutchinson Cancer Institute, o DK 173788 B1 10

Seattle, USA, Salk Institute, San Diego, USA, German Cancer Center, Heidelberg, Vesttyskland) suspenderes i Click's me- g dium med en celletæthed på 1 x 10 celler/ml og bestråles med 3 røntgenstråler i en dosis på 8 x 10 R og med en intensitet 5 på 150 R/min. Derefter podes 0,1 celler af de således bestrålede celler pr. 200 pliter medium i Click's medium indeholdende 5% FCS i mikroplader med 96 fladbundede huller (Falcon 3072) og dyrkes i 3 uger ved 37°C i en 5% C02~inkubator (kloning ved grænsefortyndingsmetoden) . De dyrkede levedygtige 10 celler overføres til en kulturplade med 24 huller (Nunc) , før cellelaget bliver sammenflydende, og dyrkes videre i 5 dage.

De dyrkede celler dyrkes videre i serum- og serumalbuminfrit syntetisk kulturmedium i ca. 2 dage med en begyndelses-celle- g tæthed på mellem 1 og 2 x 10 celler/ml. Den ovenstående væ-15 ske fra kulturen fraskilles ved centrifugering og filtreres med et 0,22 pmillipore-filterpapir til fjernelse af nedbrudt materiale og sterilisation af den ovenstående væske, og derefter bliver røntgenstrålebehandlede mutanter, der er i stand til at producere IL-2 konstitutivt udvalgt og klonet ved må-20 ling af den IL-2-aktivitet, som foreligger i den ovenstående væske.

(2) Tilvejebringelse af IL-2-producerende celler fra humane mononukleære celler fra perifert blod.

Fra humant perifert blod isoleres perifere blod-lymfo-25 cyter (i det følgende betegnet "PBL") ved densitetsgradientcentrifugering på Ficoll-Hypaque. PBL-cellerne podes i 2 ml Click’s medium indeholdende 5% FCS ved en celledensitet på 1 x 10^ celler/ml i 24 hullers Nunckulturplader sammen med 100 pliter af 5 pg/ml phytohæmagglutinin-M (Gibco) (pHA) og 30 dyrkes i 48 timer under de ovenfor beskrevne betingelser.

Cellerne vaskes og podes igen i 1 ml Click’s medium ved en 5 celledensitet på 1 x 10 celler/ml sammen med 1 ml af et konditioneret medium fremstillet ud fra humane splenocyter stimuleret med 2,5 pg/ml af concanavalin A (i det følgende be-35 tegnet "Con A") i 48 timer, og kulturmediet indeholdende 50% o DK 173788 B1 11 konditioneret medium udskiftes hver tredie dag, således at der fås en langtidskultur af humane T-lymfocyter fra PBL.

De således fremstillede langtidsdyrkede humane T-lymfocyter klones ved den ovenfor beskrevne grænsefortyndingsme-s tode i nærværelse af konditioneret medium afledt af humane splenocyter og celleklonerne formeres på lignende måde. Derefter podes de klonede humane T-lymfocyter i 1 ml RPMI 1640 ved en celledensitet på 1 x 10^ celler/ml i en 24 hullers Nunc-kulturplade i nærværelse af 10 }ig/ml PHA og dyrkes i 24 10 timer ved 37°C i en 7,5% C02~inkubator. Den ovenstående væske fra kulturen opsamles, centrifugeres, filtreres gennem et 0,22 p's milliporefilter og undersøges for IL-2-aktivitet for at specificere de IL-2-producerende humane normale T-lymfocyt--kloner.

15 (3) Tilvejebringelse af en malign cellelinie afledt af huma- — ne lymfocyter, der er i stand til at producere IL-2 i nærværelse af mitogen.

Jurkat-cellelinien eller klonede cellelinier, såsom Jurkat 111, der er fremkommet ved den ovenfor beskrevne 20 grænsefortyndingsmetode, er i stand til at producere fra 10 til 4.000 enheder/ml af IL-2 ved dyrkning i 24 timer i et serumfrit syntetisk medium som ovenfor beskrevet eller i RPMI 1640 indeholdende 1-2% pattedyrserum i nærværelse af af mi togen, såsom 10 jig/ml Con A eller 2,5 jig/ml PHA. Disse 25 maligne humane cellelinier producerer også IL-2 ved dyrkning i nærværelse af zinkchlorid, protein A eller picibanil.

(4) Tilvejebringelse af celler, der er i stand til at producere IL-2 under samtidig tilstedeværelse af et mitogen og andre co-stimulerende celler eller co-stimulerende 30 opløselige faktorer.

Den humane maligne cellelinie Molt 4F og nogle klonede cellelinier, såsom Jurkat J99, der er opnået ved grænsefortyndingsmetoden, producerer ikke IL-2, selv ved dyrkning i 24-72 timer i nærværelse af lectiner eller mitogener i en 35 hvilken som helst koncentration. Imidlertid bliver disse celler i stand til at producere IL-2 i væsentlig mængde

O

12 DK 173788 B1 (10-100 pg/ml) i løbet af en dyrkningsperiode på 24 timer ved 3 7°C, når de dyrkes sammen med 5-10 pg/ml interleukin 1, et af monokinerne, eller med 50% (antal K562- eller Raji-cel-ler.

5 Ekstraktionen af IL-2-mRNA fra celler aktiveret på den ovennævnte måde gennemføres ifølge konventionelle velkendte procedurer uafhængigt af de forskellige cellekilder. For eksempel brydes cellerne delvis eller fuldstændigt ved tilsætning af et detergent, såsom NP-40, SDS, Triton-X og deoxy-10 cholsyre, eller ved mekanisk homogenisering eller frysning--optøning. For at forhindre nedbrydning af RNA med ribonu-clease under ekstraktionen af mRNA foretrækkes det at tilsætte RNase-inhibitorer, såsom heparin, polyvinylsulfat, bento-nit, macaroid, diethylpyrocarbonat eller vanadylkompleks. IL-15 -2-mRNA kan fås fra udfældede polysomer ved IL-2-biosyntesen, som udfældes med IL-2-antistof ved ekstraktion med et detergent .

Det poly A-holdige mRNA kan fraktioneres eller koncentreres på enhver konventionel måde, f.eks. ved affinitets-20 chromatografi eller portionsvis absorption på oligo-dT-cellu- lose, poly U-sepharose af sepharose 2B, saccharosegradient-centrifugering eller ved agarosegel-elektroforese.

mRNA-fraktionerne undersøges derpå for IL-2-mRNA-akti-vitet ved afprøvning af biologiske egenskaber af proteiner, 25 som er oversat ("translated") fra mRNA-fraktionerne, eller ved identifikation af det aflæste protein ved anvendelse af monoklonalt antistof mod IL-2-peptidet. For eksempel oversættes mRNA sædvanligvis til det tilsvarende protein ved mikroinjektion i frøæg (Xenopus laevis), jf. J.B. Gurdon et al., 30 Nature 233, 177-182 (1972), eller ved anvendelse af mRNA-af-hængigt reticulolysat eller hvedekim-oversættelses-cellefrie systemer.

Aktiviteten af IL-2 kan konstateres ved mikrobestem-melsesproceduren, der først og fremmest er diskuteret af 35 Gillis et al., J. Immunol. 120, 2027-2033 (1978). Ved bestem- o DK 173788 B1 13 melsen overvåges den IL-2-afhængige celleformering af en cytotoksisk T-lymfocyt-cellelinie (i det følgende betegnet "CTLL"), der er dannet ifølge metoderne beskrevet af Gillis et al., idet 4 x 103 CTLL-celler podes i 100 pliter 5 RPMI 1640-medium indeholdende 2% FCS i mikroplader med 96 fladbundede huller sammen med 100 pliter af de seriefortyn-dede oversættelsesprodukter. Efter 20 timers inkubering ved

37°C i en 5% C0~-inkubator udsættes cellerne i 4 timer for 3 Z

0,5 pCi af H-TdR, høstes på glasfiberstrimler ved hjælp af 10 en automatisk cellehøster, hvorefter den inkorporerede radioaktivitet måles ved væskescintillationstælling. Ved disse bestemmelsesprocedurer viser CTLL-celierne, der er dyr-ket i nærværelse af IL-2, sig at inkorporere H-TdR på en dosisafhængig måde, hvilket muliggør nøjagtig beregning af 15 mængden af IL-2, der er indeholdt i forsøgsprøverne.

IL-2 er virksomt til at fremme formeringen af T-lym-focyter, hvilket muliggør måling af IL-2-aktiviteten ved anvendelse af et T-cellevækstaktivitetsindeks, idet 5 CTLL-celler overføres til 100 pliter DMEM indeholdende 2% FCS i mi-20 kroplader med 96 fladbundede huller sammen med 100 pliter af de seriefortyndede oversættelsesprodukter. Efter 72-96 timers inkubering ved 37°C i en 5% c02~inkubator tælles antallet af dyrkede og aktiverede celler ved mikroskopi. Som positiv ekstern kontrolgruppe tilsættes 100 og 10 enheder/ml af IL-2, 25 og IL-2-aktiviteten af forsøgsprøven beregnes i sammenligning med antallet af dyrkede levedygtige celler i disse kontrolgrupper.

Det således opnåede IL-2-mRNA fra den mest aktive fraktion anvendes som "template" til at syntetisere ds-cDNA, og 30 ds-cDNA1et forbindes med et vektor-DNA. Syntesen af cDNA gennemføres ved konventionelle procedurer.

Først fremstilles ss-cDNA, som er komplementært med mRNA, i nærværelse af dATP, dGTP, dCTP og dTTP ved anvendelse af revers transcriptase, idet mRNA anvendes som "template", 35 og oligo-dT anvendes som primer. mRNA-"tempiate" fjernes der- DK 173788 B1

O

14 på ved basebehandling, og ds-cDNA fås ved anvendelse af revers transcriptase eller DNA-polymerase og ved anvendelse af det ovenfor syntetiserede ss-cDNA som "template",

Rekombinant fremstillet DNA fremstilles ud fra det 5 således opnåede ds-cDNA og et vektor-DNA indeholdende repli-con, der er i stand til replikation i eukaryotiske eller pro-karyotiske celler. Det rekombinante DNA inkorporeres derefter i værtscellerne.

ds-cDNA'et og et vektor-DNA, der er i stand til at for-10 mere sig i eukaryotiske eller prokaryotiske celler, modificeres før sammenkobling ved forskellige procedurer, såsom exonu-cleasebehandling, tilsætning af kemisk syntetiserede DNA-styk-ker og G,C-ender for at forsyne enderne af ds-cDNA'et og vek-tor-DNA'et med sammenkoblelige ender. Sammenkoblingen af de 15 sammenkoblelige DNA'er gennemføres f.eks. med T^-fag-DNA-li-gase i nærværelse af ATP.

Med det således opnåede rekombinante DNA omdannes levende celler for at forstærke det klonede cDNA eller for at producere IL-2-polypeptid.

20 Egnede eukaryotiske værtsorganismer, der sædvanligvis anvendes til fremstilling af IL-2, omfatter hvirveldyr, gær osv. For eksempel kan der anvendes abeceller, f.eks. CV-1--celler, omdannet med en oprindelsesdefekt mutant af SV-40 og udtrykkende ("expressing") det store T-antigen hos SV-40 25 (COS-celler) , som diskuteret af Y. Glpzman, Cell 2^3, 175-182 (1981), celler afledt fra mus som diskuteret af S. Ohno og T. Tanaguchi, Nucleic Acids Research 10, 967-977 (1982), og gærværts-vektorsystemer anvendt til at udtrykke IFN-gen og diskuteret af R. Hitzeman et al., Nature 293, 717-722 (1981).

30 Egnede prokaryotiske værtsorganismer omfatter Escherichia coli, Bacillus subtilis osv. Til forstærkning af DNA i værtsorganismer kan det være foretrukket at anvende E. coli som værtsorganisme, men der kan også anvendes andre værtsorganismer.

35

O

15 DK 173788 B1

Egnede vektorer anvendt til E. coli omfatter EK-type--plasmidvektorerne (stringent type) pSCIOl, pRK353, pRK646, pRK248, pDF41 osv., EK-type-plasmidvektorerne (relakseret type) ColEl, pVH51, pACl05, RSF2124, pCRl, pMB9, pBR313, 5 pBR322, pBR324, pBR325, pBR32 7, pBR328, pKY2289, pKY2 700, pKN80, pKC7, pKBl58, pMK2004, pACYCl, pACYCl84, -dul osv., Agt-type-fagvektorerne Agt, Ac, Agt. AB, AWES, AC, AWES.

AB, AZJvir.,AB', AALO, AB/ Ts622, A,Dam osv. J almin delighed er pBR322 hyppigt blevet anvendt som vektor for E.

10 coli, og i dette tilfælde er de bedste kloningssæder Pst I-og EcoRI-sæderne.

Omdannelsen af værtscellen med det rekombinante DNA kan gennemføres på konventionelt anvendt måde som følger: Når værtsorganismen er prokaryotisk, såsom E. coli, 15 præpareres kompetente celler, der er i stand til DNA-optagel-se, ud fra celler høstet efter eksponentiel vækstfase og behandles derefter ved CaC^-metoden ifølge velkendte procedurer. Når der foreligger MgC^ eller RbCl i omdannelsesreaktionsmediet, forøges omdannelsens effektivitet. Omdan-20 nelsen kan også gennemføres efter dannelse af en protoplast af værtscellen.

Når værtsorganismen er eukaryotisk, kan der anvendes _ overføring af DNA som calciumphosphat-præcipitater, konventionelle mekaniske procedurer, såsom mikroinjektion, indfø-25 ring af et plasmid indkapslet i røde blodlegemer eller i li-posomer, behandling af celler med midler som lysophosphat-idylcholin, anvendelse af virus-vektorer eller lignende.

Celler, der indeholder IL-2-gen, kan isoleres efter omdannelsen ved en af de to følgende metoder.

30 (1) Ved plus-minus-metoden fås delvis renset IL-2-mRNA

ved saccharosegradientcentrifugering af mHNA ekstraheret fra mitogenaktiverede pattedyrceller som ll-12S-sediment, og derefter syntetiseres 32p-radioaktivt mærket ss-cDNA ved anvendelse af det delvis rensede mRNA som "template". Efter fjer-35 nelse af mRNA-"template" ved basebehandling hybridiseres iso- o DK 173788 B1 16 leret cDNA med delvis renset ll-12S-mRNA fra ikke-mitogenaktiverede pattedyrceller. Derefter fraktioneres ikke-hy-bridiseret og hybriddannende cDNA ved søjlechromatografi på hydroxylapatit. Det ikke-hybridiserede cDNA og det hy-5 bridiserede cDNA betegnes foreløbig prøve A og prøve B. Omdannede celler dyrkes på to nitrocellulosefiltre på ganske samme måde, og DNA'et fra cellerne fikseres på filterpapiret ved basebehandling. Prøve A og prøve B hybridiseres hver især med DNA'et på to forskellige stykker filterpapir, 10 og derefter gennemføres en autoradiografibestemmelse til udvælgelse af de omdannede organismer, der reagerer positivt på prøve A (plus), men reagerer svagt eller slet ikke på prøve B (minus), jf. Taniguchi et al., Proc. Jpn. Acad., v 155B, 464-469 (1979).

15 (2) Den anden metode består i, at f.eks. 1.000 til 10.000 omdannede kloner deles i flere gange ti eller flere gange hundrede klongrupper. De opdelte klongrupper dyrkes hver især på konventionel måde til opnåelse-af plasmrd-DNA. Derefter omdannes disse plasmid-DNA'er til ss-cDNA'er, f.eks.

20 ved varmedenaturering, og de opnåede ss-cDNA'er fikseres på nitrocellulosefilterpapirer til opnåelse af hybridisering af MRNA komplementært med de fikserede DNA'er og fremstillet ud fra pattedyrceller indeholdende aktiveret IL-2-mRNA. Alternativt hybridiseres mRNA'er indeholdende lL-2-mRNA med varmedena-25 turerede plasmid-DNA'er, og derefter fikseres DNA-mRNA-hybri-den på nitrocellulosefilterpapir. Disse filterpapirer vaskes derefter med en puffer med lav saltkoncentration, såsom ImM HEPES, eller med lOmM NaCl, og mRNA adsorberet på filterpapiret ekstraheres ved behandling med en opløsning indeholden-30 de 0,5mM EDTA og 0,1%'s SDS-opløsning i f.gks. 1 minut ved 95°C. Renset mRNA fås ved eluering ved oligo dT-cellulose--søjlechromatografi. Derefter oversættes mRNA til protein ved mikroinjektion i Xenopus laevis-æg til konstatering af IL-2--aktivitet, eller mRNA'et oversættes til et protein ved an-35 vendelse af mRNA-afhængige reticulocyter eller et hvedekim-in

O

17 DK 173788 B1 vitro-cellefrit oversættelsessystem til analyse af IL-2-ak-tiviteten ved anvendelse af anti-IL-2-antistof. Ifølge disse procedurer opdeles gruppen, hvori tilstedeværelsen af IL-2-aktivitet påvises, igen gentagne gange i grupper bestå-5 ende af et mindre antal omdannede kloner, indtil en enkelt klon indeholdende IL-2-DNA er specificeret.

Til opnåelse af cDNA, der koder IL-2-polypeptid, ud fra IL-2-producerende omdannede organismer fraskilles det rekombinante DNA i den omdannede organisme og spaltes med 10 en restriktionsendonuclease. Fra DNA-fragmenterne dannet ved spaltning skilles indsats-cDNA-fraktionen.

Den komplette nucleotidsekvens af Pstl-DNA-indsatsen, der koder IL-2-popypeptider, fra det rekombinante DNA af pIL2-50A er bestemt ved proceduren ifølge Maxam og Gilbert, 15 Meth. Enzym. 65, 499-560 (1980), og ved dideoxynucleotidkæ-deafslutningsmetoden ifølge A.J.M. Smith, Meth. Enzym. 65, 560-580 (1980).

Restriktionsendonuclease-spaltningsdiagrammet for cDNA-indsatsen er vist i fig. 1, og dens basesekvens er vist 20 i fig. 2(a), hvori cDNA’et har steder spaltet med restriktionsendonuclease af BstNI, Xbal og BstNI i den nævnte rækkefølge.

DNA-sekvensen af indsatsen indeholder en enkelt stor åben aflæsningsramme. Den første ATG-sekvens, der sædvanlig-25 vis tjener som initieringssekvens i eukaryoter (M. Kozak,

Cell 15, 1109-1123 (1978)), findes ved nucleotid 48-50 fra 5'-enden. Dette ATG følges af 152 kodoner, før man møder afslutningstripletten TGA ved nucleotid 507-509. En række af A-rester, der svarer til 31-poly(A)-enden i mRNA findes ved 30 enden af cDNA’et, og forud for denne ligger hexanucleotidet AATAAA (position 771-776), der sædvanligvis findes i de fleste eukaryotiske mHNA'er, jf. N.J. Proudfoot og C.G. Brownlee, Nature 263, 211-214 (1976).

Aminosyresekvensen, som kodes af cDNA’et, kan udledes 35 som vist i fig. 2(b) (aminosyresekvens I). Polypeptidet med

O

18 DK 173788 B1 aminosyresekvens I består af 153 aminosyrer, og dets molekylvægt beregnes til 17.631,7 dalton. Som rapporteret som fællestræk for de fleste i øjeblikket kendte sekretionsproteiner (G. Biobel et al., Syrn. Soc. Exp. Med. 3^, 9-36 5 (1979) er det N-terminale område af det udledte IL-2-poly- peptid også ret hydrofobt, og dette område tjener formodentlig som signalpeptid, der spaltes under udskillelsesprocessen for det modne IL-2. En sådan spaltning sker enten mellem Ser og Ala ved position 20 og 21 eller mellem Ala og Pro 10 ved position 21 og 22, hvorved der dannes polypeptidet med aminosyresekvens II og III, da lignende spaltningssteder ofte er blevet fundet i andre sekretionsproteiner (G. Biobel et al., Symp. Soc. Exp. Med. 3_3, 9-36 (1979)). Det modne IL--2-polypeptid vil da indeholde 133 eller 132 aminosyrer og 15 have en beregnet molekylvægt på 15.420,5 eller 15.349,4 dalton. Denne værdi sammenlignes derefter med den rapporterede værdi for humant IL-2-protein fra Jurkat-celler på 15.000 dalton, jf. S. Gillis et al., Immunological Rev. 6J3, 67-209 (1982). Desuden er det bekræftet, at DNA-fragmentet, der 20 starter fra CCT-kodonet ved position 111-113 i basesekvensen, og som derfor koder et polypeptid, der starter fra Pro i position 22 (aminosyresekvens III i fig. 2(b)), udtrykker et polypeptid, der har IL-2-aktivitet som vist i eksempel 5.

Det er også bekræftet, at DNA-fragmentet, der starter fra 25 GCA-sekvensen ved position 107-110 i basesekvensen, og som derfor koder et polypeptid, der starter fra Ala i position 21 (aminosyresekvens II i fig. 2(b)), udtrykker et polypeptid, der har IL-2-aktivitet som vist i eksempel 8.

Det har været kendt, at gener af eukaryoter ofte ud-30 viser polymorfisme, f.eks. i humane interferongener, jf.

Taniguchi et al., Gene 10, 11-15 (1980), Ohno og Taniguchi,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5305-5309 (1986), Gray et al., Nature 295, 501-508 (1981). I nogle tilfælde ledsages poly-morfismen af erstatning af visse aminosyrer i proteinpro-35 dukterne, og i andre tilfælde forbliver strukturen af pro- DK 173788 B1 19 teinproduktet uændret. I tilfælde med humant IL-2-cDNA kan der påvises et andet cDNA-klon (plL2-503), hvori A-resten ved position 503 i pIL2-50A-cDNA (fig. 2) er erstattet med en G-rest. Andre cDNA-kloner med en vis basesubstitution i 5 sammenligning med pIL-2-50A-cDNA kan også forventes.

Som det vil forstås af det ovenfor anførte, omfatter DNA-fragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse DNA, der har basesekvensen vist i fig. 2(a), DNA'er, der starter fra ATG-sekvensen ved position 48-50 og har den 10 række af baser, der følger efter ATG-sekvensen, op til mindst ATC-sekvensen ved position 504-506, DNA'er, der starter fra GCA-sekvensen ved position 108-110 og har den række af baser, der følger efter GCA-sekvensen, op til mindst ATC-kodonet, og DNA'er, der starter fra CCT-sekvensen ved position 111-15 113 og har den række af baser, der følger efter CCT-sekven sen, op til mindst ACT-sekvensen.

DNA-fragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter også DNA'er, der ender ved ACT-sekvensen ved position 504-506 og starter fra A ved position 1, ATG-sekvensen 20 ved position 48-50, GCA-sekvensen ved position 108-110 eller CCT-sekvensen ved position 111-113. DNA-fragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter endvidere DNA'er, der ender ved TGA-sekvensen ved position 507-509 og starter fra A ved position l, ATG-sekvensen ved position 48-50, GCA-25 sekvensen ved position 108-110 eller CCT-sekvensen ved position 111-113. DNA-fragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter desuden DNA'er, der ender ved C i position 801 og starter fra A i position 1, ATG-sekvensen ved position 48-50, GCA-sekvensen ved position 108-110 eller CCT-sekvensen 30 ved position 111-113. DNA-fragmenterne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter yderligere DNA'er, der ender med poly-(A) og starter fra ATG-kodonet ved position 48-50, GCA-sekvensen ved position 108-110 eller CCT-sekvensen ved position 111-113. DNA-fragmenterne ifølge den 35 foreliggende opfindelse omfatter også sådanne, hvis basesekvens svarer til aminosyresekvens I, II og III. Derudover DK 173788 B1 20 o kan polypeptider, der mangler en eller flere aminosyrer i aminosyresekvens I, eller polypeptider, hvori en eller flere aminosyrer i aminosyresekvens I er erstattet med en eller flere aminosyrer, have IL-2-aktivitet. Derfor er gener, 5 der koder sådanne polypeptider, egnede gener ved den foreliggende opfindelse. På lignende måde er gener, der har en additiv forbindelse af en eller flere basesekvenser og er i stand til at udtrykke en eller flere aminosyrer til aminosyresekvens I, II eller III, egnede ved opfindelsen, så-10 fremt de additivt forbundne aminosyrer ikke interfererer med polypeptidernes virkning med hensyn til at udtrykke IL-2-aktivitet. En modificeret additivt forbundet aminosyreregion, der interfererer med polypeptidfunktionen som IL-2, kan anvendes ved opfindelsen, såfremt den additivt forbundne re-15 gion let kan elimineres. Denne situation er ganske den samme for den additive forbindelse af DNA til 3'-enden af gener svarende til aminosyresekvens I, II og III, der koder yderligere aminosyrer ved den C-terminale ende af I, II og III, der har henholdsvis aminosyresekvens I, II og III. Derfor an-20 ses anvendelsen af gener, der koder sådanne polypeptider, at være omfattet af den foreliggende opfindelse.

Rekombinante DNA'er, der styrer produktionen af IL-2 i levende celler, kan konstrueres ved forskellige metoder.

For eksempel kan den kodende sekvens af IL-2-cDNA indføjes 25 i en udtrykningsbærer ("expression vehicle") nedenfor promotor-sekvensen. Alternativt kan et cDNA-stykke, der bærer en promoter-sekvens, indføjes ovenfor den IL-2-kodende sekvens før eller efter indføjningen af cDNA i udtrykningsbæ-reren.

30 Procedurer til konstruktion af prokaryotiske eller eukaryotiske celler, der udtrykker IL-2-cDNA og producerer IL-2-polypeptid, forklares mere detaljeret nedenfor.

(1) Udtrykning af lL-2-cDNA i E. coli.

Til udtrykning af IL-2-cDNA i E. coli sammenføjes 35 cDNA med forskellige bakterielle promotere, og der fås hy-

O

21 DK 173788 B1 bride plasmider indeholdende cDNA nedenfor promoterne. Plas-miderne overføres til f.eks. E. coli stamme HB101, og bakterier, der syntetiserer et proteinprodukt med human lL-2-ak-tivitet, klones. I det væsentlige enhver form for bakteriel 5 promotor vil styre udtrykningen af IL-2-cDNA, hvis den støder op til cDNA på passende måde. Eksempler på denne cDNA--udtrykning er beskrevet i den foreliggende beskrivelse.

Det klonede cdNA for IL-2 koder et polypeptid bestående af 153 aminosyrer som vist i fig. 2. Det N-terminale 10 område svarende til ca. 20 aminosyrer i dette polypeptid er ganske hydrofobt, og dette er karakteristisk for de fleste sekretionsproteiner. En sådan hydrofob sekvens, en såkaldt signalsekvens, spaltes under sekretionsprocessen. Det modne IL-2-polypeptid vil derfor indeholde mindre end 153 amino-15 syrer. Det er derfor ønskeligt at udtrykke den cDNA-del, der koder det modne IL-2-polypeptid, men ikke den del, der svarer til IL-2-signalsekvensen.

(i) Konstruktion af udtryknings-plasmid-bærer pTrS-3, der indeholder E. coli-trp-promoter. Dens ribosom-bindingssted 20 (SD-sekvens) for leder-peptidet ("leader peptide") er rapporteret tidligere (G. Miozzari og Yanofsky, C.J. Bacteriol.

133, 1457-1466 (1978)), og at ATG-kodon er placeret 13 bp (basepar) nedenfor SD-sekvensen (Nishi et al. Seikagaku 54, nr. 8, 676 (1982)). Plasmidbæreren indeholder også et enkelt 25 SphI-sæde lige nedenfor ATG-initieringssekvensen (fig. 4).

Til udtrykning af IL-2-cDNA spaltes plasmidet først med Sphl og behandles derefter med enten E. coli-DNA-polymerase I (Klenow-fragment) eller med bakteriofag T4-DNA-poly-merase I til fjernelse af de fremspringende 3'-ender (fig.

30 5(a)). Plasmid pIL2-50A dobbeltbehandles med Pst! og HgiAI, og et større cDNA-fragment isoleres. DNA'et behandles derefter enten med E. coli-DNA-polymerase I (Klenow-fragment) eller med bakteriofag T4-DNA-polymerase, således at de fremspringende 3'-ender gøres flugtende. Det som ovenfor behand-35 lede cDNA koder IL-2-polypeptid med 132 aminosyrer som vist

O

22 DK 173788 B1 i fig. 5(a). Dette cDNA sammenkobles derefter med pTrS-3--plasmid-DNA'et, der er forbehandlet som ovenfor, således at ATG-initieringskodonet stødes op til CCT(Pro)-sekvensen af IL-2-cDNA. På denne måde fås et plasmid pTIL2~22. Forbin-5 delsesstedet mellem trp-promoter-sekvensen og IL-2-cDNA-se-kvensen af pTIL2-22 er også illustreret i fig. 5(a).

Plasmidet pTIL2-22 vil styre syntesen i E. coli af et IL-2-polypeptid bestående af 132 aminosyrer startende med prolin.

10 (ii) Da det også er muligt, at det modne IL-2 indeholder ala-nin (position 21) som den N-terminale aminosyre i stedet for prolin, diskuteres det følgende plasmid, der styrer syntesen af et IL-2-polypeptid bestående af 133 aminosyrer.

Plasmid pTrS-3 indeholder et enkelt Clal-sæde mellem 15 SD-sekvensen og ATG-sekvensen (fig. 4). Dette plasmid spaltes med Cla I og Sal I. Plasmid pIL2-50A spaltes delvis med PstI og behandles med E. coli-DNA-polymerase I, og det største lineære DNA isoleres. DNA’et sammenkobles derefter med et syntetisk DNA-sammenkoblingsstykke ("linker") indeholdende et 20 restriktions-Xhol-spaltningssæde, og en klon indeholdende plasmidet pIL2-50A(Xho), hvori sammenkoblings-DNA'et er indført ved 3' nedenfor den IL-2-kodende sekvens, isoleres. Plasmidet pIL-2-50A(Xho) spaltes først med HgiAI, behandles enten med E. coli-Klenow-fragment eller med T4-DNA-polymerase, spal-25 tes med Xho og cDNA-fragmentet isoleres. Dette cDNA-fragment sammenkobles derefter med pTrS-3 forbehandlet med Clal og Sall og med et syntetisk DNA vist i fig. 5(b). På denne måde kan der fås et plasmid pTIL2-21, der vil styre syntesen i E. coli af et IL-2-polypeptid bestående af 133 aminosyrer og 30 startende med alanin, som illustreret i fig. 5(b). En lignende konstruktion kan også udføres uden anvendelse af Xhol-sam-menkoblingsstykke.

(iii) IL-2-polypeptider med forskellig størrelse og med forskellig N-terminal aminosyre kan fremstilles ved anvendelse 35 af pTrS-3-udtrykningsplasmidbæreren ved følgende procedure.

O

23 DK 173788 B1

Det klonede IL-2-cDNA i pIL2-50A indeholder et enkelt Ddel--sæde ved nucleotid-position 81-85. Plasmid pIL-2-50a(Xho) spaltes med Ddel, og DNA-fragmentet indeholdende den største del af cDNA'et isoleres. Fragmentet vil også indeholde DNA 5 med ca. 3.000 basepar fra pBR322 (fig. 5(c)). DNA-fragmentet behandles med exonuclease Bal 31 og spaltes derefter med Xhol. Det som ovenfor behandlede DNA sammenkobles derefter med pTrS-3, som er spaltet med Sphl, behandlet med enten Kle-now-fragment eller med t4-DNA-polymerase og derefter spaltet 10 med Sall som illustreret i fig. 5(c). Det sammenkoblede DNA

overføres til E. coll HB101, og bakteriekloner, der udtrykker humant IL-2, frasorteres. Disse kloner vil udtrykke humant IL-2 med forskellig størrelse, da DNA'et svarende til det N-terminale område af humant IL-2, fraspaltes på forskellig 15 måde. På denne måde kan der fås pTIL2-14 og pTIL-15, som bærer IL-2-cDNA.

(iv) IL-2-cDNA'et kan også udtrykkes ved anvendelse af pKT218 (tilvejebragt af K. Talmage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3369-3373 (1980)). Plasmid pKT218 spaltes med PstI og sammen-20 kobles med en IL-2-cDNA-indsats opnået ved spaltning af pIL2--50A-DNA med HgiAI og PstI (fig. 6). Det fremkomne plasmid pKIL2-21 har den sekvens ved begyndelsen af proteinsyntese--initieringen, der er vist i fig. 6. Plasmidet pKIL2-21 vil således styre syntesen i E.coli af et sammensmeltet polypep-25 tid bestående af 133 aminosyrer af IL-2 og 8-lactamase-ami-nosyrer (det første methionin fraspaltes i E. coli).

(c) Et udtrykningsplasmid pTuBlP-5, hvori promoter-sekvensen for tuf B er indføjet i pBR322, er konstrueret tidligere (Taniguchi et al., SEIKAGAKU 53_, 966 (1981)). Plasmidet inde-30 holder et enkelt Clal-sæde, og dette er placeret 2 bp nedenfor SD-sekvensen som vist i fig. 7.

Da pTrS-3 også indeholder et Clal-sæde mellem SD-sekvensen og ATG-initieringssekvensen, og da dette Clal-sæde ikke ødelægges under konstruktionen af udtrykningsplasmidet 35 ved anvendelse af pTrS-3 og IL-2-cDNA som ovenfor beskrevet,

O

24 DK 173788 B1 er det meget enkelt at erstatte den bakterielle Trp-promoter med tufB-promoter, således at det humane IL-2-cDNA udtrykkes under kontrol af tufB-promoter. For eksempel spaltes pTIL2-22 med Clal og PvuII, og DNA-fragmentet indeholdende iL-2-cDNA 5 isoleres. Dette fragment sammenkobles derefter med pTuBlP-5--DNA, forbehandles med Clal og PvuII, og der konstrueres et plasmid pTuIL2-22 som illustreret i fig.7. IL-2-aktiviteten kan påvises i ekstrakten af E. coli HB101 indeholdende plas-midet pTuIL2-22 .

10 (vi) En lignende konstruktion kan også udføres ved anvendelse af f.eks. pTiL-2-21 og i det væsentlige alle udtrykningsplas-mider, der er konstrueret med anvendelse af pTrS-3. Det er også muligt at optimere afstanden mellem SD- og ATG-sekven-sen ved behandling af f.eks. pTuIL2-22 med Clal, fjernelse 15 (eller tilføjelse) af nogle af få basepar af DNA med Bal 31 eller SI eller DNA-polymerase I (E. coli) og påfølgende gensammenkobling af plasmidet.

(2) Udtrykning af IL-2-cDNA i gær.

IL-2-cDNA kan også udtrykkes i gær ved at indføje 20 cDNA'et i passende udtrykningsvektorer og indføre produktet i værtscellerne. Forskellige shuttle-vektorer til udtrykning af fremmede gener i gærceller er blevet rapporteret (R. Heitz-man et al., Nature 293, 717-722 (1981); P. Valenzuela et al·., Nature 298, 347-350 (1982); Miyanohara et al., Proc. Natl.

25 Acad. Sci. USA 80, 1-5 (1983)). Vektoren er i stand til repli-kation i både E. coli- og gær-værtsceller, og de indeholder promotor-sekvenser af gærgener. I det væsentlige alle sådanne udtrykningsvektorer kan anvendes til udtrykning af IL-2--cDNA. Det kan være muligt at opnå højere niveauer af IL-2-30 -produktion ved anvendelse af gærceller end ved anvendelse af dyreceller eller bakterier. Et eksempel på udtrykning af humant IL-2-cDNA i gær beskrives i det følgende.

Gær/E. coli-shuttle-vektorerne pAT77 og pAM82 er beskrevet af Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 35 80, 1-5 (1983). Vektoren pAM82 er et derivat af pAT77, og

O

25 DK 173788 B1 begge bærer markører af ars 1 (D.T. stichcomb et al,, Natu-re 282, 39-43 (1979), 2 pm ori (J.R. Broach et al., Gene (ϊ, 121-133 (1979) og leu 2 (B. Ratzkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ]4_r 474-491 (1979) og promoteren for genet for sur 5 phosphatase (APase) i gær. De bærer også et 3,7 kb DNA-seg-ment af pBR322, der indeholder en ampicillin-resistens-mar-kør (Ap1) og replikations-begyndelsen (fig. 8). APase-pro-moteren kan induceres ved at ændre en høj koncentration af phosphat til en lav koncentration i kulturmediet. Til ud-10 trykning af humant IL-2-cDNA spaltes pIL2-50A med PstI efter behandling med enten E. coli-Klenowfragment eller med T4-DNA--polymerase, cDNA'et sammenkobles med pAiil82, som i forvejen er spaltet med Xhol, og inkuberes med E. coli-Klenowfragment til udfyldning af enderne. Hybride plasmider, hvori den cDNA-15 -kodende sekvens er nedenfor gær-APase-promoter-sekvensen, udvælges ved at klone dem i E. coli. Det opnåede plasmid. pYIL-2a, indføres i gær, og efter inducering af APase-promo-teren måles IL-2-aktiviteten i gærekstrakten. Plasmidet pYIL--2a indeholder en række af GC-rester mellem gær-promoteren 20 og IL-2-cDNA'et. Det er muligt, at en sådan sekvens hindrer udtrykning af IL-2-cDNA. Til overvindelse af dette problem kan der foretages følgende konstruktion af et plasmid. Plasmid pIL2-50A spaltes med PstI, og cDNA-indsatsen isoleres. Dette cDNA behandles derpå med T4-DNA-polymerase i nærværelse af 25 dATP, dGTP og dTTP, således at rækker af C-rester ved begge ender af cDNA'et fraspaltes, og behandles derefter med nuclease SI til fjernelse af rækker af G-rester. Dette DNA sammenkobles med Xhol-DNA-forbindeIsesstykke og plasmid pBR322, hvis EcoRI-sæde er spaltet og gjort flugtende med EcoRI og 30 Klenowfragment, og det fremkomne plasmid, pIL2-Xho, spaltes med Xhol, og cDNA-indsatsen isoleres. cDNA'et indføres derefter i det enkelte Xhol-sæde i pAM82, og et plasmid indeholdende den IL-2-kodende sekvens orienteret korrekt i forhold til gær-APase-promoteren klones i E. coli. Plasmidet pYIL-2b, 35 indføres i gær, og efter inducering af APase-promoteren. måles IL-2-aktiviteten i gærekstrakten.

O

26 DK 173788 B1 {3) Udtrykning af cDNA i pattedyrceller.

Et plasmid, som vil styre syntesen af humant IL-2 i pattedyrceller, kan konstrueres på følgende måde. Et plasmid pCE-1 konstrueres ud fra pKCR (K. O'Hare et al., Proc.

5 Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527-1531 (1981)) og pBR328 (X. So-beron et al.. Gene 9, 287-305 (1980)) ved en række af modifikationsprocedurer som illustreret i fig. 3, og initieringssekvensen ATG af IL-2-genet forbindes nedenfor promotoren af det tidlige SV40-gen. Dette plasmid indeholder et enkelt 10 Pstl-sæde lige nedenfor den tidlige SV40-promoter og ovenfor den del af kanin-B-globin-chromosomgenet, der indeholder et intron. Plasmidet indeholder også replikationsbegyndelsen af SV40 samt polyadenyleringssædet for det tidlige gen. Der fås således et plasmid pCEIL-2, hvori IL-2-strukturgenet vil bli-15 ve transskriberet fra den tidlige promoter af SV40 i passende værtsceller (fig. 3). Dette plasmid spaltes med Hhal og indføres ved DNA-overføring i den omdannede abecellelinie COS-7, som tillader replikation af DNA-holdige SV40-oprindel-ses-sekvenser. Det synes at være vigtigt at spalte plasmidet 20 med Hhal før overføringen, således at der opnås en effektiv udtrykning af cDNA, da sekvenser, som vil kunne genere replikation af det overførte DNA i COS-cellerne, kan fjernes fra den væsentlige del af plasmidet til cDNA-udtrykning ved denne procedure. Ved 1-3 dages dyrkning under gængse kulturbe-25 tingelser efter overføring af denne vektor til en kultur af abeceller COS-7 (Y. Gluzman, Cell, bind 23, 175-182 (1981)) bliver der sædvanligvis udskilt og produceret IL-2 i det dyrkede cellemedium. Til indføjning af forstærket DNA i andre eukaryotiske celler forbindes en vektor, der er passende for 30 værtsorganismerne, på lignende måde med cDNA-indsats, der er spaltet og isoleret fra prokayrotiske celler, og den således syntetiserede vektor kan overføres til de eukaryotiske celler, som derefter kan dyrkes.

Cellerne indeholdende det rekombinante DNA dyrkes for 35 at forstærke det rekombinante DNA eller for at producere IL-

O

27 DK 173788 B1 -2-polypeptid. Dyrkningen gennemføres på konventionel måde.

For eksempel kan omdannet gær dyrkes i et medium indeholdende en carbonkilde, en nitrogenkilde, uorganiske salte og om fornødent organiske næringsstoffer, såsom vitaminer og amino-5 syrer, ved en temperatur i området 20-37°C og en pH-værdi i området 4-7 under aerobe betingelser. Omdannede prokaryotiske organismer, såsom E. Coli eller B. subtilis, kan også dyrkes under konventionelle betingelser.

Det intracellulært eller ekstracellulært producerede 10 IL-2 udvindes ved en hvilken som helst kendt metode, såsom udfældning med ammoniumsulfat, dialyse til fjernelse af salte (under normalt tryk eller vakuum), gelfiltrering, chromatogra-fi, præparativ fladlags isoelektrisk fokusering, gelelektrofo-rese, højydelseschromatografi (i det følgende betegnet "HPLC"), 15 (ionbytning, gelfiltrering og revers fase-chromatografi) og affinitetschromatografi på farvestofbundet bærer, på aktiveret Sepharose 4B koblet med monoklonalt antistof mod IL-2 eller på lectinbundet Sepharose 4B og lign. Metoder til udvinding og rensning af IL-2 er beskrevet af Watson et al., 20 j. Exp. Med. 150, 849-861 (1979); Gillis et al., J. Immunol.

124, 1954-1962 (1980); Mochizuki et al., J. Immunol. Methods 39, 185-201 (1980) og K. Welte et al., J. Exp. Med. 156, 454-464 (1982).

Det således opnåede polypeptid udviser den samme bio-25 kemiske og biologiske opførsel, som er kendt fra IL-2 produceret af pattedyrceller ved mitogen stimulering, og har IL-2--aktivitet. Molekylvægten er ca. 15.000 dalton, og IL-2-akti-viteten neutraliseres eller udfældes fuldstændig med monoklonalt anti-IL-2-antistof i nærværelse eller fraværelse af 30 immunadsorptionsmidler, såsom "Igsorb" (Enzyme Center). Ved immunoelektroforese udviser IL-2-polypeptidet kun et enkelt præcipitat mod det tilsvarende anti-IL-2-antistof, IL-2-akti-viteten forbliver stabil efter reduktion med 2-mercaptoetha-nol og er bestandig mod behandling med DNAse og KNAse samt 35 mod varmebehandling ved 56°C i 30 min. Aktiviteten er stabil

O

28 DK 173788 B1 ved en pH-værdi mellem 2 og 9. Det producerede IL-2 kan fremme væksten af monoklonale funktionelle T-celler (cyto-toksiske T-lymfocyter), fremme thymocyt-mitogenese, give anledning til dannelse af antitumorspecifikke cytotoksiske 5 T-lymfocyter fra "hukommelses"-tilstanden i fraværelse af antigenet og kan anvendes til at forøge naturlig dræbercel-leaktivitet mod YAC-1- og RL<$1 -celler.

Efter den ovenfor anførte generelle beskrivelse af opfindelsen vil denne blive forklaret nærmere ved de føl-10 gende specifikke eksempler, der skal opfattes som illustrerende .

Eksempel 1.

(1) En human T-leukæmi-cellelinie, Jurkat-celler (kan fås frit i Japan, Vesttyskland og USA) suspenderes i RPMI 1640-medium indeholdende 10 vol.-% PCS og bestråles med røntgenstråling i en dosis på 10.000 røntgen ved stuetemperatur i 50 sekunder ved anvendelse af et Exs 150/3O0-4-rønt-genbestrålingsapparatur (Toshiba, Japan), og derefter dyrkes 20 de bestrålede celler i 5 dage ved 37°C i en 5% C09-inkubator 5 * ved en begyndelses-celledensitet på 1 x 10 celler/ml i det ovennævnte kulturmedium. De muterede celler (0,2 celler/hul) anbringes i huller 10 stykker i mikroplader med 96 fladbundede huller og dyrkes ved 37°C i en 5% C02~inkubator i 21 dage.

25 Kloner opnået fra hullerne, der udviser vækst, overfø res gentagne gange til frisk kulturmedium for at forøge klonstørrelsen, og de formerede kloner dyrkes i 24 timer ved en begyndelsescelletæthed på 1 x 10^ celler/ml i nærværelse af 50 pg/ml Con A, og IL-2-aktiviteten måles ifølge de ovenfor 30 beskrevne metoder. Der udvælges således en human T-celleli-nie betegnet Jurkat-111 (I det følgende betegnet "J-lll") (ATCC CRL8129) og klonet fra forældre-Jurkat-cellelinien, hvis IL-2-produktivitet er forøget 40 gange i forhold til forældres tammen. Den klonede cellelinie J-lll kan vokse under 35 konventionelle betingelser, og væksthastigheden er næsten den samme som for almindelige Jurkat-celler.

O

29 DK 173788 B1 (2) Celler (1 x 10^ pr. ml) af J-lll podes i 1000 ml serumfrit syntetisk kulturmedium RITC 55-9 (T. Sato et al.,

Exp. Cell. Res. 138, 127-134 (1982)) i rullekulturkolber (Falcon 3027) og dyrkes i 4 dage ved 37°C, og de formerede 5 celler høstes ved centrifugering. De høstede celler podes igen i det ovennævnte medium, hvortil der er sat 25 pg/ml af Con A, til at indeholde 4 x 10 6 celler/ml. I 4 portioner i rullekulturkolber (Falcon) anbringes 1000 ml af det podede kulturmedium i hver portion. Dyrkningen fortsættes i 10 6 timer under rotation.

(3) Jurkat-cellerne (1,2 x 106), der således er stimuleret med 25 pg/ml Con A i 6 timer, suspenderes i 8000 ml phosphat-puffer afbalanceret med saltopløsning (i det følgende betegnet "PBS"). Cellerne vaskes to gange ved centrifugering og 15 gensuspenderes i 800 ml RSB-opløsning (10 mM tris-HCl, pH--værdi 7,5, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgC^) indeholdende ribonu-cleosid-vanadyl-kompleks (10 mM), som er en inhibitor for nuclease. Derpå tilsættes detergent NP-40 til en slutkoncen-tration på 0,05%, hvorefter der blandes forsigtigt, og celle-20 kernerne fjernes ved centrifugering i 5 minutter ved 3000 o/ra ved 4°C. SDS (0,5%) og EDTA (5 mM) sættes til den ovenstående væske, og cytoplasma-RNA ekstraheres ved tilsætning af et lige så stort volumen phenol. Efter 3 ganges ekstraktion med phenol udfældes RNA med et 2 ganges volumen ethanol, og bund-25 faldet fraskilles ved filtrering og solubiliseres i 10 mM tris-HCl med en pH-værdi på 7,5. Den opnåede mængde RNA er 196 mg.

Fraktioneringen af mRNA gennemføres ved affinitets-chromatografi på oligo-(dT)-cellulose (P.L. Biochemicals, 30 Type 7). Adsorptionsopløsningen er en opløsning med en pH-vær-di på 7,5 indeholdende 20 mM tris-HCl, 0,5 M NaCl, ImM EDTA og 0,5% SDS, og elueringen gennemføres med vand og 10 mM tris--HC1 (pH-værdi 7,5) skiftevis efter vaskning af søjlen med puffer (20 mM tris-HCl, pH-værdi 7,5, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA).

35 Der fås 3,6 mg elueret mRNA. Derefter fraktioneres 2,4 mg af o DK 173788 B1 30 mRNA'et ved saccharosegradientcentrlfugering (5-2,5%'s sac-charosegradient i en opløsning med en pH-værdi på 7,5 indeholdende 50 mM tris-HCl, 1 mM EDTA og 0,2 M NaCl), idet der centrifugeres ved 26.000 o/m i 24 timer ved 4°C, og 11-12S-5 -fraktionen af mENA fraktioneres til fraktion nr. 12, 13 og 14 i mængder på hhv. 59, 46 og 60 pg.

(4) mHNA'et, der fås i fraktion nr. 13, mikroinjiceres i ægceller af Xenopus laevis (50 ng mRNA/æg), og den ovenstående kulturvæske anvendes til bestemmelse af IL-2-aktivitet. Som 10 vist i tabel 1 bekræftes forøgelsen af inkorporeringen af 3H-TdR og forøgelsen af antallet af aktiverede T-lymfocyter, hvilket klart demonstrerer, at mHNA'et i denne fraktion indeholder humant IL-2-mRNA.

15 Tabel I (a)

Optagelse af Mængde af IL-2* Prøve Fortynding ^H-TdR (cpm) (enheder/ml)

kontrol I - 553 O

(medium til bestemmelse) 20 kontrol II x 2 590 0 (ovenstående x 32 572 væske fra æg-kultur, ubehandlet) oversættelses- x 8 14.683 32 25 produkt af fraktion 13 x 32 10 *165 30 35 DK 173788 B1 31 o

Tabel I (b)

Antal T-lymfocyt- Mængde af IL-2X Fortynding celler (antal/hul) (enheder/ml)

kontrol I x 2 O O

(medium til x 16 O

5 bestemmelse) kontrol II x 2 O 0

(ovenstående x 16 O

væske fra æg-kultur, ubehandlet) 10 oversættelses- x 2 115 40 produkt af , ^ __ c ^ ,_ x 16 55 fraktion 13 x) enheden beregnes ved sammenligning af mængden af inkorporeret ^H-TdR i prøven med mængden i standard-IL-2 (lO enheder/ml) ifølge probit-ig analyse.

(5) Derefter syntetiseres cDNA in vitro ud fra fraktion nr.

13 med ll-12S-mRNA indeholdende IL-2-mKNA, og rekombinant DNA konstrueres med piasmidvektoren PBR 322. Med det rekombinante DNA omdannes E. coli, og klon-opnåede IL-2-cDNA-kloner udvæl-20 ges, som følger:

(5-1) 50 mM tris-HCl-puffer (pH-værdi 7,5), 30 mM NaCl, 6 mM

MgCl2/ 5 mM dithiothreitol (i det følgende betegnet "DTT"), 0,5 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP (dCTP indeholder 32 25 P-radiomærket dCTP), 0,7 pg oligo-(dT)10 pg mRNA og 15 enheder AMV-revers transcriptase (J.W. Beard) blandes og holdes i 90 minutter ved 41°C.

Efter afsluttet omsætning udvindes DNA som ethanol-bundfald efter phenolbehandling, og DNA solubiliseres i en opløsning 30 med en pH-værdi på 7,5 indeholdende 20 mM tris og 1 mM EDTA.

2,5 pg ss-cDNA syntetiseres. Til fjernelse af mRNA, som er til stede i denne opløsning, gøres opløsningen 0,33N med hensyn til NaOH ved tilsætning af NaOH, henstilles i 15 timer ved stuetemperatur, neutraliseres med det samme volumen 1M 35 tris-HCl med en pH-værdi på 7,5 og ledes gennem en "Sephadex

O

32 DK 173788 B1 G-50"-søjle.

Der udvindes 1,8 pg cDNA.

(5-2) 50 raM phosphatpuffer (pH-værdi 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,75 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP (dCTP inde- 3 5 holder H-mærket dCTP), 1,8 pg ss-cDNA og 8 enheder polymerase I (BRL, USA) blandes og får lov at reagere i 15 timer ved 15°C. Efter afsluttet omsætning udvindes DNA som ethanolbund-fald efter behandling med phenol og chloroform. Der dannes 1,10 pg ds-cDNA, En blanding af 50 mM natriumacetat (pH-værdi 10 4,5), 0,2 M NaCl, 1 mM ZnCl2 og 1,10 pg ds-cDNA inkuberes i 20 minutter ved 37°C, hvorefter der tilsættes 0,25 enheder nuclease (Sankyo, Japan) og inkuberes yderligere 15 minutter. Efter afsluttet omsætning behandles reaktionsproduktet to gange med phenol og anbringes på "Sephadex G-50", og der fås 15 0,55 pg ds-cDNA.

(5-3) En blanding af 0,14 M kaliumkakodylat, 30 mM tris-base, 0,1 mM DTT, 1 mM C0C12, 0,64 mM 32P-dCTP (spec. akt. 2,7 x 106 cpm/nmol), 0,55 pg ds-cDNA og 5 enheder terminal-transferase (BRL) inkuberes i 7 minutter ved 37°C, behandles med phenol og 20 anbringes på en søjle af "Sephadex G-50", og der fås 0,50 pg DNA som ethanol-bundfald. Det fremstillede DNA viser sig at være forlænget med ca. 50 dCMP-rester ved begge 3’-ender.

10 pg pBR322-DNA spaltes med restriktionsenzym PstI, og til 3'-enderne af det spaltede DNA sættes dGMP-kæde ved den samme 25 metode som anvendt til tilsætning af dCMP til ds-cDNA som beskrevet ovenfor, bortset fra at der anvendes dGTp i stedet for dCTP.

(5-4) En blanding af 50 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,05 pg pBR 322 forlænget med dGMP-rester og 0,01 pg 30 cDNA forlænget med dCMP inkuberes først i 2 minutter ved 65°C, derpå i 120 minutter ved 46°C, i 60 minutter ved 37°C og til slut i 60 minutter ved stuetemperatur. E. coli X 1776 (R. Curtiss III et al., i Molecular Cloning of Recombinant DNA (W.A. Scott & R. Werner ed.), Academic Press (1977)) podes i qc 50 ml L-næringsvæske indeholdende 100 pg/ml diamlnoplmelinsyre,

O

33 DK 173788 B1 50 pg/ml thymidin, 1% tryptophan, 0,5% gærekstrakt, 0,5%

NaCl og 0,1% glucose og dyrkes i rystekultur ved 37°C, indtil kulturvæskens absorption ved 562 nm er ca. O.D. 0,3. Efter afsluttet dyrkning henstilles kulturvæsken i 30 minutter 5 ved 0°C, hvorefter bakteriecellerne fraskilles ved centrifugering og vaskes to gange med 25 ml af en opløsning indeholdende 5 mM tris-HCl (pH-værdi 7,6), 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl^ og 10 mM RbCl.

De således fremkomne celler suspenderes i 200 ml af en opløs-10 ning indeholdende 5 mM tris-HCl (pH-værdi 7,6), 0,25 M KCl, 5 mM MgC^f 0,1 M CaC^ og 10 mM RbCl og henstilles ved 0°C i 25 minutter. Derefter fraskilles cellerne og resuspenderes i 1 ml af den samme opløsning, og det ovenfor beskrevne DNA sættes til 0,1 ml af cellesuspensionen, og suspensionen henstil-15 les ved 0°C i 60 minutter. Derpå sættes 0,7 ml L-næringsvæske til kulturen, og der omrystes i 30 minutter ved 37°C. Det således fremkomne kulturmedium (0,1 ml) spredes grundigt på overfladen af 1,5%'s agarosemediura sammensat af L-næringsvæske indeholdende 100 pg/ml diaminopimelinsyre, 50 pg/ml thymidin og 20 15 pg/ml tetracyclin og inkuberes ved 37°C i 2 dage.

(5-5) 432 fremkomne kolonier opdeles i 18 grupper, der hver indeholder 24 forskellige bakteriekloner, podes i 200 ml L-næringsvæske indeholdende lOO pg/ml diaminopimelinsyre, 50 pg/ml thymidin og 10 pg/ml tetracyclin, og dyrkes i rystekultur ved 25 37°C i 5-7 timer. Derefter tilsættes der 200 ml frisk L-næ ringsvæske indeholdende chloramphenicol til en slutkoncentra-tion på 170 pg/ml og dyrkes videre natten over. Det således forstærkede plasmid-DNA renses på konventionel måde. Kloner indeholdende IL-2-cDNA fraskilles ved en mRNA-hybridiserings-30 -oversættelsesbestemmelse (i det følgende betegnet "H-T-bestem-melse"). Den anvendte H-T-bestemmelse gennemføres på følgende måde:

Renset DNA (25 pg) spaltes med restriktionsenzym Hind III, behandles tre gange med phenol, behandles med phenol-chloroform 35 og med chloroform,udfældes med ethanol, vaskes med 80%'s ethanol

O

34 DK 173788 B1 og opløses i 40 pliter 80%'s formamid.

Reaktionsblandingen opvarmes til denaturering ved 90°C i 5 minutter og fortyndes derefter til 1,3 ml med 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M natriumcitrat). Derpå fikseres DNA'et på 5 nitrocellulosefiltre, og disse tørres ved 80°C i 3 timer og inkuberes i 18 timer ved 37°C i en opløsning indeholdende 50% formamid, 20 mM Pepes med en pH-værdi på 6,5, 0,75 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS og 250 pg poly-(A)-mRNA fra inducerede J-lll-celler til hybridisering af DNA fikseret på filtrene 10 med IL-2-mRNA. Derefter vaskes filtrene 3 gange ved 65°C med en opløsning bestående af 10 mM Pipes med en pH-værdi på 6,5, 0,15 M NaCl, 1 mM Pipes, 10 mM NaCl-opløsning og behandles med 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS-opløsning ved 95°C i 1 minut til udvinding af det hybridiserede mRNA fra filtrene. Det således 15 ekstraherede mRNA renses på en oligo-dT-cellulosesøjle ifølge konventionelle metoder og injiceres i Xenopus-ægceller til bestemmelse af IL-2-aktiviteten af oversatte proteiner. En ud af 18 grupper, der hver især består af 24 kloner, giver positivt 48 enheder/ml af IL-2-aktivitet ved den ovenfor beskrev- 3 20 ne H-TdR-inkorporeringsbestemmelse, medens de andre er klart negative. De 24 enkelte kolonier, der hører til den positive gruppe, podes i 200 ml L-næringsvæske med den samme sammensætning som ovenfor beskrevet, dyrkes aerobt i 5-7 timer ved 37°C, hvorefter der på samme måde tilsættes frisk chloramphenicol-25 holdig L-næringsvæske. Efter forstærkning af plasmid-DNA ved dyrkning natten over, renses plasmid-DNA'et på samme måde ifølge standardprocedurer. Efter spaltning af ca. 5 pg af hvert plasmid med Hind III bindes hvert plasmid-DNA til nitrocellulosefiltre på samme måde. Filtrene hybridiseres med 30 IL-2-mRNA, og det hybridiserede mRNA udvindes og injiceres i Xenopus-ægceller til bestemmelse af IL-2-aktiviteten af oversatte proteiner.

Som vist i tabel 2 giver kun plasmid-DNA renset fra en enkelt koloni, betegnet p3-16, positiv IL-2-aktivitet. Derfor iden-35 tificeres denne klon som klonen, der har IL-2-cDNA (E. coli

O

35 DK 173788 B1 X 1776/p3-16 AJ 11995 (FERM-BP-225) ) . Plasmid-DNA-p3-16 bekræftes således netop at indeholde det DNA (IL-2-gen), der er i stand til at danne den specifikke hybrid med IL-2-mRNA.

5 Tabel 2 (a)

Optagelse af Mængde af IL-2 Prøve Fortynding ^H-TdR (cpm) (enheder/ml) kontrol I - 2.010 0 (medium til bestemmelse) 10 kontrol II x 2 2.120 (ovenstående x 32 2.482 0 væske fra ægkultur, ubehandlet)

Oversættelses- x 2 20.453 58 15 produkt af mRNA x 32 20.961

Tabel 2 (b)

Antal T-lymfocyt- Mængde af IL-2

Prøve Fortynding celler (celler/hul) (enheder/ml)

20 kontrol I - O O

(medium til bestemmelse)

kontrol II x 2 O O

(ovenstående x 32 væske fra æg-25 kultur, ube handlet) oversættelses- _ __ , , . „ x 2 88 32 ET 31 * 32 x) mRNA hybridiseret med cDNA fra plasmid p3-16.

30 cDNA-indsatsen af plasmid p3-16 udviser de karakteristiske egenskaber, at den spaltes af restriktionsenzym Xbal på et enkelt sted af BstNI på to steder (ovenfor og nedenfor 35 Xbal-spaltningsstedet). Imidlertid indeholder plasmidet p3-

O

36 DK 173788 B1 -16 en cDNA-indsats bestående af ca. 650 basepar, hvilket tilsyneladende svarer til en del af IL-2-mENA med en størrelse på 11-12S.

Derfor fremstilles der et andet cDNA-udvalg ("library") 5 ved proceduren ifølge Land et al, Nucleic Acids Res. 9, 2551 (1981), ved anvendelse af IL-2-mRNA som "template". Enkelt-strenget cDBA (1,6 pg) syntetiseres ved anvendelse af 4 pg

Il-2-mRNA forlænget med dCMP-rester, og ds-cDNA syntetiseres ved anvendelse af oligo-(dG) 12-18 som Pr^-mer f°r ONA-polyme-10 rase I (Klenowf ragment )Λ cDNA'et (0,6 pg) , der er større end DNA-størrelsesmatkøren på 680 basepar, fås ved en saccharose-gradientcentrifugering og indføjes i Pstl-sædet af pBR322 ved standard-G-C-haledannelsesmetoden. Efter omdannelse af E. coli X 1776 med det rekombinante DNA undersøges ca. 2.000 kolonier 15 ved in situ-hybridiseringsmetoden ifølge Grunstein-Hogness med "nick"-oversat p3-16-cDNA-indsats som prøve, og kolonien indeholdende plasmid pIL2-50A med ca. 850 basepar og den omdannede klon (E. coli X 1776/pIL2-50A, AJ 11996 (FERM-BP-226)) identificeres. Et restriktionsendonuclease-spaltningsdiagram for 20 cDNA-indsatsen af pIL2-50A er vist i fig. 1.

Til isolering af et gen, der koder IL-2-peptid, fra omdannet E. coli X 1776 pIL2-50A behandles plasmid-DNA med restriktionsenzym PstI efter isolering af DNA-området fra cellerne ifølge gængse metoder. Det således fremkomne mindre frag-25 ment blandt to fremkomne DNA-fragmenter er DNA-genet, der koder IL-2-peptid. Den komplette nucleotidsekvens af Pstl-ind-satsen fra pIL2-50A er bestemt ved proceduren ifølge Maxam og Gilbert (A.W. Maxam et al., Enzym. 65_, 499-560 (1980)), og hele strukturen er vist i fig. 2.

30

Eksempel 2.

Plasmidet pKCR (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 7_8, nr. 3, 1527-1531 (1981)) består af (i) segmenter af SV40-DNA (vist som skraverede blokke i fig. 3) indeholdende O r en tidlig gen-promotor og en replikationsbegyndelse (0,725-

O

37 DK 173788 B1 -0,648 m.u.) og et polyadenyleringssæde fra det tidlige gen (0,169-0,144 m.u.), (ii) en del af kanin-3-globin-genet (vist som åbne blokke) (BamHI-PvuII-fragment), (iii) et segment af pBR322 (EcoRI-BamHI-fragment) indeholdende en replikationsbe-5 gyndelse og et ampicillinresistens-gen. Dette plasmid spaltes med BamHI, og efter udfyldning af begge ender af det spaltede DNA med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) indføres et syntetisk Pstl-forbindelses-DNA til konstruktion af pKCR (PstI). Plasmidet pKCR (PstI) spaltes med Sall, behandles med Klenow-10 fragment til udfyldning af enderne og spaltes derefter delvis med EcoRI til opnåelse af EcoRI-SalI-fragment, der indeholder hele DNA'et afledt af SV40 og globin-genet. Dette fragment sammenkobles derefter med et stykke af pBR328-DNA, der indeholder et tetracyclinresistens-gen og en replikationsbegyndelse 15 som skitseret i fig. 3. Det resulterende plasmid pCE-1 indeholder et enkelt Pstl-sæde lige nedenfor den tidligere promotor af SV40.

cDNA-indsatsen af pIL 2-50A fjernes ved Pstl-spaltning og sammenkobles med Pstl-spaltet pCE-1 til konstruktion af 20 pCEIL-2, hvori udtrykningen af IL-2-struktur-genet vil være under kontrol af den tidlige promoter i SV40. Plasmidet pCE-1 blev oprindelig konstrueret til cDNA-kloning ved G-C-haledan-nelsesmetoden (A.C.Y. Chang et al., Nature 275, 617-624 (1978)) i bakterier og direkte udtrykning i pattedyrceller.

25 Dette plasmid spaltes med Hhal og indføres derefter ved DNA-overføring (McCutchan et al., J. Natl. Cancer Inst. 41, 351-357 (1968)) i den omdannede abecellelinie COS-7, der muliggør replikation af DNA-holdige SV40-begyndelses-sekvenser og kan fås ifølge Y. Gluzman, Cell 2Z_, 175-182 (1981) . Det synes 30 at være vigtigt at behandle plasmidet med Hhal før overføringen for at opnå en effektiv udtrykning af cDNA, idet sekvenser, der kan genere replikationen af det overførte DNA i COS-celler, kan fjernes fra den væsentlige del af plasmidet til cDNA-ud— trykning ved denne procedure. C0S-7-celler (6 x 10 /ml) sus-35 penderes i 0,5 ml DMEM indeholdende 5% FCS i en 24 hullers

O

38 DK 173788 B1 kulturplade (Nunc) og inkuberes i 4 timer ved 37°C. Derefter sættes en blanding af 1 pg af den ovenfor beskrevne vektor, 17,6 pliter 1 mM tris-HCl indeholdende 0,1 mM EDTA, 2,4 pli-ter 2 M CaCl2 og 120 pliter af 2 x HBS indeholdende 50 mM 5 Pipes, 280 mM NaCl og 1,5 mM Na2HP0^, 12^0 (pH-værdi 7,10) til de dyrkede celler. Cellerne inkuberes yderligere 4 timer ved 37°C, og kulturmediet frasuges og vaskes med 1 ml PBS, hvorefter der tilsættes 0,5 ml PBS indeholdende 20% glycerol og henstilles ved stuetemperatur i 3 minutter. Mediet frasu-10 ges igen, og cellerne vaskes med 1 ml PBS og dyrkes i 1 ml DMEM indeholdende 5% FCS. Hver 24. time udskiftes 500 pliter af mediet med frisk medium. Hvert medium, der opsamles med de pågældende intervaller, holdes ved 4°C indtil anvendelsen.

To til tre dage efter overføringen undersøges det dyrkede 15 cellemedium for human IL-2-aktivitet. Som vist i tabel 3 indeholder den fremkomne ovenstående kulturvæske af C0S-7-cel-ler, hvortil der er overført pCEIL-2, IL-2-aktivitet. Der kan ikke påvises IL-2-aktivitet i kulturmedier af celler, hvortil der er overført pCE-1.

20

Tabel 3 IL-2-aktivitet målt ved ^H-TdR-optagelse Vækst af T-lymfo-Overført med DNA (enheder/ml)_ _cyter_ pCEIL-2 12 ++++

OZ

pCE-1 1 IL-2-aktiviteten, der findes i cellekulturmediet efter overføring af pCEIL-2 til COS-7, neutraliseres fra 12 enheder/ml til under 1 enhed/ml med anti-humant IL-2 monoklo-30 nalt antistof fra mus (BALB/c) . At C0S-7-celler, hvortil der er overført pCEIL-2, udskiller humant IL-2, viser klart, at eukaryotiske celler omdannet med et rekombinant DNA indeholdende et gen, der koder IL-2-polypeptid, og et vektor-DNA, der er i stand til replikation i de nævnte celler, netop kan 35 være anvendeligt til produktion af IL-2.

O

39 DK 173788 B1

Plasmidet pCEIL-2 (AJ 12008) inkorporeret i E. coli HB101 er blevet deponeret under nummer FERM-BP-244.

Eksempel 3.

5 E. coli X 1776/PIL2-50A (AJ 11996 (FERM-BP-226)) frem stillet ifølge eksempel 1 podes i 250 ml L-næringsvæske indeholdende 100 pg/ml diaminopimelinsyre, 50 pg/ml thymidin, 1% tryptophan, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCl og 0,1% glucose og dyrkes i rystekultur ved 37°C, indtil kulturmediets optiske 10 tæthed ved 562 nm er 0,5. Efter afsluttet dyrkning henstilles det dyrkede medium ved 0°C i 30 minutter, og cellerne høstes ved centrifugering, vaskes én gang med 20 mM tris-HCl indeholdende 30 mM NaCl og resuspenderes i 1,8 ml af den samme puffer. En opløsning indeholdende 0,2 pliter lysozym (10 mg/ml) 15 og 20 pliter 0,5 M EDTA sættes derefter til cellerne, og blandingen henstilles ved 0°C i 20 minutter, hvorpå den frysés/op-tøs tre gange. En ekstrakt af cellerne (1,5 ml) fås efter centrifugering ved 40.000 o/m i 30 minutter. Ekstrakten udsaltes med 85% ammoniumsulfat, anbringes på "Sephadex G15" til fjer-20 nelse af salte og underkastes derefter DEAE-cellulose-søjle- chromatografi, og fraktionerne elueret med 0,06 M tris-HCl-puf-fer (pH-værdi 7,6) forenes. De således forenede fraktioner frysetørres og chromatograferes på glasperler med kontrolleret porestørrelse (250 Å, Funakoshi Pharmaceuticals, Japan), og 25 der fås IL-2-aktivitet i eluatet med 0,3 M glycin-HCl-puffer, idet den IL-2-holdige fraktion har en IL-2-aktivitet på 12 en-heder/ml. Resultaterne viser klart, at E. coli X 1776/pIL2-50A, AJ 11996, faktisk producerer IL-2.

30 Eksempel 4.

Den konstitutivt IL-2-producerende cellelinie J-A1886 (ATCC CRL-8130) klonet fra Jurkatceller som beskrevet i eksempel 1, dyrkes på lignende måde i rullekuturkolber. De dyrkede celler resuspenderes i frisk syntetisk medium RITC-55-9 ved 35 en begyndelses-celledensitet på 1 x 106 celler/ml, og 8 timer 9 DK 173788 B1 40

O

efter dyrkningens start anvendes cellerne (3 x 10 celler) til ekstraktion af IL-2-mRNA som ll-12s-fraktion ifølge de i eksempel 1 beskrevne trin.

Dobbeltstrenget cDNA syntetiseres på lignende måde 5 som i eksempel 1, og cDNA’et, som er længere end 600 basepar, (2,4 pg) fås efter fraktionering på en saccharosedensi-tetsgradient. cDNA'et forlænges derefter med dCMP-rester under anvendelse af terminal deoxynucleotidyl-transferase, og en portion (50 ng) behandles med 250 ng af dGMP-forlænget, 10 Pstl-spaltet pBR322. De fremkomne hybride plasmider anvendes til omdannelse af E. coli X 1776, og der fås ca. 4.000 kloner af omdannede celler. Ifølge Grunstein-Hogness-metoden udvælges 3 kloner, der er komplementære med plasmid 3-16-cDNA anvendt som prøve. De således udvalgte kloner er omdannede klo-15 ner, der har humant IL-2-gen.

Eksempel 5.

Et plasmid, der vil styre syntesen af humant IL-2 i E. coli, konstrueres på følgende måde. Et plasmid pTIL2-22 20 konstrueres ud fra pTrS-3 (T. Nishi, T. Taniguchi et al., SEIKAGAKU 53, 967 (1981)) og pIL-2-50A indeholdende IL-2-cDNA ved en række af modifikationsprocedurer som illustreret i fig. 5(a). Plasmidet pTrS-3 indeholder en indsats af området af Trp-promoter og Shine Dalgarno (i det følgende betegnet 25 "SD") mellem EcoRI-sædet og Clal-sædet i pBR322. Plasmidet indeholder også et ATG-initieringskodon 13 bp nedenfor SD--sekvensen samt et enkelt SphI-sæde som illustreret i fig. 4. Vektoren er meget effektiv til at producere det nævnte protein, når DNA-sekvensen svarende til det nævnte protein indføjes i 30 fase lige nedenfor ATG-kodonet, hvilket sker ved Sphl-behand-ling og påfølgende behandling med T4-DNA-polymerase af pTrS-3. Derfor spaltes plasmidet pTrS-3 (30 jig) med restriktionsenzymet Sphl på konventionel måde, og efter udvinding af ethanol-præcipitater efter successiv behandling med phenol og chloro-35 form gøres begge ender flygtende ved behandling med T4-DNA-

O

41 DK 173788 B1 -polymerase. Derefter udvindes DNA'et (21,4 pg) ved lignende successiv behandling med phenol og chloroform og udfældning med ethanol. På den anden side spaltes 380 pg pIL2-50A indeholdende et IL-2-cDNA med PstI, og IL-2-cDNA-indsatsen isole-5 res ved agarosegel-elektroforese. cDNA-indsatsen (11 pg) spaltes med HgiAI, behandles med HgiAI, behandles med T4-DNA-poly-merase, og 10 pg af DNA'et med den største størrelse isoleres ved agarosegel-elektroforese. Herved fås et cDNA (7,2 pg), der koder 132 aminosyrer, og dette DNA-fragment har stumpe ender 10 (fig. 5(a)). Derefter sammenkobles det således fremkomne cDNA--fragment med en pTrS-3-vektor, der i forvejen er spaltet med Sphl og behandlet med T4-DNA-polymerase lige nedenfor ATG-se-kvensen. Det således sammenkoblede plasmid anvendes derpå til omdannelse i E. coli HBlOl ifølge konventionelle procedurer.

15 Sammenkoblingen gennemføres på følgende måde. 0,4 pg IL-2- -cDNA (største fragment) og 0,2 pg pTrS-3-vektor-DNA blandes med 0,8 enheder T4-DNA-ligase i 66 mM tris-HCl med en pH-værdi på 7,5 indeholdende 6,6 mM MgCl2, 1 mM ATP og 10 mM DTT, og blandingen får lov at reagere ved 4°C natten over. Blandt de 20 omdannede celler, der viser sig på L-næringsagarplader indeholdende ampicillin, udvælges kolonier indeholdende IL-2--cDNA-delen, der koder 132 aminosyrer, ved in situ-koloni-hy-bridiseringsbestemmelse. De således udvalgte kolonier dyrkes (10 ml) igen til fremstilling af plasmid-DNA ved lysozymbe-25 handling og frysning/optøning. Plasmid-DNA'erne spaltes med PstI og Xbal, og de fremkomne produkter analyseres ved agarosegel-elektroforese til identifikation af pTlL2-22, hvori cDNA'et er bundet til ATG-sekvensen i pTrS-3 i korrekt orientering. E. coli HBlOl indeholdende pTIL-2-22 dyrkes under kon-30 ventionelle betingelser, der er kendte til formering af mikroorganismer. Cellerne dyrkes i 10 ml X-næringsvæske (2,5% Bac-totrypton, 1,0% gærekstrakt, 0,1% glucose, 20 mM MgSO^, 50 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5) indeholdende 25 pg/ml streptomycin og 25 pg ampicillin ved 37°C natten over. 1 ml af kultursuspen-35 sionen podes i den samme X-næringsvæske (100 ml) og dyrkes

O

42 DK 173788 B1 ved 37°C. Når den optiske tæthed ved 650 nm er ca. 1,5-2,0, tilsættes der 3-indol-acrylsyre (IAA). 3 Timer efter tilsætningen af induceringsmiddel opsamles cellerne, vaskes med 20 mM tris-HCl (pH-værdi 7,5, 30 mM NaCl) og resuspenderes 5 i 8 ml af den samme puffer. Til effektiv funktion af Trp--promotoren tilsættes induceringsmidler, såsom IAA, til en slutkoncentration på 50 pg/ml. De i bakteriecellerne producerede proteiner ekstraheres ved behandling med ultralyd (0°C, 2 minutter) eller med lysozym (8 pg) (0°C, 20 minutter) 10 efterfulgt af tre på hinanden følgende frysning/optøning-be-handlinger. Ifølge denne procedure ekstraheres IL-2 sædvanligvis fra organismer. Den ekstraherede IL-2-aktivitet ligger i området fra 10.000 til 120.000 enheder/ml.

E. coli HB 101 indeholdende pTIL2-22 (AJ 12009) er de-15 poneret under nummer FERM-BP-245.

Eksempel 6.

Et plasmid pTuIL 2-22 indeholdende IL-2-cDNA konstrueres ud fra pTuBlP-5 (T. Tanaguchi et al., Seikagaku 53, 966, 20 1981) og pTIL 2-22 ifølge eksempel 5 ved procedurerne illustre ret i fig. 7. Plasmidet pTuBlP-5 indeholder en indsats af promotor-sekvensen for tufB i pBR322. Plasmidet indeholder også et enkelt Clal-sæde, og dette er placeret 2 bp nedenfor SD-sekven-sen som vist i fig. 7. Da pTrS-3 også indeholder et Clal-sæde 25 mellem SD-sekvensen og ATG-initieringskodonet, og da dette

Clal-sæde ikke ødelægges under konstruktionen af udtryknings-plasmidet ved anvendelse af pTrS-3 og IL-2-cDNA som beskrevet i eksempel 5, er det meget enkelt at erstatte den bakterielle trp--promoter med tufB-promoter, således at IL-2-cDNA’et udtrykkes 30 under kontrol af tufB-promoter.

Derfor spaltes plasmidet pTIL 2-22 (30 pg) med restriktionsenzym Clal og PvuII på konventionel måde. Fragmentet (ca.

2,2 kb) indeholdende IL-2-cDNA isoleres og renses ved agarose-gel-elektroforese, hvorved der fås 3 pg DNA. På den anden side 35 spaltes 20 pg pTuBIP-5-vektor på lignende måde med Clal og

O

43 DK 173788 B1

PvuII, og det største fragment (ca. 3,4 kb) indeholdende am-picillinresistens-gen isoleres og renses ved agarosegelelek-troforese, hvorved der fås 3,5 jig DNA. Derefter sammenkobles de på denne måde fremkomne to fragmenter, hvor det ene (ca.

5 3,4 kb) indeholder tufB-promoter, og det andet (ca. 2,2 kb) indeholder IL-2-cDNA, på følgende måde. Fragmentet indeholdende IL-2-cDNA (1,2 jig) og 0,3 jag af fragmentet indeholdende tufB-promoter blandes med 0,8 enheder T4-DNA-ligase i 66 mM tris-HCl med en pH-værdi på 7,5 indeholdende 6,6 mM 10 MgCl2, l.mM ATP og 10 mM DTT, og blandingen får lov at reagere ved 4°C natten over. Det således sammenkoblede plasmid anvendes derefter til omdannelse i E. coli HB101 ifølge konventionelle procedurer. Blandt de omdannede celler, der viser sig på L-næringsagarplader indeholdende ampicillin, udvælges 8 ko-15 lonier indeholdende IL-2-cDNA-delen såsom pTuIL 2-22 i fig.

7, og der fremstilles plasmid-DNA som beskrevet i eksempel 5.

E. coli HB 101 indeholdende pTuIL 2-22 dyrkes i L-næringsvæ-ske (100 ml) ved 37°C. Når den optiske tæthed ved 650 nm er ca. 0,5-1,0, opsamles bakteriecellerne, vaskes med 20 mM tris-20 -HC1 (pH-værdi 7,5, 30 mM NaCl) og resuspenderes i 2 ml af den samme puffer. De således producerede proteiner ekstraheres på lignende måde som i eksempel 5. Den ekstraherede IL-2-aktivi-tet er fra 6.000 til 56.000 enheder/ml.

E. coli HB101 indeholdende pTuIL 2-22 (AJ 12010) er 25 deponeret under nummer FERM-BP-246.

Eksempel 7.

Et plasmid pGIL 2-22 indeholdende IL-2-cDNA konstrue-30 res ud fra pGL 101 (T.M. Roberts og G.D. Laucer, Meth. Enzym.

68, 473-483 (1979)) og pTIL 2-22 ifølge eksempel 5.

Plasmidet pGL 101 (20 jig) indeholdende en lac -promotor spaltes med restriktionsenzym PvuII på konventionel måde, hvorved der fås 17 jig DNA ved successiv behandling med phenol 35 og chloroform og udfældning med ethanol. På den anden side

O

DK 173788 B1 44 spaltes pTIL 2-22 (75 pg) med Clal og Sall, hvorved der fås 2,2 jag af et DNA-fragment indeholdende IL-2-cDNA ved agarose--gel-elektroforese. Fragmentet gøres flugtende ved behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment), og derefter sammenkob-5 les de to således fremkomne fragmenter (0,25 og 0,66 jag) med 1.0 enheder T4-DNA-ligase på samme måde som i eksempel 6. Det således sammenkoblede plasmid anvendes til omdannelse af E. coli HB101 på konventionel måde. Blandt de omdannede celler udvælges de celler, der har en indsats af Clal-Sall-frag-10 ment indeholdende IL-2-cDNA som prøve. Disse omdannede celler dyrkes derefter i X-næringsvæske (10 ml) indeholdende 25 pg/ml af ampicillin, og plasmid-DNÅ1 et fremstilles som beskrevet i eksempel 5. Således fås plasmid-DNA'et med ATG-initieringsse-kvensen af IL-2-cDNA lige neden for en lac-promotor ved spalt-15 ning med PstI og Xbal.

Det således fremstillede pGIL 2-22 podes i 100 ml L-næ-ringsvæske indeholdende 25 pg/ml af ampicillin og 25 yg/ml af streptomycin og dyrkes. Når den optiske tæthed ved 650 nm er ca. 0,5, tilsættes der isopropyl-3-D-thiogalactopyranosid 20 * (IPTG) i en koncentration på 1 mM, og 1 time senere opsamles bakteriecellerne, og der fremstilles celleekstrakter som beskrevet i eksempel 6. Den ekstraherede IL-2-aktivitet er fra 6.000 til 80.000 enheder/ml.

E. coli HB101 indeholdende pGIL 2-22 (AJ 12011) er de- 25 , poneret under nummer FERI4-BP-24 7 .

Eksempel 8.

30 Plasmid pTrS-3 (10 jig) spaltes først med restriktionsenzym Sall, og Sall-sædet gøres flugtende ved behandling med DNA-polymerase (Klenow-fragment). Efter spaltning med Clal isoleres det største fragment indeholdende trp-promoter-området ved agarosegelelektroforese på konventionel måde, hvorved der 35 fås 3 jag DNA.

DK 173788 B1 45 o På den anden side spaltes 11 pg cDNA-indsats, opnået ved Pstl-spaltning af pIL2-50A med HgiAI, og behandles med T4-DNA-polymerase, og det største fragment isoleres og ren-ses ved agarosegelelektroforese. På denne måde fås et cDNA--fragment, der koder 132 aminosyrer i IL-2, i en mængde på 5 7,2 jig. Derpå sammenkobles 0,45 pg af fragmentet indeholden de en trp-promoter (beskrevet ovenfor), 0,5 pg HgiAl-Pstl-“fragment indeholdende IL-2-cDNA og syntetiske oligonucleotider (5·)CGATAAGCTATGGCA(3') og (3')TATTCGATACCGT(5 *) (20 pmol af hver), som begge er phosphoryleret ved 5'-enden, med 1 en-10 hed T4-DNA-ligase på samme måde som beskrevet i eksempel 5 (fig. 5(b)).

Det således sammenkoblede plasmid anvendes derpå til omdannelse af E. coli HB101. Blandt de fremkomne omdannede celler udvælges de ønskede omdannede celler på følgende måde. is Kandidaterne blandt de omdannede celler for hybridise- ring med både IL-2-cDNA og syntetiske nucleotider udvælges først ved en kolonihybridiseringsmetode, og derefter udvælges de omdannede celler, der har en indsats af DNA-fragment, som starter fra CCT-sekvensen ved position 111-113 i fig. 2(a) 20 (CCTACT-----) lige nedenfor ATG-GCA-sekvensen, ved Pstl-Xbal- -spaltning.

De ovenfor anførte, omdannede celler, der indeholder pTIL 2-21a eller pTlL 2-21b, dyrkes i L-næringsvæske på samme måde som i eksempel 5, og høje aktiviteter af IL-2 kan fin-25 des i celleekstrakter af de omdannede celler ved bestemmelse på den i eksempel 5 anførte måde.

E. coli HBlOl indeholdende pTIL 2-21a (AJ 12013) og E. coli HBlOl indeholdende pTIL 2-21b (AJ 12014) er deponeret under nummer FERM-BP-248 og FERM-BP-249.

30 Værtsorganismerne E. coli X 1776 og HBlOl (H.W. Boyer et al., J. Mol. Biol. 41, 459 (1969)), der er anvendt i de ovenfor anførte eksempler, er kendte og offentligt tilgængelige. Desuden kan værtsorganismerne fås ud fra de deponerede omdannede organismer ved dyrkning af de omdannede organismer 35 i L-næringsvæske ved 37°C, således at de respektive rekombi-

O

DK 173788 B1 46 nante DNA'er i de omdannede organismer frigøres, og fraskil-lelse af stammer, der bliver følsomme for tetracyclin og am-picillin, som værtsorganismer.

Plasmidvektorerne pBR322 (der forhandles kommercielt 5 af f.eks. Bethesda Research Laboratory), pCE-1, pTrS-3 og pGLlOl er kendte og offentligt tilgængelige. Desuden kan plasmidvektorerne fås ud fra de deponerede omdannede organismer ved fraskillelse af de rekombinante plasmid-DNA'er i de omdannede organismer på konventionel måde og ved fraskillelse 10 af plasmidvektorerne på de måder, der vil være indlysende på baggrund af, hvad der er beskrevet i de respektive eksempler. For eksempel kan pCE-1 fås ved behandling af pCEIL-2 med PstI og fraskillelse af det største dannede fragment. Desuden er pTrS-3 og pTuBlP-5 blevet deponeret som E. coli FERM-P 15 6735 og E. coli ATCC 31971.

20 25 30 35

Claims (25)

1. DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, som har human interleukin-2-aktivitet, hvor polypeptidet er valgt blandt følgende: 5 a) et polypeptid, som har følgende aminosyresekvens: Het-TyfArg-Met'Gln-,l.eu-t.eu-S«r'Cys''Il«-Ali-leu-S€r-Leu“ 20 Ali-t*u-v«l-Thr-Ain-$«r-Al»-Pro~Thr-Ser-Ser-$er-Thr-lys- Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu-Hls-Leu-Leu-leu-Asp-leu-Gln- #1tt-It«-t.eu-A*n-eiy-It*-Asn-Asn-Tyr-Ly*-Ain-Pro-Lys-Leu- Thr-Ar9-Het-Leu-Thr-Ph«-Ly*-Phe*Tyr-Het-Pro-Ly»-Lys-Al·- ThP“Glu-Leu-Lyi-Hi*-Leu-GLn-CysM.eu-Glu-5lu-5Lu“l.eu-l.ys- Pre*leu-Glu-Glu-V»l-L«u-Asn-Leu-Al»-Gln-$er-ly**Asn-Ph«- Kii-t«u-Arj“PP0-Ar9-Asp-Ueu'Ke-S*p-A*iv'ne-AsPi-V»l-Il«” Val*Leu-GLu-teu-l.y*-GLy-Ser-Glu*ThP-Thr-Phe-Met-Cys-eiu-

2. DNA-fragment omfattende en DNA-sekvens, som koder for et 30 polypeptid, som har human interleukin-2-aktivitet, hvor polypeptidet, som der kodes for, er valgt blandt a) et polypeptid, som har følgende aminosyresekvens: 35 DK 173788 B1 48 X-Thr-Sir-Ser-Ser-Thr-L.ys-Lys-Thr-Gln-teu-Gln-l.eu-Glu-Kii'Leu-'Leu-Ltu-Aip-Leu-GLn-Met-H.e-Leu-Ajn-Gl.y-Ili-Ain-Asn-Tyr-lys-Ain-Pro-Ly*-Leu*Thr-Arg-Het-l.eu*Thr-Phe-t.ys-Phe-Tyr-Mit-Pro-Ly»-tys-Ali-ThP-Glu-L«u-Ly*-Hii-teu-GlPi-5 Cy*-Leu-Glu-Glu-Glu-t-eu-Lys-Pro-leu-Gt.u-Gl.u-VAl-i.eu-A*n- l.eu-Al»-Gln-S«r-Ly*-A*n-Phe-Hi*-Leu-Arg-Pro-Are-Atp-l.eu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-V*l-IVe-V*l-Leu-Glu-Leu-Lyj-Gly-S«r-Glu-Thp-Thr-Ph«*Met-Cyi-Glu*Tyr-Al*-Asp-Glu'Thr'ALi-Thr-Ile-VAL-Glu-Phe-Leu-Ajn-Arg-Trp-Ile-Thr-Phe-Cyi-GLn-Ser-Ile-Ile-Ser-Thr-Leu-Thr, 10 hvori X betyder Ala-Pro, Pro, Met-Ala-Pro eller Met-Pro, b) et polypeptid, som er et allelisk derivat af polypeptidet a) , c) et fusionspolypeptid omfattende et polypeptid ifølge a), 15 hvori de additivt forbundne aminosyrer ikke interfererer med den biologiske aktivitet eller let kan elimineres.

3. DNA-fragment ifølge krav 1 eller 2, som har sæder, der spaltes med restriktionsendonucleaser i rækkefølgen Bst NI,

4. DNA-fragment ifølge krav 1 eller 2, som har sæder, der spaltes med restriktionsendonucleaser i rækkefølgen Dde I, Hinf I, Bst NI, Xba I, Bst NI og Sau 3A fra 5’-enden af den 25 kodende sekvens.

5. DNA-fragment ifølge krav 1, hvis basesekvens starter fra A ved position 1 og har rækken af baser op til mindst ACT-sekvensen ved position 504-506 i fig. 2(a). 30

6. DNA-fragment ifølge krav 1, hvis basesekvens starter fra ATG-sekvensen ved position 48-50 og har rækken af baser, der følger efter ATG-sekvensen, op til mindst ACT-sekvensen ved position 504-506 i fig. 2(a). 35

7. DNA-fragment ifølge krav 1, hvis basesekvens starter fra GCA-sekvensen ved position 108-110 og har rækken af baser, der følger efter GCA-sekvensen, op til mindst ACT-sekvensen ved position 504-506 i fig. 2(a). 49 DK 173788 B1

8. DNA-fragment ifølge krav 1, hvis basesekvens starter fra CCT-sekvensen ved position 111-113 og har rækken af baser, der følger efter CCT-sekvensen, op til mindst ACT-sekvensen ved position 504-506 i fig. 2(a).

9. DNA-fragment ifølge ethvert af kravene 5-8, hvori basese kvensen ender ved ACT-sekvensen ved position 504-506 i fig. 2(a) .

10. DNA-fragment ifølge ethvert af kravene 5-8, hvori base-15 sekvensen ender ved TGA-sekvensen ved position 507-509 i fig. 2(a).

11. DNA-fragment ifølge ethvert af kravene 5-8, hvori basesekvensen ender ved C ved position 801 i fig. 2(a). 20

12. DNA-fragment ifølge ethvert af kravene 5-8, hvori basesekvensen ender ved poly- (A) i fig. 2(a).

13. DNA-fragment ifølge krav 1, som har basesekvensen vist 25 i fig. 2(a).

14. Rekombinant fremstillet DNA, som omfatter et DNA-fragment ifølge et af kravene 1-13 i et vektor-DNA, der er i stand til at replikere i en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, 30 hvorved den kodende DNA-sekvens er placeret i en position nedenfor en promotor-sekvens.

15. Rekombinant DNA ifølge krav 14, hvor den prokaryotiske cellelinie tilhører slægten Escherichia, fortrinsvis Es-35 cherichia coli. DK 173788 B1 50

15 Tyr-Ala-Asp-Glu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-leu-Asn-Arg- 153 Trp-Ile-Thr-Phe~Cy*-Gln-Ser-Ile-It.e-Ser*Thr-leu-Thr b) et polypeptid, som i forhold til a) mangler en eller flere aminosyrer, 20 c) et polypeptid, hvori, i forhold til a) , en eller flere aminosyrer er erstattet, d) et fusionspolypeptid omfattende et polypeptid ifølge a), b) eller c) , hvori de additivt forbundne aminosyrer ikke interfererer med den biologiske interleukin-2-aktivitet 25 eller let kan elimineres, e) et polypeptid, som er et allelisk derivat af et polypeptid ifølge a).

16. Rekombinant DNA ifølge krav 14, hvor den eukaryotiske cellelinie tilhører slægten Saccharomyces, fortrinsvis Sac-charomyces cerevisiae.

17. Rekombinant DNA ifølge krav 14, hvor den eukaryotiske cellelinie er en abecelle transformeret med SV-40, der kon-stitutivt eksprimerer stort T-antigen.

18. Rekombinant fremstillet DNA ifølge ethvert af kravene 10 14-16, som i en passende værtsorganisme er i stand til at eksprimere cDNA-delen, som koder for modent humant inter-leukin-2-peptid, men ikke delen svarende til signalsekvensen.

19. Eukaryotisk eller prokaryotisk celle transformeret med 15 et rekombinant DNA ifølge ethvert af kravene 14-16 eller 18.

20. Celle ifølge krav 19, hvor den prokaryotiske celle tilhører slægten Escherichia, fortrinsvis Escherichia coli, som er transformeret med det rekombinante DNA ifølge krav 20 14 eller 15 eller 18.

20 Xba I og Bst NI fra 5’-enden af den kodende sekvens.

21. Celle ifølge krav 19, hvor den eukaryotiske celle tilhører slægten Saccharomyces, fortrinsvis Saccharomyces cerevisiae, som er transformeret med det rekombinante DNA ifølge 25 krav 14 eller 16 eller 18.

22. Celle ifølge krav 19, hvor den eukaryotiske celle er en pattedyrcelle.

23. Celle ifølge krav 22, hvor pattedyrcellen er en abecelle transformeret med SV-40, som konstitutivt eksprimerer stort T-antigen.

24. Fremgangsmåde til fremstilling af humant interleukin-2, 35 som omfatter dyrkning i et kulturmedium af en eukaryotisk eller prokaryotisk celle transformeret med et rekombinant DK 173788 B1 51 DNA til produktion af interleukin-2 og udvinding af det producerede interleukin-2, hvor det rekombinante DNA omfatter et DNA-fragment ifølge ethvert af kravene 1-13 i et vektor-DNA som er i stand til at replikere i cellen, og hvorved 5 den kodende sekvens af DNA-fragmentet er placeret i en position neden for en promotorsekvens.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, kendetegnet ved, at den eukaryotiske eller prokaryotiske celle transfor-10 meret med et rekombinant DNA til fremstilling af interleukin-2 er en celle eller en cellelinie ifølge ethvert af kravene 19-23.