JPS59140878A - 組換え体微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換え体微生物に関し、詳しくはヒトインター
：ロイキン２生産能を有するエシェリヒア・コリに関す
る。

エシェリヒア・コリは組換えＤＮＡ　（デオキシリボ核
酸）実験の材料として良く用いられており、ヒトインタ
ーフェロンなどの有用物質の生産に関しても、エシェリ
ヒア・コリによる生産が提案されている。

一方、リンパ球が産生ずる生物活性、薬理活性のある可
溶性の蛋白性因子であるリンホカインは生体内にお℃ζ
て微量で生体の免疫応答機構を調節する作用を有してい
る。リンホカインは、その免疫活性物質としての性格よ
り汎く抗腫瘍剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、免疫不全症治
療剤、自己免疫疾患治療剤としての有用性が期待されて
いる（Ａｄｖ、ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、、　５
０７．１９８０　）。とりわけ、インターロイキン２は
その特異な免疫応答作用から医薬全の応用が注目され、
ヒトインターロイキン２を産生ずるヒ）Ｔ白血病細胞株
が見出されたことが報告されている（ギリスら、Ｊ、　
ＥＸｐ。

Ｍｅｄ、、　１５２巻、１７０９頁、１９８０年）。

しかし、このヒトＴ白血病細胞株によるヒトインターロ
イキン２の生産量は極めて微量であり、しかもその生産
手段は大量細胞培養技術を含み非常に複雑である。ヒト
インターロイキン２を製造するための他の方法としては
、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物の
ベクターに組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せ
しめて微生物により生産させることが考えられる。しか
しながら、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮＡは
クローンされていないので、この方法を実施することは
できない。

本発明者らは、ヒトインターロイキン２の生物学的作用
、生産方法などについて研究を重ねてきたが、その過程
においてヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイキ
ン２に対応するメツセンジャーＲＮＡ　（リボ核酸）（
以下、ｍＲＮＡと略称する。）を抽出することに成功し
、このｍ１４ＮＡからこれに対応するＤＮＡを調製する
ことに成功した。さらに、このようにして得たＤＮＡを
微生物細胞内で発現することによって目的とするヒトイ
ンターロイキン２を製造できることを見出した。

すなわち本発明は、インターロイキン２活性を持つポリ
ペプチドをコードしうる遺伝子が接続されているレプリ
コンを有する組換え体徽生物を提供するものである。こ
こでインターロイキン２としてはヒトインターロイキン
２があり、インターロイキン２活性を持つポリペプチド
をコードしうる遺伝子としてはショ糖密度勾配遠心法に
よる分画により１１〜１２Ｓ画分として得られ、ヒトリ
ンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャー几ＮＡ（
以下、ｍ　ＩＬＮ　Ａと略称する。）より調製されたも
の、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素１１ｓｔ、　ＸｂａＩお
よびＢｓｔＮＩで切断される個所がこの順序で配置され
ている部分を含むものであるもの等がある。また、微生
物としてはエシェリヒア・コリが代表的なものである。

以下、エシェリヒア・コリを例とじて本発明を説明する
。

本発明の微生物、エシェリヒア・コリは以下に示す遺伝
子組換え技術によって創製することができる。すなわち
、ヒトインターロイキン２に対応し、ショ糖密度勾配遠
心法（以下、ＢＤＧ速心決心法称する。）Ｋよる分画に
より１１〜１２ｓｌｉ！Ｉｉ分として得られるａＲＮム
をヒトリンパ球由来細胞より分離し、このｍＲＮＡに相
補的なりＮＡを調製し、該ＤＮＡを適当なレプリコンに
接続し、この組換えＤＮＡをエシェリヒア・コリのＩｌ
ｌ　Ｊｉｍ　Ｋ　ｍ入する。

ｍＲＮＡは、上記したように、ヒトインターロイキン２
に対応し、８ＤＯ７心法やグルｐ過法等による分画なら
びにアガロースゲル゛ｒ＋１気泳動法により１１〜１２
５両分として得られるものであり、こＩ）　ｍ１ＬＮＡ
　ハヒト９７　ハ球由来ａｌｌ　Ｊｉ＋ｉより抽出１分
子［Ｌすることによって製造できる。

本発明に用いるヒトインターロイキュ／２ｐｉｉ生能を
イ１するヒトリンパ球由来ＩＩ　１冠としてヒト末梢面
、綿桃腺、牌瞭等よりイ４）られるリンパ球そのものも
含まれる。また、これらのリンパ球をナイロンカラム処
理、抗血清−補体処理、密度勾配分画および酵素（ノイ
ラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素等）処理などの前
処理をしだもの並びにＸ線等による変異処理およびトリ
プシン等の酵素処理等によりインターロイキン２の産生
能が付与されたものも本発明のヒトリンパ球由来細胞に
含まれる。

さらに、これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴ　
ＩＪンパ球をトリンパ球成長因子等の存在下にクローン
化したように、クローン化したものも好ましいヒトリン
パ球由来細胞である。

マタ、ヒト白血病細胞およびＴ　ＩＪンパａｉａのよう
なヒト・リンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性
化細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したもの
または悪性化細胞をクローン化したものがより好ましい
ヒトリンパ球由来細胞として用いることができる。特に
クローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通
常多い。

さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＣ！ＥＭ　。

Ｍｏ１ｔ（Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる、いわゆる）翫イブリドーマも好適なヒトリンパ
球由来顔１胞として使用できる。

これらヒトリンパ球由来細胞には（１）自発的にインタ
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。

ヒトリンパ球由来細胞にインターロイキン２ｍＲＮＡを
生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産生株
を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養すれ
ばよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を産
生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ロ
ーズウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート】
６４゜（以下、ＲＰＭ１１６４０と略記する。）培地、
ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　
ｎｎｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ３　）培地、クリック培
地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有して
も含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜４
　ｘ　１０６イｄｌｎｌの細胞密度で懸濁し、ここにマ
イトゲン；、ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸、化酵
禦；塩化、亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレ
プトリジン−０６の菌体由来リンパ球活性化成分を添加
した後、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。

マイトゲン刺激の際にマクロファーレやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞や３９７７球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ　、
　Ｄａｕｄｉ　、　Ｋ５６２．　ＢＡＬＩ、−１細胞を
共存させると同様にインターロイキン２の産生能がみら
れるような細胞があり、これらの細胞を用いてインター
ロイキン２のｍ　ＲＮＡを生成せしめる場合には、これ
らの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このよう
にすると、ｍ　ＲＮＡの収量は上昇することがある。

ヒ）　ＩＪンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内も
しくは動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養
継代は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能
であり、哺乳動物由来の血清。

血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でもＪ１１！消アクブミンすら含まない合成無血清培地
でも、これらの細胞株は培養、−増殖させることが可能
で、かつ本発明の細胞材料として用いることができるこ
とが判った。

リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン２０ｍ　ＲＮＡが生成される時間で
あり、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２
が産生され始めた頃に相当する。

具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間である。徒
らに培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン２
０ｍＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭＡや’Ｉ’ＰＡなどのホルボールエステル
類を１０〜５０　ｎ９７ｍ１添加することもある。培養
温度は３２〜３７℃の範囲が望ましＸ＋）。

以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒト
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。

（イ）　リンホカイン自発産生株の取得ヒトデリンパ球
由来白血病細胞であるジュルカット細胞（ブレッド・ハ
ラチンノン・癌研究所／シアトル／アメリカ、ンーク研
究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ国立癌センター
／ハイデルペルヒ／西ドイツ等で自由に手に入る。）を
１×１０６個／ｍｌの細胞密度でクリック培地中に懸濁
させ、１５０レントゲン４の照射速度で合計Ｂ、ｏｏ。

レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本細胞を０．
１細ｐＶ２ｏｏμｌの細胞密度で９６穴の平底マイクロ
タイタープレート（［ファルコン３０７２ｊ）に、添加
し、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で３週間３７
℃にて５％ＣＯ。インキュベーター中にて培養する（限
界希釈法によるクローニング）。

細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌン、り
社製培養プレートに移し、２　ｍｌのクリック培地中に
て・５日間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得られた
場合には、本細胞を２　Ｘ　１０’個／　ｍｌの＃ｌｌ
Ｉ胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含まない無血
清合成培地２　ｍ／；　Ｋ　５濁して２日間培養し、本
培養上清￥３００Ｏｒｐｍ、５分間の遠心分離操作で分
離し、次いで０，２２μのミリポアフィルタ−にてデブ
リス除去と無菌化を行なってインターロイキン２を得る
。こうして得られるクローン細胞よりインターロイキン
２産生株が得られる。

（ロ）　ヒト末梢血１９７７球よりインターロイキン２
産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌｊの細胞密度でクリッ
ク培地に懸濁し、各２１Ｌ６’宛２４穴のヌンクの培養
プレートに接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ
（ギプコ社製）を５μり／ｍｌの終末濃度になるように
１００μｌ添加し、」二連の条件下に４８時間培養し、
次いで細胞を培養液で洗浄し、再びＩ　Ｘ　１０５個／
ｒｎｌの細胞密度で元のヌンクの培養プレートに１ａ宛
まく。各ウェルにｌヒトの牌ｍ細胞をコンカナバリンＡ
２．５μ９７ｍｌで４８時間刺激して得たコンディショ
ニングした培養液を１ｍｌ添加し、３日間同様の培養を
繰り返し、ヒト末梢血より得たＴリンパ球を長期継代培
養する。

このように長期継代培養して得たＴリンパ球ヲ、前述と
同様の限界希釈法でクローニングおよび細胞増殖を行な
う。こうして得られたクローン化１９７７球をＩ　Ｘ　
１０’個／ｍｌの細胞密度にｉｔ　Ｐ　Ｍ　１１６４０
培地に懸濁し、ここに１０　ｌｔ９７ｍｅの終末濃度に
なるようにフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を添加し、
２４時間、３７℃で７５％ＣＯＱインキュベーター中に
て培養し、本培養土清を３．００　Ｏｒｐｍ、５分間の
遠心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリポアフ
ィルタ−で無菌化を行ないインターロイキン２が得られ
る。こうして得られるクローン化細胞よりインターロイ
キン２産生株が得られる。

（ハ）　マイトゲン刺激でインターロイキン２を生産す
るヒ）　ＩＪンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュル
カット細胞や前記１−だ限界希釈法によりクローン化さ
れたＪ−１１１株は、前記の無血清培地や面清ｌ〜２％
を含む几Ｐ１１ｊ１１６４０培地中にてコンカナバリン
ａ　１ｏ　μ９／ｍｌやＰＬＴＡ２．５μ９７ｍｅ、の
存在下に２４時間培養すると、ｌＯ〜４、”’Ｏ”００
単鵬Ｌｌのインターロイキン２を雄生することが判明し
た。また、塩化亜鉛、プロティンＡ。

ビシパニール存在下に培養しても、インターロイキン２
を産生ずる。

に）　他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
２を産生ずる細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１
ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルヵ
ット細胞の１つのクローン、ジュルカット９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノヵインの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０　ｕ　／１ｒｒｅまたはに５
６２やラージ（几ａｊｉ’）細胞をＩＸＩＱ’細胞／’
ｍｌ当り０，５ｘｌＯ’個／ｍｅ相当共存させてクリッ
ク培地中にて３７℃、２４時間培養すると、インターロ
イキン２を１０〜１’００　ｕ／ｍｉｔ　産生する。

このようにして得られた細胞よりインターロイキン２に
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
Ｄ８．　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００　　デオキシコール
酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍
結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるい
は完全に破均、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲ
ＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中に
ＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニ
ル硫酸、ベントナイト。

マカロイド、ジエチルピロカーボネイト、バナジウム複
合体などを添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２に対応する抗体を用いてイ
ンターロイキン２合成途上ノボリゾームを沈降せしめ、
これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行
なうことができる。

また、本発明に用いるＩｎＩＬＮＡの社製についてはオ
リゴｄ１１−セルロース、ポリＵ−セファロース。

セファロース２Ｂなどの吸着カラムあるいはバッチ法に
よる精製法、　ＳＤＧ遠心法による分画等によって行な
うことができる。このような精製操作によりインターロ
イキン２に対応するｍ　ｎＮＡは１ｌ−１２Ｓ画分とし
て得られる。

上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするインター
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍ　ＲＮＡを蛋白にａ訳するのによく
用いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ　１ａｅｖｉｓ　）の卵母細胞にｍＲ，ＮＡを注入し
て翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、
小麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行な
われている。

ここに用いたインターロイキン２の活性検定法は次の通
りである。即ち、検体１００μｌを９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭＩ　１６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６六マイクロプレート上において各１００μｌの希
釈系列を作成する。そこにギリスら（’Ｎａｔｕｒｅ、
　２６８巻、１５４頁、（１９７７））によって教□示
された方法に従って作成した活性化Ｔ　ＩＪンパ球株を
、４　Ｘ　１０”個／１ｏＯμｌの細胞□密度として１
００μｌ宛各くぼみに添加する。３７°Ｃ１５％炭酸ガ
スインキュベーター中２０時間静置培養後、トリチウム
化チミジン０．５μＣ１を加工、４時間パルスを行なっ
た後、この分野で良く知られた方法に従って細胞を採取
し、１ｔｌｌ胞内にとり込まれた放射線量を測定する。

インターロイキン２活性の高い培養上清はど活性化Ｔリ
ッツ球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が多いこ
とから、検体中に含有されるインターロイキン２量を容
易に知ることができる。

またインターロイキン２はＴリンパ球分裂増殖せしめる
作用がありこの作用によるｌｌＩ　ＩＪンパ球増殖活性
の検定法は次の通りである。

検体１００μｌを９６穴マイクロクイタープレートの１
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＩＥＭ
培地に針佳希ポ２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプ
レート上において各１００μｌの希釈系列を作成する。

そこに上述活性化Ｔ　ＩＪンパ球株を５個／１００μで
の細胞密度として１００μｅ宛各くぼみに添加する。３
７℃、５％炭炭酸ガスインキュベクター中７２ｈ゛もし
くは９６時間静敢培養してその後、倒立顕微鏡にて生存
する活性化Ｔリンパ球数をカウントする。この際、１０
０ｕ／ｍｅ、　　１０　ｕ／ｍｌの活性を有するインタ
ーロイキン２をポジティブ・コントロールとして用い、
検体添加ＷｊにおけるＴリッツ球の増殖数と比較し、検
体のインターロイキン２活性を算出する。

かくして得られたインターロイキン２　ｍＲＮＡよりイ
ンビトロで相補的なりＮＡ　（ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物のベクターなどに組込んで微生物等でインターロイ
キン２を生産することを可能ならしめる。

このようなｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。

ｍ　ＲＮ　Ａを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとし
て、ａＡＴｐ、　ｄＧＴｐ、　ａＣＴｐ、　ａＴＴｐの
存在下で逆転写酵母によりｍＲＮＡと相補的な単ｔａｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写
ｌ）Ｙ素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重ｆｉ
ｃＤＮＡを合成する。

次いで、得られたＤＮＡ両端を必要によりエキソヌクレ
エースで処理し、それぞれに適当なリンカ−ＤＮＡを接
続し、あるいはアニーリング可能な組合ぜのル基を複数
個５（合せしめる。しかる後、これをエシェリヒア・コ
リ内で自律盃）製できるレプリコンを含むベクターに組
込む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断
し、必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能
な組合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工
した二重＠！ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガー
ゼを用いて接続せしめる。

得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス。

ザツカロマイセス・セレビシェ宿も使用できる。

エシェリヒア・コリの場合について使用されるベクター
を以下に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９
８１）参照） ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
８ｃ１０Ｌ、　ｐＲＫ３５３．　ｐ几に６４６．　ｐ几
に２４８　。

ｐＤＦ４１等、ＥＫ糸プラスミドベクター（リラツクス
ト型）の（！ａｌＥ１．　ｐＶＨ５１，ｐＡＯ１０５，
Ｆ、５Ｆ２１２４　、ｐＯＲ，１、ｐＭＥ９．ｐＥＲ３
１３，ｐＢＲ３２２、ｐＥＲ３２４、ｐＢＲ３２５，ｐ
ＢＲ３２７，ｐＢ几３２８．ｐＫＹ２２８９゜ｐＫＹ２
７００．ｐＫＮ８０．ｐＫＯ７，ｐＫＢ１５８．ｐＭＫ
２００４　、　ｐＡ（！Ｙ（Ｅｌ、　　ｐＡＯＹＯ１８
４、λｄ（ｌ　１等、λｇｔ系ファージベクターのλｇ
ｔ・λＣ２λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ・λＣ１λＷＥＳ・
λＢ／　、　　λＺＪｖｉｒ・λＢ’ｌ　　λＡＬＯ−
λＢ、　λＷＥＳ・Ｔａ２０５゜λＤａｍ等。

これらのベクターのうちエシェリヒア・コリに対しては
一般にｐ４３Ｒ３２２が良く用いられている。

ｐＢＲ３２２の場合にはｃＤＮＡの糾込み場所はＰｓｔ
、ＩサイＦ　＋　　ＤＣＯＲ，Ｉサイトがよく利用され
ている。

プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣ１＠処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込ま
せる方法が採用されており、Ｍｇ０ｊＱあるいはＲｂＣ
／をさらに共存させることにより形質転換の効率が一層
増すことも知られている。

また、微生物細胞をスフェロプラストあるいはプロトプ
ラスト化してから形質転換させてもよい。

形質転換株からインターロイキン２遺伝子が組込まれて
いる株を選別するには、以下のような方法がある。

（１）すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法と称
されるもので、まずｃｏｎＡによって刺激したジュルカ
ット細胞よりｍＲ，ＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によっ
てインターロイキン２　ｍＲＮ４を部分精製したのち（
はぼ１１〜１２８　　ｍＲＮＡ）、このｒｎＲＮＡを用
いて３２ｐによりラベル１−だ１本ＫＭｃＤＮｈを合成
する。ついでｃＤＮＡ合成の鋳型となったｆｌｌＲＮＡ
をアルカリ処理によって除いた後、このｃ、ＤＮＡとＣ
０ＩＩＡで刺激していないジュルカット細胞より抽出し
た１　１〜１２８　１１ＲＮＡの部分精製ｍＲＮＡの過
剰とハイブリダイズさせた。そしてこのｃｏｎＡ刺激し
ていないｍＲＮＡにノ・イブリダイズしなかったｃＤＮ
Ａとハイブリッドを形成したｃＤＮＡとをヒドロキシア
パタイトカラムによって分画し、それぞれプローブＡお
よびプローブＢとする。

次に前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ２枚
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定しで
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにノ＼イブリダイズさ
せた後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡ
にはポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには
弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを
検索する（　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａ、！、’、
　Ｐａｏｃ、Ｊｐｎ、Ａｃａｄ、。

ｖｏ／　５５Ｂ、４６４　４６９（１，９７９））。

あるいは形質転換株、たとえば１００　（Ｊ〜１０，０
００クローンを数十ないし数洒のクローンの集団に分け
、集団毎に形質転換株を混合種＠Ｌ２、ＣＭ法によって
）プラスミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを
熱変性等により単鎖１）ＮＡにしてニトロセルロースフ
ィルターに固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述し
、たよりなインターロイキン２　　ｍＲＮＡを含むヒト
ワコ白血球＃ｊ１１胞よりＲ）・δ製したｍＲＮＡをノ
・イブリダイズさせる。あるいはＤＮＡな熱度＋１させ
た後、先にインターロイキン２　ｍＲＮＡを含むｍＲＮ
Ａをハイブリダイズさせた後に、ＤＮＡ−ｍＲＮＡ　　
ノーイフリツドをニトロセルロースフィルターに固定す
る方法もある。

次に、このフィルターをｌ　ｍＭピペス、１０ｍＭＮ　
ａＣｌのような低塩電液でよく洗滌した後、０．５ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　　０．１％８１）Ｓのような溶液で、
ｆｌｌえ＋ｉ９５°Ｃ，１分間程度の熱処理を行なって
フィルターに吸着したｎｕＲＮＡを溶出する。そして、
これをオリゴｄＴ−セルロースカラムに力・けるなどの
ｔｉ作を行なってｍＴ１．ＮＡを回収する。次に、この
ｍＲＮＡをアフリカッメガエルσ）封Ｈ母ｎ’ｄｌｌ胞
に注入して■白に翻訳させてインターロイキン２活性’
ｉ＝　１ｉｌｉｌ定する。

あるいけ、ウサギ網状赤血球な（・しを″１１．ｌＪ＼
麦胚芽のｊｎ　ｖｊ、ｔｒｏ　　１７Ｊｌ訳糸で蛋白に
１ｆＰＩＩ訳さ−ｌ−た７、イ）・ターロイキン２抗体
でインターロイキン２を検定１−る。

かくしてインターロイキン２活性の検ＩＬｉされた集団
が見出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化
してより小さな集団に分け、０１Ｓ述の方法を繰返して
最終的には単数のクローンに＃ｌＩ１分イヒし、インタ
ーロイキン２　　ｃＤＮＡを含むクローンを同定する。

このようにして得られたインターロイキン２遺伝子が組
込まれている組換体微生物は常法によって培養すればよ
い。

力”４　＜　してインターロイキン２の遺伝子を有する
組換え体微生物菌体内にインターロイキン２の遺伝子が
増ＩＪ、生産され、インターロイキン２遺伝子を大量に
調製することかできる。又、得られた組換体微生物を用
いてＩＬ−２ポリペプチドを生産せしめることができる
。

実施例１ （１）　　ｌＯｇ！／容：ｉｔ％の牛胎児血清を含有す
るＲＰＭＩ　１６４０培地で、当分野で良く知られた方
法で培養したヒｌ−Ｔ白血病Ｉ…胞ジュルヵット細胞（
日本、アメリカ、西ドイツ等で自由に入手できる）を上
記の培地に懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装
置ＥＸＳ　１５０　／　８００−４型を用いてｌ、００
０レントゲンの総照射線量を照射した。

次いで、この照射された細胞をＩ　Ｘ　１０’個／　ｍ
ｌの細胞密度で上述の培地中で５％炭炭酸ガス中ソ７ｃ
５日間培養した。次に、９６穴マイクロプレ一トｌＯ枚
に０．２個／ｗｅｌｌ（（ぼみ）になるように本変異細
胞を接種し、５％炭酸ガス中８７０にて２１日間培養し
た。細胞増殖の観察されたクローンを順次継代増殖させ
、次いでＩ　Ｘ　ｌ　Ｏ’個／　ｍｌの細胞密度でＣｏ
ｎＡ３０μｍ１／ａｔ存在下に２４時間培養し、培養上
清に放出されるインターロイキン２の産生量を前出の方
法で測定し、原ジュルカット細、胞に比し産生−唯が４
０倍以上に改善された変異化クローン細胞少ニルカット
ｌｌ１株（ＡＴＣＣＣＲＬ８１２９）を得た。不法は通
常の培養方法で増殖し、その増殖速度はジュルカット細
胞と同程度であった。

（２）本ジュルカット１ｌｌｉｌ’ｌ胞株をｌ　Ｘ　１
０’個／ｍｌの細胞密度で無血清合成培地ＩｔＩＴＣ５
５−９１、０００ｒｎｌに懸濁し、ファルコン社裏回転
培養瓶に入れ、８７Ｃで４日間培養・、シ、遠沈操作に
より細胞を集めた。この細胞を４ＸｌＯ’個／ゴの細胞
密度にて上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎ　Ａ２５
μ９７ｍ１を添加し、上記ファルコン社製回転培４を瓶
（４本ンにＬ　０００　ｔｒｔｌで張り込みＯ時間回転
培養１〜た。

（８）　　このようにして得たＣｏｎ　Ａ　２５　ｔｉ
ｌｌ　／ｍ／で６時間誘導したジュルカットにＩＩＩ胞
（１，２Ｘ　ｌ　Ｏ”ａ胞）をＰＢＳ溶液８００　ｍｌ
にＡｊ＆濁し、細胞を遠心によって２度洗浄してから、
ヌクレアーゼ阻害剤であるＲ４ｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ　−Ｖａｎａｄｙｌ　Ｃｏｍｐｌｅｘ’（１０ｍＭ
　）を含んだＲ８Ｂ溶液（１０ｉｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　。

ｐＨ７，５’、　　ｌ　ＯｍＭＮａｃｔ、　　１．’５
　ｍＭＭｇｃｔ２）　８００ｍｅに懸濁した。次に、Ｎ
Ｐ−４０を０．０５％になるように加え゛た後、ゆるや
かに攪拌後＆　０００　ｒｐｍで５分遠心して核を除去
し、その上清液に５ＤＳ（０，５％）とＥＤＴＡ’　（
５ｍＭ　）　　を加えた後、ただちにフェノールを等量
加え細胞質ＲＮＡ　　を抽出１゜た。合計８回フェノー
ル抽出を繰返してから２容エタノールでＲＮＡ　　を沈
澱し、遠心でこの沈澱を集めｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉａ−Ｈ
Ｃｌ、　ｐＨ７，５で溶解した。

このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮＡ量
は１９６■であった。

次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ　。

Ｔｙｐｅ？）ｔ−用い、カラムクロマトダラフイーを行
なツタ。吸着Ｌｒｌ　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ、
　ｐＨ７，５。

０、５　Ｍ　ＮａＣ４，ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．
５％ＳＤＳ％液にＲＮＡを溶解して行ない、溶出は緩衝
液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　　ｐＨ７，５、０，
５ＭＮａＣｔ、　ｌ　ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄後、水とｌ
　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）で交互にｍ
　ＲＮ　Ａを溶出することにより行なった。この結果、
溶出されたｍＲＮＡ■は８．６〜であった。

さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４ｍｇ）をＳＤＧ遠
心（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ／、　　ｐＨ７，５、１ｍ
ＭＥＤＴＡ　、　０．２　Ｍ　ＮａＣ１を含む５〜２５
％シヨ糖密度勾配。Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰＳ　２８　ｏ
−ターＴ２６．００Ｏｒｐｍ、２４時間、４Ｃ）ｔ、て
分画し、ｌ　ｌ　−１２ｓのｍＲＮＡ画分を分画番号１
２．１８．１４としてそれぞれ５９μ９．４６μ９，６
０μｇ得た。

（４）　ここに得られた分画番号１８のｍＲＮＡを前出
の検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１個
当り５０　ｎ、９をマイクロインジェクション法により
注入して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン
２の活性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化
チミジンの取り込みおよび活性化’ｌ’　ＩＪンパ球数
の増加がみられ、これら分画のｍＲＮＡＵ本発明のヒト
インターロイキ７２ｍ１えＮＡを含有することが証明さ
れた。

表　　−■ （イ） 対間１ （アッセイ培地）　　　　　　　　　　５５８　　　　
　　　０分画１３の翻訳物　ｘ８　　１４６８８Ｘ３２
　　　１０１６５　　　　　　３２対照ＩＯ （アッセイ培地１．）８□６　　　　　　　　　ｏ　　
　　　　　　　　。

分画１８の翻訳物　Ｘ　２　　　　１１５Ｘ１６　　　
　　５５　　　　　４０ ネ各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ　）のプロビットｅプロットを標準インク−ロイキン
２（１０単位、／ｍｌ）と比較して求めた０ （５）次に、ここで得られたインターロイキン２ｍＲＮ
Ａを含む１１〜１２８　ｍＲＮＡ分画１８よりｅ　Ｄ　
Ｎ　Ａをインビトロで合成し、プラスミドベクターＰＢ
ｔｌ１２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒ
ア・コリにトランスボームしてインターロイキン２　ｃ
ＤＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。

（５−１）　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）。

８０　ｍＭ　ＮａＣｔ、　　６　ｍＭ　ＭｇＣ４、５ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭの各ｄＡ
ＴＰ、　ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ　、　　ｄＴＴＰ　（ｄＣＴＰは３２ｐラベル
したものを含む）、Ｑ、７５μにＩオリゴ（ｄＴ’）＋
ｏ　、　ｌ　０１１９　ｍＲＮＡおよび１５ユニツ）Ａ
ＭＶ逆転写酵素（Ｊ、Ｗ。

Ｂｅａｒｄ　）を混ぜ、４１Ｃに９０分間保った。反応
終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノール沈澱
としてＤＮＡを回収し、２０　ｍ１ＶＩ　Ｔｒｉｇ　、
　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，５溶液に溶解した。これ
により約２．５μＩの１本鎖ｃＤＮＡが合成された。こ
の溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加え
て０、８８　Ｎ　ＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、
次いで溶液をＩ　Ｍ　Ｔｒｉ８−ＨＣｌ　、　　ｐ’Ｈ
７，５の等量で中和し［セファデックスＧ−５０Ｊカラ
ムに通した。

これにより１．８μｇのｃＤＮＡを回収した。

（５−２）５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，５）　、　
１０ｍＭＭｇｃｔ２．　ｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ　、　０．
７５　ｍＭの各ｃＡＴＰ　。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、（ｄｃＴＰ［”Ｈでラ
ベルされたものを含む）、１．８μＩ１本鎖ｃＤＮＡ、
８ユニットボリメレース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）　
Ｉ　（米国ＢＲＬ・製）を混ぜ、１５Ｃで１５時間反応
を行なった。反応終了後、フェノール処理１１回、りｌ
’ロホルム処理１回を行ない、エタノール沈澱としてＤ
ＮＡを回収した。この反応により１．　ｌ　０８ｇの二
重鎖ｃＤＮＡを得た。

次いで、５０　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４５）　ｅＯ
，’２　ＭＮａＣｌ、　１　ｍＭＺｎｃｔ、、　１．１
０μｇ二重鎮ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを混ぜて８７Ｕで２０分ｍ
］インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレア
ーゼＳＩ（三共（…製）を加え、さらに１５分間インキ
ュベートした。反応終了後、フェノール処理２回行ない
、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに迫し、０．５５
μｇの二重鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを回収した。

（５−８）　Ｏ，１４Ｍカコジル酸カリウム、８０ｒｒ
Ｍトリス塩基、　０．１　ｍＭＤＴＴ　、　ｌ　ｍＭ　
ＣｏＣ１，、０，６４ｍＭ″Ｐ−ｄＣＴＰ　（Ｓｐｃ、
　ａｃｔ　、　２．７　Ｘ　ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／　ｎ　ｍ
ｏｌ　）　、　０．５５１１７に重鎖ｃＤＮＡおよび５
ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を
混ぜ８１Ｃで７分間インキュベートし、反応終了後、フ
ェノール処理１回を行ない、［セファデックスＧ−５Ｏ
Ｊカラムに通しエタノール沈澱としてＤＮＡ　０．５０
μ９を回収したところ約５０個のｄＣＭＰが両８′末端
に付加された。

ＰＢＲＢ　２２　ＤＮＡ　ｌ　Ｏμ９を制限酵素Ｐｓｔ
　ｌ　で切断したのち、前述の二重鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに
ｄＣＭＰ鎖を付加したのと全く同じ条件でｄＧＴＰＱ代
りにｄＧＴＰを用いて両８′末端にｄＣＭＰ鎖を伺加し
た。

かくして約５０個のｄＧＭＰが両８′末端に付加された
。

（５−４）５０　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）
、０．１ＭＮｎＣ１、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．０５
　ＡｊｌのｄＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２２，ｇ、０
１μｇのｄＣＭＰが付加されたｃＤＮＡをまず６５ｔ、
’で２分間、次いで４６Ｃで１２０分間、さらに３’　
７　Ｃで６０分間、そして室温で６０分間保持した。

エシェリヒア・コリχ１７７６を５０ｍ１のＬ培地（１
００μ／ｌ　／　ｍｌのジアミノピメリン酸と　５０μ
ｌ／ｒｔｔｌのチミジン、１％トリプトン、（１５％酵
母エキス、０．５％ＮａＣ１および０１％グルコースを
含む）に接種Ｉ〜、培養液の５６２ｍμにおける吸光Ｉ
Ｗがおよそ０８になる寸で３７Ｃで振とり培養ｉ−た。

培養終了後、培養液をＯＣで８０分間放置し、次に菌体
を遠心分離により集め、５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７，６）　、　０．Ｉ　ＭＮａＣｌ、　　５　ｍＭＭｇ
Ｃ４゜１０　ｍＭ　ＲｂＣ１の溶液２５ｍ１で２回洗浄
しに０得られた菌体を５　ｍＭ　Ｔｒｉ８−ＨＣｌ　（
ｐＨ７，６）　。

０、２５　Ｍ　ＫＣｌ　、　５　ｍＭ　ＭｇＣ１，、Ｏ
，ｌ　Ｍ　ＣａＣ４および１０　ｍＭ　ＲｂＣｌを含む
溶液２０　ｒｕｌ　Ｋ懸濁し、ＯＣにて２５分間静置後
、遠心分離により菌体を集めた。

上記と同じ溶液１　ｍｌ　Ｋ　＠体を再び懸濁Ｌ、得ら
れた菌体懸濁液の０．２　ｍｌに上記組換えＤＮＡを入
れ、ＯＣで４０分間静置した。さらに、８７Ｃで２分間
保ったのち、再びＯＣで６０分間静置Ｉ−た。次に、こ
れに前記り培地０．７　ｍｌを加えて３７Ｃで８０分間
振とり培養した。この培養液０．１　ｍｌを１００μｌ
／　／　ｍｌジアミノピメリン酸、５０８ｍ１／ｍｌチ
ミジンと１５μ／ｌ　／　ｍｅテトラザイクリンを含む
し培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、８７Ｃに
て２日間インキュベートした。

（５，−５）上記において出現したコロニー４５２個を
それぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体
として１００μｆ／　／　ｌｌｌ１のジアミノピメリン
酸、５０μＦ　／　ｍｅのチミジンと１゛０μｆ／ｍｌ
のテトラサイクリンを含むＬ培地２００　ｍｌに接種し
、６７℃で５〜・７時間振盪培養後、クロラムフェニコ
ールを最終６Ｗ、１１度で１７０μ！７／ｍｌになるよ
うに加えた新鮮な上記り培地２ＱＯｍｇを迫力１１シ、
さらに−耽振盪培養する。こうしてプラスミドＤＮＡを
増幅しておいて常法に４ｉ（ＥつてプラスミドＤＮＡを
精製し７た。このＤＩＪＡを用いてＨｙｂｒｉｄｉｚａ
ｔｉｏｎ　−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｓＳａｙ法でイ
ンターロイキン２ＣＤＮＡ　ｋもつクローンラスクリー
ニングした。ここで用いた１１ｙｂｒｉｃｌｉｚａｔｉ
ｏｎ　−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙは以下の
ようにして行なった。

精製したＤＮＡ２５／Ｊｐを制限１１′ｆ素Ｈ１ｎｄ　
（ｌＩで切１ｌｉｌｉ　Ｌ、フェノール処ｆ：１ｉ１６
回、フェノール−クロロポルム処理１回およびクロロホ
ルム処理１回を行なってＤＩＪＡをエタノール沈澱して
８０％０％エフノール浄したのち回収し、これを８０％
ホルムアミド溶液４０　ｐｔ　Ｋ溶解し、９０°Ｃで５
分間熱ｒＡｔ／１．させた。その後、１０　Ｘ、　ＳＳ
Ｏ（１，５Ｍ　Ｎａ１ｌ。

０１５Ｍクエン酸５ナトリウム）でｔ　５　ｍ、ｅ　Ｋ
希釈した。これをニトロセルロースフィルターに固７１
ｇし、８０°Ｃで６時間別熱乾ｉｆｆ、：　Ｉ、た。こ
のフィルターを５０％ホルムアミド、２Ｑｍ％ヒペ７．
．ｐＨ６，５゜０、７５　Ｍ　Ｎａ０ｔ、　５ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、　、　０．２％ＳＤＳおよび２５０　ｐ７ｍＲ
ＮＡｆ：含む溶液中で５７℃、１８ｆ１ｆ間インキュベ
ートしてフィルター」二のＤＮＡとインターロイキン２
　ｍＲＮＡ　とをハイブリダイズびせた０次いで、この
フィルターヲ１０　ｍＭヒペスｐＨ６，５，０，１５Ｍ
ＮａＯ４，１ｍＭＥＤＴＡ、　０．２％ＳＤＳ溶液で６
５°Ｃで６回洗浄した後、さらに１ｍＭビベス、　　１
０　ｍＭ　ＮａＣ２溶液で５回洗浄し、次いで０５ｍＭ
］！１ＤＴＡ、　　０．１％ＳＤＳ溶液で９５℃で１　
ｍｉｎ処β１１シてフィルターに１吸冶したｍＲＮＡを
溶出した。

これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムにか
けて回収した。この回収したｍ　ＲＮＡをアフリカッメ
ガエルの印付ｉ１ｕ　ｌ：ｕ、に注入し、蛋白に翻訳さ
せインターロイキン２活ｉｙｌ：を１ｉｌｉｌ定した。

こ□の結果、１８集団の中の１集団にＯＩＪ述のトリチ
ウム化チミジンの取り込み１ｉによる活性４す１定法に
より４８単イ）ｌ　／　ｍＩ！のインター口・ｒキン２
の活性が検出された。

そこで、さらにこのｑＳ団に属する２４コロニーン１：
今度は単独にそれぞＪｉ削述［、／３−ように１００μ
グ’／ｌ１ｌｊのジアミノピメリンｒｙ’ｒ、５０μｆ
Ｊ／ｍｌのチミジンと１０μ！７／威のテトラサイクリ
ン穴含むＬ培地２００ｍ１　（Ｉ′ｌ：二接４１＋　Ｌ
、り７°Ｃで５〜７１１オ１１５１粘ｉ＜ｉｌｌ音（）
ｉイ妥、クロラムフェニコールをＭ　ＩＨ％　ｊ；、’
：；　１．ｐ’−（１７０ｐ　’ｆ／ｍｅにｔ、（ルヨ
ウにＩｊｌｌ　エたｔｌｉ　ＬＱ’ｆｉ　ｆＬ　」二記
Ｌ　　Ｌ音Ｊ’＋’：　２１Ｊ　ＩＪ　ｍｌ　’４７４
ｊｊ加し、さらに−夜振盪ＱＪ　ａ’Ａ　Ｌ−てプラス
ミドＤ　Ｎ　Ａ−を増幅しでおいて常法に６ｔつ−Ｃプ
ラスミドＤ　Ｎ　ＡをＩｉ’ｊ　’ＪＪ％　Ｌ　ｋ。そ
して各ＤＩＱＡ５ｔｔ９−をＨｌｎｄ　ｉｌｌで切ｌｔ
ｊ「Ｌ　ｌこｔｋ　、　＋Ｊｉ＋　回（！：　同仕１ｔ
（ニトロセルロースフィルターに固定してインターロイ
キン２ｍＲＮＡとノ＼イプリダイズさせ、ｍＲＮＡ　　
を回収してアフリカッメガエルの卵１Ｈ：　ｉｌｌ胞に
注入して蛋白にＷ８１　ｇＲＬインターロイキン２活性
を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにインタ
ーロイキン２クローンか存在するか検定したところ１コ
ロニーよりｆＩ）られた＊１゛ｊ製プラスミドＤＮＡ、
　　プラスミドｐ５−１６にクローンがインターロイキ
ン２ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ１
７７６１５−１６　ＡＪ１１９９５　（ＦＥＲＭ−ＢＰ
２２５　）　）であると同定された。

即チプラスミドｐ３−１６のｃ　ＤＮＡはインターロイ
キン２ｍＲＮＡと１１斤異的にハイブリッドを形成ずろ
ＤＮＡ（インターロイキン２遺伝子）をもつことがＪｌ
に明され／ζ。

次にプラスミドｐ５−１６のｃＤＮＡの制限酊；！（Ｉ
ＪＪ及び下流）切断され／ζ。しかし、このｃＤＮＡは
約６５０塩基１１よシなり、１１〜１２Ｓのインターロ
イキン２ｍＲＮＡの一部に対応するものとわかったので
、［りび同様にして調製したヒトインターロイキン２ｍ
ＲＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄ　ｅｔ
ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｉ’Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　ｖ
ｏｌ、９．　ｐ２５５１　（１９８１）　）により目り
述同保にしてｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成し、プラスミドｐＢ
Ｒ１！２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ　−ｃ
ｏｌｉχ１７７６を形質転換させ、約２０００個の転挾
株、Ｄヶカ、ヵ、５、アウ７ｒ〒含、、！：Ｅ４Ｊ、Ｕ
Ｆ洗ζｐンＶえクローン’　ｆ’　Ｇｒｕｎｓｔｅ、ｉ
ｎ　’−Ｈｏｇｎｅｓｓ　の方法をｉｉ’ｆいて選別し
、約８５０　塩基対のｃＤＮＡインザートを持つプラス
ミド、ｐ工Ｌ２−５ＯＡを持つ転ＮＳ株（エシェリヒア
、　　コ　　リ　　　χ　１７７６／　工Ｉ、−２−５
０Ａ　　　Ａ　　Ｊ　１１９９６（ＦＥＢＭ−Ｉ３１’
　２２（Ｓ　’）　）を得た。このｐ工Ｌ２−５ＯＡの
ｃ　ＤＮＡの制限酵−Ｒ切１１＋地図を図−１に示す。

表　−２（イ） （ロ） −１　プラスミドｐ５−１６のｃＤＮＡにハイブリダイ
ズしたｍＲＮＡ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２８プラスミ
ドベクターにｐＫＯＲベクター（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　、　ｖｏｌ　７Ｂ　、　
＆５１５２７−１５１１．１９８１）のｓｖ　ａ　Ｑウ
ィルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組み込
んだＰＣ’Ｅ−’１ベクターを造成した。そしてプラス
ミドル５−１６−５ＯＡクローンのプラスミドよりＰｓ
ｔ（で挿入されたｃＤＩＪＡを切り出し、ｐｃ！！ニー
１　ベクターのＰｓｔＪサイトに押入した（プラスミド
ｐＯＥ工Ｌ−２）。このトキの押入様式は図−２に示す
ようにＳＶ４０初期造伝子のプロモーターの下流に工Ｌ
−２ｉ１１伝子のイニシエイションコドンＡＴＧが接続
されているものである（図の１）。このベクターをサル
培養Ｉ＄１１１胞のＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、
　Ｙ、　ｃｅｌｌ　ｖｏｌ、　２５　ｐｌ　７５−１８
２（１９８１））に感染せしめ（ＭｃＯｕｔｃｈａｎ　
ｅｔ　ａｌ　Ｊ、　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ工ｎｓｔ、　ｖｏｌ、　４１　ｐ３５１−
５５７　（１９６Ｂ）　）、培養上清に出てくる工Ｌ−
２活性を検Ｊ！Ｊ　した。対照としてベクタープラスミ
ドｐｃｍ　−ｉを用いて同様の方法で実験を行ない工Ｌ
−２活性を−１べた。結果を表−３に示す。

表−３ 史１ｆＣコｃＤ　ＩＬ−２活性は、マウス抗ヒトエＬ−
２モ／クローナル抗体によって中和され、工Ｌ−２活性
は１　ｕ／罰以下となった。

実施例 実施例１と同様の方法で変異クローン化して得られたイ
、ンターロイキン２自発産生株Ｊ−Ａｌ２Ｏ２（ＡＴＯ
Ｃ！　ＯＲＬ　８１５０）を同様に回転培養瓶にて大最
に′ｉ培養増殖させ’ｌＸＩＤ６個／１Ｒ１の細胞密度
で新鮮：に゛ｒ、、工Ｔｏ−５５−９培地に再懸濁し８
時間後の細胞を集め、本細胞５Ｘ１０９個より実施例１
同様に１１〜１２Ｓ画分のインターロイキン２に対応す
るｍＲＮＡが得られる。

以下、実施例１と同様の方法により二重鎖ｃＤＮＡを合
成し、ｐＢＲ１１２２ベクターにｄｃ−ｄＱ　ｔａｉｌ
法で組み込み、この組換えＤＮＡをエシェリヒア・瓢 コ、□リ−χ１７７６にトランスホームして、形質転侯
株約４０００株を得た。Ｇｖｕｎｓｔｅｉｎ　−Ｈｏｇ
ｎｅｓｓ　の方法を用いてプローブとしてプラスミドｐ
３−１６（’ＤＮＡと相同性のあるクローンを３個選別
した。

すなわち、これらはインターロイキン２遺伝子をもつク
ローンであることがｆｆ＋Ｅ明された。

【図面の簡単な説明】

図−１はインターロイキン２活性を持つボリペプチドを
コードしつる逍伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＯＲｉ工Ｌ’−しの造成経過の説明図であ
る。 生゛１許出願人　財団法人　癌研究会 同　　味の素株式会社 東京都中央区京橋１丁目５番８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ｉ）　　インターロイキン２活性を持つポリペプチド
   をコードし５る遺伝子が接続されているレプリコンを有
   する組換え体微生物。 （２）　　インターロイキン２がヒトインターロイキン
   ２である特許請求の範囲第１項記載の組換え体微生物。 （３）　　インターロイキン２活性を持つポリペプチド
   をコードしうる遺伝子が、ショ糖密度勾配遠心法による
   分画により１１〜１２ｓ画分として得られヒトリンパ球
   由来細胞より分離されるメツセンジャーＲＮＡより調製
   されたものである特許請求の範囲第１項記載の組換え体
   微生物。′ （４）　　インターロイキン２活性を持つポリペプチド
   をコードしうる遺伝子が、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｂ
   ｓｔＮＩ　、　ＸｂａＩおよびＢｓｔ、ＮＩで切断され
   る個所がこの順序で配置されている部分を含むものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の組換え体微生物。