JPH01157394A - ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 - Google Patents
ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有する真核生物を形質転換す
るためのベクターおよび該ベクターにより形質転換され
た真核生物に関する。
ドをコードする遺伝子を含有する真核生物を形質転換す
るためのベクターおよび該ベクターにより形質転換され
た真核生物に関する。
インターロイキン２はその特異な免疫応答作用から医薬
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
トＴ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
トＴ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、。
１５２巻、 １７０９頁、 １９８０年）。
しかし、このヒトＴ白血病細胞株によるインターロイキ
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の方法として、イン
ターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクターに
組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微生
物により生産させることが考えられる。
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の方法として、イン
ターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクターに
組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微生
物により生産させることが考えられる。
本発明者らは微生物により生産させるために必要なイン
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
ヒト
すなわち、本発明は、ゝママ′ンターロイキン２活性を
もつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する真核生
物を形質転換するためのベクターならびに該ベクターに
より形質転換された真核生物に関する。
もつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する真核生
物を形質転換するためのベクターならびに該ベクターに
より形質転換された真核生物に関する。
本発明のベクターにコードされるポリペプチドは分子中
に以下のアミノ酸配列を有するものである。
に以下のアミノ酸配列を有するものである。
八ｌａ Ｐｒｏ Ｔ１１ｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
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Ｔｈｒ Ｌｅｕｈｒ 上記ポリペプチドをコードする遺伝子は、そのＤＮＡｇ
ｌ中に制限酵素ＢｓｔＮＬ、 Ｘｂａ４および８ｓｔＮ
Ｉで切断される個所がこの順序で配首されている部分を
含み、以下のポリペプチド■又はＩＩをコードするもの
であり、以下の塩基配列Ｉ又は■１を有するものである
。
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ｌ中に制限酵素ＢｓｔＮＬ、 Ｘｂａ４および８ｓｔＮ
Ｉで切断される個所がこの順序で配首されている部分を
含み、以下のポリペプチド■又はＩＩをコードするもの
であり、以下の塩基配列Ｉ又は■１を有するものである
。
ポリペプチド■
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Ｃ八ＴＣＴＣ：Ａ ＡＣＡ ＣＴＡＡＡＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２Ｓ画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分難されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡと略称する。）より調製される。
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Ｔｈｒ Ｌｅｕｈｒ 塩基配列Ｉ 八ＴＧ ＴＡＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴ
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Ｃ八ＴＣＴＣ：Ａ ＡＣＡ ＣＴＡＡＡＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２Ｓ画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分難されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡと略称する。）より調製される。
即ち、インターロイキン２産生能を有するリンパ球由来
細胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜１
２３画分のｍＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えはエ
シェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエシ
ェリヒア・コリ細胞内て増巾せしめ、インターロイキン
２ポリペプチドを発現しつるＤＮＡを有するクローンを
単離し、単離されたクローンが有するプラスミド中に挿
入されているＤＮＡを分列すればよい。
細胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜１
２３画分のｍＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えはエ
シェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエシ
ェリヒア・コリ細胞内て増巾せしめ、インターロイキン
２ポリペプチドを発現しつるＤＮＡを有するクローンを
単離し、単離されたクローンが有するプラスミド中に挿
入されているＤＮＡを分列すればよい。
本発明のインターロイキン２活性をもつポリペプチドを
コードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに接続し
て得られた組換えＤＮＡを真核生物細胞内に導入すれば
、その真核生物をインターロイキン２生産能を有するよ
うに形質転換することができる。
コードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに接続し
て得られた組換えＤＮＡを真核生物細胞内に導入すれば
、その真核生物をインターロイキン２生産能を有するよ
うに形質転換することができる。
ｍＲＮＡは、上記したように、インターロイキン２に対
応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２Ｓ画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出９分離することによって製造できる。
応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２Ｓ画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出９分離することによって製造できる。
本発明に用いるインターロイキン２産生能を有するヒト
リンパ球由来細胞を例として説明すれば、ヒト末梢血、
扁桃腺、牌臓等より得られるリンパ球そのものも含まれ
る。また、これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗
血清−補体処理。
リンパ球由来細胞を例として説明すれば、ヒト末梢血、
扁桃腺、牌臓等より得られるリンパ球そのものも含まれ
る。また、これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗
血清−補体処理。
密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガラクト
ース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並びにＸ
線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理等に
よりインターロイキン２の産生能が付与されたものも本
発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。さらに、これ
らヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴリンパ球をＴリ
ンパ球成長因子等の存在下にクローン化したように、ク
ローン化したものも好ましいヒトリンパ球由来細胞であ
る。
ース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並びにＸ
線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理等に
よりインターロイキン２の産生能が付与されたものも本
発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。さらに、これ
らヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴリンパ球をＴリ
ンパ球成長因子等の存在下にクローン化したように、ク
ローン化したものも好ましいヒトリンパ球由来細胞であ
る。
また、ヒト白血病細胞およびＴリンパ腫細胞のようなヒ
トリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞
を上記のような前処理もしくは変異処理したものまたは
悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒトリ
ンパ球由来細胞として用いることができる。特にクロー
ン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い
。
トリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞
を上記のような前処理もしくは変異処理したものまたは
悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒトリ
ンパ球由来細胞として用いることができる。特にクロー
ン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い
。
さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＣＥ ！Ｊ 。
Ｍｏ１ｔ４Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる、いわゆるハイブリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
られる、いわゆるハイブリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
これらヒトリンパ球由来細胞には（１）自発的にインタ
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生するものがある。
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生するものがある。
ヒトリンパ球由来細胞にインターロイキン２ｍＲＮＡを
生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産生株
を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養すれ
ばよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を産
生する細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ロ
ーズウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート１
８４０ （以下、ＲＰＭＩ １６４０と略記する。）培
地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ）培地、クリック
培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有し
ても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜
４ Ｘ １０６個／ｍＡの細胞密度で懸濁し、ここにマ
イトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；
塩化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリ
ジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後
、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産生株
を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養すれ
ばよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を産
生する細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、ロ
ーズウェル・パーク・メモリアル・インスチチュート１
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地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
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培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有し
ても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜
４ Ｘ １０６個／ｍＡの細胞密度で懸濁し、ここにマ
イトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；
塩化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリ
ジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後
、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
マイトゲン刺激の際にマクロファージやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
Ｄａｕｄｉ、に５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共存させ
ると同様にインターロイキン２の産生能がみられるよう
な細胞があり、これらの細胞を用いてインターロイキン
２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの細胞の
存在下にマイトゲン刺激を行なう。このようにすると、
ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
Ｄａｕｄｉ、に５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共存させ
ると同様にインターロイキン２の産生能がみられるよう
な細胞があり、これらの細胞を用いてインターロイキン
２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの細胞の
存在下にマイトゲン刺激を行なう。このようにすると、
ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることかできることか判っ
た。
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることかできることか判っ
た。
リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン２のｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
、インターロイキン２のｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間である。徒
らに培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン２
のｍＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭＡやＴＰＡなとのホルボールエステル類を
ｌθ〜５０ｎｇ／ｍＩ！添加することもある。培養温度
は３２〜３７℃の範囲が望ましい。
らに培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン２
のｍＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭＡやＴＰＡなとのホルボールエステル類を
ｌθ〜５０ｎｇ／ｍＩ！添加することもある。培養温度
は３２〜３７℃の範囲が望ましい。
以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒト
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
（イ）リンホカイン自発産生株の取得
ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立筋センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）をＩＸＩＱ’個／ｍＱの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合計ａ、ｏｏｏレントゲンのＸ線照射を行なう。この
後、本細胞を０．１細胞／２００μＰの細胞密度で９６
穴の平底マイクロタイタープレート（「ファルコン３０
７２Ｊ ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリック培
地中で３週間３７℃にて５％Ｃ０２インキユベーター中
にて培養する（限界希釈法によるクローニング）。細胞
の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面
全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社製培
養プレートに穆し、２ｍβのクリック培地中にて５日間
細胞を増殖させる。
（フレッド ハッチンソン・癌研究所／シアトル／アメ
リカ、ソータ研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ
国立筋センター／ハイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）をＩＸＩＱ’個／ｍＱの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合計ａ、ｏｏｏレントゲンのＸ線照射を行なう。この
後、本細胞を０．１細胞／２００μＰの細胞密度で９６
穴の平底マイクロタイタープレート（「ファルコン３０
７２Ｊ ）に添加し、５％牛脂児血清を含むクリック培
地中で３週間３７℃にて５％Ｃ０２インキユベーター中
にて培養する（限界希釈法によるクローニング）。細胞
の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が底面
全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社製培
養プレートに穆し、２ｍβのクリック培地中にて５日間
細胞を増殖させる。
十分量の細胞が得られた場合には、本細胞を２×１０６
個／ｍρの細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含
まない無血清合成培地２ｒｎＲに懸濁して２日間培養し
、本培養上清を３．（１（ｌＱｒｐｍ、 ５分間の遠
心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリボアフィ
ルターにてデブリス除去と無菌化を行なってインターロ
イキン２を得る。こうして得られるクローン細胞よりイ
ンターロイキン２産生株が得られる。
個／ｍρの細胞密度にて血清も血清由来アルブミンも含
まない無血清合成培地２ｒｎＲに懸濁して２日間培養し
、本培養上清を３．（１（ｌＱｒｐｍ、 ５分間の遠
心分離操作で分離し、次いで０．２２μのミリボアフィ
ルターにてデブリス除去と無菌化を行なってインターロ
イキン２を得る。こうして得られるクローン細胞よりイ
ンターロイキン２産生株が得られる。
（ロ）ヒト末梢血Ｔリンパ球よりインターロイキン２ａ
生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をｌＸｌ０６個／ｍＲの細胞密度でクリック培地
に懸濁し、各２ｍＲ宛２４穴のヌンクの培養プレートに
接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社
製）を５μｇ／ｒｎＲの終末濃度になるように１００μ
！！添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細
胞を培養液で洗浄し、再びｌＸｌ０’個／ｍＲの細胞密
度で元のヌンクの培養プレートに１ ｍｊｌ宛まく。各
ウェルにヒトの牌臓細胞をコンカナバリンＡ（以下、Ｃ
ｏｎＡと略称する。） ２．Ｊｚｇ１０＋１！で４８時
間刺激して得たコンディショニングした培養液を１ ｍ
Ａ＋添加し、３日間同様の培養を繰り返し、ヒト末梢血
より得たＴリンパ球を長期縫代培養する。このように長
期縫代培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希
釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。こうして
得られたクローン化Ｔリンパ球をｌＸ１０６個／ｍＲの
細胞密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、ここに１
０μｇ／ｌｌ１１！の終末濃度になるようにフィトヘマ
グルチニンＣＰ）ＩＡ）を添加し、２４時間、３７℃で
７．５％ＣＯ２インキュベーター中にて培養し、本培養
上清を３，０００ｒｐｍ、 ５分間の遠心分離操作で分
離し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化
を行ないインターロイキン２が得られる。こうして得ら
れるクローン化細胞よりインターロイキン２産生株が得
られる。
生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
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に懸濁し、各２ｍＲ宛２４穴のヌンクの培養プレートに
接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ社
製）を５μｇ／ｒｎＲの終末濃度になるように１００μ
！！添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細
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度で元のヌンクの培養プレートに１ ｍｊｌ宛まく。各
ウェルにヒトの牌臓細胞をコンカナバリンＡ（以下、Ｃ
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間刺激して得たコンディショニングした培養液を１ ｍ
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より得たＴリンパ球を長期縫代培養する。このように長
期縫代培養して得たＴリンパ球を、前述と同様の限界希
釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。こうして
得られたクローン化Ｔリンパ球をｌＸ１０６個／ｍＲの
細胞密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、ここに１
０μｇ／ｌｌ１１！の終末濃度になるようにフィトヘマ
グルチニンＣＰ）ＩＡ）を添加し、２４時間、３７℃で
７．５％ＣＯ２インキュベーター中にて培養し、本培養
上清を３，０００ｒｐｍ、 ５分間の遠心分離操作で分
離し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌化
を行ないインターロイキン２が得られる。こうして得ら
れるクローン化細胞よりインターロイキン２産生株が得
られる。
（ハ）マイトゲン刺激でインターロイキン２を生産する
ヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカット
細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ−
１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地中にてＣｏｎＡ ＩＯμｇ／ｍｆ
やＰＨＡ ２．５μｇ／ｍｐ の存在下に２４時間培
養すると、ｌＯ〜４，０００単位／ｍβのインターロイ
キン２を産生ずることが判明した。また、塩化亜鉛、プ
ロティンＡ、ビシバニール存在下に培養しても、インタ
ーロイキン２を産生ずる。
ヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカット
細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ−
１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含むＲ
ＰＭＩ １６４０培地中にてＣｏｎＡ ＩＯμｇ／ｍｆ
やＰＨＡ ２．５μｇ／ｍｐ の存在下に２４時間培
養すると、ｌＯ〜４，０００単位／ｍβのインターロイ
キン２を産生ずることが判明した。また、塩化亜鉛、プ
ロティンＡ、ビシバニール存在下に培養しても、インタ
ーロイキン２を産生ずる。
（ニ）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
２を産生する細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１
ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカ
ット細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノ力インの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０ｕ／ａｌｌまたはに５６２や
ラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１ｘｉｏ’細胞／１１１１！
当り０．５×１０６個ＺｌＩＩＮ相当共存させてクリッ
ク培地中にて３７℃、２４時間培養すると、インターロ
イキン２を１０〜１００ｕ／ｍ１産生する。
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
２を産生する細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１
ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカ
ット細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノ力インの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０ｕ／ａｌｌまたはに５６２や
ラージ（Ｒａｊｉ）細胞を１ｘｉｏ’細胞／１１１１！
当り０．５×１０６個ＺｌＩＩＮ相当共存させてクリッ
ク培地中にて３７℃、２４時間培養すると、インターロ
イキン２を１０〜１００ｕ／ｍ１産生する。
このようにして得られた細胞よりインターロイキン２に
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａ
ｓｅによるＲＮへの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボネ
イト、バナジウム複合体などに添加しておくのが好まし
い。また、必要に応じては、インターロイキン２に対応
する抗体を用いてインターロイキン２合成途上のポリゾ
ームを沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤など
で抽出することができる。ｍＲＮＡはオリゴｄＴ−セル
ロース、ポリローセファロース、セファロース２Ｂなど
の吸着カラムあるいはバッチ法による精製法、ＳＤＧ遠
心法による分画等によって精製することができる。この
ような精製操作によりインターロイキン２に対応するｍ
ＲＮＡは１ｌ−１２ｓ画分として得られる。
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮａ
ｓｅによるＲＮへの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボネ
イト、バナジウム複合体などに添加しておくのが好まし
い。また、必要に応じては、インターロイキン２に対応
する抗体を用いてインターロイキン２合成途上のポリゾ
ームを沈降せしめ、これよりｍＲＮＡを界面活性剤など
で抽出することができる。ｍＲＮＡはオリゴｄＴ−セル
ロース、ポリローセファロース、セファロース２Ｂなど
の吸着カラムあるいはバッチ法による精製法、ＳＤＧ遠
心法による分画等によって精製することができる。この
ような精製操作によりインターロイキン２に対応するｍ
ＲＮＡは１ｌ−１２ｓ画分として得られる。
上記の如くして得られたｍＲＮＡか目的とするインター
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳
させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小麦胚
芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわれて
いる。
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳
させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小麦胚
芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわれて
いる。
ここに用いたインターロイキン２の活性検定法は次の通
りである。即ち、検体１００μ２を９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭｌ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６穴マイクロプレート上において各１００ｕＲの希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４
Ｘ １０３個／１００ｄの細胞密度として１ｏ０４１＋
宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
０，５ μＣｉを加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、細胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清はど活性化Ｔリンパ球内にとり
込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体中
に含有されるインターロイキン２量を容易に知ることが
できる。
りである。即ち、検体１００μ２を９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭｌ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６穴マイクロプレート上において各１００ｕＲの希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４
Ｘ １０３個／１００ｄの細胞密度として１ｏ０４１＋
宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
０，５ μＣｉを加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、細胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清はど活性化Ｔリンパ球内にとり
込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体中
に含有されるインターロイキン２量を容易に知ることが
できる。
またインターロイキン２はＴリンパ球を分裂増殖せしめ
る作用がありこの作用によるＴリンパ球増殖活性の検定
法は次の通りである。
る作用がありこの作用によるＴリンパ球増殖活性の検定
法は次の通りである。
検体１００μ！を９６穴マ、イクロタイタープレートの
１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ
培地を２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上
において各１００μ！の希釈系列を作成する。そこに上
述活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μρの細胞密度と
して１００μｇ宛各くぼみに添加する。
１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ
培地を２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上
において各１００μ！の希釈系列を作成する。そこに上
述活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μρの細胞密度と
して１００μｇ宛各くぼみに添加する。
３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中７２時間もし
くは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存
する活性化Ｔリンパ球数をカウントする。
くは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存
する活性化Ｔリンパ球数をカウントする。
この際、１００ｕ／ｍｆｆ 、 ｌＯｕ／ｍｉ＋の活性
を有するインターロイキン２をポジティブ・コントロー
ルとして用い、検体添加群におけるＴリンパ球の増殖数
と比較し、検体のインターロイキン２活性を算出する。
を有するインターロイキン２をポジティブ・コントロー
ルとして用い、検体添加群におけるＴリンパ球の増殖数
と比較し、検体のインターロイキン２活性を算出する。
かくして得られたインターロイキン２ ｍＲＮＡよりイ
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のような方法で行
なうことかできる。
なうことかできる。
ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして、
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下
で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃＤＮＡを
合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、除去した
後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写酵素ある
いはＤＮＡポリメラーセを用いて二重１ＪｌｃＤＮＡを
合成する。得られたＤＮＡの両端を必要によりエキソヌ
クレエースで処理し、それぞれに適当なリンカ−ＤＮＡ
を接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を
複数個重合せしめる。しかる後、これを例えばエシェリ
ヒア・コリ内で自律複製できるレプリコンを含むベクタ
ーに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素
で切断し、必要により適当なリンカ−またはアニーリン
グ可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。このよう
に加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リ
ガーゼを用いて接続せしめる。
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下
で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃＤＮＡを
合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、除去した
後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写酵素ある
いはＤＮＡポリメラーセを用いて二重１ＪｌｃＤＮＡを
合成する。得られたＤＮＡの両端を必要によりエキソヌ
クレエースで処理し、それぞれに適当なリンカ−ＤＮＡ
を接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を
複数個重合せしめる。しかる後、これを例えばエシェリ
ヒア・コリ内で自律複製できるレプリコンを含むベクタ
ーに組込む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素
で切断し、必要により適当なリンカ−またはアニーリン
グ可能な組合せの塩基を複数個重合せしめる。このよう
に加工した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リ
ガーゼを用いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス、サツカロマイセス
・セレビシェ等も使用できる。エシェリヒア・コリの場
合に使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核
酸酵素２６＠４号（１９８１）参照） εに系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３、ｐＲに６４６． ｐＲに
２４８． ｐＤＦ４１等。
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス、サツカロマイセス
・セレビシェ等も使用できる。エシェリヒア・コリの場
合に使用されるベクターを以下に例示する。（蛋白質核
酸酵素２６＠４号（１９８１）参照） εに系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｃｌｏｌ、 ｐＲＫ３５３、ｐＲに６４６． ｐＲに
２４８． ｐＤＦ４１等。
εに系プラスミドベクター（リラックスド型）のＣａ１
Ｅ１． ｐＶＨ５１，ｐＡｃ１０５． Ｒ５Ｆ２１２４
． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９゜ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢ
Ｒ３２８，ｐＫＹ２２８９． ｐＫＹ２７００． ｐＫ
Ｎ８０． ｐＫＣ７゜ｐＫＢ１５８． ｐＭＫ２００４
． ｐＡｃＹｃｌ、 ＭＣＹＣｌ３４．λｄｕ１等。
Ｅ１． ｐＶＨ５１，ｐＡｃ１０５． Ｒ５Ｆ２１２４
． ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９゜ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢ
Ｒ３２８，ｐＫＹ２２８９． ｐＫＹ２７００． ｐＫ
Ｎ８０． ｐＫＣ７゜ｐＫＢ１５８． ｐＭＫ２００４
． ｐＡｃＹｃｌ、 ＭＣＹＣｌ３４．λｄｕ１等。
λｇｔ系ファージベクターのλｇｔ・λＣ９λｇｔ・λ
Ｂ。
Ｂ。
λＷＥＳ−λＣ１λＷＥＳ−λＢ′、 λＺＪｖｉｒ・
λＢ′、 λＡＬＯ−λＢ。
λＢ′、 λＡＬＯ−λＢ。
λＷＥＳ−Ｔｓ６２２．λＤａｍ等。
これらのベクターのうちエシェリヒア・コリについては
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
ｐＢＲ３２２の場合にはｃＤＮＡの組込み場所はＰｓｔ
Ｉサイト、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
Ｉサイト、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣρ２処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込ま
せる方法が採用されており、ＭｇＣＲ２あるいはＲｂＣ
１’をさらに共存させることにより形質転換の効率が一
層増すことも知られている。また、微生物細胞をスフェ
ロプラストあるいはプロトプラスト化してから形質転換
させてもよい。
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣρ２処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込ま
せる方法が採用されており、ＭｇＣＲ２あるいはＲｂＣ
１’をさらに共存させることにより形質転換の効率が一
層増すことも知られている。また、微生物細胞をスフェ
ロプラストあるいはプロトプラスト化してから形質転換
させてもよい。
形質転換株からインターロイキン２遺伝子が組込まれて
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法と称される
もので、まずＣｏｎＡによって刺激したジュルカット細
胞よりＩＩＩＲＮ八を抽出し、ＳＤＧ遠心法によってイ
ンターロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（１１
〜１２３ ｍＲＮＡ）、このｍＲＮＡを用いて３２ｐに
よりラベルした１木鎮ｃＤＮＡを合成する。ついでｃＤ
ＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理によっ
て除いた後、このｃＤＮＡとＣｏｎＡで刺激していない
ジュルカット細胞より抽出した１１〜１２３ ｍＲＮ
Ａの部分精製ｍＲＮＡの過剰とハイブリダイズさせる。
もので、まずＣｏｎＡによって刺激したジュルカット細
胞よりＩＩＩＲＮ八を抽出し、ＳＤＧ遠心法によってイ
ンターロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（１１
〜１２３ ｍＲＮＡ）、このｍＲＮＡを用いて３２ｐに
よりラベルした１木鎮ｃＤＮＡを合成する。ついでｃＤ
ＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理によっ
て除いた後、このｃＤＮＡとＣｏｎＡで刺激していない
ジュルカット細胞より抽出した１１〜１２３ ｍＲＮ
Ａの部分精製ｍＲＮＡの過剰とハイブリダイズさせる。
そしてこのＣｏｎＡ！１ｉｌＪｉＸしていないｍＲＮＡ
にハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリットを
形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによ
って分画し、それぞれプローブＡおよびプローブＢとす
る。
にハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリットを
形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによ
って分画し、それぞれプローブＡおよびプローブＢとす
る。
次に前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ２枚
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさせ
た後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡに
はポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには弱
く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを検
索する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｉ’、、 Ｐａ
ｏｃ、 Ｊｐｎ。
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさせ
た後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡに
はポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには弱
く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを検
索する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｉ’、、 Ｐａ
ｏｃ、 Ｊｐｎ。
Ａｃａｄ、、 ｖｏｆｆ ５５Ｂ、 ４６４〜４６９（
１９７９））。
１９７９））。
あるいは形質転換株、たとえば１０００〜１０，０００
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により車＆ＪＩＩＤＮＡにしてニトロセルロースフィ
ルターに固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述した
ようなインターロイキン２ ｍＲＮＡを含むヒトＴ白血
球細胞より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により車＆ＪＩＩＤＮＡにしてニトロセルロースフィ
ルターに固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述した
ようなインターロイキン２ ｍＲＮＡを含むヒトＴ白血
球細胞より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。
あるいはＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキ
ン２ ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた
後、ＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロース
フィルターに固定する方法もある。
ン２ ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた
後、ＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロース
フィルターに固定する方法もある。
次に、このフィルターを１ ｍＭピベス、 １０ｍＭＮ
ａＣＲのような低塩溶液でよく洗浄した後、０ 、５
ｍ ＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＤＳのような溶液で、例
えば９５℃。
ａＣＲのような低塩溶液でよく洗浄した後、０ 、５
ｍ ＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＤＳのような溶液で、例
えば９５℃。
１分間程度の熱処理を行なってフィルターに吸着したｍ
ＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セルロ
ースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡを回
収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵
母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキン２
活性を測定する。あるいはウサギ網状赤血球ないしは小
麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた後
、インターロイキン２抗体でインターロイキン２を検定
する。
ＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セルロ
ースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡを回
収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵
母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキン２
活性を測定する。あるいはウサギ網状赤血球ないしは小
麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた後
、インターロイキン２抗体でインターロイキン２を検定
する。
かくしてインターロイキン２活性の検出された集団が見
出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化して
より小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的に
は単数のクローンに細分化し、インターロイキン２ポリ
ペプチドをコートするＤＮＡを含むクローンを単離する
。
出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化して
より小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的に
は単数のクローンに細分化し、インターロイキン２ポリ
ペプチドをコートするＤＮＡを含むクローンを単離する
。
得られたクローンよりインターロイキン２ポリペプチド
をコートするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたヘクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せはよい。
をコートするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたヘクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せはよい。
インターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮへの
構造は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（Ｍｅｔ
ｈ。
構造は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（Ｍｅｔ
ｈ。
Ｅｎｚｙｍ、 ６５．４９９−５６０．１９８０）およ
びジデオキシヌクレオチド鎗終結法（Ｓｍｉｔｈ、 Ａ
、 Ｊ、 ＩＣ，Ｍｅｔｈ。
びジデオキシヌクレオチド鎗終結法（Ｓｍｉｔｈ、 Ａ
、 Ｊ、 ＩＣ，Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍ、 ６５．５６０−５８０．１９８０）等を
用いる常法により決定できる。
用いる常法により決定できる。
本発明において単離され、インターロイキン２活性をも
つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもので
ある。
つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもので
ある。
／
＼、 。
コく ロω コ← ａ、＋ｉ＋Ｉ
−← −ロ らロ −■ −ト
ーく
ｚｃｐ ｚ＋ ｃａ＋ ｚｃｐ
ＶＪ Ｃ−）−（： ψく ・−く ψく：）−１０
ロＱ くく ＝ω くく ｃ−）ト ｓ−＜ Ｃ／）ロ η＜ Ｘ＜ −← ＝Ｃ−） 島く ≧く 為く ＯＣ＋）ｌ−１＜−＜―＜―＜ ｌ← ｌく −ω コロ Ｌω コロ 為く ≧＜ ａ）← ０口 ａ）← −＜Ｅ−４← −Ｑ りく −ω φロ ２← コく ｚく コＣ−１＞−ｅ い−ｃｅ −−ｄ： −−ｔｆ
：Ｃ）← −＜＜＜ コロ コロ コロ Ｌ＜２← −＜ＣＯ← ｚ＜ ：ω φ＜ ｊｃＪ −ロ ーく ←＜ ＜＜ Ｆ−＜ ＜口（コ （コ Ｌ−１−ｍ Ｗ← ΦＱ コく コロ ０Ｑ −← −ロ ０← ａ）← り← −く くロ −← Σく ＬＥ−≧く ηロ ｚト 関口 ωＣ−ロ 為く φく −ロ ｒく コロ ―＜＜＜ くく Ｖ＜Ｚ← ηロ コく ＬＩ（Ｊ（Ｌｌω ψく トく ｏヒ 為く り← ＜＜―＜ −■ ←← 一← コｌｊＯω −ロ ーＩＪＣ！：ｌ ：ω ０← −Ｑ Φ←ａ）← ←
＜−トｃＬＩＣ＋）〉口 Σく ０← Ｃ）← −ロ コく く −ω −← Ｃ）← −く ω 乙ＣＪ １−１＜ ：Ｓ：＜ Φじく ← コ＜４））−Ｉ ← ← ト ーく −）−１ロ く ロ ・ コロ −＜Ｅ−＠ ← ト 拳 ヒ ω く ・ −Ｉ−１ＱＩロ ロ く ← 拳ロ ｃ
＋）−Ｃ＋：Ｊ ロ く ← φｌ ト
← ト ロ く く ・ロ く
← Φ ≧＜ ｔＣ＜ ＜ Ｉｍ ← −一 Ｃ＋！
：Ｉ ＬＩ １＋：Ｉ Ｑ ← く
・コロ く＜ ← ω ← Φ く ← ← Φ Ｃ／） ロ ｚｃｐ ← く ←
・≧く ψ ＜＜＜＜ 番 −＜＜＜ ロ Ｅ−Ｉ ← く ＜ト＜＜ コく コロ く Ｑ く く Φ ＋ｃ）← く ← く く−ロ −（
Ｊ ＜ Ｅ−＜ ＜← く ω く コく Φ← ← ← Ｑ く −＜：← ＣＪ Ｅ−Ｃｊ Ｅ−ロ ロ ロ、
← ＜＜ト＜ ω ← く ← コロ コロ ← く ← く ← ← く ← 一← −く ロ ｃ５ ← く −← Φ← ロ ← ← ロ 〉ロ 〉ｃ！：＋ｌ−Ｉ ← Ｑ ←ロ く く
← Ｑ ＜ Ｑ ← く ← Ｑ トー←
−← く ロ ト ー＜−＜ ← Ｃ−ｌｌ−１＜ ← く ← く −＜Ｌ、ＩＣ−）＜ ← ロ く ｃｃ５Ｉ−１ＩＣＪ ＜ ＣＪ Ｃｊ
Ｅ−〉ロ ←く ← ロ ト く ← く く ２ＣＪ Φく く ← く Ｃ／） ＜： −４ｃ−）ＣＪ Ｅ−−ｔｆ：
←＜＜＜ロ ← ロ く ← ω Φく −Φ ＬＣＪ コロ ロ −ω ０← 為＜−＜ ロ くロ Σ＜Ｅ−＠← コロ ← ω −← ２Φ ０← コロ ｃ−＋ ０ｃ５−く −ｅ← ０← ← ｌく ロω −← −Ｑ 口 （： ２Ｃ＋１ コく ｃＡ口 ０トく りく ０！
−１≧（： Ｌ口 ω くく −← −く 乙り ← ＣＪ Ｌ＜Ｃｓ、← ０← ｌく Ｑ −ロ ψく ＝← ≧く ＜ Ｅ−＜ ＜Ｃｊ：ｌ Ｑ−ト一（：く ← −Ｑ コＣ５Ｌ＜ コロ 口 ＣＯ← Ｑ ← ＝ ω ω ←く 〉ロ
ーｃ−）１−＜ −〇 〇 く コヒ コロ コロ コく ロ Φ← Ｃ）← ０← −く ト −ω −ω −ω コロ く の＜＝＜ −ロ コく く ω コ← ｔＡ← ｅ１ｏロ コく Ｅ＋Ｉａ）← −く Ｌロ −く ＜−Ｑ：Ｉ：ｃ＋）＜＜ コロ く ）−１−← コ＋＋５−〇 コく Ｅ−Ｉａ、＋ロ −く ＝ω Φト ← ｌ＜ コロ ←く −ω ← コく コロ コｃ＋１ｃ／３← ロ ω← ０← ω← 冶口 ← −Ｑ −ω −ω ω← ω く ロく ｚく ψく ２口 ω −ＣＪ −−ｅｃ ≧＜−＜ Ｅ−＜Ｃｊ Ｃ＋：５０−く ロω 上記塩基配列の中、分子量が１５０００ダルトンである
と報告されているインターロイキン２をコードできるフ
レームは、上記塩基配列に示されているものたけである
。蛋白合成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧＴドン
から始まることが殆んどであるから、最初のイニシェー
ションコドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧへ
の前のＡＣＴ （スレオニン）迄がインターロイキン
２ポリペプチドに対応する塩基配列と考えられる。また
、インターロイキン２のような分泌蛋白においては疎水
性アミノ酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチドが存在
し、このペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ
酸に富んだＮ−末端部シグナルペプチドに相当するもの
と考えられる。したがって、例えばＡＴＧＴドンから２
１番目のコドンＧＣＡ （アラニン）よりターミネー
ションコドンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチド
であってもインターロイキン２活性を有するものと考え
られる。また、上記アラニン以後の又は上記スレオニン
以前のいくつかのアミノ酸がないものであって連続した
複数の塩基配列部であってもインターロイキン２蛋白の
活性部位を保持しているようなポリペプチドであるなら
ばインターロイキン２活性を有することが十分に考えら
れる。
ロＱ くく ＝ω くく ｃ−）ト ｓ−＜ Ｃ／）ロ η＜ Ｘ＜ −← ＝Ｃ−） 島く ≧く 為く ＯＣ＋）ｌ−１＜−＜―＜―＜ ｌ← ｌく −ω コロ Ｌω コロ 為く ≧＜ ａ）← ０口 ａ）← −＜Ｅ−４← −Ｑ りく −ω φロ ２← コく ｚく コＣ−１＞−ｅ い−ｃｅ −−ｄ： −−ｔｆ
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と報告されているインターロイキン２をコードできるフ
レームは、上記塩基配列に示されているものたけである
。蛋白合成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧＴドン
から始まることが殆んどであるから、最初のイニシェー
ションコドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧへ
の前のＡＣＴ （スレオニン）迄がインターロイキン
２ポリペプチドに対応する塩基配列と考えられる。また
、インターロイキン２のような分泌蛋白においては疎水
性アミノ酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチドが存在
し、このペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ
酸に富んだＮ−末端部シグナルペプチドに相当するもの
と考えられる。したがって、例えばＡＴＧＴドンから２
１番目のコドンＧＣＡ （アラニン）よりターミネー
ションコドンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチド
であってもインターロイキン２活性を有するものと考え
られる。また、上記アラニン以後の又は上記スレオニン
以前のいくつかのアミノ酸がないものであって連続した
複数の塩基配列部であってもインターロイキン２蛋白の
活性部位を保持しているようなポリペプチドであるなら
ばインターロイキン２活性を有することが十分に考えら
れる。
本発明のＤＮＡの５′−末端に、インターロイキン２遺
伝子の情報発現のために有害でない１又は複数の塩基が
配列されていてもよい。また、５′−末端に１又は複数
のアミノ酸を発現しつるような塩基が配列されていても
、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロイ
キン２活性を持つために有害でないものであったり、ま
た有害なものであっても容易に脱離できるようなもので
あれば、問題はない。
伝子の情報発現のために有害でない１又は複数の塩基が
配列されていてもよい。また、５′−末端に１又は複数
のアミノ酸を発現しつるような塩基が配列されていても
、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロイ
キン２活性を持つために有害でないものであったり、ま
た有害なものであっても容易に脱離できるようなもので
あれば、問題はない。
３′−末端についても同様に、ポリペプチドかインター
ロイキン２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。また
、ＤＮＡの化学合成などにより遺伝子の一部または遺伝
子構造から推論されるポリペプチドの一部を改変するこ
とも可能である。さらに、後記する実施例に記載したヒ
ト細胞以外の細胞より得たｍＲＮＡを用いて遺伝子を得
ることもできる。したがって、要はインターロイキン２
活性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡであれば本
発明において使用することができる。
ロイキン２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。また
、ＤＮＡの化学合成などにより遺伝子の一部または遺伝
子構造から推論されるポリペプチドの一部を改変するこ
とも可能である。さらに、後記する実施例に記載したヒ
ト細胞以外の細胞より得たｍＲＮＡを用いて遺伝子を得
ることもできる。したがって、要はインターロイキン２
活性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡであれば本
発明において使用することができる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
（１） １０容量／容量％の牛胎児血清を含有するＲＰ
ＭＩ１６４０培地で、当分野で良く知られた方法で培養
したヒトＴ白血病細胞ジェルカット細胞（日本。
ＭＩ１６４０培地で、当分野で良く知られた方法で培養
したヒトＴ白血病細胞ジェルカット細胞（日本。
アメリカ、西ドイツ等で自由に人手できる）を上記の培
地に懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
Ｓ １５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲ
ンの総照射線量を照射した。次いで、この照射された細
胞をｔｘｔｏ’個／ｍｐの細胞密度で上述の培地中で５
％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９６穴マ
イクロプレ一ト１０枚に０．２個／ｗｅｌｌになるよう
に本変異細胞を接種し、５％炭酸ガス中３７℃にて２１
日間培養した。細胞増殖の観察されたクローンを順次継
代増殖させ、次いで１×１０６個／Ｉβの細胞密度でＣ
ｏｎＡ ５０μｇ／ｍｘ存在下に２４時間培養し、培養
上清に放出されるインターロイキン２の産生量を前出の
方法で測定し、原ジュルカット細胞に比し産生量が４０
倍以上に改善された変異化クローン細胞ジュルカット１
１１株（ＡＴＣＧ ＣＲＩ、８１２９）を得た。本株は
通常の培養方法で増殖し、その増殖速度はジュルカット
細胞と同程度であった。
地に懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
Ｓ １５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲ
ンの総照射線量を照射した。次いで、この照射された細
胞をｔｘｔｏ’個／ｍｐの細胞密度で上述の培地中で５
％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９６穴マ
イクロプレ一ト１０枚に０．２個／ｗｅｌｌになるよう
に本変異細胞を接種し、５％炭酸ガス中３７℃にて２１
日間培養した。細胞増殖の観察されたクローンを順次継
代増殖させ、次いで１×１０６個／Ｉβの細胞密度でＣ
ｏｎＡ ５０μｇ／ｍｘ存在下に２４時間培養し、培養
上清に放出されるインターロイキン２の産生量を前出の
方法で測定し、原ジュルカット細胞に比し産生量が４０
倍以上に改善された変異化クローン細胞ジュルカット１
１１株（ＡＴＣＧ ＣＲＩ、８１２９）を得た。本株は
通常の培養方法で増殖し、その増殖速度はジュルカット
細胞と同程度であった。
（２）本ジュルカット１１１細胞株をｌＸｌ０’個／ｍ
ｆの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ５５−９１，Ｏ
ＯＯｍｆに懸濁し、ファルコン社製回転培養瓶に入れ、
３７℃で４日間培養し、遠沈操作により細胞を集めた。
ｆの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ５５−９１，Ｏ
ＯＯｍｆに懸濁し、ファルコン社製回転培養瓶に入れ、
３７℃で４日間培養し、遠沈操作により細胞を集めた。
この細胞を４ Ｘ １０８個／ｆｆ１Ｉ＋の細胞密度に
て上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎＡ ２５μｇ／
ｍｐを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶（４本）
に１．０００ｍＲで張り込み６時間回転培養した。
て上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎＡ ２５μｇ／
ｍｐを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶（４本）
に１．０００ｍＲで張り込み６時間回転培養した。
（３）このようにして得た（：ｏｎＡ ２５Ｂ／ｍＪで
６時間誘導したジュルカット細胞（１，２ｘ １０１０
細胞）をＰＢＳ （８液８００ｎｌに懸濁し、細胞を遠
心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であ
るＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ
Ｃｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ） を含んだＲＳＢ ｉ液（
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ、 ｐＨ７，５，１０ｍ
ＭＮａＣＲ，１，５ｍＭ ＭｇＣｊ’２） ８００ｍ
１に懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になるよ
うに加えた後、ゆるやかに攪拌後３，０００ｒｐｍで５
分遠心して核を除去し、その上清液にＳＤＳ （０，５
％）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後、ただちにフェ
ノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰返してから２容のエタノールでＲＮＡ
を沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ）、 ｐＨ７，５で溶解した。
６時間誘導したジュルカット細胞（１，２ｘ １０１０
細胞）をＰＢＳ （８液８００ｎｌに懸濁し、細胞を遠
心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であ
るＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ
Ｃｏｍｐｌｅｘ（１０ｍＭ） を含んだＲＳＢ ｉ液（
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ、 ｐＨ７，５，１０ｍ
ＭＮａＣＲ，１，５ｍＭ ＭｇＣｊ’２） ８００ｍ
１に懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になるよ
うに加えた後、ゆるやかに攪拌後３，０００ｒｐｍで５
分遠心して核を除去し、その上清液にＳＤＳ （０，５
％）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後、ただちにフェ
ノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰返してから２容のエタノールでＲＮＡ
を沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊ）、 ｐＨ７，５で溶解した。
このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮＡ
ｉは１９６ｍｇであフた。
ｉは１９６ｍｇであフた。
次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、 Ｔｙｐｅ７）を用い、カラムクロマトグラフ
ィーを行なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＩＪＩ
、 ｐＨ７，５，０，５Ｍ ＮａＣ！！。
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ、 Ｔｙｐｅ７）を用い、カラムクロマトグラフ
ィーを行なった。吸着は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＩＪＩ
、 ｐＨ７，５，０，５Ｍ ＮａＣ！！。
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．５％ ＳＤＳ溶液にＲＮＡ
を溶解して行ない、溶出は緩衝？＆ （２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ）、 ｐＨ７，５゜０．５ Ｍ ＮａＣ
Ｒ，１＋ｎＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１Ｏｎ＋ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）で交互にｍＲＮＡを溶
出することにより行なった。この結果、溶出されたｍＲ
ＮＡｆｆ１は３．６ｍｇであった。
を溶解して行ない、溶出は緩衝？＆ （２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ）、 ｐＨ７，５゜０．５ Ｍ ＮａＣ
Ｒ，１＋ｎＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１Ｏｎ＋ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）で交互にｍＲＮＡを溶
出することにより行なった。この結果、溶出されたｍＲ
ＮＡｆｆ１は３．６ｍｇであった。
さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４＋ｎｇ）をＳＤＧ
遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ、 ｐＨ７，５，１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ＭＮａＣ４’を含む５〜２５
％シ［密度勾配、Ｈｉ ｔ ａ ｃ ｈ １ＲＰＳ ２
８０−ターで２６．ＯＯＯｒｐｍ、 ２４時間、４℃）
して分画し、１１−１２ｓのｍＲＮＡ画分を分画番号１
２゜１３、１４としてそれぞれ５９ｕｇ、 ４６ａｇ、
６０ｕｇ得た。
遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ、 ｐＨ７，５，１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．２ＭＮａＣ４’を含む５〜２５
％シ［密度勾配、Ｈｉ ｔ ａ ｃ ｈ １ＲＰＳ ２
８０−ターで２６．ＯＯＯｒｐｍ、 ２４時間、４℃）
して分画し、１１−１２ｓのｍＲＮＡ画分を分画番号１
２゜１３、１４としてそれぞれ５９ｕｇ、 ４６ａｇ、
６０ｕｇ得た。
（４）ここに得られた分画番号１３のｍＲＮＡを前出の
検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１個当
り５０ｎｇをマイクロインジェクション法により注入し
て得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン２の活
性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化チミジ
ンの取り込みおよび活性化Ｔリンパ球数の増加がみられ
、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロイキ
ン２ ｍＲＮＡを含有することが証明された。
検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１個当
り５０ｎｇをマイクロインジェクション法により注入し
て得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン２の活
性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化チミジ
ンの取り込みおよび活性化Ｔリンパ球数の増加がみられ
、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロイキ
ン２ ｍＲＮＡを含有することが証明された。
表 −１
（イ）
（ロ）
・各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン２
（１０ｉｌ−位／ｍ２）と比較して求めた。
ｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン２
（１０ｉｌ−位／ｍ２）と比較して求めた。
（５）次に、ここで得られたインターロイキン２ｍＲＮ
Ａを含む１１〜１２３ ｍＲＮＡ分画１３よりｃＤＮＡ
をインビトロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ３２
２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア・コリ
にトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤＮＡク
ローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
Ａを含む１１〜１２３ ｍＲＮＡ分画１３よりｃＤＮＡ
をインビトロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ３２
２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア・コリ
にトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤＮＡク
ローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
（５−１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）１ｃｉ’緩衝液（
ｐＨ７，５）、 ３０ｍＭＮａＣＲ，６ｍＭ ＭｇＣｌ
２． ５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ） 、
０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄｃＴ［’
、 ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３２ｐラベルしたもの
を含む） 、 ０．７μｇオリゴ（ｄＴ）１０．１０μ
ｇｍＲＮＡおよび１５ユニット八ＭＶ逆転写酵素（Ｊ、
Ｗ、 Ｂｅａｒｄ）を混ぜ、４１℃に９０分間保った
。反応終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノー
ル沈澱としてＤＮＡを回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
ｐＨ７，５）、 ３０ｍＭＮａＣＲ，６ｍＭ ＭｇＣｌ
２． ５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ） 、
０．５ｍＭの各ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄｃＴ［’
、 ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３２ｐラベルしたもの
を含む） 、 ０．７μｇオリゴ（ｄＴ）１０．１０μ
ｇｍＲＮＡおよび１５ユニット八ＭＶ逆転写酵素（Ｊ、
Ｗ、 Ｂｅａｒｄ）を混ぜ、４１℃に９０分間保った
。反応終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノー
ル沈澱としてＤＮＡを回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ。
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７，５溶液に溶解した。これ
により約２．５μｇの１木鎖ｃＤＮＡが合成された。こ
の溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加え
て０．３３ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次い
で溶液をＩＭＴｒｉｓ−ｔｌｃｆ、 ｐｌ−１７，５の
等量で中和し「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通し
た。これにより１．８ＭｇのｃＤＮＡを回収した。
により約２．５μｇの１木鎖ｃＤＮＡが合成された。こ
の溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加え
て０．３３ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次い
で溶液をＩＭＴｒｉｓ−ｔｌｃｆ、 ｐｌ−１７，５の
等量で中和し「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通し
た。これにより１．８ＭｇのｃＤＮＡを回収した。
（５−２） ５０ ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ）１７
．５）、 １０ｍＭＭｇＧ４□、１０ｍＭ ＤＴＴ、
０．７５ｍＭの各ｃＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄ（
：ＴＰ。
．５）、 １０ｍＭＭｇＧ４□、１０ｍＭ ＤＴＴ、
０．７５ｍＭの各ｃＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄ（
：ＴＰ。
ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む
）。
）。
１．８μｇ １木釦ｃＤＮＡ、 ８ユニツトボリメレ
ース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）
を混ぜ、１５℃で１５時間反応を行なった。反応終了後
、フェノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない
、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応に
より１．１０Ｍｇの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
ース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）
を混ぜ、１５℃で１５時間反応を行なった。反応終了後
、フェノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない
、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応に
より１．１０Ｍｇの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
次いで、５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、
０．２ＭＮａＣＲ、１ｍＭ ＺｎＣ！！、２．１ｉｏＢ
二重１ＪｌｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分間インキュ
ベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアーゼＳ＋（
三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベートした
。反応終了後、フェノール処理を２回行ない、「セファ
デックスＧ−５ＯＪカラムに通し、０ 、５ Ｆｌμｇ
の二重１１ｃＤＮＡを回収した。
０．２ＭＮａＣＲ、１ｍＭ ＺｎＣ！！、２．１ｉｏＢ
二重１ＪｌｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分間インキュ
ベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアーゼＳ＋（
三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベートした
。反応終了後、フェノール処理を２回行ない、「セファ
デックスＧ−５ＯＪカラムに通し、０ 、５ Ｆｌμｇ
の二重１１ｃＤＮＡを回収した。
（５−３） ０．１４Ｍカコジル酸カリウム、 ３０
ｍＭ トリス塩基、 ０．１ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
ＣｏＣ！！２．０．６４ｍＭ ３２Ｐ −ｄＣＴＰ
（比活性２．７Ｘ １１０６ｃｐ／ｎｍｏＮ） 、 ０
．５５Ｍｇ二重鎮ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミナ
ルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７℃で７分間
インキュベートし、反応終了後、フェノール処理１回を
行ない、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通しエタ
ノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０Ｍｇを回収したとこ
ろ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加された。
ｍＭ トリス塩基、 ０．１ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
ＣｏＣ！！２．０．６４ｍＭ ３２Ｐ −ｄＣＴＰ
（比活性２．７Ｘ １１０６ｃｐ／ｎｍｏＮ） 、 ０
．５５Ｍｇ二重鎮ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミナ
ルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７℃で７分間
インキュベートし、反応終了後、フェノール処理１回を
行ない、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通しエタ
ノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０Ｍｇを回収したとこ
ろ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加された。
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ、 ｇ、９’１ｉ−１１
３（１９７７、））廿＝カ：イ五櫓＝ｔ８−１４才を噌
４ギ１０μｇを制限酵素Ｐｓｔ Ｉで切断したのち、前
述の二重ＱＱ ｃＤＮＡ １．：ｄＣＭＰ鎖を付加した
のと全く同じ条件でｄＣＴＰＯ代りにｄＧＴＰを用いて
両３′末端にｄ Ｇ Ｍ Ｐ ＆Ｒを付加した。かくし
て約５０個のｄＧＭＰが両３′末端に付加された。
３（１９７７、））廿＝カ：イ五櫓＝ｔ８−１４才を噌
４ギ１０μｇを制限酵素Ｐｓｔ Ｉで切断したのち、前
述の二重ＱＱ ｃＤＮＡ １．：ｄＣＭＰ鎖を付加した
のと全く同じ条件でｄＣＴＰＯ代りにｄＧＴＰを用いて
両３′末端にｄ Ｇ Ｍ Ｐ ＆Ｒを付加した。かくし
て約５０個のｄＧＭＰが両３′末端に付加された。
（５−４） ５０ｍＭ Ｔｒｊｓ−１（ＣＩ！（ｐＨ７
，５）、 ０．１Ｍ ＮａＣＲ。
，５）、 ０．１Ｍ ＮａＣＲ。
５ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．０５ＭｇのｄＧＭＰが付加
されたｐＢＲ３２２゜０．０１℃ｇのｄＣＭＰか付加さ
れたｃＤＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６℃で１
２０分間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０
分間保持した。
されたｐＢＲ３２２゜０．０１℃ｇのｄＣＭＰか付加さ
れたｃＤＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６℃で１
２０分間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０
分間保持した。
エシェリヒア・コリχ１７７６ を５０ｍｊ！のし培
地１００μｇ／ｎｆ！のジアミノピメリン酸と５０Ｍｇ
／ｍＩ！のチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス。
地１００μｇ／ｎｆ！のジアミノピメリン酸と５０Ｍｇ
／ｍＩ！のチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス。
０．５％ＮａＣｆｆおよび０．１％グルコースを含む）
に接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ
０．３になるまで３７℃で振どう培養した。培養終了後
、培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離
により集め、５ ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣｆ（ｐＨ７，６
）。
に接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ
０．３になるまで３７℃で振どう培養した。培養終了後
、培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離
により集め、５ ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣｆ（ｐＨ７，６
）。
０．１Ｍ ＮａＣｌ２ 、５ｍＭ ＭｇＣ２２，１０
ｍＭ ＲｂＣＪの溶液２５ｍ１＋で２回洗浄した。
ｍＭ ＲｂＣＪの溶液２５ｍ１＋で２回洗浄した。
得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣＲ（ｐＨ７
，６）。
，６）。
０．２５Ｍ ＫＣｆｆ、 ５ｍＭ ＭｇＣｊ）２．
０．１ Ｍ ＣａＣＲｚおよび１０ｍＭ ＲｂＣ１＋
を含む溶液２０ｍＡ’に懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液１
ｆｌｕ’に菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０
．２ｍｊ＋に上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間
静置した。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０
℃で６０分間静置した。次に、これに前記り培地０．７
ｍｆを加えて３７℃で３０分分間上う培養した。この培
養液０．１ｍｉ＋をｔｏａｕｇ／ｍｚジアミノピメリン
酸、５０Ｍｇａｍｅチミジンと１５Ｍｇ／ｍｌテトラサ
イクリンを含むし培地の１．５％寒天培地上に一面に塗
抹し、３７℃にて２日間インキュベートした。
０．１ Ｍ ＣａＣＲｚおよび１０ｍＭ ＲｂＣ１＋
を含む溶液２０ｍＡ’に懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液１
ｆｌｕ’に菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０
．２ｍｊ＋に上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間
静置した。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０
℃で６０分間静置した。次に、これに前記り培地０．７
ｍｆを加えて３７℃で３０分分間上う培養した。この培
養液０．１ｍｉ＋をｔｏａｕｇ／ｍｚジアミノピメリン
酸、５０Ｍｇａｍｅチミジンと１５Ｍｇ／ｍｌテトラサ
イクリンを含むし培地の１．５％寒天培地上に一面に塗
抹し、３７℃にて２日間インキュベートした。
（５−５）上記において出現したコロニー４３２個をそ
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体と
して１００μｇ／ｍｐのジアミノピメリン酸。
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体と
して１００μｇ／ｍｐのジアミノピメリン酸。
５０μｓ／ｍｉ＋のチミジンとｌＯμｇ／ｍ！！のテト
ラサイクリンを含むＬ培地２００ｍ１ｌに接種し、３７
℃で５〜７時間振どう培養後、クロラムフェニコールを
最終濃度で１７０μｇ／ｍｊ！になるように加えた新鮮
な上記し培地２００ｍｆを追加し、さらに−晩振どう培
養する。
ラサイクリンを含むＬ培地２００ｍ１ｌに接種し、３７
℃で５〜７時間振どう培養後、クロラムフェニコールを
最終濃度で１７０μｇ／ｍｊ！になるように加えた新鮮
な上記し培地２００ｍｆを追加し、さらに−晩振どう培
養する。
こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法に従っ
てプラスミドＤＮＡを車前製した。このＤＮＡを用いて
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ法でインターロイキン２ ｃＤＮＡをもつ
クローンをスクリーニングした。ここで用いた１ｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓ
ａｙは以下のようにして行なった。
てプラスミドＤＮＡを車前製した。このＤＮＡを用いて
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｓｓａｙ法でインターロイキン２ ｃＤＮＡをもつ
クローンをスクリーニングした。ここで用いた１ｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓ
ａｙは以下のようにして行なった。
精製したＤＮＡ２５μｇを制限酵素旧ｎ ｄ ＩＩＩで
切断し、フェノール処理３回、フェノール−クロロホル
ム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なってＤＮ
Ａをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄したの
ち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μ２に溶
解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、ｌｏｘ
ＳＳＣ（１，５Ｍ ＮａＣＲ，０，１５Ｍ クエン酸
３ナトリウム）で１．３ｍρに希釈した。これをニトロ
セルロースフィルターに固定し、８０℃で３時間加熱乾
燥した。このフィルターを５０％ホルムアミド。
切断し、フェノール処理３回、フェノール−クロロホル
ム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なってＤＮ
Ａをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄したの
ち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μ２に溶
解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、ｌｏｘ
ＳＳＣ（１，５Ｍ ＮａＣＲ，０，１５Ｍ クエン酸
３ナトリウム）で１．３ｍρに希釈した。これをニトロ
セルロースフィルターに固定し、８０℃で３時間加熱乾
燥した。このフィルターを５０％ホルムアミド。
２０ｍＭビベス、 ｐＨ６，５，０，７５Ｍ ＮａＣｊ
！ 、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ。
！ 、 ５ｍＭ ＥＤＴＡ。
０２％ ＳＯＳおよび２５０ＭｇｍＲＮＡを含む溶液中
で３７℃、 １８時間インキュベートしてフィルター上
のＤＮＡとインターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイブリ
ダイズさせた。次いで、このフィルターを１０ｍＭビベ
スｐＨ６，５，０，１５Ｍ ＮａＣ１＋ 、
１ ［１１Ｍ ＥＤＴＡ、 ０．２％ ＳＯＳ溶
液で６５℃で３回洗浄した後、さらに１ ｍＭビベス。
で３７℃、 １８時間インキュベートしてフィルター上
のＤＮＡとインターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイブリ
ダイズさせた。次いで、このフィルターを１０ｍＭビベ
スｐＨ６，５，０，１５Ｍ ＮａＣ１＋ 、
１ ［１１Ｍ ＥＤＴＡ、 ０．２％ ＳＯＳ溶
液で６５℃で３回洗浄した後、さらに１ ｍＭビベス。
１（１ｍＭ ＮａＣＲｍ１ｌｌで３回洗浄し、次いで０
．５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＯＳ溶液で９５℃で１
分間処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶出した
。これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムに
かけて回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリカッメ
ガエルの卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させインターロ
イキン２活性を測定した。この結果、１８集団の中の１
集団に前述のトリチウム化チミジンの取り込み量による
活性検定法により４８単位／ｍｌ＋のインターロイキン
２の活性が検出された。そこで、さらにこの集団に属す
る２４コロニーを今度は単独にそれぞれ前述したように
ＩＨμｇ／ｍｉ＋のジアミノピメリン酸、５０Ｍｇ／ｍ
ｐのチミジンと１０Ｍｇ／ｎ＋ｊ＋のテトラサイタリン
を含むし培地２００１に接種し、３７℃で５〜７時間□
振どう培養後、クロラムフェニコールを最終濃度で１７
０Ｍｇ／ｍＲになるように加えた新鮮な上記し培地２０
Ｏｎ＋Ｊを追加し、さらに−夜振どう培養してプラスミ
ドＤＮＡを増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮ
Ａを精製した。そして各ＤＮＡ５μｇを旧ｎ ｄ Ｉｌ
ｌで切断した後、前回と同様にニトロセルロースフィル
ターに固定してインターロイキン２ ｍＲＮＡとハイブ
リダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエル
の卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン２
活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにイ
ンターロイキン２クローンが存在するか検定したところ
１コロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ 、プラ
スミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵母
細胞に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見出
され（表−２）、本クローンがインターロイキン２ ｃ
ＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７６
／３−１６ＡＪ １１９９５ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２２５
））であると同定された。即ちプラスミドｐ３−１６の
ｃＤＮＡはインターロイキン２ ｍＲＮＡと特異的にハ
イブリッドを形成するＤＮＡ、（インターロイキン２遺
伝子）をもつことが証明された。
．５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＯＳ溶液で９５℃で１
分間処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶出した
。これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムに
かけて回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリカッメ
ガエルの卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させインターロ
イキン２活性を測定した。この結果、１８集団の中の１
集団に前述のトリチウム化チミジンの取り込み量による
活性検定法により４８単位／ｍｌ＋のインターロイキン
２の活性が検出された。そこで、さらにこの集団に属す
る２４コロニーを今度は単独にそれぞれ前述したように
ＩＨμｇ／ｍｉ＋のジアミノピメリン酸、５０Ｍｇ／ｍ
ｐのチミジンと１０Ｍｇ／ｎ＋ｊ＋のテトラサイタリン
を含むし培地２００１に接種し、３７℃で５〜７時間□
振どう培養後、クロラムフェニコールを最終濃度で１７
０Ｍｇ／ｍＲになるように加えた新鮮な上記し培地２０
Ｏｎ＋Ｊを追加し、さらに−夜振どう培養してプラスミ
ドＤＮＡを増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮ
Ａを精製した。そして各ＤＮＡ５μｇを旧ｎ ｄ Ｉｌ
ｌで切断した後、前回と同様にニトロセルロースフィル
ターに固定してインターロイキン２ ｍＲＮＡとハイブ
リダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエル
の卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン２
活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにイ
ンターロイキン２クローンが存在するか検定したところ
１コロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ 、プラ
スミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵母
細胞に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見出
され（表−２）、本クローンがインターロイキン２ ｃ
ＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７６
／３−１６ＡＪ １１９９５ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２２５
））であると同定された。即ちプラスミドｐ３−１６の
ｃＤＮＡはインターロイキン２ ｍＲＮＡと特異的にハ
イブリッドを形成するＤＮＡ、（インターロイキン２遺
伝子）をもつことが証明された。
次にプラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡの制限酵素切断個
所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢＲＬ社）で１
ケ所、 ＢｓｔＮｒ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（ＸｂａＩ切断個所の
上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡＧま
約６５０塩基対よりなり、１１〜１２ｓのインターロイ
キン２ ｍＲＮＡの一部に対応するものとわがフたので
、再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍ
ＲＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｃｌ ｅ
ｔ ａｐ、 Ｎｕｃｌｅｉｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢＲＬ社）で１
ケ所、 ＢｓｔＮｒ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（ＸｂａＩ切断個所の
上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡＧま
約６５０塩基対よりなり、１１〜１２ｓのインターロイ
キン２ ｍＲＮＡの一部に対応するものとわがフたので
、再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍ
ＲＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｃｌ ｅ
ｔ ａｐ、 Ｎｕｃｌｅｉｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
ｖｏｌ、 ９． Ｉ）２５５１［１９８１））により前
述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２
２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ−ｃｏｌｉχ
１７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株のなか
から、プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持
つｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓ ｔｅ ｉｎ−１１ｏ
ｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃ
ＤＮＡインサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−５ＯＡ
を持つ転換株（エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−
２−５０Ａ ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６）
）を得た。
述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２
２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ−ｃｏｌｉχ
１７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株のなか
から、プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持
つｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓ ｔｅ ｉｎ−１１ｏ
ｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃ
ＤＮＡインサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−５ＯＡ
を持つ転換株（エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−
２−５０Ａ ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６）
）を得た。
このｐＩＬ２−５０ＡのｃＤＮＡの制限酵素切断地図を
図−１に示す。
図−１に示す。
７／
＼
＼
＼に、−、ｉ、、、：
表 −２
中１ プラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡにハイブリダイ
ズしたＴＯＲＮＡ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２８プラスミ
ドベクター（Ｇｅｎｅ、 ９．２８７−３０５ （１９
８０））にｐＫｃＩ’１ベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ目
、 Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 ｖｏｌ ７８゜
Ｎｏ、３．１５２７−１５３１．１９８１）（７）ＳＶ
４０ウイルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域
を組み込んだｐＣＥ−１ベクターを造成した。そしてプ
ラスミドｐｒｔ、−２−ｓｏ＾クローンのプラスミドよ
りＰｓｔＩで挿入されたｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−
１ベクターのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐ
ｃＥＩＬ−２）。なお、このプラスミドｐＣＥＩＬ−２
が組み込まれているエシェリヒア・コリｌ（Ｂ １０１
（ＡＪ １２００８）は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２４
４として寄託されている。このときの挿入様式は図−２
に示すようにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流
にインターロイキン２遺伝子のイニシエイションコドン
ＡＴＧが接続されているものである（図のＩ）。このベ
クターをサル培養細胞のＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａ
ｎ、 Ｙ、 Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２３ｐ１７５−１８
２ （１９８１）） に感染せしめ（Ｍｃ Ｃｕｔｃ
ｈａｎ ｅｔａＩＪ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎ５ｔ、 ｖｏｌ、４１ ｐ３５１−３５７（１９８８
）） 、培養上清に出てくるインターロイキン２活性を
検討した。対照としてベクタープラスミドＩｌにＥ−１
を用いて同様の方法で実験を行ないインターロイキン２
活性を調べた。結果を表−３に示す。
ズしたＴＯＲＮＡ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２８プラスミ
ドベクター（Ｇｅｎｅ、 ９．２８７−３０５ （１９
８０））にｐＫｃＩ’１ベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ目
、 Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、 ｖｏｌ ７８゜
Ｎｏ、３．１５２７−１５３１．１９８１）（７）ＳＶ
４０ウイルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域
を組み込んだｐＣＥ−１ベクターを造成した。そしてプ
ラスミドｐｒｔ、−２−ｓｏ＾クローンのプラスミドよ
りＰｓｔＩで挿入されたｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−
１ベクターのＰｓｔＩサイトに挿入した（プラスミドｐ
ｃＥＩＬ−２）。なお、このプラスミドｐＣＥＩＬ−２
が組み込まれているエシェリヒア・コリｌ（Ｂ １０１
（ＡＪ １２００８）は、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２４
４として寄託されている。このときの挿入様式は図−２
に示すようにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流
にインターロイキン２遺伝子のイニシエイションコドン
ＡＴＧが接続されているものである（図のＩ）。このベ
クターをサル培養細胞のＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａ
ｎ、 Ｙ、 Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２３ｐ１７５−１８
２ （１９８１）） に感染せしめ（Ｍｃ Ｃｕｔｃ
ｈａｎ ｅｔａＩＪ、 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎ５ｔ、 ｖｏｌ、４１ ｐ３５１−３５７（１９８８
）） 、培養上清に出てくるインターロイキン２活性を
検討した。対照としてベクタープラスミドＩｌにＥ−１
を用いて同様の方法で実験を行ないインターロイキン２
活性を調べた。結果を表−３に示す。
表 −３
更にこのインターロイキン２活性は、マウス抗ヒトイン
ターロイキン２モノクローナル抗体によって中和され、
インターロイキン２活性は１ ｕ／ｍ！！以下となった
。
ターロイキン２モノクローナル抗体によって中和され、
インターロイキン２活性は１ ｕ／ｍ！！以下となった
。
インターロイキン２活性を持つポリペプチドをコードし
ているＤＮＡは、エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ
−２−５ＯＡ細胞より常法によりプラスミドＤＮＡ部を
分離し、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ
で消化した後、生成した二つのＤＮＡフラグメントより
分子量の小さいフラグメントを分離することにより得た
。
ているＤＮＡは、エシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ
−２−５ＯＡ細胞より常法によりプラスミドＤＮＡ部を
分離し、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ
で消化した後、生成した二つのＤＮＡフラグメントより
分子量の小さいフラグメントを分離することにより得た
。
得られたＤＮＡの塩基配列は、前記Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔの化学法に準じて調べたところ、前述のとおり
の配列を有していることが判明した。
ｂｅｒｔの化学法に準じて調べたところ、前述のとおり
の配列を有していることが判明した。
図−１はインターロイキン２活性を持つポリペプチドを
コードしつる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＣＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 特許出願人 財団法人 癌 研 究 合同 味の素
株式会社 代 理 人 弁理士 久保１）藤 部−−１！１１
コードしつる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＣＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 特許出願人 財団法人 癌 研 究 合同 味の素
株式会社 代 理 人 弁理士 久保１）藤 部−−１！１１
Claims (4)
- （１）ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子を含有する真核生物を形質転換する
ためのベクター。 - （２）ポリペプチドが、分子中に次のアミノ酸配列を含
むものである特許請求の範囲第１項記載の真核生物を形
質転換するためのベクター。 【遺伝子配列があります】 - （３）ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子を含有するベクターを有する真核生
物。 - （４）ポリペプチドが、分子中に次のアミノ酸配列を含
むものである特許請求の範囲第３項記載の真核生物。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63292085A JPH0832237B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63292085A JPH0832237B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57229619A Division JPS59140882A (ja) | 1982-03-31 | 1982-12-24 | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01157394A true JPH01157394A (ja) | 1989-06-20 |
| JPH0832237B2 JPH0832237B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=17777353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63292085A Expired - Lifetime JPH0832237B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0832237B2 (ja) |
-
1988
- 1988-11-18 JP JP63292085A patent/JPH0832237B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0832237B2 (ja) | 1996-03-29 |
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