JPS59140898A - インタ−ロイキン−２の製造法 - Google Patents
インタ−ロイキン−２の製造法Info
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- JPS59140898A JPS59140898A JP57234607A JP23460782A JPS59140898A JP S59140898 A JPS59140898 A JP S59140898A JP 57234607 A JP57234607 A JP 57234607A JP 23460782 A JP23460782 A JP 23460782A JP S59140898 A JPS59140898 A JP S59140898A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はインターロイキン−２の製造法に関シ、詳しく
は遺伝子組換え技術により創製し′たエシェリヒア属の
微生物によるインターロイキン−２に関する。
は遺伝子組換え技術により創製し′たエシェリヒア属の
微生物によるインターロイキン−２に関する。
インターロイキン−２はその特異な免疫応答作用から医
薬への応用が注目され、ヒトインターロイキン−２を産
生ずるヒ）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告され
ている（ギリスら、Ｊ、 ｌｘｐ。
薬への応用が注目され、ヒトインターロイキン−２を産
生ずるヒ）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告され
ている（ギリスら、Ｊ、 ｌｘｐ。
Ｍｅｄ、、１５２巻、１７０９頁、１９８０年）。
しかし、このヒトＴ白血病細胞株によるヒトインターロ
イキン−２の生産量は極めて微量であり、しかも生産に
は細胞を大量に培養することが必要となシ、解決されな
ければならない新たな問題が生じる。
イキン−２の生産量は極めて微量であり、しかも生産に
は細胞を大量に培養することが必要となシ、解決されな
ければならない新たな問題が生じる。
→にしばしが一１７日５昧フ（→−−一本発ＩＪＩＪ者
らは、廿＊インターロイキン−２の生物学的作用、生産
方法などについて研究を重ねてきたが、その過程におい
てヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイキン−２
に対応するメツセンジャーＲＮＡ （リボ核酸）（以下
、ｍＲｌＡと略称する。）を抽出することに成功し、こ
のｍＲＮＡからこれＫ ｆ＝Ｉ応するＤＮＡを調製する
ことに成功した。
らは、廿＊インターロイキン−２の生物学的作用、生産
方法などについて研究を重ねてきたが、その過程におい
てヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイキン−２
に対応するメツセンジャーＲＮＡ （リボ核酸）（以下
、ｍＲｌＡと略称する。）を抽出することに成功し、こ
のｍＲＮＡからこれＫ ｆ＝Ｉ応するＤＮＡを調製する
ことに成功した。
さらに、このようにして得たＤＮＡを微生物細胞内で発
現することによって目的とするヒトインターロイキン−
２を製造できることを見出した。
現することによって目的とするヒトインターロイキン−
２を製造できることを見出した。
すなわち本発明は、インター四イキンー２活性を持つポ
リペプチドをコードしている遺伝子が接続されているレ
プリコンを有し、インターロイキン−２生産能を有する
エシェリヒア属の微生物を培養することを特徴とするイ
ンターロイキン−２の製造法である。ここでインターロ
イキン−２としてはヒトインターロイキン−２があシ、
インク−ロイキン−２活性を描っポリペプチドをコード
しうる遺伝子としてはショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２Ｓ画分として得′られ、ヒトリンパ球
由来細胞よシ分離されるメツセンジャー ＲＮＡ （以
下、ｍＲＮＡと略称する。）よシ調製されたもの、その
ＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｂｇｔ、Ｘｂａ工およびＢｓｔＮ
工で切断される個所がこの順序で配置されている部分を
含むものであるもの等がある。また、微生物としてはエ
シェリヒア・フリカ代表的なものである。以下、エシェ
リヒア・コリヲ５１３ トして本発明を説明する。
リペプチドをコードしている遺伝子が接続されているレ
プリコンを有し、インターロイキン−２生産能を有する
エシェリヒア属の微生物を培養することを特徴とするイ
ンターロイキン−２の製造法である。ここでインターロ
イキン−２としてはヒトインターロイキン−２があシ、
インク−ロイキン−２活性を描っポリペプチドをコード
しうる遺伝子としてはショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２Ｓ画分として得′られ、ヒトリンパ球
由来細胞よシ分離されるメツセンジャー ＲＮＡ （以
下、ｍＲＮＡと略称する。）よシ調製されたもの、その
ＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｂｇｔ、Ｘｂａ工およびＢｓｔＮ
工で切断される個所がこの順序で配置されている部分を
含むものであるもの等がある。また、微生物としてはエ
シェリヒア・フリカ代表的なものである。以下、エシェ
リヒア・コリヲ５１３ トして本発明を説明する。
本発明の微生物、エシェリヒア・コリは以下に示す遺伝
子組換え技術によって創製することができる◇すなわち
、ヒトインターロイキン−２に対応し、ショ糖密度勾配
遠心法（以下、ｓＤＧ遠心法と略称する。）による分画
によ９１１〜１２８画分として得られるｍｌ’ｔＮＡを
ヒトリンパ球由来細胞より分離し、このｍＲＩＪＡ Ｋ
相補的なりＮＡを調製し、該ＤＮＡを適当なレプリコン
に接続し、この組換えＤＮＡ ヲエシエリヒア・コリの
細胞に導入スる。
子組換え技術によって創製することができる◇すなわち
、ヒトインターロイキン−２に対応し、ショ糖密度勾配
遠心法（以下、ｓＤＧ遠心法と略称する。）による分画
によ９１１〜１２８画分として得られるｍｌ’ｔＮＡを
ヒトリンパ球由来細胞より分離し、このｍＲＩＪＡ Ｋ
相補的なりＮＡを調製し、該ＤＮＡを適当なレプリコン
に接続し、この組換えＤＮＡ ヲエシエリヒア・コリの
細胞に導入スる。
ｍＲＭＡは、上記したように、ヒトインターロイキン−
２に対応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画な
らびにアガｐ−スゲル電気泳動法によ！７１１〜１２Ｓ
画分として得られるものであり、このｍＲＩＪＡはヒト
リンパ球白来ａ胞よシ抽出１分離することによって製造
できる。
２に対応し、ＳＤＧ遠心法やゲル濾過法等による分画な
らびにアガｐ−スゲル電気泳動法によ！７１１〜１２Ｓ
画分として得られるものであり、このｍＲＩＪＡはヒト
リンパ球白来ａ胞よシ抽出１分離することによって製造
できる。
本発明に用いるヒトインターロイキン−２産生能を有す
るヒトリンパ球由来細胞としてヒト末梢血、扁桃腺、肺
臓等より得られるリンパ球そのものも含まれる。また、
これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−補体
処理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガ
ラクトース酸化酵素等）処理などの前処理をしだもの並
びにＸｍ等による変異処理およびトリプシン等の酵素処
理等によりインターロイキン−２の産生能が付与された
ものも本発明のヒ） ＩＪンパ球由来細胞に含まれる。
るヒトリンパ球由来細胞としてヒト末梢血、扁桃腺、肺
臓等より得られるリンパ球そのものも含まれる。また、
これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−補体
処理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガ
ラクトース酸化酵素等）処理などの前処理をしだもの並
びにＸｍ等による変異処理およびトリプシン等の酵素処
理等によりインターロイキン−２の産生能が付与された
ものも本発明のヒ） ＩＪンパ球由来細胞に含まれる。
さらに１これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴ
ＩＪンパ球をＴリンパ球成長因子等の存在下にクローン
化したように１クローン化したものも好ましいヒ） Ｉ
Ｊンパ球由来細胞である。
ＩＪンパ球をＴリンパ球成長因子等の存在下にクローン
化したように１クローン化したものも好ましいヒ） Ｉ
Ｊンパ球由来細胞である。
また、ヒト白血病細胞およびＴ ＩＪン／ぐ腫細胞のよ
うなヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性
化細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したもの
または悪性化細胞をクローン化したものがより好ましい
ヒドリン／ぐ球由来細胞として用いることができる。特
にクローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが
通常多い。
うなヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性
化細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したもの
または悪性化細胞をクローン化したものがより好ましい
ヒドリン／ぐ球由来細胞として用いることができる。特
にクローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが
通常多い。
さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＯＥＭ。
Ｍｏ１ｔ４Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる、いわゆるハイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
られる、いわゆるハイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
これらヒトリンパ球由来細胞には（１）自発的にインタ
ーロイキン−２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在
下または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激する
ことによジインターロイキン−２を産生ずるものがある
。
ーロイキン−２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在
下または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激する
ことによジインターロイキン−２を産生ずるものがある
。
ヒトリンパ球由来細胞にインターロイキン−２ｍＲＮＡ
を生成せしめるにあたり、インターロイキン−２自発産
生株を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養
すればよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン−
２を産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄
後、ローズウェル・パークφメモリアルーインスチチュ
ー）１６４０（以下、ＲＰＭ工１６４０と略記する。）
培地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ８ ）培地、クリッ
ク培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有
しても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０５〜
４Ｘ１０６個／ ｍｌの細胞密度で懸濁し、ここにマイ
トゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；塩
化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリジ
ン−０等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、
細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
を生成せしめるにあたり、インターロイキン−２自発産
生株を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養
すればよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン−
２を産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄
後、ローズウェル・パークφメモリアルーインスチチュ
ー）１６４０（以下、ＲＰＭ工１６４０と略記する。）
培地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ８ ）培地、クリッ
ク培地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有
しても含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０５〜
４Ｘ１０６個／ ｍｌの細胞密度で懸濁し、ここにマイ
トゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；塩
化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリジ
ン−０等の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、
細胞を洗浄、刺激剤を除去する。
マイトゲン刺激の際にマクロファージやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン−２を産生しう
る細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共
存させると同様にインターロイキン−２の産生能がみら
れるような細胞があり、これらの細胞を用いてインター
ロイキン−２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これ
らの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このよう
にすると、ｍＲＮＡの収賊は上昇することがある。
ク細胞を共存させるとインターロイキン−２を産生しう
る細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ、
Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６２． ＢＡＬＬ−１細胞を共
存させると同様にインターロイキン−２の産生能がみら
れるような細胞があり、これらの細胞を用いてインター
ロイキン−２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これ
らの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このよう
にすると、ｍＲＮＡの収賊は上昇することがある。
ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞拐料として用いることができることが判っ
た。
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞拐料として用いることができることが判っ
た。
リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球か活性化され
、インターロイキン−２のｍＲＮＡが生成される時間で
あり、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン−
２が産生され始めた頃に相当する。具体的には通常、刺
激剤添加後６〜１２時間である。徒らに培養時間を延ば
すと、生成したインターロイキン−２のｍＲＮＡが分解
されてしまう。また、リンパ球活性化に際し、ＰＭＡや
ＴＰＡなどのホルボールエステル類を１０〜５ｏｎｌＦ
／Ｍ添加することもある。培養温度は６２〜６７°Ｃの
範囲が望ましい。
、インターロイキン−２のｍＲＮＡが生成される時間で
あり、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン−
２が産生され始めた頃に相当する。具体的には通常、刺
激剤添加後６〜１２時間である。徒らに培養時間を延ば
すと、生成したインターロイキン−２のｍＲＮＡが分解
されてしまう。また、リンパ球活性化に際し、ＰＭＡや
ＴＰＡなどのホルボールエステル類を１０〜５ｏｎｌＦ
／Ｍ添加することもある。培養温度は６２〜６７°Ｃの
範囲が望ましい。
以下にインターロイキン−２を産生ずる能力を有するヒ
トリンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明す
る。
トリンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明す
る。
（イ） リンホカイン自発産生株の取得ヒｌ−Ｔリンパ
球由来白血病細胞であるジュルカット細胞（フレンド・
）・ツチンソン・癌ｆＪＦ 突所／シアトル／アメリカ
、ソーク研死所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ国立
癌センター／ノＸイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に手
に入る。）を１×１０６個／ ｍｌの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合ｉ１ａ、ｏｏ。
球由来白血病細胞であるジュルカット細胞（フレンド・
）・ツチンソン・癌ｆＪＦ 突所／シアトル／アメリカ
、ソーク研死所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ国立
癌センター／ノＸイデルベルヒ／西ドイツ等で自由に手
に入る。）を１×１０６個／ ｍｌの細胞密度でクリッ
ク培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度
で合ｉ１ａ、ｏｏ。
レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本細胞を０１
細胞／２００μｔの細胞密度そ９６穴の平底マイクロタ
イタープレート （「ファｉコン５０７２ｊ ）に添加
し、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で６週間６７
°Ｃにて５％ｃｏ、 ・インキュベーター中にて培養す
る（限界希釈法によるクローニンク°）。
細胞／２００μｔの細胞密度そ９６穴の平底マイクロタ
イタープレート （「ファｉコン５０７２ｊ ）に添加
し、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で６週間６７
°Ｃにて５％ｃｏ、 ・インキュベーター中にて培養す
る（限界希釈法によるクローニンク°）。
細胞の生育が詔められた培養ウェル中の細胞は、細胞が
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ゴのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分景の細胞が得られた場合には
、本細胞を２Ｘ１０’個／ｍ／の細胞密度にて血清も血
清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２ ＩＩｌ
に懸濁して２日間培養し、本培養上清をｘｏｏｏｒｐｍ
、５分間の遠心分離操作で分離し、次いでα２２μのミ
リポアフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なって
インターロイキン−２を得ろ。こうして得られろクロー
ン細胞よりインターロイキン−２産生株が得られる。
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ゴのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分景の細胞が得られた場合には
、本細胞を２Ｘ１０’個／ｍ／の細胞密度にて血清も血
清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２ ＩＩｌ
に懸濁して２日間培養し、本培養上清をｘｏｏｏｒｐｍ
、５分間の遠心分離操作で分離し、次いでα２２μのミ
リポアフィルターにてデブリス除去と無菌化を行なって
インターロイキン−２を得ろ。こうして得られろクロー
ン細胞よりインターロイキン−２産生株が得られる。
（ロ） ヒト末梢血Ｔリンパ抹゛よりインターロイキン
−２産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ノ・イバークの密
度勾配遠心法によシ末梢血リンパ球を採取する。本末梢
リンパ球をｌＸ１０６個／１の細胞密度でクリック培地
に懸濁し、各２ ｍｌ宛し４穴のヌンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ
礼製）を５μｆ／ｍｌの終末濃度になるように１００μ
を添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細胞
を培養液で洗浄し、再びｌＸ１０５個／ｍｌの細胞密度
で元のヌンクの培養プレートに１ｍｌ宛まく。各ウェル
にヒトの肺臓細胞をフンカナバリンＡ（以下、ＣｏｎＡ
と略称スル。）２．５μｍ／コで４８時間刺激して得
ｆｒ、、コンディショニングした培養液を１ ｍｌ添加
し、３日間同様の培養を繰シ返し、ヒト末梢血よシ得た
Ｔリンパ球を長期継代培養する。このように長期継代培
養して得た’ｌ” ＩＪフン球を、前述と同様の限界希
釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。
−２産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ノ・イバークの密
度勾配遠心法によシ末梢血リンパ球を採取する。本末梢
リンパ球をｌＸ１０６個／１の細胞密度でクリック培地
に懸濁し、各２ ｍｌ宛し４穴のヌンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（ギブコ
礼製）を５μｆ／ｍｌの終末濃度になるように１００μ
を添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細胞
を培養液で洗浄し、再びｌＸ１０５個／ｍｌの細胞密度
で元のヌンクの培養プレートに１ｍｌ宛まく。各ウェル
にヒトの肺臓細胞をフンカナバリンＡ（以下、ＣｏｎＡ
と略称スル。）２．５μｍ／コで４８時間刺激して得
ｆｒ、、コンディショニングした培養液を１ ｍｌ添加
し、３日間同様の培養を繰シ返し、ヒト末梢血よシ得た
Ｔリンパ球を長期継代培養する。このように長期継代培
養して得た’ｌ” ＩＪフン球を、前述と同様の限界希
釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。
こうして得られたクローン化Ｔリンパ球をｌＸ１０６個
／１ｎｌの細胞密度にＲＰＭ工１６４０培地に懸濁し、
ここに１０１１７．／ｒｌの終末濃度になるようにフィ
トヘマグルチニン（ＰＨＡ ）を添加し、２４時間、６
７°ＣでＺ５％ＣＯ，インキュベーター中にて培養し、
本培養上清を４０００ｒＰｌ、５分間の遠心分離操作で
分離し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌
化を行ないインターロイキン−２が得られる。こうして
得られるクローン化細胞よりインターロイキン−２産生
株が得られる。
／１ｎｌの細胞密度にＲＰＭ工１６４０培地に懸濁し、
ここに１０１１７．／ｒｌの終末濃度になるようにフィ
トヘマグルチニン（ＰＨＡ ）を添加し、２４時間、６
７°ＣでＺ５％ＣＯ，インキュベーター中にて培養し、
本培養上清を４０００ｒＰｌ、５分間の遠心分離操作で
分離し、次いで０．２２μのミリポアフィルタ−で無菌
化を行ないインターロイキン−２が得られる。こうして
得られるクローン化細胞よりインターロイキン−２産生
株が得られる。
（ハ） マイトゲン刺激でインターロイキン−２を生産
するヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカ
ット細胞や前記した限界希釈法によりクローン化された
：ｒ−１ｉ１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を
含む”ＲＰＭ１１６４０培地中にてｃｏｎ Ａ １０
ｐ 、ｊｉｌ’／ ｔｎｌやＰＨＡ ２．５ ｐｙ／ｍ
ｌの存在下に２４時間培養すると、１０〜４．ＯＯ’０
単位／’ｒｎｌのインターロイギン−２を産生ず、るこ
とが判明シた。また、塩化亜鉛、プロティンＡ、ビシノ
ｑニール存在下に培養しても、インターロイキン−２を
産生ずる。
するヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカ
ット細胞や前記した限界希釈法によりクローン化された
：ｒ−１ｉ１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を
含む”ＲＰＭ１１６４０培地中にてｃｏｎ Ａ １０
ｐ 、ｊｉｌ’／ ｔｎｌやＰＨＡ ２．５ ｐｙ／ｍ
ｌの存在下に２４時間培養すると、１０〜４．ＯＯ’０
単位／’ｒｎｌのインターロイギン−２を産生ず、るこ
とが判明シた。また、塩化亜鉛、プロティンＡ、ビシノ
ｑニール存在下に培養しても、インターロイキン−２を
産生ずる。
に）他の細胞もしくはその細胞の？石化する因子の存在
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
−２を産生ずる細胞の取得ヒドリ′／パ球悪性化細胞Ｍ
０１ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュ
ルカット細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は
、上述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で
加えて２４〜７２時間培養してもインターロイキン−２
を産生じない。ところが、この間モノ力インの１種であ
るインターロイキン−１を５〜１０ｕ／ｍ７またはに５
６２やラージ（Ｒａｊｊ、）細胞をｌＸ１０６細胞／
ｍｅ当り０．’５Ｘｉ０６個／ｒｎノ相当共存させてク
リック培地中にて５７°Ｃ２２４時間培養すると、イン
ターロイキン−２を１０〜Ｉ Ｄ Ｏｕ、／ｍＪ産生す
る。
下にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン
−２を産生ずる細胞の取得ヒドリ′／パ球悪性化細胞Ｍ
０１ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュ
ルカット細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は
、上述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で
加えて２４〜７２時間培養してもインターロイキン−２
を産生じない。ところが、この間モノ力インの１種であ
るインターロイキン−１を５〜１０ｕ／ｍ７またはに５
６２やラージ（Ｒａｊｊ、）細胞をｌＸ１０６細胞／
ｍｅ当り０．’５Ｘｉ０６個／ｒｎノ相当共存させてク
リック培地中にて５７°Ｃ２２４時間培養すると、イン
ターロイキン−２を１０〜Ｉ Ｄ Ｏｕ、／ｍＪ産生す
る。
このようにして博られた細胞よりインターロイキン−２
に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わ
ず常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０、
ＳＤＳ 、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｚ １００デオキシコール
酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍
結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるい
は完全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲ
ＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中に
ＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ホ゛リビ
ニル硫酸、ベントナイト。
に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わ
ず常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０、
ＳＤＳ 、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｚ １００デオキシコール
酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍
結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるい
は完全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲ
ＮａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中に
ＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ホ゛リビ
ニル硫酸、ベントナイト。
マカロイド、ジエチルピロカーボネイト、バナジウム複
合体などを添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン−２に対応する抗体を用いて
インク−ロイキン−２合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよｐ、、−ｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出す
る方法も行なうことができろ。
合体などを添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン−２に対応する抗体を用いて
インク−ロイキン−２合成途上のポリゾームを沈降せし
め、これよｐ、、−ｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出す
る方法も行なうことができろ。
まｌこ、本発明に用いるｍＲＮＡの複製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−セファロース。
ゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−セファロース。
セファロース２Ｂなどの吸着カラムあるいはノくフチ法
による精製法、 ＳＤＧ遠心法による分画等によって行
なうことができる。このよう７”、ＣＨＨ操作によジイ
ンターロイキン−２に対応するｍＲＮＡは１１〜１２Ｓ
画分として得られる。
による精製法、 ＳＤＧ遠心法による分画等によって行
なうことができる。このよう７”、ＣＨＨ操作によジイ
ンターロイキン−２に対応するｍＲＮＡは１１〜１２Ｓ
画分として得られる。
上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするインター
ロイキンー２に対応するものであることを確認するため
には、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べる
か、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行な
えばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく
用いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ １ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して
翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小
麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわ
れている。
ロイキンー２に対応するものであることを確認するため
には、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べる
か、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行な
えばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく
用いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ
ｓ １ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して
翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、小
麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行なわ
れている。
ここに用いたインターロイキン−２の活性検定法は次の
通りである。即ち、検体１００μｌを９６穴マイクロタ
イタープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を
含有するｎＰＭｌ １６４０培地に２倍希釈を繰り返し
て、９６六マイクロプレート上において各１００μｌの
希釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８＠、 １５４頁、 （１９７７））によって教
示された方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、
４ ｘ Ｉ Ｑ３個／１００μｌの岬１胞密度として１
００μｌ宛各くぼみに添加する。３・７℃。
通りである。即ち、検体１００μｌを９６穴マイクロタ
イタープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を
含有するｎＰＭｌ １６４０培地に２倍希釈を繰り返し
て、９６六マイクロプレート上において各１００μｌの
希釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８＠、 １５４頁、 （１９７７））によって教
示された方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、
４ ｘ Ｉ Ｑ３個／１００μｌの岬１胞密度として１
００μｌ宛各くぼみに添加する。３・７℃。
５％炭酸ガスインキュベーター中２０時間静置培養後、
トリチウム化チミジン０．５μＯｉを加え、４時間パル
スを行なった後、この分野で良く知られた方法に従って
細胞を採取し、細胞内にとり込まれた放射線量を測定す
る。インターロイキン−２活性の高い培養上清はど活性
化Ｔリッツ球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が
多いことから、検体中に含有されるインターロイキン−
２量を容易に知ることができる。
トリチウム化チミジン０．５μＯｉを加え、４時間パル
スを行なった後、この分野で良く知られた方法に従って
細胞を採取し、細胞内にとり込まれた放射線量を測定す
る。インターロイキン−２活性の高い培養上清はど活性
化Ｔリッツ球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が
多いことから、検体中に含有されるインターロイキン−
２量を容易に知ることができる。
また、インターロイキン−２はＴリンパ球分裂増殖せし
める作用がありこの作用による１９７７球増殖活性の検
定法は次の通りである。
める作用がありこの作用による１９７７球増殖活性の検
定法は次の通りである。
検体１００μｌを９６穴マイク四タイタープレートの１
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地に２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上に
おいて各１００μｌの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μｌの細胞密度とし
て１００μノ宛各くぼみじ添加する。３７°Ｃ，５％炭
酸ガスインキュベーター中７２時間もしくは９６時間静
置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存する活性化Ｔ
ＩＪンパ球数をカウントする。この際、１００ ｕ／ｍ
ｌ 、 １０ｕ／ｍｌの活性を有するインターロイキン
−２をポジティブ・コントロールとして用い、検体添加
群におけるＴ ＩＪンパ球の増殖数と比較し、検体のイ
ンターロイキン−２活性を算出する。
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地に２倍希釈を繰り返して９６穴マイクロプレート上に
おいて各１００μｌの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μｌの細胞密度とし
て１００μノ宛各くぼみじ添加する。３７°Ｃ，５％炭
酸ガスインキュベーター中７２時間もしくは９６時間静
置培養してその後、倒立顕微鏡にて生存する活性化Ｔ
ＩＪンパ球数をカウントする。この際、１００ ｕ／ｍ
ｌ 、 １０ｕ／ｍｌの活性を有するインターロイキン
−２をポジティブ・コントロールとして用い、検体添加
群におけるＴ ＩＪンパ球の増殖数と比較し、検体のイ
ンターロイキン−２活性を算出する。
か（して得られたインターロイキン−２ｍＲＮＡよりイ
ンビトロで相補的なりＮＡ （ＣＤＮＡ）を合成し、微
生物のベクターなどに組込んで微生物等でインターロイ
キン−２を生産することを可能ならしめる。
ンビトロで相補的なりＮＡ （ＣＤＮＡ）を合成し、微
生物のベクターなどに組込んで微生物等でインターロイ
キン−２を生産することを可能ならしめる。
このようなｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。
な方法で行なうことができる。
ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴ０丁をブライマーとして、
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＯＴＰ、 ｄ’ｌ’ＴＰの
存在下で逆転写酵母によりｍ ＲＮＡと相補的な単鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写
酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ＣＤＮ
Ａを合成する。
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄＯＴＰ、 ｄ’ｌ’ＴＰの
存在下で逆転写酵母によりｍ ＲＮＡと相補的な単鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写
酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ＣＤＮ
Ａを合成する。
次いで、得られたＤＮＡ両端を必要によりエキソヌクレ
エースで処理し、それぞれに適当なリンカ−ＤＮＡを接
続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複数
個重合せしめる。しか゛る後、これをエシェリヒア・コ
リ内で自律複製できるレプリコンを含むベクターに組込
む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し
、必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な
組合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工し
た二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを
用いて接続せしめる。
エースで処理し、それぞれに適当なリンカ−ＤＮＡを接
続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複数
個重合せしめる。しか゛る後、これをエシェリヒア・コ
リ内で自律複製できるレプリコンを含むベクターに組込
む。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し
、必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な
組合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工し
た二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを
用いて接続せしめる。
上記の如（ｍＲＮＡより調ｉされたｆ＞Ｎｈはその鎖中
に下記の部分構造（Ｉ）または（ＩＩ）を含むものであ
る。
に下記の部分構造（Ｉ）または（ＩＩ）を含むものであ
る。
（Ｉ） ＡＴＧ ＴＡＯＡＧＧ ＡＴＧ ＯＡＡ Ｏ
’ｆｆＯＯＴＧ ＴＣＴ ＴＧＯＡＴＴ ＧＯＡ Ｃ！
ＴＡ ＡＧ’Ｉ’ Ｏ’ｌ’Ｔ ＧＯＡ Ｃ！Ｔ’Ｉ’
ＧＴＯＡＣ！Ａ ＡＡＯＡＧ’Ｉ’ＧＯＡ ＯＯＴ
ＡＣＴ ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＣ！Ｔ ＡＯＡ ＡＡ、Ｇ
ＡＡＡ、 ＡＯＡ ＣＡＧＯＴＡ ＯＡＡ ＯＴＧ
ＧＡＧ ＯＡＴ ’ｌ”ＴＡ ＯＴＧ ＯＴＧ ＧＡＴ
ＴＴＡ ０ＡＧＡＴＧ ＡＴＴ Ｔ’Ｌ”Ｇ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＴＴ 、ＡＡＴ ＡＡ’ｌ’ ＴＡＯＡＡ
Ｇ ＡＡＴＣｏｏ ＡＡＡ ＣＴＣＡｃＣＡＧＧ ＡＴ
Ｇ Ｃ！Ｔｏ ＡＯＡ ＴＴ’ｌ’ ＡＡＧ ＴＴＴＴ
ＡＯＡＴＧ ０００ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＯＯＡＯＡ
ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ０ＡＴＯＴＴ ｃＡＧ ’Ｉ
’ＧＴ Ｏ’Ｉ’Ａ ＧＡＡ ＧＡ、Ａ ＧＡＡ ＯＴ
ｃ ＡＡＴ ＣＯＴ ０ＴＧＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ
ＯＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＯＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡＡ
Ａ ＡＡＯ’Ｉ”Ｉ’Ｔ ＯＡＯＴＴＡ ＡＧＡ ００
０ ＡＧＧ ＧＡＯ’Ｉ’ＴＡ Ａ’［’ＯＡＧＣ！
ＡＡＴＡ’Ｊ’ＯＡＡＯＧ’Ｉ’Ａ ＡＴＡ ＧＴＴ
ＯＴＧ ＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＯＯＧＡ
Ａ Ａ、ＯＡ ＡＣＡ ＴＴＯＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ
’Ｉ’ＡＴ ＧＯＴ ＧＡ’Ｉ’ ＧＡＧＡＯＡ Ｇ
ＯＡ ＡＯＣ！ ＡＴ’ｌ’ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＴ
Ｏ’ｌ’Ｇ ＡＡＯＡＧＡ ’Ｉ’ＧＧＡＴＴ ＡＯ
ＯＴ’ｌ”Ｔ ＴＧＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡ’Ｔ’ＯＡＴ
Ｏ’Ｉ！ＯＡ ＡＣ！Ａ ＯＴＡＣＴ （ＩＩ） ＧＯＡ ＯＯ’ｌ’ ＡＣＴ ＴＯＡ
ＡＧＴ ’Ｉ’０’Ｊ’ ＡＯＡ ＡＡＧ ＡＡｌｒＡ
Ｃ，Ａ ＯＡＧ ＣＴＡ ＯＡＡ （ＴＴＯＧＡＧ Ｏ
ＡＴ ＴＴＡ Ｃ？ＴＧ Ｏ’ｌ’Ｇ ＧＡＴ’Ｉ’Ｔ
Ａ ＣＡＧ Ａ’ｌ’Ｇ ＡＴＴ ’Ｉ’ＴＧ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＯＪＡＧ Ａ
Ａ’ｌ’ Ｃｏｏ ＡＡＡ ＣＴＣＡＯＯＡＧＧ ＡＴ
Ｇ ＣＴＣＡＯＡ Ｔ’ｌ’ＴＡＡＧ Ｔ’ＴＴ ＴＡ
ＯＡＴＧ ＯＣＣＡＡＧ ＡＡＧ Ｇｏｏ ＡＣ！Ａ
ＧＡＡ ０ＴＧＡＡＵ ＯＡ’ｌ’ ＣＴＴ ＯＡＧ
ＴＧＴ ｃＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＯＡＡ
ＴＣＣ’ｌ！ ＯＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ’ＧＴＧ Ｏ
ＴＡ ＡＡ’［”Ｉ’ＴＡ ＧＯＴ ＣＡＡ ＡＧＯＡ
、ＡＡ ＡＡＯＴＴＴ ＯＡＣＴＴＡ ＡＧＡ Ｃｏｏ
Ａ、ＧＧ ＧＡＯ’Ｉ”Ｉ’Ａ ＡＴＯＡＧ（Ｅ Ａ
Ａ’ｌ’ Ａ’Ｊ’Ｃ！ ＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ Ｇ’
Ｉ’Ｔ ＯＴＧ ＧＡＡ Ｃ！’Ｉ’Ａ ＡＡＧＧＧＡ
Ｔａｏ ＧＡＡ ＡＯＡ ＡＯＡ ＴＴａ ｉ〒Ｇ
Ｔ’ＧＴ ＧＡＡ ＴＡ’［’ ＧＯ’ｌ’ＧＡＴ Ｇ
ＡＧ ＡＣ！Ａ ＧＯＡ ＡＯＯＡＴＴ ＧＴＡ ＧＡ
Ａ ＴＴＴ ＯＴＧ ＡＡＯＡＧＡ ＴＧＧ 、Ａ’
ｌ”Ｉ’ ＡＣ！Ｏ’ＦＴＴ ＴＧＴ （！ＡＡ Ａ
ＧＯＡ’ｌ’ＯＡＴＯ’Ｉ”０ＡＡＣＡ Ｃ’ｌ’Ａ
ＡＣＴ 上記塩基配列（Ｉ）および＜ＴＩ）はそれぞれ下記のポ
リペプチド（Ｉ）および（ｎ）に相応している。
’ｆｆＯＯＴＧ ＴＣＴ ＴＧＯＡＴＴ ＧＯＡ Ｃ！
ＴＡ ＡＧ’Ｉ’ Ｏ’ｌ’Ｔ ＧＯＡ Ｃ！Ｔ’Ｉ’
ＧＴＯＡＣ！Ａ ＡＡＯＡＧ’Ｉ’ＧＯＡ ＯＯＴ
ＡＣＴ ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＣ！Ｔ ＡＯＡ ＡＡ、Ｇ
ＡＡＡ、 ＡＯＡ ＣＡＧＯＴＡ ＯＡＡ ＯＴＧ
ＧＡＧ ＯＡＴ ’ｌ”ＴＡ ＯＴＧ ＯＴＧ ＧＡＴ
ＴＴＡ ０ＡＧＡＴＧ ＡＴＴ Ｔ’Ｌ”Ｇ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＴＴ 、ＡＡＴ ＡＡ’ｌ’ ＴＡＯＡＡ
Ｇ ＡＡＴＣｏｏ ＡＡＡ ＣＴＣＡｃＣＡＧＧ ＡＴ
Ｇ Ｃ！Ｔｏ ＡＯＡ ＴＴ’ｌ’ ＡＡＧ ＴＴＴＴ
ＡＯＡＴＧ ０００ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＯＯＡＯＡ
ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ０ＡＴＯＴＴ ｃＡＧ ’Ｉ
’ＧＴ Ｏ’Ｉ’Ａ ＧＡＡ ＧＡ、Ａ ＧＡＡ ＯＴ
ｃ ＡＡＴ ＣＯＴ ０ＴＧＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ
ＯＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＯＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡＡ
Ａ ＡＡＯ’Ｉ”Ｉ’Ｔ ＯＡＯＴＴＡ ＡＧＡ ００
０ ＡＧＧ ＧＡＯ’Ｉ’ＴＡ Ａ’［’ＯＡＧＣ！
ＡＡＴＡ’Ｊ’ＯＡＡＯＧ’Ｉ’Ａ ＡＴＡ ＧＴＴ
ＯＴＧ ＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＯＯＧＡ
Ａ Ａ、ＯＡ ＡＣＡ ＴＴＯＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ
’Ｉ’ＡＴ ＧＯＴ ＧＡ’Ｉ’ ＧＡＧＡＯＡ Ｇ
ＯＡ ＡＯＣ！ ＡＴ’ｌ’ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＴ
Ｏ’ｌ’Ｇ ＡＡＯＡＧＡ ’Ｉ’ＧＧＡＴＴ ＡＯ
ＯＴ’ｌ”Ｔ ＴＧＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡ’Ｔ’ＯＡＴ
Ｏ’Ｉ！ＯＡ ＡＣ！Ａ ＯＴＡＣＴ （ＩＩ） ＧＯＡ ＯＯ’ｌ’ ＡＣＴ ＴＯＡ
ＡＧＴ ’Ｉ’０’Ｊ’ ＡＯＡ ＡＡＧ ＡＡｌｒＡ
Ｃ，Ａ ＯＡＧ ＣＴＡ ＯＡＡ （ＴＴＯＧＡＧ Ｏ
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Ａ ＣＡＧ Ａ’ｌ’Ｇ ＡＴＴ ’Ｉ’ＴＧ ＡＡＴ
ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＯＪＡＧ Ａ
Ａ’ｌ’ Ｃｏｏ ＡＡＡ ＣＴＣＡＯＯＡＧＧ ＡＴ
Ｇ ＣＴＣＡＯＡ Ｔ’ｌ’ＴＡＡＧ Ｔ’ＴＴ ＴＡ
ＯＡＴＧ ＯＣＣＡＡＧ ＡＡＧ Ｇｏｏ ＡＣ！Ａ
ＧＡＡ ０ＴＧＡＡＵ ＯＡ’ｌ’ ＣＴＴ ＯＡＧ
ＴＧＴ ｃＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＯＡＡ
ＴＣＣ’ｌ！ ＯＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ’ＧＴＧ Ｏ
ＴＡ ＡＡ’［”Ｉ’ＴＡ ＧＯＴ ＣＡＡ ＡＧＯＡ
、ＡＡ ＡＡＯＴＴＴ ＯＡＣＴＴＡ ＡＧＡ Ｃｏｏ
Ａ、ＧＧ ＧＡＯ’Ｉ”Ｉ’Ａ ＡＴＯＡＧ（Ｅ Ａ
Ａ’ｌ’ Ａ’Ｊ’Ｃ！ ＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ Ｇ’
Ｉ’Ｔ ＯＴＧ ＧＡＡ Ｃ！’Ｉ’Ａ ＡＡＧＧＧＡ
Ｔａｏ ＧＡＡ ＡＯＡ ＡＯＡ ＴＴａ ｉ〒Ｇ
Ｔ’ＧＴ ＧＡＡ ＴＡ’［’ ＧＯ’ｌ’ＧＡＴ Ｇ
ＡＧ ＡＣ！Ａ ＧＯＡ ＡＯＯＡＴＴ ＧＴＡ ＧＡ
Ａ ＴＴＴ ＯＴＧ ＡＡＯＡＧＡ ＴＧＧ 、Ａ’
ｌ”Ｉ’ ＡＣ！Ｏ’ＦＴＴ ＴＧＴ （！ＡＡ Ａ
ＧＯＡ’ｌ’ＯＡＴＯ’Ｉ”０ＡＡＣＡ Ｃ’ｌ’Ａ
ＡＣＴ 上記塩基配列（Ｉ）および＜ＴＩ）はそれぞれ下記のポ
リペプチド（Ｉ）および（ｎ）に相応している。
（■） Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ ＧＩＮ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ ８ｅｒ （ｌｙｓｌｌｅ Ａｌａ Ｌ
ｅ、ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔ
ｈｒ’ＡｓＮ ８ｅｒＡ、ｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ ８ｅｒ ８ｅｒ Ｔｈｒ’ ：Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒ’ ＧＩＮＬｅｕ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ’Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ ＬｅｕＬｅｕ’ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇ’
ｌＮＭｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａ−ｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈ
ｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐｒ。
Ｌｅｕ Ｌｅｕ ８ｅｒ （ｌｙｓｌｌｅ Ａｌａ Ｌ
ｅ、ｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔ
ｈｒ’ＡｓＮ ８ｅｒＡ、ｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ ８ｅｒ ８ｅｒ Ｔｈｒ’ ：Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒ’ ＧＩＮＬｅｕ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ’Ｈ
ｉｓ Ｌｅｕ ＬｅｕＬｅｕ’ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇ’
ｌＮＭｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａ−ｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈ
ｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐｒ。
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａ、ｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｔｉ１ｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＴｙｒＭｅｔ Ｐ
ｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ ＬｙＳ ＨｉｓＬｅｕＧＩＮ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅ
ｕ ＧｌｕＧｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ、 ＡｓＮ Ｌｅｕ
Ａｌａ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ’ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ、 Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｌｅｕ ＩＩｓ Ｓｅｒ ＡｓＮ ｌ１ｅＡｓｌｊＶａ
ｌ １１ｅ’Ｖａｌ ｌ１ｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ｇ１ｙ’８ｅｒ Ｇｌｕ’Ｔ’ｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ ’Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓ
ｐ Ｇｌｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇ］、ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ 、ＡｓＮ Ａｊｇ Ｔｒｐ
ｌ１ｅＴｈｒ Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｉ
ｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ（ｕ）
Ａ］、ａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｆｅｒ ８ｅｒ ８ｅ
ｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ”ＬｆｓＴｈｒ ＧＩＮ Ｌｅｕ
ＧＩＮＬｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＧＩＮ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅ
ｕ ＡｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
ＡｓＮ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｌ１ｒ Ａｒｇ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ＬｙｓＰｈｅ Ｔｙ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＨｉｓ Ｌｅｕ ＧＩＮ Ｏ
ｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ｐｒ。
Ｔｉ１ｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＴｙｒＭｅｔ Ｐ
ｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ ＬｙＳ ＨｉｓＬｅｕＧＩＮ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅ
ｕ ＧｌｕＧｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ、 ＡｓＮ Ｌｅｕ
Ａｌａ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ’ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ、 Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｌｅｕ ＩＩｓ Ｓｅｒ ＡｓＮ ｌ１ｅＡｓｌｊＶａ
ｌ １１ｅ’Ｖａｌ ｌ１ｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ｇ１ｙ’８ｅｒ Ｇｌｕ’Ｔ’ｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ ’Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓ
ｐ Ｇｌｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ
Ｇ］、ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ 、ＡｓＮ Ａｊｇ Ｔｒｐ
ｌ１ｅＴｈｒ Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｉ
ｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ（ｕ）
Ａ］、ａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｆｅｒ ８ｅｒ ８ｅ
ｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ”ＬｆｓＴｈｒ ＧＩＮ Ｌｅｕ
ＧＩＮＬｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＧＩＮ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｅ
ｕ ＡｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙｓ
ＡｓＮ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｌ１ｒ Ａｒｇ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ＬｙｓＰｈｅ Ｔｙ
ｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＬｙｓＨｉｓ Ｌｅｕ ＧＩＮ Ｏ
ｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ｐｒ。
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＡｓＮ Ｌ
ｅｕ Ａｌａ ＧＩＮ ８ｅｒ ＬｙｓＡｓＮ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ ５ｅｒＡｓＮ Ｉｌｅ ＡｓＮ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ＧｌｙＳｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｍｅ、ｔ （３ｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ
ＡｓｐＧｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＡｓＮ ＡｒｇＴｒｐ
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ ＴｈｒＬ
ｅｕ Ｔｈｒ なお、インターロイキン−２ポリペプチドをコードする
ＤＮＡの構造はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（
Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、６５．４９９〜５６０．１９
８０ ）およびジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｓｍ
１ｔｈ、 Ａ、Ｊ、Ｈｏ。
ｅｕ Ａｌａ ＧＩＮ ８ｅｒ ＬｙｓＡｓＮ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ ５ｅｒＡｓＮ Ｉｌｅ ＡｓＮ
Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ ＧｌｙＳｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｍｅ、ｔ （３ｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ
ＡｓｐＧｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＡｓＮ ＡｒｇＴｒｐ
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ ＴｈｒＬ
ｅｕ Ｔｈｒ なお、インターロイキン−２ポリペプチドをコードする
ＤＮＡの構造はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの化学法（
Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、６５．４９９〜５６０．１９
８０ ）およびジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｓｍ
１ｔｈ、 Ａ、Ｊ、Ｈｏ。
Ｍｅｔ’ｈ＝ Ｅｎｚｙｍ−９６５，５６０〜５８０．
１９８０ ）等を用いる常法により決定することができ
る。
１９８０ ）等を用いる常法により決定することができ
る。
本発明において単離され、インターロイキン−２活性を
持つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもの
誓ある。
持つポリペプチドが発現されたＤＮＡは以下に示すもの
誓ある。
上記塩基配列のうち分子量が１５０００ダルトンである
と報告されているインターロイキン−２をコードできる
フレームは、上記塩基蘭列に示されているものだけであ
る。蛋白合成の一始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧコド
ンから始まることが殆んどであるから、最初のイニシェ
ーションコドンＡＴＧよりターミネーションコドン’Ｉ
’ＧＡの前のＡＯＴ（スレオニン）までがインターロイ
キン−２ポリペプチドに対応する塩基配列と考えられる
。また、インターロイキン−２のような分泌蛋白におい
ては疎水性アミノ酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチ
ドが存在し、このペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋
白が知られている。上記塩基配列から判断すると、疎水
性アミノ酸に富んだＮ−末端部シグナルペプチドに相当
するものと考えられる。
と報告されているインターロイキン−２をコードできる
フレームは、上記塩基蘭列に示されているものだけであ
る。蛋白合成の一始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧコド
ンから始まることが殆んどであるから、最初のイニシェ
ーションコドンＡＴＧよりターミネーションコドン’Ｉ
’ＧＡの前のＡＯＴ（スレオニン）までがインターロイ
キン−２ポリペプチドに対応する塩基配列と考えられる
。また、インターロイキン−２のような分泌蛋白におい
ては疎水性アミノ酸に富んだ、いわゆるシグナルペプチ
ドが存在し、このペプチドは分泌の際に切断され成熟蛋
白が知られている。上記塩基配列から判断すると、疎水
性アミノ酸に富んだＮ−末端部シグナルペプチドに相当
するものと考えられる。
したがって、たとえばＡＴＧコドンから２１番目めコド
ンＧＯＡ （アラニン）ヨリターミネー′ジョンコドン
ＴＧＡの前のＡＣＴまでに対応するペプチドであっても
インターロイキン−２活性を有するものと考えられる。
ンＧＯＡ （アラニン）ヨリターミネー′ジョンコドン
ＴＧＡの前のＡＣＴまでに対応するペプチドであっても
インターロイキン−２活性を有するものと考えられる。
また、上記アラニン以後の又は上記スレオニン以前のい
くつかのアミノ酸がないものであって連続した複数の塩
基配列部であってもインターロイキン−２蛋白の活性部
位を保持しているようなポリペプチドであるならばイン
ターロイキン、−２活性を有することが十分に考えられ
る。
くつかのアミノ酸がないものであって連続した複数の塩
基配列部であってもインターロイキン−２蛋白の活性部
位を保持しているようなポリペプチドであるならばイン
ターロイキン、−２活性を有することが十分に考えられ
る。
本発明のＤＮＡの５′−末端に、インターロイキン−２
、遺伝子の情報発現のために有害でない−または複数の
塩基が配列されていてもよい。また、５′−末端に−ま
たは複数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列され
ていても、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがイン
ターロイキン−２活性を持つために有害でないものであ
ったり、また有害などのであっても容易に脱離できるよ
うなものであれば問題はない。
、遺伝子の情報発現のために有害でない−または複数の
塩基が配列されていてもよい。また、５′−末端に−ま
たは複数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列され
ていても、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがイン
ターロイキン−２活性を持つために有害でないものであ
ったり、また有害などのであっても容易に脱離できるよ
うなものであれば問題はない。
３′−末端についても同様、ポリペプチドがインターロ
イキン−２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が、３′
−末端に付加されていてもよいし、有害なものであって
も容易に脱離できるようなものであれば問題はない。ま
た、ＤＮＡの化学合成な。
イキン−２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が、３′
−末端に付加されていてもよいし、有害なものであって
も容易に脱離できるようなものであれば問題はない。ま
た、ＤＮＡの化学合成な。
どにより本発明の遺伝子の一部または本発明の遺伝子構
造から推論されるポリペプチドの一部を改変することも
可能である。さらに実施例に記載したヒト細胞以外の細
胞より得たｍ’ＲＮＡを用いて本発明の遺伝子を得るこ
ともできる。従って、要はインターロイキン−２活性を
もつポリペプチドをコードするＤＮＡであれば本発明の
遺伝子に含まれな〜）。
造から推論されるポリペプチドの一部を改変することも
可能である。さらに実施例に記載したヒト細胞以外の細
胞より得たｍ’ＲＮＡを用いて本発明の遺伝子を得るこ
ともできる。従って、要はインターロイキン−２活性を
もつポリペプチドをコードするＤＮＡであれば本発明の
遺伝子に含まれな〜）。
得られた組換えＤＮＡはレプリコンとしてベクターの宿
主微生物に導入する。宿主微生物として本発明ではエシ
ェリヒア・コリを使用したが、バチルス・ズブチリス、
サツカロマイセス・セレビシェ等も使用できる。エシェ
リヒア・コリの場合について使用されるベクターを以下
に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９８１）
参照）ＩｉｉＫ系プラスミドベクター（ストリンジェン
ト型）のｐｓＯｌｏｌ、 ｐＲ，に３５３ 、 ｐＲＫ
６４６ 、 ｐＲＫ２４８ 。
主微生物に導入する。宿主微生物として本発明ではエシ
ェリヒア・コリを使用したが、バチルス・ズブチリス、
サツカロマイセス・セレビシェ等も使用できる。エシェ
リヒア・コリの場合について使用されるベクターを以下
に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９８１）
参照）ＩｉｉＫ系プラスミドベクター（ストリンジェン
ト型）のｐｓＯｌｏｌ、 ｐＲ，に３５３ 、 ｐＲＫ
６４６ 、 ｐＲＫ２４８ 。
ｐＤＦ ４１ 等、 ＥＫ 系プラスミドベクター（リ
ラックスド型）のＣａ１Ｅ、１． ｐＶＨ５１，ｐＡＯ
１０５，Ｒ８Ｆ２１２４゜ｐＯＲｌ、 ｐＭＢ９． ｐ
Ｂ１１３１３． ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４゜ｐＢＲ
３２５，ｐＥＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ２２８９
゜ｐＫＹ２７００．ｐＫＮ８０．ｐｘｃ７．ｐＫＥ１５
８．ｐＭＫ２００４゜ｐＡＯＹＯｌ、 ｐＡＣＹＯ１８
４，λｄｕ１等、λｇｔ 系ファージベクターのλｇ
ｔ・λＣ１λｇｔ・λＢ、λＷＥ８・λＣ９λＷＥＳ・
λＢ／、λＺＪｖｉｒ−λＢ′、λＡＬＯ−λＢ、λＷ
ＥＳ−Ｔｓ６２２゜λＤａｍ等。
ラックスド型）のＣａ１Ｅ、１． ｐＶＨ５１，ｐＡＯ
１０５，Ｒ８Ｆ２１２４゜ｐＯＲｌ、 ｐＭＢ９． ｐ
Ｂ１１３１３． ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４゜ｐＢＲ
３２５，ｐＥＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ２２８９
゜ｐＫＹ２７００．ｐＫＮ８０．ｐｘｃ７．ｐＫＥ１５
８．ｐＭＫ２００４゜ｐＡＯＹＯｌ、 ｐＡＣＹＯ１８
４，λｄｕ１等、λｇｔ 系ファージベクターのλｇ
ｔ・λＣ１λｇｔ・λＢ、λＷＥ８・λＣ９λＷＥＳ・
λＢ／、λＺＪｖｉｒ−λＢ′、λＡＬＯ−λＢ、λＷ
ＥＳ−Ｔｓ６２２゜λＤａｍ等。
これらのベクターのうちエシェリヒア・コリに対しては
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
一般にｐＢＲ３２２が良く用いられている。
ｐＢＲ３２２の場合にはｃＤＮＡの組込み場所はＰｓｔ
Ｉサイ）、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
Ｉサイ）、ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されている。
プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣＩＱ処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込ま
せる方法が採用されており、Ｍｇ（１！ｌ、あるいはＲ
ｂＣ７をさらに共存させることにより形質転換の効率が
一層一寸ことも知られている。
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＣＩＱ処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてプラスミドを取込ま
せる方法が採用されており、Ｍｇ（１！ｌ、あるいはＲ
ｂＣ７をさらに共存させることにより形質転換の効率が
一層一寸ことも知られている。
また、微生物細胞をスフェロプラストあるいはプロトプ
ラスト化してから形質転換させてもよい。
ラスト化してから形質転換させてもよい。
形質転換株からイック−ロイキン−２遺伝子が組込まれ
ている株を選別するには、以下のような方法がある。
ている株を選別するには、以下のような方法がある。
（りすなわちこの選択方法はプ゛ラス・マイナス法と称
されるもので、まず０ｏｎＡによって刺激したジュルカ
ット細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によって
インターロイキン−２ｍＲＮＡを部分精製したのち（は
ぼ１１〜１２８ ｍＲＮＡ）、このｍ ＲＮＡを用い
て３２ｐによりラベルした１水銀ｃ ＤＮＡを合成する
。ついでｃ ＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアル
カリ処理によって除いた後、このＣＤＮＡとＣｏｎＡで
刺激していないジュルカット細胞より抽出した１１〜１
２８ｍ：ＲＮＡの部分精製ｍ ＲＮＡの過剰とハイブリ
ダイズさせた。そしてこの（：！ｏｎＡ刺激していない
ｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブ
リッドを形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカ
ラムによって分画し、それぞれグローブＡおよびプロー
ブＢとする。
されるもので、まず０ｏｎＡによって刺激したジュルカ
ット細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によって
インターロイキン−２ｍＲＮＡを部分精製したのち（は
ぼ１１〜１２８ ｍＲＮＡ）、このｍ ＲＮＡを用い
て３２ｐによりラベルした１水銀ｃ ＤＮＡを合成する
。ついでｃ ＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアル
カリ処理によって除いた後、このＣＤＮＡとＣｏｎＡで
刺激していないジュルカット細胞より抽出した１１〜１
２８ｍ：ＲＮＡの部分精製ｍ ＲＮＡの過剰とハイブリ
ダイズさせた。そしてこの（：！ｏｎＡ刺激していない
ｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブ
リッドを形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカ
ラムによって分画し、それぞれグローブＡおよびプロー
ブＢとする。
次に、前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ２
枚のニトロセルロースフィルターに生育させておき、ア
ルカリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定し
ておく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢ
を用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさ
せた後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡ
にはポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには
弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを
検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌｏ、 Ｐ
ａｏｃ、Ｊｐｎ。
枚のニトロセルロースフィルターに生育させておき、ア
ルカリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定し
ておく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢ
を用いてそれぞれ別々にフィルターにハイブリダイズさ
せた後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡ
にはポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには
弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを
検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌｏ、 Ｐ
ａｏｃ、Ｊｐｎ。
Ａｃａｄｏ、 ｖｏ１５’５Ｂ、 ４６４−４６９ （
１９７９） ）。
１９７９） ）。
あるいは形質転換株、たとえば１０００〜１０，０００
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮ、Ａにしてニトロセルロースフィルタ
ーに固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したよう
なインターロイキン−２ｍ ＲＮＡを含むヒ）Ｔ白血球
細胞より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あ
るいはＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン
−２ｍＲＮＡを含むｍｕＮＡをハイブリダイズさせた後
に、ＤＮＡ −ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロー
スフィルターに固定する方法もある。
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
スミドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮ、Ａにしてニトロセルロースフィルタ
ーに固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したよう
なインターロイキン−２ｍ ＲＮＡを含むヒ）Ｔ白血球
細胞より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あ
るいはＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン
−２ｍＲＮＡを含むｍｕＮＡをハイブリダイズさせた後
に、ＤＮＡ −ｍＲＮＡハイブリッドをニトロセルロー
スフィルターに固定する方法もある。
次に、このフィルターを１ ｍＭピペス、１０ｍＭＮａ
Ｃ１のような低塩溶液でよく洗滌した後、０．５ｍＭ
ＩＥＤＴＡ 、 ０．１％ＢＤＢのような溶液も、例
えば９５℃、１分間程度の熱処理を行なってフィルター
に吸着したｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴ
ｄＴ−セルロースカラムにかけるなどの操作を行なって
ｍＲＮＡを回収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカッ
メガエルの卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインタ
ーロイキン−２活性を測定する。あるいはウサギ網状赤
血球ないしは小麦胚芽（７） ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻
訳系で蛋白に翻訳させた後、インターロイキン−２抗体
でインターロイ＋ｙ−２を検定する。
Ｃ１のような低塩溶液でよく洗滌した後、０．５ｍＭ
ＩＥＤＴＡ 、 ０．１％ＢＤＢのような溶液も、例
えば９５℃、１分間程度の熱処理を行なってフィルター
に吸着したｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴ
ｄＴ−セルロースカラムにかけるなどの操作を行なって
ｍＲＮＡを回収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカッ
メガエルの卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインタ
ーロイキン−２活性を測定する。あるいはウサギ網状赤
血球ないしは小麦胚芽（７） ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻
訳系で蛋白に翻訳させた後、インターロイキン−２抗体
でインターロイ＋ｙ−２を検定する。
かくしてインターロイキン−２活性の検出された集団が
見出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化し
てより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的
には単数のクローンに細分化し、インターロイキン−２
ｃＤＮＡを含むクローンを同定する。
見出されれば、この集団の混合クローンの数を細分化し
てより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終的
には単数のクローンに細分化し、インターロイキン−２
ｃＤＮＡを含むクローンを同定する。
このようにして得られたインターロイキン−２遺伝子が
組込まれている組換え体微生物は常法にヨッて培養すれ
ばよい。
組込まれている組換え体微生物は常法にヨッて培養すれ
ばよい。
かくしてインターロイキン−２の遺伝子を有する組換え
体微生物菌体内にインターロイキン−２の遺伝子が増巾
、生産され、インターロイキン−２遺伝子を大量に調製
することができる。
体微生物菌体内にインターロイキン−２の遺伝子が増巾
、生産され、インターロイキン−２遺伝子を大量に調製
することができる。
また、このようにして得られた組換え体微生物を常法、
たとえばグルコースなどの炭素源やアンモニウムイオン
などの窒素源等を含む培地に該微生物を接種し、該微生
物の増殖に適する条件下で所定の期間培養することによ
って大量の培養物を得、この培養物より常法によりイン
ターロイキン−２ポリペプチドを容易に取得することが
できる。
たとえばグルコースなどの炭素源やアンモニウムイオン
などの窒素源等を含む培地に該微生物を接種し、該微生
物の増殖に適する条件下で所定の期間培養することによ
って大量の培養物を得、この培養物より常法によりイン
ターロイキン−２ポリペプチドを容易に取得することが
できる。
ここでエシェリヒア・コリの場合について説明する。
糾換え体微生物のエシェリヒア・コリヲタとえばグルコ
ースなどの炭素源やアンモニウムイオン日間培養すれば
よい。
ースなどの炭素源やアンモニウムイオン日間培養すれば
よい。
次に、培養物からインターロイキン−２活性を持つポリ
ペプチドを単離、精製する。この操作も当該技術におい
て知られている手段によ′り行なえばよく、たとえば塩
析、濃縮、真空透析、ゲルｐトゲラフイー停の種々の方
法を単独に、あるいは適宜組合せて用いて行なうことが
できる。
ペプチドを単離、精製する。この操作も当該技術におい
て知られている手段によ′り行なえばよく、たとえば塩
析、濃縮、真空透析、ゲルｐトゲラフイー停の種々の方
法を単独に、あるいは適宜組合せて用いて行なうことが
できる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例
（１） インターロイキン−２産生能を有するジェル
カット１１１細胞株（ＡＴＯ（！ ＣＲＬ８１２９ ）
を１×１０６個／ｍｌの細胞密度で無血清合成培地ＢＩ
ＴＯ５５−９１，０００ｍＡ！に懸濁し、ファルコン社
製回転培養瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操作
により細胞を集めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄ
の細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここに０ｏｎＡ
２５μｇ／ｍｌを添加し、上記ファルコン社製回転培養
瓶（４本）に１． ＯＯＯｍｌで張り込み６時間回転培
養した。
カット１１１細胞株（ＡＴＯ（！ ＣＲＬ８１２９ ）
を１×１０６個／ｍｌの細胞密度で無血清合成培地ＢＩ
ＴＯ５５−９１，０００ｍＡ！に懸濁し、ファルコン社
製回転培養瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操作
により細胞を集めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄ
の細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここに０ｏｎＡ
２５μｇ／ｍｌを添加し、上記ファルコン社製回転培養
瓶（４本）に１． ＯＯＯｍｌで張り込み６時間回転培
養した。
（２） このようにして得た０ｏｎＡ２５μ０／ｒｄ
で６時間誘導したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０”細
胞）をＦＢ、Ｓ溶液８００ｍ１に懸濁し、細胞を遠心に
よって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲ
ｉｂｏｎｕｃｌｅｏＳｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ Ｃｏ
ｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ８Ｂ溶液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ 、 ｐａ ７．５゜１０ ｍ
Ｍ Ｎａ１ｌ 、 １．５ ｍＭ Ｍｇ０１Ｑ−＞
８００１１１に懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５
％になるように加えた後、ゆるやかに攪拌後３．００
Ｏｒｐｍで５分遠心して核を除去し、その上清液に８Ｄ
８ （０，５％）とＥＤＴＡ ＜ ｓ ｍＭ ）を加え
た後、ただちにフェノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽
出した。合計３回フェノール抽出を繰返してから２容エ
タノールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０
ｍＭＴｒｉｓ −ＨｏＩ 、 ｐＨ７： ５で溶解し
た。このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮ
Ａ ｔは１９６■であった。
で６時間誘導したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０”細
胞）をＦＢ、Ｓ溶液８００ｍ１に懸濁し、細胞を遠心に
よって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲ
ｉｂｏｎｕｃｌｅｏＳｉｄｅｓ−Ｖａｎａｄｙｌ Ｃｏ
ｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ８Ｂ溶液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ 、 ｐａ ７．５゜１０ ｍ
Ｍ Ｎａ１ｌ 、 １．５ ｍＭ Ｍｇ０１Ｑ−＞
８００１１１に懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０５
％になるように加えた後、ゆるやかに攪拌後３．００
Ｏｒｐｍで５分遠心して核を除去し、その上清液に８Ｄ
８ （０，５％）とＥＤＴＡ ＜ ｓ ｍＭ ）を加え
た後、ただちにフェノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽
出した。合計３回フェノール抽出を繰返してから２容エ
タノールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０
ｍＭＴｒｉｓ −ＨｏＩ 、 ｐＨ７： ５で溶解し
た。このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮ
Ａ ｔは１９６■であった。
次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ ）−セ＃ 四−ス（Ｐ、 Ｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｇ 。
（ｄＴ ）−セ＃ 四−ス（Ｐ、 Ｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｇ 。
Ｔｙｐｅ７ ）を用い、カラムクロマトグラフィーを行
なった。吸着は２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ
７，５。
なった。吸着は２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ
７，５。
０、５ Ｍ Ｎａｐ／ 、 ］ ｍＭ ＥＤＴＡ 、
０．５％ＳＤＢ溶液にＲＮＡを溶解して行ない、溶出
は緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯｌ、 ｐＨ７，５，
０，５Ｍ Ｎａ１ｌ、 １ ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄後、
水と１０ ｍＭ ’Ｉ！ｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，
５）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。
０．５％ＳＤＢ溶液にＲＮＡを溶解して行ない、溶出
は緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯｌ、 ｐＨ７，５，
０，５Ｍ Ｎａ１ｌ、 １ ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄後、
水と１０ ｍＭ ’Ｉ！ｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ７，
５）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。
この結果、溶出されたｍＲＮＡ量は３．６〜であった。
さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４７１１Ｐ）をＳＤ
Ｇ遠心（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ。
Ｇ遠心（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ。
０、２ Ｍ Ｍａｉｌを含む５〜２５％シヨ糖密度勾配
。
。
Ｈｌｔａｃｈｉ ＲＰＳ ２８ ローターで２６，００
０ ｒＴ）ｍ。
０ ｒＴ）ｍ。
２４時間、４℃）して分画し、１１−１２８のｍＲＮＡ
画分を分画番号１２，１３．１４としてそれぞれ５９μ
り、４６μり、６０μり得た。
画分を分画番号１２，１３．１４としてそれぞれ５９μ
り、４６μり、６０μり得た。
（３） ここに得られた分画番号１３のｍＲＮＡを前
出の検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１
個当り５０μｇをマイクロインジェクション法により注
入して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン−
２の活性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化
チミジンの取り込みおよび活性化Ｔ’Ｊンパ球数の増加
がみられ、これら分画のｍ ＲＮＡは本発明のヒトイン
ターロイキン−２ｍＲＮＡを含有することが証明された
。
出の検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１
個当り５０μｇをマイクロインジェクション法により注
入して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキン−
２の活性検定に供したところ、次表に示すトリチウム化
チミジンの取り込みおよび活性化Ｔ’Ｊンパ球数の増加
がみられ、これら分画のｍ ＲＮＡは本発明のヒトイン
ターロイキン−２ｍＲＮＡを含有することが証明された
。
表−■
ｃ４）
対照ｌ−５５３０
（アッセイ培地）
ｘ ８ １４６８３
分画１３の翻訳物 Ｘ３□ □。１６５３２対照
Ｉ ×２ ０ （アッセイ培地） ×１６ ０
０分画１３ ノｖｙ、ｐ物Ｘ ２ １１５
４０Ｘ１６ ５５ ＊各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン
−２（１０単位／ｄ）と比較して求めた。
Ｉ ×２ ０ （アッセイ培地） ×１６ ０
０分画１３ ノｖｙ、ｐ物Ｘ ２ １１５
４０Ｘ１６ ５５ ＊各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン
−２（１０単位／ｄ）と比較して求めた。
（４） 次に、ここで得られたインターロイキン−２
ｍＲＮＡを含む１１〜１２８ ｍＲＮＡ分画１３より
ｃＤＮＡをインビトロで合成し、プラスミド□ベクター
ＰＢＲ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリ
ヒア・コリにトランスホームしてインターロイキン−２
ＣＤＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で（４−１）
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）
、３０ｍＭ Ｍａｉｌ、 ６ ｍＭ ＭｇＯ１＠ 、
５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍ
Ｍの各ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ。
ｍＲＮＡを含む１１〜１２８ ｍＲＮＡ分画１３より
ｃＤＮＡをインビトロで合成し、プラスミド□ベクター
ＰＢＲ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリ
ヒア・コリにトランスホームしてインターロイキン−２
ＣＤＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で（４−１）
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）
、３０ｍＭ Ｍａｉｌ、 ６ ｍＭ ＭｇＯ１＠ 、
５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍ
Ｍの各ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ。
ｄＴＴＰ （ｃｌＯＴＰは８２ｐラベルしたものを含む
）。
）。
０．７５μクオリゴ（ｄＴ）□。、 １０ ｐｇｍＲ
ＮＡおよび１５ユニットＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、Ｗ、１
３ｅａｒｄ ）を混ぜ、４１℃に９０分間保った。反応
終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノール沈澱
としてＤＮＡを回収し、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７，５溶液に溶解した。これ
により約２．５μりの１本領ｃＤＮＡが合成された。こ
の溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加え
て０．３３ Ｎ ＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、
次いで溶液をＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、 ｐｈｉ
７．５の等量で中和し「セファデックスＧ−５０」カラ
ムに通した。これにより１．８μりのｃ ＤＮＡを回収
した。
ＮＡおよび１５ユニットＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、Ｗ、１
３ｅａｒｄ ）を混ぜ、４１℃に９０分間保った。反応
終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノール沈澱
としてＤＮＡを回収し、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ 、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７，５溶液に溶解した。これ
により約２．５μりの１本領ｃＤＮＡが合成された。こ
の溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加え
て０．３３ Ｎ ＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、
次いで溶液をＩ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、 ｐｈｉ
７．５の等量で中和し「セファデックスＧ−５０」カラ
ムに通した。これにより１．８μりのｃ ＤＮＡを回収
した。
（４−２） ５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
１０ｍＭＭｇ０１． 、 １０ ｍＭ ＤＴＴ 、
０．７５ ｍＭの各ｃＡＴＰ 。
１０ｍＭＭｇ０１． 、 １０ ｍＭ ＤＴＴ 、
０．７５ ｍＭの各ｃＡＴＰ 。
ｄＧ’［’Ｐ、 ｄ（！ＴＰ、 ｄＴＴＰ、 （ｃｌｃ
ＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む）、１．８μｇ１
本鎖ｃＤＮＡ、 ８ユニツトポリメレース（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ ） １． （米国ＢＲＬ製）を混ぜ、１５
°Ｃで１５時間反応を行なった。
ＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む）、１．８μｇ１
本鎖ｃＤＮＡ、 ８ユニツトポリメレース（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ ） １． （米国ＢＲＬ製）を混ぜ、１５
°Ｃで１５時間反応を行なった。
反応終了後、フェノール処理１回、クロロホルム処理１
回を行ない、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。
回を行ない、エタノール沈澱としてＤＮＡを回収した。
この反応により１．１０μりの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５） 。
０、２ Ｍ Ｍａｉｌ 、 １ ｍＭ ＺｎＯ１＠ 、
１．１０μクニ重鎖ｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分
間インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレア
ーゼＳｓ （三共（株） ｆｆ ＞を加え、さらに１５
分間インキュベートした。反応終了後、フェノール処理
２回行ない、［セファデックスＧ−５０，ｊカラムに通
し、０．５５μグの二重＠ｃＤＮＡを回収した。
１．１０μクニ重鎖ｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分
間インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレア
ーゼＳｓ （三共（株） ｆｆ ＞を加え、さらに１５
分間インキュベートした。反応終了後、フェノール処理
２回行ない、［セファデックスＧ−５０，ｊカラムに通
し、０．５５μグの二重＠ｃＤＮＡを回収した。
（４−３） ０．１４ Ｍカコジル酸カリウム、’３０
ｍＭ）リス塩基、 ０．１ ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
Ｏｏｏ！＠ 、 ０．６４ ｍＭ”Ｐ−ｄＯＴＰ （Ｓ
ｐｃ、’ａｃｔ、 ２．７ Ｘ １０６ｃｐｍ／ｎ ｍ
ｏｔ）。
ｍＭ）リス塩基、 ０．１ ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
Ｏｏｏ！＠ 、 ０．６４ ｍＭ”Ｐ−ｄＯＴＰ （Ｓ
ｐｃ、’ａｃｔ、 ２．７ Ｘ １０６ｃｐｍ／ｎ ｍ
ｏｔ）。
０．５５μクニ重鎖ｃ ＤＮＡおよび５ユニツトのター
ミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ ）を混ぜ３７℃で
７分間インキュベートし、反応終了後、フェノール処理
１回を行ない、「セファデックスＧ−５ＯＪカラムに通
しエタノール沈澱としてＤＮＡ０．５０μりを回収した
ところ約５０個のｄＯＭＰが両３′末端に付加された。
ミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ ）を混ぜ３７℃で
７分間インキュベートし、反応終了後、フェノール処理
１回を行ない、「セファデックスＧ−５ＯＪカラムに通
しエタノール沈澱としてＤＮＡ０．５０μりを回収した
ところ約５０個のｄＯＭＰが両３′末端に付加された。
ＰＢＲ３２２ＤＮＡ １０μりを制限酵素ＰｓｔＩで切
断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＯＭＰ鎖を付加
したのと全く同じ条件でｄｃＴＰの代りにａＧＴＰを用
いて両３１末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。かくして約５
０個のｄ ＧＭＦが両３１末端に付加された。
断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＯＭＰ鎖を付加
したのと全く同じ条件でｄｃＴＰの代りにａＧＴＰを用
いて両３１末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。かくして約５
０個のｄ ＧＭＦが両３１末端に付加された。
（４−４）５ ０ｍＭＴｒｉｓ−ＨｏＩ （ｐＨ７，
５）、 ０．１ ＭＮａＯｊ 、 ５ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、 ０．０５ ｆｉりのｄＧＭＰが付加されたＰＢ
Ｒ３２２，０，０１μりのｄｏｏＦが付加されたｃＤＮ
Ａをまず６５℃で２分間、次いで４６°Ｃで１２０分間
、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０分間保持
した。
５）、 ０．１ ＭＮａＯｊ 、 ５ ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、 ０．０５ ｆｉりのｄＧＭＰが付加されたＰＢ
Ｒ３２２，０，０１μりのｄｏｏＦが付加されたｃＤＮ
Ａをまず６５℃で２分間、次いで４６°Ｃで１２０分間
、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０分間保持
した。
エシェリヒア・コリχ１７７６を５ＱｍｌのＬ培地（１
００μｇ７ｍｔ、のジアミノピメリン酸と５０μ９４の
チミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキス。
００μｇ７ｍｔ、のジアミノピメリン酸と５０μ９４の
チミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキス。
０．５％ＮａＣ７および０．１％グルコースを含む）に
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
．３になるまで３７°Ｃで振とう培養した。培養終了後
、培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離
により集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（３１（ｐＨ７，
６）、 ０．１ＭＮａ０ｔ、 ５ｍＭＭｇ０！、、
１０ ｍ’ＭＲｂＯ７の溶液２５＋１１／で２回洗浄
した。
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
．３になるまで３７°Ｃで振とう培養した。培養終了後
、培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心分離
により集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（３１（ｐＨ７，
６）、 ０．１ＭＮａ０ｔ、 ５ｍＭＭｇ０！、、
１０ ｍ’ＭＲｂＯ７の溶液２５＋１１／で２回洗浄
した。
得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨｏＩ （ｐＨ
７，６） 。
７，６） 。
０、２５ Ｍ ＫＯｌ 、 ５ ｍＭ ＭｇＯ！９．
０．１ Ｍ ０ａｌｌ＠ および１０ ｍＭ Ｒｂ０
ｌを含む溶液２０ｍ１に懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液ＩＩ
ｒＬｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０．
２ ｄに上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置
した。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０℃で
６０分商静置した。
０．１ Ｍ ０ａｌｌ＠ および１０ ｍＭ Ｒｂ０
ｌを含む溶液２０ｍ１に懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた。上記と同じ溶液ＩＩ
ｒＬｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液の０．
２ ｄに上記組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置
した。さらに、３７℃で２分間保ったのち、再び０℃で
６０分商静置した。
次に、これに前記り培地Ｑ、 ７ ａｕを加えて３７℃
で３０分間振とう培養した。この培養液Ｑ、 ｌ ｍｌ
を１００μ９７ｍ１ジアミノピメリン酸、５０μｇ７ｍ
ｉチミジンと１５μ９７ｍ１テトラサイクリンを含むＬ
培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて
２日間インキュベートした。
で３０分間振とう培養した。この培養液Ｑ、 ｌ ｍｌ
を１００μ９７ｍ１ジアミノピメリン酸、５０μｇ７ｍ
ｉチミジンと１５μ９７ｍ１テトラサイクリンを含むＬ
培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて
２日間インキュベートした。
（４−５）上記において出現したコロニー４３２個をそ
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団のｄに接種
し、３７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニ
コールを最終濃度で１７０μ９７ｍ、ｅになるように加
えた新鮮な上記り培地２ｏｏｍｔを追加し、さらに−晩
振盪培養する。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅してお
いて常法に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。このＤ
ＮＡを用いてＨｙｂｒｉｄｉｍｔｌｏｎ−ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ 法でインターロイキン−２ｃ
ＤＮＡをもつクローンをスクリーニングした。ここで用
いたＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｎｓｌａｔｉｏ
ｎ ａｓｓａｙ は以下のようにして行なった。
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団のｄに接種
し、３７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニ
コールを最終濃度で１７０μ９７ｍ、ｅになるように加
えた新鮮な上記り培地２ｏｏｍｔを追加し、さらに−晩
振盪培養する。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅してお
いて常法に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。このＤ
ＮＡを用いてＨｙｂｒｉｄｉｍｔｌｏｎ−ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ 法でインターロイキン−２ｃ
ＤＮＡをもつクローンをスクリーニングした。ここで用
いたＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｎｓｌａｔｉｏ
ｎ ａｓｓａｙ は以下のようにして行なった。
精製したＤＮＡ ２５μりを制限酵素Ｂｉｎｄｍで切断
し、フェノール処理３回、フェノール−クロロホルム処
理１回およびクロロホルム処理１回を行なってＤＮＡを
エタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄したのち回
収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μｔに溶解し
、９０℃で５分間熱変性させた。
し、フェノール処理３回、フェノール−クロロホルム処
理１回およびクロロホルム処理１回を行なってＤＮＡを
エタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄したのち回
収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μｔに溶解し
、９０℃で５分間熱変性させた。
その後、１０ＸＳＳＯ（１，５ＭＮａ０／、 ０．１５
Ｍクエン酸３ナトリウム）で１．３ ｍｌに希釈した。
Ｍクエン酸３ナトリウム）で１．３ ｍｌに希釈した。
これをニトロ七ルロースフィルターに固定し、８０℃で
３時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムア
ミド、２０ｍＭピベス、 ｐＨ６，５，Ｑ、７５Ｍ
ＮａＯ！ 、 ５ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．２％８Ｄ
８および２５０μｑ ｍＲＮＡ を含む溶液中で３７℃
、１８時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡと
インターロイキン−２ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせ
た。次いで、このフィルターを１０ｍＭピペスｐｕ ６
．５ 。
３時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムア
ミド、２０ｍＭピベス、 ｐＨ６，５，Ｑ、７５Ｍ
ＮａＯ！ 、 ５ ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．２％８Ｄ
８および２５０μｑ ｍＲＮＡ を含む溶液中で３７℃
、１８時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡと
インターロイキン−２ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせ
た。次いで、このフィルターを１０ｍＭピペスｐｕ ６
．５ 。
０．１５ ＭＮａｏｌ、 １ ｍＭＥＤＴＡ 、 ０
．２％ＳＤＳ溶液で６５°Ｃで３回洗浄した後、さらに
１ ｍＭビペス。
．２％ＳＤＳ溶液で６５°Ｃで３回洗浄した後、さらに
１ ｍＭビペス。
１０ ｍＭ Ｎａ１ｌ溶液で３回洗浄し、次いで０．５
ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．１％ＳＤＳ溶液で９５℃で１
ｍ’ｉｎ処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶
出した。これを常法に従ってオリゴｄｔ−セルロースカ
ラムにかけて回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させイン
ターロイキン−２活性を測定した。
ｍＭＥＤＴＡ 、 ０．１％ＳＤＳ溶液で９５℃で１
ｍ’ｉｎ処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡを溶
出した。これを常法に従ってオリゴｄｔ−セルロースカ
ラムにかけて回収した。この回収したｍＲＮＡをアフリ
カッメガエルの卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させイン
ターロイキン−２活性を測定した。
この結果、１８集団の中の１集団に前述のトリチウム化
チミジンの取り込み量による活性検定法により４８単位
／ ｍｌのインターロイキン−２の活性が検出された。
チミジンの取り込み量による活性検定法により４８単位
／ ｍｌのインターロイキン−２の活性が検出された。
そこで、さらにこの集団に属する２４コロニーを今度は
単独にそれぞれ前述したよ５［１００μ９７ｍ、ｌのジ
アミノピメリン酸、５０μｇＡのチミジンと１０μり／
ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ培地２００ｄに接種し
、３７℃で５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコー
ルを最終濃度で１７０μり／ｍｌになるよ′うに加えた
新鮮な上記■、−培地２００ ｍｌを追加し、さらに−
夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法
に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。そして各ＤＮＡ
５μｑをＢｉｎｄｍで切断した後、前回と同様にニト
ロセルロースフィルターに固定してインターロイキン−
２ｍＲＮＡ とハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡを回収
してアフリカッメガエルの卵母細胞に注入して蛋白に翻
訳しインターロイキン−２活性を測定して、２４コロニ
ーの中のどのコロニー１１Ｃイアターロイキン−２クロ
ーンが存在するか検定したところ１コロニーより得られ
た精製プラスミドＤＮＡ 。
単独にそれぞれ前述したよ５［１００μ９７ｍ、ｌのジ
アミノピメリン酸、５０μｇＡのチミジンと１０μり／
ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ培地２００ｄに接種し
、３７℃で５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコー
ルを最終濃度で１７０μり／ｍｌになるよ′うに加えた
新鮮な上記■、−培地２００ ｍｌを追加し、さらに−
夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法
に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。そして各ＤＮＡ
５μｑをＢｉｎｄｍで切断した後、前回と同様にニト
ロセルロースフィルターに固定してインターロイキン−
２ｍＲＮＡ とハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡを回収
してアフリカッメガエルの卵母細胞に注入して蛋白に翻
訳しインターロイキン−２活性を測定して、２４コロニ
ーの中のどのコロニー１１Ｃイアターロイキン−２クロ
ーンが存在するか検定したところ１コロニーより得られ
た精製プラスミドＤＮＡ 。
プラスミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを
卵母細胞に翻訳させたものにインターロイキン−２活性
が見出され（表−２）、本クローンがインターロイキン
−２ｃＤＮＡ ヲ持つクローン（エシェリヒア・コリχ
１７７６／３−１６ＡＪ１１９３−１６ＡＪ１１９９５
（ＦＥＲであると同定された。即ちプラスミドｐ３−１
６のｃＤＮＡはインターロイキン−２ｍＲＮＡと特異的
にハイブリッドを形成するＤＮＡ （（”：／ ｐ −
ｏイキンー２遺伝子）をもっことが証明された。
卵母細胞に翻訳させたものにインターロイキン−２活性
が見出され（表−２）、本クローンがインターロイキン
−２ｃＤＮＡ ヲ持つクローン（エシェリヒア・コリχ
１７７６／３−１６ＡＪ１１９３−１６ＡＪ１１９９５
（ＦＥＲであると同定された。即ちプラスミドｐ３−１
６のｃＤＮＡはインターロイキン−２ｍＲＮＡと特異的
にハイブリッドを形成するＤＮＡ （（”：／ ｐ −
ｏイキンー２遺伝子）をもっことが証明された。
次にプラスミドｐ３−１６のｃ ＤＮＡの制限酵素切断
地図を検討したところ、ｘｂａＩ（米国ＥＲＬ社）で１
ケ所、 ＢｓｔＮＩ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ、ｎｄ
Ｅｉｏ Ｌａｂ。
地図を検討したところ、ｘｂａＩ（米国ＥＲＬ社）で１
ケ所、 ＢｓｔＮＩ （米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ、ｎｄ
Ｅｉｏ Ｌａｂ。
社）で２ケ所（ＸｂａＩ切断個所の上流及び下流）切断
された。しかし、このｃ ＤＮＡは約６５０塩基対より
なり、１１〜１２８のインターロイキン−２ｍＲＮＡ
の一部に対応するものとわかったので、再び同様にして
調製したヒトインターロイキン−２ｍＲ，ＮＡ を鋳
型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄｅｔ ａｌ、 Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ｖｏ／、９．
ｐ２５５１（１９８１）） により前述同様にして
ＣＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２２に挿入した
。このプラスミドを用いてＥ−ＣＯＩＩχ１７７６を形
質転換させ、約２０００個の転換株のなかから、プラス
ミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持つｃ Ｄ Ｎ
ＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方
法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃ ＤＮＡインサ
ートを持つプラスミドｐ Ｉ Ｌ ２〜５ＯＡを持つ転
換株（エシェリヒア・コリＺ １７７６／ＩＬ−２−５
０Ａ ＡＪ １１９９６ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６））
を得た。このｐＩＬ２−５ＯＡのｃＤＮＡの制限酵素切
断地図を図−１に示す。
された。しかし、このｃ ＤＮＡは約６５０塩基対より
なり、１１〜１２８のインターロイキン−２ｍＲＮＡ
の一部に対応するものとわかったので、再び同様にして
調製したヒトインターロイキン−２ｍＲ，ＮＡ を鋳
型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄｅｔ ａｌ、 Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ｖｏ／、９．
ｐ２５５１（１９８１）） により前述同様にして
ＣＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢＲ３２２に挿入した
。このプラスミドを用いてＥ−ＣＯＩＩχ１７７６を形
質転換させ、約２０００個の転換株のなかから、プラス
ミドｐ３−１６のｃＤＮＡと同じ配列を持つｃ Ｄ Ｎ
ＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ−Ｈｏｇｎｅｓｓの方
法を用いて選別し、約８５０塩基対のｃ ＤＮＡインサ
ートを持つプラスミドｐ Ｉ Ｌ ２〜５ＯＡを持つ転
換株（エシェリヒア・コリＺ １７７６／ＩＬ−２−５
０Ａ ＡＪ １１９９６ （ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６））
を得た。このｐＩＬ２−５ＯＡのｃＤＮＡの制限酵素切
断地図を図−１に示す。
表−２（イ）
＊ｌｌプラスミドル３−１のｃＤＮＡにハイブリダイズ
したｍＲＮ人 このエシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０Ａ
ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６） を２５
０．ｍｌのＬ培地（１００μｇ〜のジアミノピメリン酸
と５０ ｐ’）／ｍｌのチミジン、１％トリプトブアン
。
したｍＲＮ人 このエシェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０Ａ
ＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２６） を２５
０．ｍｌのＬ培地（１００μｇ〜のジアミノピメリン酸
と５０ ｐ’）／ｍｌのチミジン、１％トリプトブアン
。
０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ１ｌおよび０．１％
グルコースを含む）に接種し、培養液の５６２ｍμにお
ける吸光度がおよそ０．５になるまで３７°Ｃで振とう
培養した。
グルコースを含む）に接種し、培養液の５６２ｍμにお
ける吸光度がおよそ０．５になるまで３７°Ｃで振とう
培養した。
培養終了後、培養液を０℃で３０分間放置し、次に遠心
分離により菌体を集め、２０ ｍＭ ）リス−ＨＯ／
（３０ｍＭ−Ｎａ０１含有）１０ｒＩＬｌで１回洗浄シ
タのち１．８ ｍｌの同緩衝液に懸濁した。これに１０
ｍｇ／ＩＩＬｌのリゾチーム液０．２μｔと０．５ Ｍ
−ＥＤＴＡ ２０μｔを添加し、０℃で２０分間放置後
、凍結と融解とを３回繰返した。しかる後、１０．００
Ｏｒｐｍ。
分離により菌体を集め、２０ ｍＭ ）リス−ＨＯ／
（３０ｍＭ−Ｎａ０１含有）１０ｒＩＬｌで１回洗浄シ
タのち１．８ ｍｌの同緩衝液に懸濁した。これに１０
ｍｇ／ＩＩＬｌのリゾチーム液０．２μｔと０．５ Ｍ
−ＥＤＴＡ ２０μｔを添加し、０℃で２０分間放置後
、凍結と融解とを３回繰返した。しかる後、１０．００
Ｏｒｐｍ。
１０分および４０．００ Ｏｒｐｍ、 ３０分の遠心
分離を行ない、上清液として菌体抽出液１−５ ｍｌを
得た。
分離を行ない、上清液として菌体抽出液１−５ ｍｌを
得た。
この菌体抽出液を８５％硫安で塩析したのち、セファデ
ックスＧ−１５（ファルマシア社製）で脱塩シ、ＤＥＡ
Ｅセルロースカラムクロマトグラフィーでイオン強度変
化による段階溶出を行ない０．０６Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）で溶出する分画をプールした。このプール分
画を凍結乾燥した後、コントロールボアーガラス（ＯＰ
Ｇ ）ビーズ（３５０Ｘ。
ックスＧ−１５（ファルマシア社製）で脱塩シ、ＤＥＡ
Ｅセルロースカラムクロマトグラフィーでイオン強度変
化による段階溶出を行ない０．０６Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）で溶出する分画をプールした。このプール分
画を凍結乾燥した後、コントロールボアーガラス（ＯＰ
Ｇ ）ビーズ（３５０Ｘ。
フナコシ薬品製）を用いるクロマトグラフィーな行ない
、０．３Ｍグリシン塩酸緩衝液にて溶出した。
、０．３Ｍグリシン塩酸緩衝液にて溶出した。
次いで、本分画を０．ＯＩＭ）リス緩衝液（ｐｌＨ７，
６）でオレンジセファロースカラムに吸着させｏ、ｏｉ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，６）と１．０ Ｍ−ＮａＯｌ
で溶出した。
６）でオレンジセファロースカラムに吸着させｏ、ｏｉ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，６）と１．０ Ｍ−ＮａＯｌ
で溶出した。
かくして得られたインターロイキン−２活性画分を５０
ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析後、凍結乾燥
を行なって重炭酸アンモニウムを除去した。得られた両
分をインターロイキン−２活性検定用の２％ＦＢＳ含有
クリック培地１ ｍｌに溶解してインターロイキン−２
活性を検定した。一方、対照として組換え体微生物では
ないエシェリヒア・コリχ１７７６を全（同様に処理し
て得た両分のインターロイキン−２活性を検定した。結
果を表−３に示す。
ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に対し透析後、凍結乾燥
を行なって重炭酸アンモニウムを除去した。得られた両
分をインターロイキン−２活性検定用の２％ＦＢＳ含有
クリック培地１ ｍｌに溶解してインターロイキン−２
活性を検定した。一方、対照として組換え体微生物では
ないエシェリヒア・コリχ１７７６を全（同様に処理し
て得た両分のインターロイキン−２活性を検定した。結
果を表−３に示す。
表−３
対 照 Ｉ −８１２０（アッセイ培
地） 以上の結果より、本発明で得られた組換え体微生物エシ
ェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０ＡＡＪ１１
９９５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２５）が確かにインターロイ
キン−２を生産していることが確認された。
地） 以上の結果より、本発明で得られた組換え体微生物エシ
ェリヒア・コリχ１７７６／ＩＬ−２−５０ＡＡＪ１１
９９５（ＦＥＲＭ−ＢＰ２２５）が確かにインターロイ
キン−２を生産していることが確認された。
図−１はインターロイキン−２活性を持つポリペプチド
をコードし５る遺伝子の制限酵素地図である。
をコードし５る遺伝子の制限酵素地図である。
Claims (7)
- （１） インターロイキン−２活性を持つホ゛リペブ
チドをフードしている遺伝子が接続されているレプリコ
ンを有し、インターロイキン−２生産能を有するエシェ
リヒア属の微生物を培養することを特徴とするインター
ロイキン−２の＃！造法。 - （２） インターロイキン−２がヒトインターロイキ
ン−２である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （３） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドをコードしている遺伝子がインターロイキン−２に対
応し、ショ糖密度勾配遠心法による分画により１１〜１
２Ｓ画分□として得られ、ヒトリンパ球由来却）胞よ砂
分離されるメツセンジャーＲＮＡよシ調製されたＤＮＡ
である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （４） インターロイキン−２活性ヲ持つポリペプチ
ドをコードしている遺伝子が、その鎖中に制限酵素Ｂｓ
ｔ Ｎ工、 Ｘｂａ工およびＢａｔ Ｎ工で切断される
個所がこの順序で配置されている部分を含むものである
特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （５） インターロイキン−２活性を持つぎりペプチ
ドをコードしている遺伝子が、ＡＴＧ ＴＡｃＡＧＧ
ＡＴＧ ＯＡＡ ＣＴＣＱＴＧ ＴＣＴ Ｔ
Ｇ（ＩＡＴＴ ＧＯＡ ＯＴＡ ＡＧＴ ＯＴ
Ｔ ＧＯＡ ０ＴＴＧＴＯＡＯＡ ＡＡＯＡＧＴ
Ｇ（！Ａ ＯＣＴ ＡＯ，Ｔ’ＩＯＡ ＡＧ
Ｔ Ｔ（！Ｔ ＡＯＡ ＡＡＧ ＡＡＡ Ａ
ＯＡσＡＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＯＴＧ ＧＡＧ
（７ＡＴ ＴＴＡＯＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴ
ＴＴＡ ＯＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴＴＴＧ Ａ
ＡＴ ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ Ｔ
ＡＧＡＡＧ ＡＡＴ ０００ ＡＡＡ ＣＴＣ
ＡＣ！ＯＡＧＧＡＴＧ ＣＴＣＡＯＡ ＴＴＴ
ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＡＯＡＴＧ ０００ ＡＡ
Ｇ ＡＡＧ ＧＯＯＡＯＡ ＧＡＡＯＴＧ Ａ
ＡＡ ＯＡＴ ＯＴＴ ＱＡＧ ＴＧＴ ０Ｔ
ＡＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣｊＴＣｊ ＡＡ
Ｔ ＯＯＴ （７ＴσＧＡＧ ＧＡＡ Ｇ
ＴＧ ＯＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣ
ＴＯＡＡ ＡＧＯＡＡＡ ＡＡＯＴＴＴ
ＧＡＣＴＴＡＡＧＡ ０００ ＡＧＧ Ｇ
ＡＯＴＴＡ ｋＴ′ｏ、 ＡＧＯＡＡＴ Ａ
ＴＯＡＡＯ（）ＴＡ ＡＴＡ ＧＴ’ｌ’
０ＴＧＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ
Ｔｏｏ ＧＡＡ ＡＯＡＡＯＡ Ｔ
ＴＯＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ
ＧＯＴＧＡＴ ＧＡＧ ＡＯＡ Ｇ（１
！Ａ ＡＯＴＯＡＴＴ ＧＴＡＧＡＡ ＴＴ
Ｔ ＯＴＧ ＡＡＯＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＴＡ
ＯＯＴＴＴ ＴＧＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡＴ
ＯＡＴＯＴＯＡ ＡＯＡ ＣＴＡ ＡＯＴなる部
分構造をその鎖中に含むものである特許請求の範囲第１
項記載の製造法。 - （６） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドをコードしている遺伝子が、ＧＯＡ Ｃ０ＴＡＣＴ
ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＯＴ ＡＯＡ
ＡＡＧ ＡＡＡＡＯＡ ＯＡＧ ＯＴＡ
ＯＡＡ ＯＴＧ ＧＡＧ ０ＡＴＴ
ＴＡ ＯＴＧ ＯＴＧ ＧＡＴ ＴＴ
Ａ ＯＡＧ ＡＴＧＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡ
Ｔ ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴＴＡＯＡ
ＡＧ ＡＡＴ Ｃｏｏ ＡＡＡ ＣＴ
ＣＡＯＯＡＧＧ ＡＴＧ ＯＴＯＡＯＡ
ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＴ’ｌ”ＴＡＣ！ Ａ
ＴＧ ０００ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＣ
ＯＡＯＡＧＡＡ ＯＴＧ ＡＡＡ ＯＡＴ
ＯＴＴ ＣＡＧ ＴＧＴＯＴＡ （
）ＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＣＡＡＴ
０ＯＴＯＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ
ＯＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡＧＯＴ Ｏ
ＡＡ ＡＧＯＡＡＡ ＡＡＯＴＴＴ ０Ａ
ＯＴＴＡ ＡＧＡ ０００ ＡＧＧ
ＧＡＯＴＴＡ ＡＴＣ！ＡＧＯＡＡＴ ＡＴＯ
ＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ ＧＴＴＯＴＧ Ｇ
ＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ （）ＧＡ Ｔ
ｏｏ ＧＡＡＡＣＡ ＡＯＡ ＴＴＯＡＴ
Ｇ ＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴＧＯＴ
ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＯＴＡ ＧＣ！Ａ
ＡＯＯＡＴＴＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＴ
ＯＴＧ ＡＡＯＡＧＡ ＴＧＧＡＴＴ Ａ
ＯＣＴＴＴ ＴＧＴ Ｃ！ＡＡ ＡＧＯＡ
ＴＯＡＴｃ ＴＯＡ ＡＯＴＡ ＯＴＡ ｋＯ
Ｔなる部分構造をその鎖中に含むものである特許請求の
範囲第１項記載の製造法。 - （７） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドが、Ｍｅｔ Ｔ７ｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ ＧＩ
Ｎ Ｉ＋ｅｕ、１８ｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ 工ｌ
ｅ Ａｌａ Ｌｅｕ ５ｅｒＬｅｕ Ｖａｌ
’Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＡｓＮ
５ｅｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｓ＠ｒ Ｓｅｒ’ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮ’
Ｌｅｕ ＧＩＮ ＬｅｕＧｌｕ Ｈｌｓ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ
ＬｅｕＧＩＮ Ｍｅｔ 工ｌｅ Ｌｅｕ
ＡｓＮ ＧＩＬｙ ＰｈｅＡｓＮ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｅ ＬｅｕＴｈｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ ＬｙＢＰｈｅ
Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｅ
Ｌｙｅ ＡｌａＴｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｉ＋７８ Ｈｌｓ Ｉ＋ｅｕ Ｇ
ＩＮＯｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ’Ｇ
１ｕ Ｌｅｕ １ＬｙｓＰｒｏ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ ’Ｖ＆ｌ Ｉ＋’ｅ
ｕ ＡｓＮＬｅｕ Ａｌ’ａ ＧＩＮ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ ＡＥＩＩＪ ＰｈｅＨ
ｌｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒ
ｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ工ｌｅ Ｂｅｒ
ＡｓＮ 工ｌｅ Ａ’ｅＮ Ｖａｌ
工１ｅＶａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉ＋ｅｕ
Ｌｙｅ Ｇｌｙ ５ｅｒＧｌｕ Ｔ
ｈｒ ’［’ｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
Ｏｙｓ ＧｌｕＴｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈ、ｒ工
ｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅ
ｕ ＡｓＮ ＡｒｇＴｒｐ 工ｌｅ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ Ｓ
ａｒ工１ｅ 工ｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ・（８） インターロイキン−２活性を特つボ、
リペプチドが、Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ ５ｅｒＴｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ ＧＩＮ Ｌｅｕ ＧＩＮＬｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｈｌｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＧＩＮ Ｍ
ｅｔ 工ｌｅ Ｌｅｕ ＡｅＮ Ｇｌ
ｙＰｈｅ ＡｅＮ Ｔｈｒ Ｉ＋ｙｓ
ＡｓＮ Ｐｒｏ ＬｙｓＬｅｕ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
ＰｈｅＬｙｓ 、Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙ日Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
Ｈｌｓ ＬｅｕＧＩＮ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ＬｅｕＬ３
ｒ８ 、Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｉ＋ｅｕＡｅＮ Ｌｅｕ
Ａｌａ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ム
８ＮＰｈｅ Ｈｌｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｒｇ ＡｓｐＬｅｕ 工１
ｅ Ｓｅｒ ＡｓＮ 工１ｅ
ＡｓＮ Ｖａｌ工ｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ 、Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＧｌｙＳ
ｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｍｅｔ ｅｙｅＧｌｕ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
ＡｌａＴｈｒ 工ｌｅ ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＡｓＮＡｒｇ
Ｔｒｐ 工ｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
（！ｙｓ ＧＩＮＳｅｒ 工１ｅ
工ｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒである特許請求の範囲第３項記載の製造法
。
Priority Applications (20)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57234607A JPS59140898A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | インタ−ロイキン−２の製造法 |
| US06/463,496 US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| DE8383101035T DE3377363D1 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA000424401A CA1341562C (en) | 1982-03-31 | 1983-03-24 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| AU21472/83A AU556353B2 (en) | 1982-12-15 | 1983-11-17 | Interleukin-2 polypeptide |
| DD25780883A DD218632A5 (de) | 1982-12-15 | 1983-12-12 | Verfahren zur herstellung von interleukin-2 |
| DK577283A DK173788B1 (da) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | DNA-fragment, som koder for et polypeptid med interleukin-2-aktivitet, rekombinant DNA omfattende dette DNA-fragment, cellelinie transformeret med det rekombinante DNA og fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af denne cellelinie |
| AT435083A AT392082B (de) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Das polypeptid interleukin-2 kodierendes gen, rekombinante, dieses gen enthaltende dna, diese rekombinante dna aufweisende zellinien und verfahren zur herstellung von interleukin-2 unter verwendung der genannten zellen |
| HU426383A HU197938B (en) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Process for producing gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the gene, living cell line having the recombinant dna and process for producing interleukin-2 with such cells |
| BE0/212058A BE898473A (fr) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombinant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-2 |
| CA 443333 CA1341633C (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| EP83112661A EP0118617B1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| DE8383112661T DE3382383D1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2-polypeptide. |
| US07/814,049 US5620868A (en) | 1982-03-31 | 1991-12-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US08/096,842 US5399669A (en) | 1982-03-31 | 1993-07-26 | Interleukin-2 polypeptides |
| US08/331,146 US5700913A (en) | 1982-12-15 | 1994-10-28 | Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides |
| US08/516,563 US5795769A (en) | 1982-03-31 | 1995-08-18 | Gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the gene, a living cell line possessing the recombinant DNA and method for producing interleukin-2 using the cell |
| US08/621,097 US5795777A (en) | 1982-03-31 | 1996-03-22 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US09/769,396 US20010041362A1 (en) | 1982-03-31 | 2001-01-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57234607A JPS59140898A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | インタ−ロイキン−２の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140898A true JPS59140898A (ja) | 1984-08-13 |
Family
ID=16973682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57234607A Pending JPS59140898A (ja) | 1982-03-31 | 1982-12-27 | インタ−ロイキン−２の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59140898A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61205497A (ja) * | 1985-03-11 | 1986-09-11 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
-
1982
- 1982-12-27 JP JP57234607A patent/JPS59140898A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61205497A (ja) * | 1985-03-11 | 1986-09-11 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
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