JPS58170798A - メツセンジヤ−ｒｎａおよびその調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はメッセンジャーＲＮＡ（リボ横酸）（以下、ｍ
ｌＮムと略称する。）ＫｉｉｌＬ、詳しくはヒトインタ
ーロイキン２に対応し、ヒトリンパ球由来ａｍより得ら
れ、シヨ着１！度勾配遠心法（以下、８ＤＧ達心法と略
称する。）による分−により１１〜１２８＃分として得
られるｍＲＮムおよびその−製法［８１″′！る。

リンパ球が産生する生物活性、薬理活性のある可溶性の
蛋白性因子であるリンホカインは生体内・Ｋお（・−〇
微量で生体の免疫応答機構をａｌｌｉｌｌする作用を有
している。リンホカインは、その免疫活性物質としての
性格より汎く抗腫瘍剤、抗つィルス剤、抗−剤、免疫不
全症治療剤、自己免疫疾患治療剤としての有用性が期待
されている（ムｄｖ、　ｉｎＩｍｍｕｎｏｐｈａｒａｉ
、、　５０７ｅ　１９８Ｇ　）　４１就中、インターロ
イキン２はその特異な免疫応答作用から医事への応用が
注目されている。

ヒトインターロイキン２を産生するヒトＴ白愈病細胞株
が１株見出されたことが報告されている（ギリスら、Ｊ
、ｌｉｐ、　Ｍａｄ、、　１５２巻、　１７０９頁。

１９８０年）。しかし、このヒトＴ白自病Ｊｉｌｉ胞株
によるヒトインターロイキン２の生産量は極めて微量で
あり、しかもその生産手段は大量細胞墳養技術を含み非
１１にＩ［雑である。

ヒトインターロイキン２を製造するための他の方法とし
【は、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮＡ（デオ
キシリボ被験）を微生物のベクターに組込んで微生物細
胞内で複製、転写、■駅せしめ【微生物により生産させ
ることが考えられる。

しかしながら、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮ
Ａはクローン化されていないので、この方法を実施する
ことはできない。

本発明者らは、ヒトインターロイキン２の生物学的作用
、生産方法などＫついて研究を重ねてきたが、その過１
１においてヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイ
キン２に対応するｍＲＮムを抽出することに成功し、こ
のｍ１ＬＮムからこれに対応するＤＮＡを調製すること
に成功した。このようにして得たＤＮＡを微生物細胞内
で発現することにより目的とするヒトインターロイキン
２をＩ造できる。

本発明は、ヒトインターロイキン２に対応し、ヒトリン
パ球由来細胞より得られ、８ＤＧ達心法による分−によ
り１１−１２８１１分として得られるｒｎＲＮムおよび
その製造法を提供するものである。

本発明のｍＲＮムは、上記したようへ、ヒトインターロ
イキン２に対応し、ｓＤＧ、−遣応竺やゲルト過法勢に
よる分画ならびにアガロースゲル電気泳動法により１１
〜１２８画分として得られ、るものであり、このｍＲＮ
ムはヒトリンパ球由来細胞より抽出。

分離することによって製造できる。

本発明に用いるヒトインターロイキン２ｔｉ生能を有す
るヒトリンパ球由来細胞としてヒト末梢血。

扁桃腺、牌臓等より得られるリンパ球そのものも含まれ
る。また、これらのリンパ球なナイロンカラム処理、抗
血清−補体処理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニ
ダーぞ、ガラクトース酸化酵素等）処理などの前処理を
したもの並びＫＸ線等による変異処理およびトリプシン
等の酵素処１ｌＩＩｌ！によりインターロイキン２の産
生能が付与されたものも本発明のヒトリンパ球由来細胞
に含まれる。

さらに、これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえばテリ
ンパ球を７９７７球成長因子等の存在１にクローン化し
たようＫ、クローン化したものも好ましいヒトリンパ球
由来細胞である。

また、ヒト白血病細胞およびＴリンパ腫細胞のようなヒ
トリンパ球悪性化＃ｌ飽やこれらヒトリンパ球悪性化細
胞を上記のような前処理もしくは変異処理したものまた
は悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒト
リンパ球由来細胞として用いることができる。特にクロ
ーン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮムが通常多
い。

さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞と０１Ｍ。

Ｍｏ１ｔ４ν等のとト腫ＩＩ細胞とを細胞融合セしめて
得られる、いわゆるハイプリドーマも好適なヒトリンパ
球由来細胞として使用できる。

これらヒトリンパ球由来細胞には（１）自発的にインタ
ーロイキン２を産生するもの、（２）弛め細胞の存在下
または非存在下にマイトーグンと接触せしめて刺激する
ことＫよりインターロイキン２を産生ずるものがある。

ヒトリンパ球由来細胞にｍＲＮムを生成せしめるにあた
り、インターロイキン２自発意生株を用いる場合には、
これら細胞を通常の方法で培養すればよい。マイトーゲ
ン刺激によりインターロイキン２を産生ずる細胞を用い
る場合には、細胞を十′分に洗浄後、ローズウェル・パ
ーク・メ毫リアル・インスチチュート１６４０　（以下
、ＲＰＭ１１６４０と略記する。）ｔＩＩ地、ダルベツ
コのイーグルス変形１．１ｕｌｂｅｃｃ＋’ｓ　ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ　ｌａｇｌ＊ｓ　）培地、クリック培地など
の通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有しＣも含有
しなくてもよい）や合成無血清培地Ｋ　Ｏ，５〜４Ｘ１
０’個／ｄの細胞密度で層濁し、ここにマイトーゲン；
ノイラミ二ダーぞ、ガラクトース酸化酵素；塩化亜鉛尋
の亜鉛化合物；プロテインム、ストレプトリジンー〇等
の画体由来リンパ球活性化成分を添加した徒、細胞を洗
浄、＠激剤を除去する。

マイトゲン刺激のＩＩＫマクロファージやプントリティ
ック細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しう
る細胞や１リンパ球や７％　ＩＪンパ球由来細胞株Ｒａ
ｊｉ、　Ｄａｕｄｉ、　Ｋ５６２．　ＢＡＬＬ−１細胞
な共存させると同様にインターロイキン２の産生能がみ
られるよ５な細胞があり、これらの細胞を用いてｍＲＮ
ムを生成せしめる場合には、これらの細胞の存在下にマ
イトーゲン刺激を行なう。このようＫすると、ｍＲＮム
の収量は上昇することがある。

ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養−代
は通常の細胞培養用培地を用（・て行なうことが可能で
あり、哺乳動物由来の血清。

血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でも崖清アルブ建／すら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることができることが判っ
た。

リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、ｍＲＮムが生成される時間であり、この時間は細胞の
接養上清にインターロイキン２が産生され始めた頃に相
当する。具“体的には通常ン刺激剤添加後３〜１２時間
である。徒らに培養時間を嬌ばすと、生成したｍＲＮム
が分解されてしまう。

また、リンパ球活性化に際し、ＰＭＡやテＰムなどのホ
ルボ・−ルエステル類をｌθ〜５０ｎｇ／−添加するこ
ともある。培養温度は３２〜３７℃の範囲が望まし、い
。

以下にインターロイキン２を産生する能力を有するヒｌ
−ＩＪンパ球由来細胞の取得方法の例をさらに具体的に
説明する。

（イ）インターロイキン２自発意生株の取得ヒト１１’
リンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞（７レ
ツド・ハツチンソン・癌研究所／シアトル／アメリカ、
ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイツ国立癌
竜ンター／ハイデルベルヒ、／西ドイツ等で自由に手に
入る。）を１×１０’個／−の細胞密度でクリック培地
中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で合計
８，０００レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本
細胞を０１細胞／２００μｌの細胞密度で９６穴の平底
マイクロタイタープレート（［ファルコン３０７２Ｊ）
に添加【、５％牛脂児自清を含むクリック培地中で３週
間３７°Ｃにて５％００．インキュベーター中にて培養
する（限界希釈法によるクローニング）。

細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プｖ−）Ｋ移し、２−のクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得られた場合には
、本細胞を２Ｘ１０’個／ｗＬｌの細胞密度にて血清も
血清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２ｄに”
懸濁して２日間培養し、本培養上清を３．００　Ｑ　ｒ
ｐｍｅ　Ｓ分間の遠心分離操作で分離し１次いで０．２
２μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を
行なう。

こうして得られるクローン化細胞よりインターロイキン
２産生株が得られる。

（ロ）ヒト末梢血！リンパ球よりインターロイキン２童
生株の取得 ヒトの末梢處を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ　Ｘ　１０’個／ａの細胞密度でクリック培
地Ｅｌｌ濁し、各２ｄ宛２４穴のヌンクの培養プレート
に！Ｉ種する。ここにフイトヘマグルチニンーＭ（キブ
コ社製）を５μｇ／ＷＬｔｌＦ）終末淡度になるよ５に
１００μＥ添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次
いで細胞を培養液で洗浄し、再びｔ　ｘ　ｔ　ｏ’個／
−の細胞密度で元のヌンクの培養７゛レー）Ｋ　ｌ＠を
宛まく。各ウェルにラットの牌１１ｍｍ胞をコンカナバ
リンＡ２．５μ９７ｍ１で４８時間刺激して得たコンデ
ィショニングした培養液１ｄを３日間毎に添加して同様
の培養を繰り返し、ヒト末梢血より得た１９７７球を長
期縫代培養する。このように艇期纏代培養して得たＴ　
＋７ンパ球を、前述と同様の限界希釈法でクローニング
および細胞増殖を行なう。こうして得られたクローン化
Ｔす７７球をＩ　Ｘ　１０”個／ｘｉ　ｆ）Ｍ胞密度Ｋ
ｉＬＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、ここに２．５μＱ／
ｄの終末濃度になるようにフィトヘマグルチニン（ＰＨ
ム）を添加し、２４時間、３７℃で７．５　％　００．
インキュベーター中に′Ｃ培養し、本培養尖、清を３．
０．０Ｏｒｐｍ。

５分間の遠心物離操作で分離し、次いで０．２２μのミ
リポアフィルタ−で無−化を行なう。こうして得られる
クローン化細胞よりインターロイキン（）マイトータン
刺激でインターロイキン２を生産するヒトリンパ球山来
悪性化細胞の取得 前述のジュルカット細胞や前記した限界希釈法によりク
ローン化されたＪ−１１１株は、前記の無麿清培地や自
消１〜２％を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中にてコンカ
ナバリンＡ（以−１・、Ｃｏｎムと略称する。）１０縛
／ｄやＰＨム２．５メジ９／ｄの存在下に２４時間培養
すると、１０〜４，０００単位／ｄのインターロイキン
２を産生ずることが判明した。また、［Ｅ亜鉛、プロテ
インム、ビシバニール存在下に培養しても、インターロ
イキン２を産生ずる。

に）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在下
にマイトータンで刺激することによりインターロイキン
２を産生する細胞の取得 ヒトリンパ球悪性化細ｌＩＭａｌｔ　４Ｆや前述の限界
希釈法でクローン化されたジュルカット１ＩｌｌＩｌ＆
の１つのクローンジェルカット９９株は、上述のごとき
レクチンやマイトタンを広い濃度範囲で加えて２４〜７
２時間培養してもインターロイキン２を産生じない。と
ころが、この間モノカインのｔｌｌであるインターロイ
キンｌを５〜１０＃／−またはに５６２やラージ（Ｒａ
ｊｉ）細胞をｌ　Ｘ　ｌ　Ｏ’細胞膚’Ａ　＃）　０．
５　ｘ　１０’　＠／、４＠ｍ共存さセ【クリック培地
中にて３７℃、２４時間培養すると、インターロイキン
２を１０〜１００μ／ｍｌ意生する。

このようにして得られた細胞よりインターロイキン２に
対応するｍＲＮムを抽出するＫ　＆！　、細胞の種類を
問わず常法によって行なえｉばよい。たとえば、ＮＰ−
４０，８ＤＢ、　ＴｒｌｔｏｎＸ１００デオキシコール
酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍
結融解などの１理的方法を用いて、細胞を部分的あるい
は完全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲ
ＮａｓｅによるＲＮムの分解を防ぐために、抽出液中に
ＲＮａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニ
ル硫酸、ベントナイト。

マカロイド、ジエチルピロカーボネイト、バナジクム秦
合体などを添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２ＫＴｉ応する抗体を用いて
インターロイキン２合成途上のポリゾームを沈降せしめ
、これＫよりｍＩＬＮムを界面活性剤などで抽出する方
法も行なうことができる。

また、本発明のｍＩＬＮムの精製についてはオリゴｄ！
−セルロース、ポリＵ−セノアロース、セファロース２
Ｂなどの吸着カラムあるいはバッチ法による精製法、　
８ＤＧ達心法によるβ−等によって行なうことができる
。このような精製操作により本発明のｍＲＮムは１１−
１２８１１分として得られる。

上記の如くして得られた１ｖムが目的とするインターロ
イキン２に対応するものであることを確認するためには
、　ｍＲＮムを蛋白Ｋｌｌ訳させ七〇生ｍ活性を調べる
か、抗体等を用いてその蛋白を同定する勢の方法を行な
えばよい。たとえばｍＲＮムを蛋白に翻訳するのによく
用いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕ
ａ　１ａｅＶｉＢ　）の卵母細胞ＫｍＲＮムを注入して
翻訳させる、あるいはＲｅ　ｔ　ｉ　−ｃｕｌｏｃｙｔ
ｅ−１ｙｚａｔｅ　、網状赤自球ライゼート、Ｗｈｅａ
ｔｇｅｒｍ　などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが
行なわれている。

ここｆｃ用いたインターロイキン２の活性検定法は次の
通りである。即ち、検体１００μｌを９６大マイクロタ
イタープレートの１！７ＩＩＡ目に添加し、２≦の牛胎
児―清を含有するＲＰＭＩ　１６４０棲地に２倍希釈を
繰り返して、９６六マイクログレート−ＥＫおい−Ｃ各
１００μｌの希釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎ
ａｔｕｒｅ　＊　　２６８巻、１５４真（１９７７））
によつ−Ｃ教示された方法に従って作成した活性化Ｔリ
ンパ雌株を、４　Ｘ　１０ａ個／１００μｌの細胞密度
として１００μｌ宛各くぼみに添加する。３７℃、５％
戻酸ガスインキュベーター中２０時間静置墳養後、トリ
チウム化デミジン０．５μＯ１を加え、４時間パルスを
行なった後、この公費で良く知られた方法に従って、ｍ
ｍを採取し、細胞内にとり込まれた放射線量を１定する
。インターロイキン２活性の耗い培養上清はと活性化Ｔ
　１７７７球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が
多いことから、検体中に含有されるインターロイキン２
量を容易に知ることができる。

かくして得られたインターロイキン２　ｍＲＮムの最も
大きな利用法は、これらのｍＲＮムよりインビトロで相
補的なりＮム（ＣＤＮム）を合成し、微生物のベクター
などに組込んで微生物等でインターロイキン２を生産す
ることを可能ならしめることにある。

このよりなｃＤＮムの合成は、過電試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。

鳳ＲＮムを鋳型とし、オリゴｄ１゛をプライｉ−として
ｄムＴｌ’、ｄＧ〒Ｐ、ｄｏ〒Ｐ、ｄＴ！ｌ・Ｐの存在
下で逆転写酵素によりｍＲＮムと相補的な単鎖ｃＤＮム
を合成し、アルカリ処理で鋳ｔ／ｍＲＮムを分解、除去
した後、今度は単鎖ｃＤＮムを鋳型にして、逆転写酵素
あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ｃＤＮＡを
合成する。次いで得られたＤＮム両端を必要によりエキ
ソヌクレエースで処理し、それぞれに適当なりＮムを接
続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複数
個重合せしめる。しかる後、これを微生物ベクターに組
込む。組込む方法は、ベクターを適当なｍ＠酵素で切断
し、必要により適漁なりンカーまたはアニーりング可能
な組合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工
した二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼ
な用いて接続せしめる。

得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物としてはエシェリヒア・コリ等のエシェ
リヒア属の微生物、バチルス・ズブチリス勢のバチルス
属の微生物、サツカロミセス・セレビシェ等のサツカロ
ミセス属の微生物ナトが好適である。これら微生物に使
用されるベクターを以−トに例示する。（蛋白質核酸酵
素２６巻４号（ｔ９ｓｌ）参照）　ＩＫ系プラスミドベ
クター（ストリンジェントｍ）のｐ８０１０１．　ｐＲ
Ｋ３５３．　ｐｆＬＫ６４６、　ｐＲＫ２４８．　ｐＤ
？４１等、ＩＮ系プラスミドベクター（リラックスド握
）の０ａｌ１１．　ｐＶＨ５１゜ｐム０１０５．　ＩＬ
８Ｆ２１２４．　ｐＯＲｌ、　ｐＭＢ９．　Ｂ凡３１３
゜ｐＢＲ３２２，ｐｉｌＲ３２４，ｐＢＲ３２５，ｐＢ
ＩＬ３２７．　ｐＢ鼠３２８、　ｐＫＹ２２８９．　ｐ
ＫＹ２７００．　ｐＫＮ８０．　ｐＫＯ？。

ｐＫＢ１５８．　ｐＭＫ２００４．　ｐム０ＹＯ１，ｐ
ム０ＹＯ１８４゜λ（］１１間、λｇＬ系ファージベク
ターのλｇＬ・λ。。

λｇｔ　・　λＢ　、　λｗｎｓ−λＣ１λｗｎｇ　・
　λ７．　λＺＪｖ１ｒ・λＢ！。

λムＬＯ・λＢ、λｗｍｇ−〒ｓ　６２２．λＤａｍ等
、シャーンベクターのシャロン４ム、シャロン３ム、シ
ャロン１６ム、シャロン１３ム、シャロン１４ム、シヤ
ロン１５ム、シヤロン８．シャロン１０．シャロン１７
゜シャロン２０勢、チオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｇ　）
グループベクターのＬ　５１２　、　　λＺＢＱ８　、
λＺＹＶ５Φ、λＺＵＶΦ２．λＺＵＶφ３．λＹＩＱ
１１Φ１．ハ’１ｌＱＪｉΦ、λＹＩＱ８Φ３．λＢａ
ｍ＊λＢａｔ等、枯草−のプラスミドベクターｐテム１
０１５．　　ｐＬＢ１５．　　ｐＴム１０２０　、ｐＬ
８２８　。

ｐＬ８１３．　ｐＴム１０５Ｇ、　ｐＴＡＩ０６０．　
ｐ７ム１０３０　。

ｐ〒ム１０３１等、スタフィロコッカス由来のプラスミ
ドベクターｐＴ１２７　、　ｐ０１９４　、　ｐ０２２
１．　ｐ０２２３゜ｐＵｌｌ　１１２．　ｐＵＢｌｌｏ
、　ｐＢム０５０１．　ｐｌｉム２１００．ｐＨ９４，
ｐＴＰ４．　ｐ’ｌ”Ｐ５等、酵母ベクターｐＪＤＩ１
２１９゜ＹＩｐｌ３．　ＹＲｐ７．　ＹＩｐｌ、　ｐＹ
Ｏ，ｐＴ（３２゜微生物のベクター、たとえばｐＩｉｌ
Ｌ３２２　　などのＰｇｔＩあるいは１ｃｏｉＬＩ　５
ｉｔｅなど目的に応じた個所に組み込み、適当な宿主に
トランスホームして該インターロイキン２を宿主中で発
現させることができる。

得られたｍＲＮＡがインターロイキン２に対応する遺伝
情報を有していることを以下の方法によってｉｉｉ　ｇ
−する。

アフリカッメガエルの体内より卵母細胞をとり出し、卵
母１個当り約５０μ９の１１〜１２８　ｍ１ＬＮムをマ
イクロインジェクション法により注入し、その２０個を
２００　＃Ｊのバース培地（Ｂａｒｔｈ’ｓｍｔｉ＋ｉ
ｘｕｍ　３　（Ｇｕｒｄｏｎ、　Ｊ、ＢｌＩＴｈｅ　ｃ
ｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｇｅｎｓＥｘｐｒｅｓｓ〕ｏｎ　
ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｏｘｔ
、ＩＪｎｌｖ。

Ｐｒｅｓｓ、　１９７４　）中で２２℃、１６時間培養
したのちガラス俸で卵母細胞を破砕する。次にこれを１
０．００　ＯｒｐｍでｌＯ分関連心し、上清を検体とし
て前述のインターロイキン２の活性検定に供する。

上述のような種々のヒトリンパ球由来細胞でインターロ
イキン２産生能を有する細胞より本発明の１１−ｘ２ｓ
ｇ分であるｍＲＮＡを調製する方法を以トの実施例によ
り好しくｉｌｌ！ｔｉする。なお、本実施鉤に下す以外
の細胞より得られるインターロイキン２に対応するｍＲ
ＮＡの場合にも本発明は全く同様に実施できるものであ
、す、特許請求の範囲発明の範１１に含まれるものであ
る。

実施例１ ４１）１Ｇ容量／容量憾の牛胎児血清を含有するｉＬＰ
ＭＩ　１６４０培地で、当分野で良く知られた方法で培
養したヒトデ白麿病細胞ジュルカット細胞（日本、アメ
リカ、西ドイツ等で自由に入手できる）を上記の培地Ｋ
ｌｌ濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＩＸｇ
　　１５０／３００−４　！ＩＩを用いて１．０００レ
ントゲンの総照射線量を照射した。次いで、この照射さ
れた細胞をｌ×１０″個／−の細胞密度で上述の培地中
で５≦炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９６
六マイクロプレー）１０枚に０．２個／ｗｅｌｌ　（＜
ばみ）Ｋなるように本１ｃＪ！４細胞を接種し、５％縦
駿ガス中３７℃にて２１日間培養した。

細胞増殖の観ｌｌｌ倭れたクローンを順次継代増殖させ
１次いでＩ　Ｘ　ｌ　Ｏ’個／ｄの細胞密度でＯｏｎム
５０μｇ／−存在下に２４時間培養し、培養上清に放出
されるインターロイキ／２の産生量を前出の方法で一定
し、原ジュルカット細胞に比し産生量が４０倍以上に改
善された変・異化クローン細胞ジュルカット１１１株を
得た。゛本株は通常の接養方法で増殖し、その増殖速度
はジュルカット細胞と同程度であった。

（２）　　本ジュルカット１１　ＩＩＩ胞株をＩ　Ｘ　
１０’＠／、１の細胞密度で無血清合成培地ＲＩ〒０５
５−９１，０００ＷＬｔ）（懸濁し、ファルコ社製回転
培養瓶に入れ、３７°Ｃで４日間培養し、遠沈操作によ
り細胞を集めた。

この細胞を４　Ｘ　１０’個／ｊＩｊの細胞密度にて上
述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎム１０μ９／ｄを添
加し、上記ファルコン社製回転培養瓶に１，０００Ｊ１
７で彊り込み６時間回転培養した。

（３）　　このようにして得たＣｏｎム１０μ９／ｄで
６時間誘導したジュルカット細胞（３Ｘ１０”細胞）を
ｐｎｓｉａ２００ｄＫ層濁し、細胞を遠心によって２度
洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲ＋ｂｏｎｕ
Ｃ１，＝ｏｓｉｄｅｓ−ｖａｎａｄｙｌ　Ｏｏｍｐｌｅ
ｘ　（１０ｍＭ　）を含んだ）ＬＳＢ溶液（１０ｍＭテ
ｒｘｓ−Ｈ（Ｍ　、　ｐＨ７，５。

１０　＋１１Ｍ　Ｎａ（’／　、　１．５　ｍＭ　Ｍｇ
Ｏ１ｍ　）　２００１１１　Ｋ懸濁し、。

た。＆に、　ＮＰ−４０ヲ０．０５　％　Ｋナルよ５に
加えたのち、ゆるやかに攪拌後３．００　Ｏｒｐｍで５
分遠心して核酸を除去し、その上清液に８Ｄ６（０，５
％）と１１Ｉ１１テム（５ｍＭ　）を加えた後、ただち
にフェノールを勢量加え、Ｓ胞質ＫＮムを抽出した。合
計３回フェノール抽出を繰返してから２容エタノールで
ＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０　ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＯｊ　、　　ｐＨ７，５で溶解した。このよう
にしてジュルカツ）ｍ胞から得られたＲＮＡ量は３３〜
であった。

次Ｋ、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄ〒）−セルロース（Ｐ、Ｌ、１３１０ＣｈｅＩｎｉ
Ｃａ１５ｓＴｙｐｅ　７　）を用い、カラムクロマトグ
ラフィーな行なった。吸着は２０　ｍＭ　Ｔｒｌｍ−Ｈ
ＣＩ　、　　ｐＨ７，５、０，５Ｍ　Ｎａ０ｊ　、　　
１　ｍＭ　ＮＤ？ム溶液にＲＮＡを溶解して行ない、溶
出は上記緩衝液で洗浄後、水とｌＯｍＭＴｒｈａ−ＨＯ
Ｉ　（ｐＨ７，５）で交互４１ＣＩＩ］ＲＮムを溶出す
ることにより行なった。この結果、溶出されたｍＲＮＡ
量は８６０μすであった。

さらに、このｍＲＮＡの一部（６９０ｆｉ９）を８ＤＧ
遠心（５０ｍＭ　Ｔｒｘｓ−ＨＯＩ、　　ｐＨ７，５，
１ｕ＋Ｍ　ＩＤＴム。

０．２　ｈ４　Ｎ、ｉ０７を含む５〜２５％シヨ着密度
勾配。

）１ｉｔｃａｃｌ＋ｌ　ＰＲＢ　４Ｑ　ｏ−ターで３５
．００Ｏｒｐｍ　、　　１６時間、４’Ｃ）して分−し
、１１−１２８０ｍＲＮＡ（４７μす）を得た。

（４）　　ここに得られた分画番号１１．１２．１３の
ｍＲＮＡ　ｋ前出の検定法に従い、アフリカッメガエル
の卵母細胞に１個当り５０ｎｇをマイクロインジェクシ
ョン法により注入して得られた卵母細胞抽出物なインタ
ーロイキン２の活性検定に供したところ、次表に示すト
リチウム化チミジンの取り込みが６られ、これら分画の
ｍＲＮＡは本発明のヒトインターロイキン２　ｍＲＮＡ
を含有することが証明された。

本各希釈度のトリチウふ化チミジンの取り込み量（ｃｐ
ｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン２
（ｌＯ単単位−）と比較して求めた。

（５）次Ｋ、ここで得られたインターロイキンｍＲＮＡ
を含む１１〜１２８　ｍＲＮＡよりＣＤＮムをインビト
ロで合成し、プロスミドベクターＰＢＲ３２２と組換え
体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア・コリにトランス
ホームしてインターロイキン２ｃＤＮムクローンを持つ
一株を以下の方法で選択した。

（５−１）　　ｓ　ｏ　ｍＭ〒ｒ１ｍ−ＨＤＩ緩衝液（
］）Ｈ７，５）、３０ｍＭ　Ｎａ０ｊ　、　　６　ｍＭ
　Ｋｇ（３１，、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）
、０．５ｍＭの各ｄＡ’ｌ’Ｐ、　ｄＧ’！’Ｐ、　ｄ
Ｏ’ｌ’Ｐ。

ａＴＴＰ　（ａＯＴＰは■ｐラベルしたものを含む）。

０．７５μリオリゴ（ｄ？）　　、　７．２　μ９　ｍ
ＲＮＡおよび０ １５−Ｌ＝ットムＭＹ逆転写酵素（Ｊ、Ｗ、１ｅａｒｄ
　）を混ぜ、４１℃に９０分間保った。これにより約１
．８μｇの１重鎖ｃＤＮムが合成された。反応液からｍ
ＲＮＡを除くために、反応液にＮａ　ＯＨ溶液を加えて
０．３３　Ｎ　ＮａＯＨとし、室温にて１５時間置き、
次いで溶液を中和し、「セファデックスＧ−５０゜カラ
ムに通した。これにより１．３μｑのｃＤＮＡを回収り
、た、。

（５−２）　　５　（ｌ　ｍＭリン酸緩＊＊　（ｐＵ　
７．５　）　、　　１０ｍＭＭｇｃｌ、　、　　１０　
ｍＭＤＴ’ｌ’、　０．７５　ｍＭの各ｄムチＰ。

ｄＧＴＰ　、　ｄＯ’ｌ”Ｐ　、　ｄＴＴＰ　（ｄＯＴ
Ｐは、すＨでラベルされたものを含む）、１．３μ９１
本鎖ｃＤＮム、８ユニットボリメレース（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ　）　Ｉ　（米国ＢＲＬ社）を混ぜ、１５℃で
１５時間反応を行なった。

この反応により０．８２μりの二重鎖ｃ　ＤＮＡを得た
。

次いで、５０　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）　。

０、２　Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　Ｚｎ０ｊ、　、　　０
．８２μｑ二重鎖ｃＤＮムを混せ−（３７℃で２０分間
インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアー
ゼ８１（三共（帽）を加え、さらｋ１５分間インキュベ
ートした。しかる後、０．４３　ｆｉ９の二［＠１ｃＤ
Ｎムを回収した。

（５−３）　　Ｏ，１４Ｍカコジル酸カリウム、３０ｍ
Ｍ）リス塩基、　Ｕ、　ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ　、　　１　
ｍＭＣｏａｌ＠　、　０．６４　ｍＭ”Ｐ−ＬＪＣ’ｌ
’Ｐ　（Ｂｐｃ、ａｃｔ、　２．７　Ｘ　１０　ｃｐｍ
／’ｎ　ｍｏｌ　）。

０．４３μノニ重鎖ｃＤＮムおよび５ユニツトのターば
ナルトンメスフェラーゼ（米国ＢＫＬ社）を混ぜ３７℃
で７分間インキュベートしたところ約５０個のｄＯＭＦ
が両３′末端に付加された。

ＰＢＲ３２２ＤＮム１０μりを制限酵素ＰａｔＩで切柳
したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＯＭＦ鎖を付加し
たのと全く同じ条件でｄｏ’ｌ”Ｐの代りＫｄＧ’ｆ’
Ｐを用いて両３′末端にｄＧＭＰ鎖を付加した。かくし
て約５０個のｄＧＭＰが両３′末端に付加された。

（５−４）　　５０ｖｎＭＴｒ１ａ−ＨＯＩ　（ｐＨ７
，５）　、　　０．１ＭＮａ０４５　ｖａＭ　ＩＤＴム
、００５μりのｄＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２２，０
，０１μ２のｄＯＭＦが付加されたｃＤＮＡをまず６５
℃で２分間、次いで４６℃で１２０分間、さらに３７℃
で６０分間、そして室温で６０分間保持した。

エシェリヒア　−コリｚ１７７６を５０１１７のＬ′＃
Ｉ地（１００μ９／ｄのジアミノピメリン酸と５０μ９
／ｒａｔのチミジン、１％）リプトン、Ｏ，ＳＳ酵母エ
キス。

０、５　％　ＮａＣｊｌおよび０．１囁グルコースを含
む）に接種し、培養液の６５０１１１．＃ｌＫおける吸
光度がおよそ０．３になるまで３７℃で振どう培養した
。培養終了後、一体を遠心分−により集め、５　ｍＭ　
Ｔｒｉａ−Ｈｃｔ　　（＋市７．６　）　、　　０．　
ｌ　Ｍ　Ｎａ０ｊ　、　　５　ｍｊｄ　Ｍｇ、ＣＩ、　
。

１０　ｍＭ　Ｒｂ０ｊの溶９２５ｍ（で２回洗浄した。

得らｉｔだ菌体を５　ｕ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ハｃｌ（ｐＨ
７，６）。

０．２５　Ｍ　ＫＯＩ　、　　５　ｒｎＭＭｙ５ｃｊｌ
＠　、　　０、Ｉ　Ｍ　Ｃａ１ｌ、およびｌ　Ｏｏ・Ｍ
　ＲｂＣｌを含む溶液２０ＩＩｊＫｌｌ瀾し、０℃にて
２５分開−置後、遠心分離により菌体を集めた。１ｄ（
：と同じ溶液１１ｄｌｌＣ９体を再び懸濁し、得られた
菌体轡濁液の０．２１に上記組換大ＤＮＡを入れ、０℃
で４０分間静置した。さらに、３７”Ｃで２分関味−っ
たのち、再びＯ″Ｃで６０分間静置し７だ。

次に、これに前記り培地０．７紅を加えて３７”Ｃで３
０分間振と５培養した。この培養ｇ　ｏ、　ｔ　ｌ１７
を１００μｇ〜ジアミノピメリン酸、５０μｇ／Ｍチミ
ジンと１５μ９／１テトラサイクリンな含むＬ培地の１
５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて２ｌ間゛イ
ンキュベートした。

（５−５）　　７１記において山塊したコロニー３，０
００個を、ＩＩＪＯμＱ／ｌｕｔのジアミノピメリン酸
、５０μり／ＩノＬｅのチミジンと１５μ９７’ａｌの
テトラサイクリンを含むＬ培地の１．５％寒天培地上に
ミリポアフィルタ−ＨＡＷＧを置いたものの上に一面に
塗抹した（同一のものを２枚作る。）。これを３７℃で
２晩インキユベートした後、コロニーが出現したものに
ついてフィルターを剥がし、このフィルターを０．５　
Ｎ　ＮａＯＨＫ１０分間浸した。

次′に％０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ□ｊ緩衝液（ｐＨ７
，５）に５分間浸し、さらに１．５　Ｍ　Ｍａｉｌ　／
　０．５　Ｍ　Ｔｒｌａ　−ＨＯｊ緩衝ｉ１　（ｐＨ７
，５）に５分間浸した。次いで、５Ｓａ（０，１５ＭＮ
ａＯｊｌｏ、０１５　Ｍクエン酸ナトリウム。

ｐＨ７，５）の２倍希釈液に５分間浸漬した。

しかる後、ティッシュペーパー上にフィルターを移し、
風乾後８０℃で３時間加熱した。これＫよりフィルター
上に岨換えＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡが固定される
。

フィルター上のＤ）ＩＩｃインターロイキン２に対応す
るｃＤＮムプロープをノ・イブリダイスさせてインター
四イキン２ヰ童能を有するコロニーを以下のようＫして
選別した。

この選別方法はプラス・マイナス法と称されるもので、
次のようにして行なった。まずＯｏｎムによって刺激し
たジュルカット細胞より（ＩＩＲＮムを抽出し、８ＤＧ
逮心法によってインターロイキン２ｍＲＮＡを部分精製
したのち（ｆｔｈ　１１　”　１２８ｍＲＮＡ）、この
ｍＲＮＡを用い一１１述の如（ａ２ｐラベルシタＣＤＮ
ムを合成した。ｚＲＮムをアルカリ処理によって除いた
恢、（！ｏｎムで誘導していないジュルカット細胞より
抽出した１１−１２８の部分Ｗｔ＃！＋ｎＲＮムの過剰
と７・イブリダイズさせた。

次に、この山ＲＮムに〕・イブリダイズしなかったｃ　
ＤＮＡと、このｍ　）ＬＮＡとノ・イブリッドを形成し
たｃ　ＤＮＡとを・ヒドロキシアノくタイトカラムクロ
マトグラフィーによって分離し、それぞれプローブＡお
よびプローブＢとした。

先に指摘した如く、全く同じフィルターを２枚用意１．
−〔あるので、１枚はブロープムと他の１枚はプローブ
Ｂと別個に）・イブリグイブさせたのちオートラジオグ
ラフィーを行ない、プロープムにはポジティブに反応す
る（プラス）がグローブＢには弱く、もしくは全く反応
しない（マイナス）コロニーな検索した。

このようにして３，０００個のコロニー９８個のＯｏｎ
ムによる誘発により合成されたｍＲＮＡに対応するｃＤ
Ｎムが組み込まれているプラスミドを有スるコロニーを
選別した。ここでのノ・イブリダイゼーションの条件は
フィルターを８８０の３倍希釈液で６５℃、３０分間浸
し、さらにＳＳＣの３倍希釈とＤｅｎｈａ　ｒ　を原液
（０２％Ｆｉｃａｌｌ　４００　、０．２％ポリビニル
ピロリドン、０，２％ウシ直清アルブミン）Ｋ６０分間
浸し１次にノ・イブリドバッファ（Ｉ　ＭＮａＣｊ、　
　５０ｍＭＴｒｉｓ−［０７，ｐＨ８−０゜ｌ　Ｑ　ｍ
Ｍ　ＩＤテム、ｏ、１ｓｓＤｓ）とＤｅｎｈａｒｔ原液
およびエシェリヒア・コリＤＮＡ適当量（このとき１０
μ７ぐらい）でもって６５℃で１夜予備的ノ・イブリダ
イぞ−ションを行なった。さらにノ・イブリドバッファ
ー、　Ｄｅｎｈａｒｔ　Ｊｉ液、エシェリヒア・コリＤ
Ｎム、ラベルされたブロープムまたはＢ中に６５℃、２
晩浸しＩ・イブリダイズする。次いでフィルターを８８
０の２倍希釈液でよ（洗い、さらにＳＳＯの１０倍濃縮
液と０，１％８Ｄ８で６５℃３０分間浸し、これを２回
繰返した後、ＳＳＯの２倍希釈液で洗（・、風乾後オー
トラジオグラフィーする。

得Ｉ−，れたコロニーにおけるインターロイキン２遺伝
子の検定 Ｙ、記８個のコロニーからそれぞれＤＮＡを単離゛し、
それぞれ熱変性させておいてから、部分精製したインタ
ーロイキン２　ｍＲＮムとハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズの条件は８０％ホルムアミド。

２０　ｉｔ；Ｍパイプス（ｐｌｌ　６．５　）　０．４
　Ｍ　Ｎａｐ／　、　　５　ｍＭｌ＜Ｄ’ｌ’Ａ　、　
　５３℃でインキュベートさせた。次にＤＮＡにハイブ
リダイズしたｍＲＮムをニトロセルロース膜を通すこと
によって特異的にフィルター上に保貿させ（他のｍＲＮ
ムは通過する）、その後フィルターからｍＲＮムを抽出
し、ウサギ網状赤血球ライゼートを用いる無細胞蛋白合
成系により■訳させ、ヒトインターロイキン２に対応す
る特異的な蛋白が検出された。この中の１株ムＪ１１７
８２をＡＴＣＯにブダペスト条約に基つきムＴｃ０３６
０６４として寄託した。

実九例２ 実ル例１と同様の方法で、変異クローン化して得られた
インターロイキン２自発意生株Ｊ−ム１８８６を同様に
回転培養瓶にて大量に培養増殖させ１×ｌＯ″個／献の
細胞密度で新鮮なＲＩＴＯ−５５−９培地に再懸濁し８
時間後の細胞を集め、本細胞３×ｌＯ”個より実施例１
同様に１１〜１２８両分のインターロイキン２に対応す
るｍ１ＬＮムが得られる。

実施例３ ｘ！Ｉ照射をしないジュルカット細胞を実施例１と一様
に限界希釈法でクローニングし、インターロイキン２童
生能が全くないクローン化細胞Ｊ−９９細胞株を得た。

本細胞株を実施例１と同様に回転培養瓶にて大量に増殖
させＩ　Ｘ　１０’個／Ｗｉｌの細胞密度で新鮮なＲＩ
ＴＯ−５５−９培地に再懸濁し、ここにコンカナパリン
ム１０μ９／Ｉｄ、ラージ細胞ｏ、５ｘｉｏ’個／ｍｌ
、ホルボールミリステートアセテ−）　１０　ｎ９〜を
添加し、回転培養瓶中にて１．０００−の容量で６時間
培養した。本細胞３×１０１個より実施例１と同様Ｋ１
ｌ−１２８［分のインターロイキン２に対応するｍＲＮ
ムが得られる。

手続補正書（自発） 昭和５７年８月１１日 ％１斤長官若杉和夫　殿 １、　φ件０表−示 特願昭５７−５１１２２ ２　発明の名祢 メッセンジャーＲＮＡおよびその調製法五　補止ををす
る者 事件との関係　特許出願人 財団法人　癌研究会 味の素株式会社 ４　　代　　理　　人 〒１０４ ｍ１ｌｌｉ中央区京橋１丁目１番１０号西勘ビル５ｗ１ （７４０７）　　弁理士　久保田藤部 璽ｌｌ１ｌ！ｌ　（２７５）０７２１査！ｉｍ＋Ｈの対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ＆ｓｕｉヒの内容 明細書簡ｓ１ｇ下から４行目の「ムＴＯＯ５６ｏ６４Ｊ
を［ム丁ｃｃ　１ｏ４４Ｊ　に釘止する。

（以上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトインターロイキン２に対応し、ヒトリンパ球由
   来ＩＪｍ麿より得られ、シＷＩＩＩ密度勾配達心法゛に
   よる分１１により１１〜１２８画分として得られるメッ
   センジャーＲＮＡ。 ２）ヒトリンパ球由来細胞がヒトインターロイキン２自
   発意生株である特許請求の範８１Ｎ１項記載のメツセン
   ジャー鮒ム。 ３）ヒトリンパ球由来細胞がマイトーゲンにより刺激さ
   れることによりヒトインターロイキン２を産生する細胞
   である特許請求の範ｉｉ！！ｌ第１項記載のメッセンジ
   ャーＲＮＡ。 ４）ヒトリンパ球由来細胞が他の細胞の存在下にマイト
   ーゲ７により刺激されることｋよってヒトインターロイ
   キン２を産生する細胞である特許請求の範囲第１項記載
   のメツセンジャーＩＬＮム。 ５）ヒトインターロイキン２に対応し、ショ糖書度勾配
   達心法による分画により１１〜１２ａ画分として得られ
   るメツセンジャーＩＬＮＡをヒトリンパ球由来細胞より
   分離することを特徴とするメツセンジャー朋ムの調製法
   。 ６）ヒトリンパ球由来細胞がヒトインターレイキン２自
   発意生株である特許請求の範囲第５項記載のメツセンジ
   ャーＩＬＮムの調製法。 フ）ヒトリンパ球由来細胞がマイトーゲンにより刺激さ
   れることによりヒトインターロイキン２を産生するＭ胞
   である特許請求の範囲第５項記載のメツ竜ンジャーＲＮ
   ムの調製法。 ８）ヒトリンパ球由来細胞が他の細胞の存在下にマイト
   ーゲンにより刺激されることＫよってヒトインターロイ
   キン２を産生する細胞である＊齢請求の範囲第５項記載
   のメジセンジャー朋ムの調製法。